JP6368502B2 - 糖ペプチドの質量分析法 - Google Patents

Description

本発明は、糖ペプチドの質量分析法に関する。詳細には、糖鎖が結合した糖ペプチド（糖アミノ酸を含む）を、ペプチドのＮ末端のアミノ基を標識試薬で簡便かつ効率よく標識する事により、目的の糖ペプチドを質量分析法（特に、Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ））で高感度に検出、または分析する方法、及びその方法により前立腺特異抗原（ＰＳＡ）で初めて見出された硫酸化糖鎖を有する糖ペプチドに関する。

近年、グライコプロテオミクスが盛んになり、糖ペプチドの質量分析計を用いた解析技術が求められている。グライコプロテオミクスとは、生体試料の糖ペプチドを網羅的に解析する事によって、糖タンパク質の同定、糖タンパク質中の糖鎖結合部位および各結合部位における糖鎖構造と糖鎖の分布情報を得る手法である。しかし、他の生体分子が混在している系で生体試料中の糖ペプチドを質量分析計で解析することは極めて困難である。よって、多くのグループらによって、生体試料から糖ペプチドの分離技術が開発されている。今までに糖鎖認識するレクチンを用いたアフィニティーカラム、糖鎖の親水性を利用したボロン酸担持カラム、ＨＩＬＩＣカラム、糖鎖と金属イオンの錯体を利用したＴｉＯ_２担持カラム、糖の酸化反応を利用したヒドラジドカラム等がグライコプロテオミクスに使用されている（非特許文献１）。しかしながら、上記の手法で分離しても同一のペプチド鎖に結合している糖鎖は多様性に富んでいる為、結果として個々の糖ペプチドは分散し、存在量のダイナミックレンジも大きく異なっている為、網羅的に検出する事は容易ではない。さらに、糖鎖部分が中性糖鎖ばかりでなく、シアル酸や硫酸などが１個以上結合した酸性糖鎖も多種含まれ複雑になっている事も検出を困難にしている。

また、数多くの研究者らによって、メタボロミクス、プロテオミクスの為に脂質や糖を結合していないペプチドの検出を高感度にする方法として生体分子のアミノ基、カルボキシル基に質量分析計でのイオン化を向上させる標識方法が開発されている。正電荷を持つ第４級リンや第４級アミン等の標識試薬を導入する手法は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳだけでなくＥＳＩ−ＭＳにおいても有効とされている（非特許文献２、３、４）。しかし、第４級リンの正電荷を持つｔｒｉｓ−（２，４，６−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ（ＴＭＰＰ）の標識は糖ペプチドにおいてほとんど効果がない。他にも、Ｃｏｕｍａｒｉｎ等を脂質や糖ペプチド以外のペプチドの標識試薬として用いてイオン化を向上させながら、蛍光機能と色素といった分光計で検出できるという付加価値を持たせている手法も開発されている（非特許文献５）。

また、正電荷を持つ６−ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ（ＡＱＣ）を用いて糖ペプチドのアミノ基に標識した糖ペプチドはｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅにおいてイオン化が向上する事が報告されている（非特許文献６）。

現在までに開発されているこれらの標識試薬はほとんどｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅをターゲットにした物であり、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅでの測定に対応している化合物はほとんどない。

特開２００８−５１７９０

ＲＡ．Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， １１３， ｐ２６６８−２７３２， ２０１３ ＷＪ．Ｌｅａｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１６， ｐ４３３−４４１， ２００２ ＳＪ． Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１７， ｐ６０３−６２０， ２００３ Ｈ． Ｋｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２２， ｐ２０６３−２０７２， ２００８ Ａ．Ｐａｓｈｋｏｖａ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７７， ｐ２０８５−２０９６， ２００５ Ｒ． Ｕｌｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２０， ｐ１４６９−１４７９，２００６ Ｍ． Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ９， ｐ２３５４−２３６８，２０１０ Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ ＲＬ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７４， ｐ１８８４−１８９０，２００２ Ｙｕ Ｓ−Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ． Ｊ．， ３０， ｐ１８３−１９４， ２０１３

生体試料中の微量の糖ペプチドを質量分析法によって、迅速かつ簡便に分析する事ができれば、疾患や細胞分化等のバイオマーカー探索に役立つ事が出来る。
従って、本発明の目的は、糖ペプチドの質量分析法において糖ペプチドの検出感度を増加させる方法を提供することである。

本発明者は、シアロ糖ペプチドを効率よく質量分析計で検出する研究の中で、シアル酸に第３級アミンを有する２−アミノピリジンを導入する事によって、シアル酸の１位にあるカルボキシル基の正電荷と中和させ、イオン的に安定化させる事によってシアロ糖ペプチドの検出を向上させる手法を報告している。（非特許文献７）

また、本発明者らは、糖ペプチドのペプチド鎖のカルボキシル基にジアゾメタン誘導体を用いてエステル結合でピレン等の疎水性化合物を導入する事によって、糖ペプチドのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量分析計での検出の向上を見いだしている（特許文献１）。

これらの知見に基づいて更に検討を重ねた結果、糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ基を電荷的に中性な疎水性化合物で標識する事によって、イオンペアを組む可能性のあるペプチド鎖のアミノ基の電荷を無くして電荷的に中和し、糖ペプチドのイオン化が向上することを見いだし、本発明の完成に至ったものである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ基を特定の構造を有する標識試薬により標識し、しかる後に標識された糖ペプチドを質量分析法、または、質量分析法の一手法であるタンデム質量分析法（ＭＳ^ｎ法）に供する事により、それらの化合物を簡便かつ高感度に分析できる事を見いだし、本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明は、少なくともアミノ基を有する糖ペプチドを質量分析法により分析する方法であって、当該糖ペプチドを下記一般式（１）で示されるカルバメート化合物もしくは、下記一般式（２）で示されるカルボン酸無水物、下記一般式（３）で示されるカルボン酸化合物を混合酸無水物法から得られるカルボン酸無水物により標識し、質量分析法に付す事に特徴を有する糖ペプチド分析に存ずる。（図１）

