JP2005062125A - 大腸癌及び大腸腺腫の検査方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 高率で大腸癌患者及び大腸癌の危険度の高い患者を検出することができる大腸癌及び大腸腺腫の診断に役立つ検査方法及び検査薬を提供する。
【解決手段】 糖鎖硫酸化酵素GlcNAc-6-硫酸基転移酵素のアイソザイムの分布に非癌大腸組織と大腸癌及び大腸腺腫組織との間で顕著な差異があることを見出し、これを応用することによって一定範囲のGlcNAc-6-硫酸化糖鎖群を患者組織や糞便検体から検出することにより大腸癌及び大腸腺腫を特異的に検出できることを明らかにした。大腸癌及び大腸腺腫組織に存在する酵素により特異的に生成されるGlcNAc-6-硫酸化糖鎖と反応するMECA-79抗体（ファーミンジェン社製カタログ番号09961D、ベクトン・ディッキンソン社）を用いれば大腸癌及び大腸腺腫の検査ができる。
【選択図】 なし
【解決手段】 糖鎖硫酸化酵素GlcNAc-6-硫酸基転移酵素のアイソザイムの分布に非癌大腸組織と大腸癌及び大腸腺腫組織との間で顕著な差異があることを見出し、これを応用することによって一定範囲のGlcNAc-6-硫酸化糖鎖群を患者組織や糞便検体から検出することにより大腸癌及び大腸腺腫を特異的に検出できることを明らかにした。大腸癌及び大腸腺腫組織に存在する酵素により特異的に生成されるGlcNAc-6-硫酸化糖鎖と反応するMECA-79抗体（ファーミンジェン社製カタログ番号09961D、ベクトン・ディッキンソン社）を用いれば大腸癌及び大腸腺腫の検査ができる。
【選択図】 なし
Description
この発明は、ヒトの大腸癌及び大腸腺腫の検査方法、そのための抗体、及び検査薬に関する。
大腸癌患者は年々増加しており、早期発見のための検査方法が必要とされている。現在、大腸癌の検査には便の免疫潜血反応や各種の腫瘍マーカーが利用されているが、いずれもその陽性率は満足出来るものではない。すなわち、大腸癌の検査のために用いられている便の免疫潜血反応検査の陽性率は50〜60％であり、大腸癌の腫瘍マーカーとしては癌胎児性蛋白(carcino-embryonic antigen, CEA)、CA19-9、STXなどがあり治療効果の判定や再発のモニターとして用いられているが、早期大腸癌の発見に関して十分な腫瘍マーカーであるとはいえない。
脾曲部を境として大腸を右半と左半とに分けると、右半大腸癌は、広汎に大腸癌患者の検診に用いられている抗ヘモグロビン抗体を用いた便潜血検査で偽陰性となることが多いので、とくに右半大腸癌の早期診断率の上昇に貢献する検査法の開発が待たれている。大腸癌の発生母地とされる大腸腺腫の検体診断に至っては現在なお適切なものがなく、もっぱら内視鏡検査に頼らなければならない現状である。簡便な検査法で大腸腺腫の診断が可能になれば、内視鏡検査をすべきかどうかの振り分けに役立ち、大腸癌の早期発見に資すると考えられる。
正常大腸においては糖鎖の硫酸化がさかんであるが、大腸癌においては、糖鎖の硫酸化は顕著に低下することが知られており、大腸に多いガラクトースの3'-硫酸化も、あるいはN-アセチルグルコサミン（以下「GlcNAc」という。）の6-硫酸化も減少する（非特許文献１）。患者大腸癌組織及び非癌大腸組織においてGlcNAc-6-硫酸基転移酵素の多数のアイソザイムが知られているが、そのなかでI-GlcNAc6STは癌化にともなって顕著に減少するため、大腸癌における糖鎖の硫酸化の顕著な低下が説明される（非特許文献２）。他方、非癌大腸のアイソザイムのひとつであるGlcNAc6ST-1は、癌化にともなって量的に顕著な変化を示さない。さらに、他のアイソザイムであるHEC-GlcNAc6STは癌で顕著に増加する（非特許文献３）。
癌で増加するHEC-GlcNAc6STは6-硫酸化GlcNAcを合成するが、この酵素はいろいろな糖鎖中のGlcNAcを硫酸化するので、実際に細胞内で合成される糖鎖の構造と抗原性はきわめて多様である。一方、GlcNAc6ST-1やI-GlcNAc6STも6-硫酸化GlcNAcを合成するため、6-硫酸化GlcNAcがHEC-GlcNAc6STにより合成されるというだけでは、癌の特異的診断に用いることができない。
しかし、GlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6STの基質特異性はHEC-GlcNAc6STよりも狭いことが判明している（非特許文献３，４）。このため、GlcNAc6ST-1やI-GlcNAc6STであまり合成されず、HEC-GlcNAc6STだけが合成できる6-硫酸化糖鎖が存在する可能