上記式中、カルバメート化合物もしくは、カルボン酸無水物、カルボン酸に結合するＸは、芳香族性を示す炭素環化合物又は複素環化合物残基を表し当該芳香環は置換基（１個又は複数個）を有していてもよく、前記芳香環を構成する原子に関しては、炭素原子のみ、或いは、炭素原子と炭素原子以外の原子、例えば窒素原子、硫黄原子等を上げる事ができ、炭素原子のみ（炭素環）で又は炭素とそれ以外の原子（複素環）とで、当該環を形成する事が出来る。尚、糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ基の電荷を除去、または軽減する為に標識を行うので、当該芳香環は、電荷を持つ官能基（アミン、カルボン酸等）は含まない、もしくは正電荷を持つ官能基及び負電荷を持つ官能基がイオンペアとして併せ持ち電荷的に中性な化合物である。

本発明は、以下の糖ペプチドの質量分析法、及びその方法により前立腺特異抗原（ＰＳＡ）で初めて見出された硫酸化糖鎖を有する糖ペプチドである。
［１］ 電荷的に中性な芳香環もしくは複素環の単環を持ち、且つアミノ基と反応しうる官能基を持つ標識化合物を用いて、糖ペプチドのペプチド鎖のＮ末端のアミノ基に、又はＮ末端及び側鎖のアミノ基に標識して質量分析することを特徴とする糖ペプチドの質量分析法。
［２］ 前記糖ペプチドが酸性糖鎖を有する糖ペプチドである［１］に記載の糖ペプチドの質量分析法。
［３］ 前記糖ペプチドが硫酸化糖鎖を有する糖ペプチドである［１］に記載の糖ペプチドの質量分析法。
［４］ 前記硫酸化糖鎖を有する糖ペプチドが下記式（４）で表される糖ペプチドである［３］に記載の糖ペプチドの質量分析法。
［５］ 下記式（４）で表される糖ペプチド、又は、下記式（４）で表される糖ペプチド構造を含む前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の糖タンパク質。

本発明の方法により糖ペプチドを標識することで、従来、困難であった以下のことが可能となる。
１．生体試料からの糖ペプチドの検出。
２．糖鎖を有するタンパク質の同定。
３．糖ペプチドの糖鎖構造の同定。
そして、これらはいずれも疾患関連マーカーの探索に新たな手法を提供するものである。

糖ペプチドのアミノ基の標識方法の概略を示す図である。 実施例１、比較例１において行った標識する前の糖ペプチドとＡｃ標識、Ｂｚ標識した糖ペプチドのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルを示す図である。 実施例３において行ったＩｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｌｙｓ−Ｓｅｒの糖ペプチドにＮ末端アミノ基、又はＮ末端及び側鎖のアミノ基にＢｚ標識した糖ペプチドのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルを示す図である。 実施例３において行ったＬｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒの糖ペプチドにＮ末端アミノ基、又はＮ末端及び側鎖のアミノ基にＢｚ標識した糖ペプチドのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルを示す図である。 実施例４において行ったウシリボヌクレアーゼＢ由来糖ペプチドのＢｚ標識化の効果を示すＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルの図である。 実施例４において行ったヒト免疫グロブリン由来糖ペプチドのＢｚ標識化の効果を示すＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルの図である。 実施例５において行ったウシサイログロブリン糖タンパク質のＢｚ標識された糖ペプチドの構造と分子量を示す図である。 実施例５において行ったウシサイログロブリン糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドの測定までのプロトコールを示す図である。 実施例５、比較例２において行ったウシサイログロブリン糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドの非標識、Ｎ端標識化合物のｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルを示す図である。 実施例６において行ったヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）糖タンパク質のＢｚ標識された糖ペプチドの構造と分子量を示す図である。 実施例６において行ったヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドの測定までのプロトコールを示す図である。 実施例６において行ったヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドのＮ端標識化合物のｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルを示す図である。 実施例７において行ったヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖タンパク質のＢｚ標識された糖ペプチドの構造と分子量を示す図である。 実施例７において行ったヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドの測定までのプロトコールを示す図である。 実施例７において行ったヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドのＮ端標識化合物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルを示す図である。 実施例７において行ったヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドのＮ端標識化合物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルの拡大を示す図である。 ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドのフラグメントパターンを示す図である。 実施例８において行ったヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドのｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。 実施例８において行ったヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドのｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳスペクトルとＭＳ^３スペクトルを示す図である。 実施例８において行ったヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖タンパク質の硫酸化糖ペプチドのｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳスペクトルとＭＳ^４スペクトルを示す図である。 実施例９において行った酸性糖鎖を有する糖ペプチドの標識前とＢｚ標識した糖ペプチドのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルを示す図である。 実施例１０において行ったシアル酸を有する酸性糖ペプチドのｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳスペクトルとＭＳ^３スペクトルを示す図である。 安定同位体標識を用いた糖ペプチドの定量法の概略を示す図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ１ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルを示す図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ１ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルの拡大図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ１ｌａｍｂｄａのｈ−Ｂｚ標識体とｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルを示す図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ１ｌａｍｂｄａのｈ−Ｂｚ標識体とｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルの拡大図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ１ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とＩｇＧ１ｌａｍｂｄａのｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルを示す図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ１ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とＩｇＧ１ｌａｍｂｄａのｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルの拡大図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ２ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルを示す図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ２ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルの拡大図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ２ｌａｍｂｄａのｈ−Ｂｚ標識体とｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルを示す図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ２ｌａｍｂｄａのｈ−Ｂｚ標識体とｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルの拡大図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ２ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とＩｇＧ２ｌａｍｂｄａのｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルを示す図である。 実施例１２において行ったヒトＩｇＧ２ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とＩｇＧ２ｌａｍｂｄａのｄ−Ｂｚ標識体、並びにその１：１の混合物のＭＳスペクトルの拡大図である。

（１） 質量分析法
「質量分析法」とは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、レーザー脱離（ＬＤ）法、高速電子衝撃（ＦＡＢ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学（ＡＰＣＩ）法などのイオン化方法によって分子を含む試料をイオン化し、次いで、飛行時間法（タイムオブフライト法、ＴＯＦ法）、二重収束法、四重極集束法等を用いて、イオン化した分子を質量／電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離し検出する方法である。
本発明においてイオン化法は限定されないが、好ましくは、ＭＡＬＤＩ法である。

糖、糖鎖、タンパク質、糖など修飾を含むタンパク質、核酸、糖脂質などの分子は、分子量及び組成が同一の構造異性体が存在するので、芳香環による標識化後、プリカーサーイオンの生成を高めて、ＭＳ^ｎ（ｎ＝１）解析を行い、異性体に特異的なイオンを生成して構造情報を得ることができる。糖ペプチドに標識した分子をＭＳ^ｎ（ｎ＞２）解析する場合、糖鎖構造を含むフラグメントイオンを選択する事によって、糖鎖構造情報を得る事が出来、またペプチドを含むフラグメント分子を選択する事によって、ペプチド配列情報及び糖鎖結合位置を決定することができる。
本発明の質量分析法は、以上に記載されたＭＳ^ｎ（ｎ＞１）解析を含む。

ＭＳ^ｎ（ｎ＞１）解析で得られたスペクトルは、糖、糖鎖、タンパク質、糖など修飾を含むタンパク質、核酸、糖脂質などの分子の構造を特定する上で有用である。また、当該スペクトルから得られる糖鎖部分の構造情報及び当該糖鎖部分の分子内結合位置のような情報は、当該分子の機能解明あるいは当該分子が関与する病態の解明に有用な情報を得る方法を提供する。したがって、本発明の質量分析法によって得られるスペクトルから得られる情報を集積したデータ集積体は、集積された情報の照会を行うコンピュータシステムおよび本発明の質量分析法と組み合わせることによって、広範な構造未知の分子の構造の特定、機能の解明および当該分子か関与する病態の解明に有用な情報を提供することができる。

（２） 電荷的に中性な芳香環もしくは複素環の単環を持ち、且つアミノ基と反応する官能基を持つ標識化合物
本発明で用いる標識化合物は、中性の水溶液又は有機溶媒、もしくはその水溶液と有機溶媒の混合液中で塩素、臭素、ヨウ素、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のイオンと結合していない状態で正電荷を帯びている第４級リン、第１級、第２級、第３級、第４級アミン等や負電荷を帯びているカルボン酸、硫酸等の官能基は含まない、もしくは電荷的に中性になる様に正電荷と負電荷の官能基がイオンペアになっている化合物であり、疎水性を示す芳香環を構成する原子に関しては、炭素原子のみ、或いは、炭素原子と炭素原子以外の原子、例えば窒素原子、硫黄原子等を上げる事ができ、炭素原子のみ（炭素環）で又は炭素とそれ以外の原子（複素環）とで、当該環を形成している芳香環もしくは複素環の単環を持つ化合物であり、また、アミノ基を標識する反応性官能基として上記の中性である官能基以外としてカルバメート誘導体、カルボン酸無水物、カルボン酸等を含んでいる化合物である。この反応性官能基は、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基以外にＬｙｓ，Ｈｉｓ，Ｔｒｐ等の側鎖のアミノ基と反応する。従来、糖ペプチドＣ末端の標識には、疎水性が高いナフチル基、ピレン基などが好まれるが、糖ペプチドＮ末端に関しては本発明により単環化合物であるベンゾイル基の方が親イオンを多く生成し十分な感度を得る事が見出された。具体的には、無水安息香酸（ｂｅｎｚｏｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、安息香酸（ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３，４，５−トリメトキシ安息香酸無水物（３，４，５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、４−トリフルオロメチル安息香酸無水物（４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、３，５−ビストリフルオロメチル安息香酸（３，５−Ｂｉｓ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２−メトキシ安息香酸（２−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−メトキシ安息香酸（３−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−メトキシ安息香酸（４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２，４−ジメトキシ安息香酸（２，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２，５−ジメトキシ安息香酸（２，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２，６−ジメトキシ安息香酸（２，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３，４−ジメトキシ安息香酸（３，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３，５−ジメトキシ安息香酸（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−メトキシ−３，５−ジメチル安息香酸（４−ｍｅｔｈｏｘｙ−３，５−ｄｉｔｈｙｌｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−メトキシ−２−メチル安息香酸（３−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−メトキシ−４−メチル安息香酸（３−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２，３，４−トリメトキシ安息香酸（２，３，４−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２，３，６−トリメトキシ安息香酸（２，３，６−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２，４，５−トリメトキシ安息香酸（２，４，５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２，４，６−トリメトキシ安息香酸（２，４，６−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３，４，５−トリメトキシ安息香酸（３，４，５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−メチル安息香酸（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２−メチル安息香酸（２−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−メチル安息香酸（３−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、２−トリフルオロメチル安息香酸（２−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、３−トリフルオロメチル安息香酸（３−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、４−トリフルオロメチル安息香酸（４−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、フタル酸ベンジルアミド（ｐｈｔｈａｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ）、２，３−ピリジンジカルボン酸無水物（２，３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、２，３−ピリジンジカルボン酸（２，３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、２，４−ピリジンジカルボン酸（２，４−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、２，５−ピリジンジカルボン酸（２，５−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、２，６−ピリジンジカルボン酸 （２，６−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、３，４−ピリジンジカルボン酸（３，４−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、３，５−ピリジンジカルボン酸（３，５−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）などが挙げられる。

（３） 糖ペプチド
糖ペプチドとは、ペプチドに糖鎖が結合している物である。本発明では、糖アミノ酸も糖ペプチドに含まれるものとする。通常、糖ペプチドの糖鎖には、Ｎ結合型糖鎖とＯ結合型糖鎖があり、前者はアスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖に結合した糖鎖であり、後者はセリン、スレオニンの側鎖に結合した糖鎖であるがその他の結合様式も存在する。生物に通常、存在している糖鎖の組成には、グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース（Ｇａｌ）と言われるヘキソース（Ｈｅｘ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）と言われるＮ−アセチルヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）と言われるデオキシヘキソース（ｄＨｅｘ）があり、これらの糖は中性を示し、これらだけで構成された糖鎖は中性糖鎖と呼ばれる。また、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）と言われるシアル酸やグルクロン酸（ＧｌｃＡ）、イズロン酸（Ｉｄｏ）等と言ったカルボン酸を有する糖も存在し、これらは酸性を示し、これを含む糖鎖は酸性糖鎖と呼ばれる。さらに、生体中の糖には、糖の水酸基にアセチル基、メチル基、リン酸基、硫酸基等が修飾されて存在している物もあり、この中でリン酸基、硫酸基で修飾された糖は酸性を示し、これを含む糖鎖も酸性糖鎖と呼ばれる。

（４） 式（４）で表される糖ペプチド、及び式（４）で表される糖ペプチド構造を含む前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の糖タンパク質
式（４）で表される糖ペプチド構造は、本発明において初めて同定されたＰＳＡの新規糖鎖構造である。これにより、このＰＳＡ上の硫酸化糖ペプチドを質量分析計及びＥＬＩＳＡ測定等の標準物質としてバイオマーカーの指標にする事ができる。また、この糖ペプチド構造もしくは、これを含むＰＳＡ糖タンパク質を抗原として抗体を作成する事により、生体試料中に存在する式（４）で表される糖ペプチド構造を含む前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の糖タンパク質を検出して、定量が行えるので、疾患等の臨床診断に役立つ。

以下に本発明の実施例を挙けるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
糖ペプチドのペプチド鎖のＮ末端アミノ基のベンゾイル（Ｂｚ）化
最初に、卵黄由来糖ペプチド（Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４Ｎｅｕ５Ａｃ_２）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）のリジン（Ｌｙｓ）の側鎖アミノ基をＢｅａｒｄｓｌｅｙ Ｒ．Ｌ．らの手法（非特許文献８）によって、グアニジド化し、その後、酸加水分解によって、脱シアリル化を行い、ペプチドのＮ末端に１個アミノ基を有する糖ペプチド（Ｈ−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｔｈｒ−ＯＨ）を調製した。この糖ペプチドを用いて、標識による効果を調べた。

まず、Ｈ−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｔｈｒ−ＯＨ（１００ｐｍｏｌ）に対して、無水安息香酸（Ｂｚ_２Ｏ）を用いて糖ペプチドのＮ末端のアミノ基の標識化を行い、質量分析計で測定した。図２で示されるようにＢｚ基による標識ではｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ共に標識前の試料より検出感度が非常に向上している。

＜比較例１＞
糖ペプチドのペプチド鎖のＮ末端アミノ基のアセチル（Ａｃ）化
同様に、Ｈ−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｔｈｒ−ＯＨに対して、無水酢酸（Ａｃ_２Ｏ）を用いて糖ペプチドのＮ末端のアミノ基の標識化を行い、質量分析計で測定した。図２で示されるようにＡｃ基による標識ではｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ共に標識前と比べて感度（ピーク強度、ＳＮ比）が悪くなっている。

＜実施例２＞
糖ペプチドのペプチド鎖のＮ末端アミノ基への標識試薬の比較
次に、電荷的に中性かつ芳香環又は複素環を持つ表１の（２）、（５）、（８）のカルボン酸無水物、カルボン酸を用いてＨ−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｔｈｒ−ＯＨのＮ末端のアミノ基に標識し、試料を混合して質量分析計で測定する事により、ピーク強度比を計算し、それぞれのイオン感度を評価した。

＜参考例＞
表１の（３）、（４）、（６）、（７）は、芳香環又は複素環の単環を持つ標識化合物ではないが、参考例として行い、評価している。
芳香環が１、２、４個あるベンゾイル（１）、ナフトイル（３）、ピレノイル（４）基を比較した結果、芳香環が１個のベンゾイルが一番、感度が良かった。また、芳香環が１つでもメトキシが結合している物（２）は、感度が悪かった。しかしながら、カルボン酸と３級アミンが混在して電荷的に中性な化合物（５）は、感度が良かった。また、２つの芳香環又は複素環を持つ（３）、（７）と（８）を比較した結果、ほぼ同程度の感度である事が分かった。

＜表１＞ 糖ペプチドのペプチド鎖のＮ末端のアミノ基に標識した化合物のイオン検出感度（標識なしの糖ペプチドを１とした）

＜実施例３＞
Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｈ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＯＨのＮ末端アミノ基のみ標識した場合と、リシン側鎖アミノ基をも標識した場合の比較
Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｈ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＯＨを用いてペプチドのＮ末端に１個だけ標識した糖ペプチドＢｚ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｂｚ−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｔｈｒ−ＯＨとＬｙｓの側鎖のアミノ基と合わせて２箇所に標識されたＢｚ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｌｙｓ（Ｂｚ）−Ｓｅｒ−ＯＨ、３箇所に標識化されたＢｚ−Ｌｙｓ（Ｂｚ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４）−Ｌｙｓ（Ｂｚ）−Ｔｈｒ−ＯＨを作成し、それぞれ等量混ぜて質量分析計で測定し、ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅの両方で標識化の個数によるイオン化の比較を行った。

この結果、負電荷ではＢｚ標識はＮ末端のアミノ基だけでなく、側鎖のアミノ基にも標識されている方がイオン感度は向上している事が示された。正電荷では、プロトン付加イオンとして検出される場合は、イオン化の促進があるが、ナトリウム付加イオンとして検出される場合はイオン化の促進は起こらなかった。

＜実施例４＞
ウシリボヌクレアーゼＢ由来糖ペプチド、ヒト免疫グロブリン由来糖ペプチドのＮ末端アミノ基のベンゾイル化
同じペプチド鎖に複数の異性体の糖鎖が結合しているウシリボヌクレアーゼＢ由来糖ペプチド、ヒト免疫グロブリン由来糖ペプチドを用いて同様にペプチド鎖のＮ末端のアミノ基にＢｚ標識を行い、標識前の糖ペプチドと等量混ぜて質量分析計で測定し、ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅの両方で標識化によるイオン検出の比較を行った。

この結果、糖ペプチドのペプチド鎖のＮ末端のアミノ基へのＢｚ標識は、糖鎖の種類によらず、イオン感度を向上させる事が出来、また、ペプチド鎖の組成が異なる糖ペプチドにおいてもイオン化が向上する事が分かった。

＜実施例５＞
ウシサイログロブリン糖ペプチドＰｈｅ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１ＳＯ_３）のＮ末端アミノ基のベンゾイル化
ウシサイログロブリン（５００μｇ）を１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（５０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（５μＬ）、２００ｍＭジチオトレイトール水溶液（５μＬ）を加え、５６℃で３０分間加熱し、５００ｍＭヨードアセトアミド水溶液（５μＬ）を加え、室温で遮光条件下３０分間静置する。この溶液にＴＰＣＫ処理トリプシン（１０ｍｇ／ｍｌ，２μＬ）を加え、３７℃で２時間反応させる。反応溶液を８５℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で過剰な試薬を除去し、濃縮する。次に、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（５０μＬ）を加え、サーモリシン（１０００Ｕ／μＬ，４μＬ）を加え、５６℃で１０時間反応させる。反応溶液を減圧濃縮し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）（５０μＬ）に溶かし、シアリダーゼ（１０Ｕ／ｍＬ，２μＬ）を加え、３７℃で２時間反応させる。反応溶液を８５℃１５分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、濃縮する。この試料に水（２０μＬ）、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｗｅｔ１００μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）、エタノール：水＝１：１（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、２００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（２ｍＬ）で硫酸化糖ペプチド画分を回収し、減圧濃縮した。これにＤＭＦ（５μＬ）を加え、６０℃５分間、加熱し、２００ｍＭ無水安息香酸−メタノール溶液（１００μＬ）を加え、超音波洗浄機を用いて１５分間室温で超音波しながら反応を行い、試薬を不活性化させ、エステル化反応を止める為、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５μＬ）、７Ｍアンモニウム水溶液（１０μＬ）を加え、減圧濃縮を行った。この反応物を水（１ｍＬ）に溶かし、Ｃ１８ Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、５０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、８０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。

この試料を水に溶かし、約１μＭにしてＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ ｏｆ ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。

ＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１ＳＯ_３）のｍ／ｚ（質量／電荷比）＝２２３０．８の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンが検出できた。 さらに、その糖鎖構造の異なるＢｚ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_６ＨｅｘＮＡｃ_５ｄＨｅｘ_１ＳＯ_３）、Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_７ＨｅｘＮＡｃ_５ｄＨｅｘ_１ＳＯ_３）、Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_７ＨｅｘＮＡｃ_６ｄＨｅｘ_１ＳＯ_３）のｍ／ｚ＝２５９８．８、２７５８．０、２９６１．０の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンも検出できた （図７） 。

＜比較例２＞
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで分画した硫酸糖ペプチドを標識せずに質量分析計を用いて測定したが、硫酸化糖ペプチドは観測されなかった（図９）。

＜実施例６＞
ヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）糖ペプチドＶａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_５ＳＯ_３）−Ｈｉｓ−ＴｈｒのＮ末端アミノ基のベンゾイル化
ヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）（１５μｇ）を１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（３μＬ）、２００ｍＭジチオトレイトール水溶液（３μＬ）を加え、５６℃で３０分間加熱し、５００ｍＭヨードアセトアミド水溶液 （３μＬ）を加え、室温で遮光条件下３０分間静置する。この溶液にＴＰＣＫ処理トリプシン（１０ｍｇ／ｍｌ，１μＬ）を加え、３７℃で２時間反応させる。反応溶液を８５℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、減圧濃縮する。次に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）（５０μＬ）に溶かし、シアリダーゼ（１０Ｕ／ｍＬ，２μＬ）を加え、３７℃で２時間反応させる。反応溶液を８５℃１５分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５スピンカラム（６００μＬ）で脱塩し、減圧濃縮する。次に、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（５０μＬ）を加え、サーモリシン（１０００Ｕ／μＬ，４μＬ）を加え、５６℃で１０時間反応させ、０．８％トリフルオロ酢酸水溶液（５０μＬ）を加え、反応を停止させ、減圧濃縮した。これにＤＭＦ（５μＬ）を加え、６０℃５分間、加熱し、２００ｍＭ無水安息香酸−メタノール溶液（１００μＬ）を加え、超音波洗浄機を用いて１５分間室温で超音波しながら反応を行い、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５ μＬ）、７Ｍアンモニウム水溶液（１０μＬ）を加え、減圧濃縮を行った。この試料を水（１０００μＬ）に溶かし、活性炭カラム（５０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（２ｍＬ）、水（２ｍＬ）の順番で十分洗浄した後に、５０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、８０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）で溶出し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｗｅｔ１００μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）、エタノール：水＝１：１（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、２００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（２ｍＬ）で硫酸化糖ペプチド画分を回収し、減圧濃縮した。

この試料を水（２０μＬ）に溶かし、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ ｏｆ ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。
ＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_５ＳＯ_３）−Ｈｉｓ−Ｔｈｒのｍ／ｚ＝２４４４．８の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンが検出できた。

＜実施例７＞
ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖ペプチドのＮ末端アミノ基のベンゾイル化
ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（１．３μｇ）を１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（３μＬ）を加え、５６℃で３０分間加熱する。この溶液にサーモリシン（１０００Ｕ／μＬ，１μＬ）を加え、５６℃で１０時間反応させた。次に、１４Ｍアンモニウム水溶液（２２μＬ）を加え、Ｏ−メチルイソウレア塩酸塩水溶液（１ｍｇ／μＬ，１２μＬ）を加え、６５℃で３０分間反応した。この反応液に１０％トリフルオロ酢酸水溶液（１２０μＬ）を加え、減圧濃縮した。そして、０．８％トリフルオロ酢酸水溶液（１００μＬ）を加え、９０℃で３０分間加熱する事により、脱シアリル化を行い、減圧濃縮した。これにＤＭＦ（５μＬ）を加え、６０℃５分間、加熱し、２００ｍＭ無水安息香酸−メタノール溶液（１００μＬ）を加え、超音波洗浄機を用いて１５分間室温で超音波しながら反応を行い、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５μＬ）、７Ｍアンモニウム水溶液（１０μＬ）を加え、減圧濃縮を行った。この試料を水（１０００μＬ）に溶かし、活性炭カラム（５０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（２ｍＬ）、水（２ｍＬ）の順番で十分洗浄した後に、５０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、８０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）で溶出し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｗｅｔ５０μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝４：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、エタノール：水＝１：１（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で糖ペプチド画分を回収し、減圧濃縮した。

この試料を水（１０μＬ）に溶かし、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬを添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ ｏｆ ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。
ＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_５ｄＨｅｘ_１ＳＯ_３）−Ｌｙｓ−Ｓｅｒのｍ／ｚ＝２６５１．１の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンとｍ／ｚ＝２６５２．８の［Ｍ＋Ｈ］^＋イオンが検出できた。

＜実施例８＞
ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖ペプチドＢｚ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_５ｄＨｅｘ_１ＳＯ_３）−Ｌｙｓ−ＳｅｒのＭＳ^ｎ解析
島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅでＭＳ^ｎ測定を行った。

上記で得られたｍ／ｚ＝２６５２．８の［Ｍ＋Ｈ］^＋イオンをプリカーサーイオンとしてＭＳ／ＭＳ（すなわちＭＳ^２）測定を行った。 衝突誘起解離エネルギー（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ））＝１００で測定すると、親イオン（プリカーサーイオン）から硫酸基が解離したイオンであるｍ／ｚ＝２５７２．８と糖の還元末端側のＹ_１切断を含むペプチド部分のイオンであるｍ／ｚ＝１１１２．４並びに糖の還元末端側の^０，２Ｘ_１切断を含むペプチド部分のイオンであるｍ／ｚ＝８４６．３が顕著に観測された。

次に、上記で得られたｍ／ｚ＝２６５１．１の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンをプリカーサーイオンとしてＭＳ^２測定並びにＭＳ^３測定、ＭＳ^４測定を行った。ＣＩＤ＝１００で測定すると、糖の還元末端側の^０，２Ｘ_１切断を含むペプチド部分のイオンであるｍ／ｚ＝８４４．３と硫酸基を持つ糖鎖部分を示す^０，２Ａ_６イオンであるｍ／ｚ＝１８０５．４が観測された。次に、ｍ／ｚ＝１８０５．４のイオンを選択イオンとしてＣＩＤ＝１５０でＭＳ^３測定を行った。すると、硫酸基を持つ糖鎖部分である^２，４Ａ_６イオンであるｍ／ｚ＝１５９９．４と非還元末端側の硫酸基を持つＢ_２イオン（ＨｅｘＮＡｃ_２＋ＳＯ_３）であるｍ／ｚ＝４８５．３が観測された。これによって、Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_５ｄＨｅｘ_１ＳＯ_３の糖鎖構造中の非還元末端側のＬａｃｄｉＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）に硫酸基が結合している事が示された。さらに、ｍ／ｚ＝４８５．３のイオンを選択イオンとしてＣＩＤ＝３００でＭＳ^４測定を行った。この測定から硫酸基を持つ^３，５Ａ_２イオンであるｍ／ｚ＝３５６．０とＢ_１イオン（ＧａｌＮＡｃ＋ＳＯ_３）であるｍ／ｚ＝２８１．９と^３，５Ａ_１イオンであるｍ／ｚ＝１５２．９が検出された事によって、このＬａｃｄｉＮＡｃが１−４結合しているＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃである事、非還元末端側のＧａｌＮＡｃの４位もしくは６位に硫酸基が結合している事が示され、これはＫｈｏｏらによって報告されたメチル化した硫酸化糖鎖と同様のフラグメントパターンを示していた。（非特許文献９）

本発明により十分なイオンが検出され、ＰＳＡ上にこの硫酸化糖鎖が結合していることを初めて見出し、ＭＳ^ｎ測定を行うことが可能になったので、硫酸基を持つ糖鎖構造を示すフラグメントイオンが観測され、その結合位置情報も入手できる事が示された。

＜実施例９＞
酸性糖鎖を持つシアロ糖ペプチドのペプチド鎖の無水安息香酸によるＮ末端標識
卵黄由来糖ペプチド（Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４Ｎｅｕ５Ａｃ_２）−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）のリジン（Ｌｙｓ）の側鎖アミノ基をＢｅａｒｄｓｌｅｙ Ｒ． Ｌ．らの手法（非特許文献８）を改良した（反応停止を氷零下で酢酸を用いて行う）グアニジド化を行い、シアル酸の脱離を起こさずにペプチドのＮ末端に１個アミノ基を有する糖ペプチド（Ｈ−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４Ｎｅｕ５Ａｃ_２）−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｔｈｒ−ＯＨ）を調製した。この糖ペプチドに無水安息香酸（Ｂｚ_２Ｏ）を用いて糖ペプチドのＮ末端のアミノ基のＢｚ標識化を行い、質量分析計で測定した。図２０で示されるように、酸性糖鎖を持つ糖ペプチドにおいてもＢｚ標識を行う事によってｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ，ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ共に検出感度（ピーク強度、ＳＮ比）が向上している。

＜実施例１０＞
卵黄由来糖ペプチドＢｚ−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ（Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４Ｎｅｕ５Ａｃ_２）−Ｈｏｍｏａｒｇ−ＴｈｒのＭＳ^ｎ解析
島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅでＭＳ^ｎ測定を行った。

上記で得られたｍ／ｚ＝３０５０．８の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンをプリカーサーイオンとしてＭＳ／ＭＳ（すなわちＭＳ^２）測定を行った。 衝突誘起解離エネルギー（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ））＝１２０で測定すると、親イオン（プリカーサーイオン）からシアル酸が１個、２個解離したイオンであるｍ／ｚ＝２７５９．８、２４６８．７と糖の還元末端側の^０，２Ｘ_１切断を含むペプチド部分のイオンであるｍ／ｚ＝９２９．４とシアル酸１個が脱離した糖鎖部分を示す^０，２Ａ_７イオンであるｍ／ｚ＝１８２９．４が観測された。次に、ｍ／ｚ＝１８２９．４のイオンを選択イオンとしてＣＩＤ＝１５０でＭＳ^３測定を行った。すると、シアル酸１個を持つ糖鎖部分である^２，４Ａ_７イオンであるｍ／ｚ＝１７６９．４と非還元末端側のシアル酸１個を持つＢ_３、Ｂ_６イオンであるｍ／ｚ＝６５５．１、１７０９．４が観測された。

＜実施例１１＞
安定同位体標識された安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｄ_５−ＢｚＯＳｕ）の合成
重水素で標識された安息香酸（１２７ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（２３０ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１６７μｌ，１．２０ｍｍｏｌ）をジメチルアミドホルム（１ｍＬ）に溶かし、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２０６ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８０分間反応させた。反応溶液をフィルター濾過した後に、濾液を減圧濃縮する。この残渣にイソプロパノール（５ｍＬ）を加え、加熱しながら溶かした後に冷やす事によって、目的物となる下記式（５）で表される安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｄ_５−ＢｚＯＳｕ，以下ｄ−ＢｚＯＳｕと記す）（１８４ｍｇ，８２％）を得た。（ＴＬＣ）Ｒｆ０．４２［トルエン−酢酸エチル（１０：１）］

合成した安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｄ−ＢｚＯＳｕ）の分析値を以下に示す。
^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ２．９１（ｓ，４Ｈ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ２５．６３，１２４．８８，１２８．３１，１３０．１３，１３４．３８，１６１．８２，１６９．２４

＜実施例１２＞
ヒトミエローマプラズマより産生されたヒトＩｇＧ１ｋａｐｐａ，ヒトＩｇＧ１ｌａｍｂｄａ，ＩｇＧ２ｋａｐｐａ，ヒトＩｇＧ２ｌａｍｂｄａ（１００μｇ）をそれぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（２００μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（２０μＬ）を加え、９０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（１０μｇ）を加え、３７℃で１５時間反応させる。反応溶液を９０℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、濃縮する。これに水（２０μＬ）とピリジン（１０μＬ）を加え、２００ｍＭ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｄ_０−ＢｚＯＳｕ，ｈ−ＢｚＯＳｕ）、ジメチルホルムアミド溶液もしくは２００ｍＭ重水素標識安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｄ−ＢｚＯＳｕ）、ジメチルホルムアミド溶液（２０μＬ）を加え、５７℃で１２時間反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、水（２００μＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をＧ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、Ｃ１８ Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液 （６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ｗｅｔ５０μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝８：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、エタノール：水＝１：２（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で糖ペプチドを回収し、減圧濃縮した。

この試料をそれぞれ水（２０μＬ）に溶かし、そのままの標識体とｈ−ＢｚＯＳｕとｄ−ＢｚＯＳｕで標識した物の１：１の混合物、並びにＩｇＧ１ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とヒトＩｇＧ１ｌａｍｂｄａのｄ−Ｂｚ標識体の１：１の混合物、ＩｇＧ２ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とヒトＩｇＧ２ｌａｍｂｄａのｄ−Ｂｚ標識体の１：１の混合物をＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ ｏｆ ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。

ＭＳ測定では、ＩｇＧ１ｋａｐｐａからは図２４、図２５で示されるように、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ＡｒｇにＨｅｘ_３ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１，Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１，Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１，Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_５ｄＨｅｘ_１の４種類の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝ｈＢｚ体２７３７．７（ｄＢｚ体２７４２．７１）、ｈＢｚ体２８９９．７４（ｄＢｚ体２９０４．８６）、ｈＢｚ体３０６１．７２（ｄＢｚ体３０６６．７４）、ｈＢｚ体３１０２．８６（ｄＢｚ体３１０７．７４）が検出され、ｌａｍｂｄａからは図２６、図２７で示されるように、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ＡｒｇにＨｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_３ｄＨｅｘ_１、Ｈｅｘ_３ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１、Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_４、Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１、Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１の５種類の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝ｈＢｚ体２６９６．７４（ｄＢｚ体２７０１．６６）、ｈＢｚ体２７３７．７（ｄＢｚ体２７４２．７１）、ｈＢｚ体２７５３．７５（ｄＢｚ体２７５８．７４）、ｈＢｚ体２８９９．７４（ｄＢｚ体２９０４．８６）、ｈＢｚ体３０６１．７２（ｄＢｚ体３０６６．７４）が検出された。

また、ＩｇＧ２ｋａｐｐａからは図３０、図３１で示されるように、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＡｒｇにＨｅｘ_３ＨｅｘＮＡｃ_４，Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_４の２種類の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝ｈＢｚ体２５５９．６３（ｄＢｚ体２５６４．８４）、ｈＢｚ体２７２１．６４（ｄＢｚ体２７２６．７２）が検出され、ｌａｍｂｄａからは図３２、図３３で示されるように、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＡｒｇにＨｅｘ_３ＨｅｘＮＡｃ_３ｄＨｅｘ_１，Ｈｅｘ_３ＨｅｘＮＡｃ_４，Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_３ｄＨｅｘ_１，Ｈｅｘ_３ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１，Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_４，Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１，Ｈｅｘ_３ＨｅｘＮＡｃ_５ｄＨｅｘ_１，Ｈｅｘ_５ＨｅｘＮＡｃ_４ｄＨｅｘ_１，Ｈｅｘ_４ＨｅｘＮＡｃ_５ｄＨｅｘ_１の９種類の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝ｈＢｚ体２５０２．５４（ｄＢｚ体２５０７．５８）、ｈＢｚ体２５５９．６３（ｄＢｚ体２５６４．８４）、ｈＢｚ体２６６４．７１（ｄＢｚ体２６６９．７２）、ｈＢｚ体２７０５．７７（ｄＢｚ体２７１０．７２）ｈＢｚ体２７２１．６４（ｄＢｚ体２７２６．７２）、ｈＢｚ体２８６７．７７（ｄＢｚ体２８７２．７２）、ｈＢｚ体２９０８．８（ｄＢｚ体２９１３．８）、ｈＢｚ体３０２９．７１（ｄＢｚ体３０３４．７７）、ｈＢｚ体３０７０．７５（ｄＢｚ体３０７５．８６）が検出された。

また、ｈ−ＢｚＯＳｕとｄ−ＢｚＯＳｕで標識した物の１：１の混合物からのスペクトルからそれぞれの糖鎖毎に分子量差５．０３Ｄａの等量のイオンペアが検出されているので、この標識方法が軽水素標識の物と重水素標識の物とで定量的に反応している事が示された。さらに、ＩｇＧ１ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とヒトＩｇＧ１ｌａｍｂｄａのｄ−Ｂｚ標識体の１：１の混合物のスペクトルから図２８、図２９で示されるように、およびＩｇＧ２ｋａｐｐａのｈ−Ｂｚ標識体とヒトＩｇＧ２ｌａｍｂｄａのｄ−Ｂｚ標識体の１：１の混合物のスペクトルから図３４、図３５で示されるように、同じ量のＩｇＧ中での糖鎖の割合が違うのを定量的に示す事が出来た。

本発明により初めて同定されたＰＳＡの硫酸化糖ペプチド 式（４）は、質量分析計及びＥＬＩＳＡ測定等の標準物質としてバイオマーカーの指標にする事ができる。また、この糖ペプチド構造もしくは、これを含む前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を抗原として抗体を作成する事が出来る。

Claims (4)

1. アミノ基と反応しうる官能基が、前記官能基を除き電荷的に中性な芳香環もしくは複素環の単環に結合してなる標識化合物を用いて、糖ペプチドのペプチド鎖のＮ末端のアミノ基に、又はＮ末端及び側鎖のアミノ基に標識して質量分析することを特徴とする糖ペプチドの質量分析法。
2. 前記糖ペプチドが酸性糖鎖を有する糖ペプチドである請求項１に記載の糖ペプチドの質量分析法。
3. 前記糖ペプチドが硫酸化糖鎖を有する糖ペプチドである請求項１に記載の糖ペプチドの質量分析法。
4. 前記硫酸化糖鎖を有する糖ペプチドが下記式（４）で表される糖ペプチドである請求項３に記載の糖ペプチドの質量分析法。
   

   

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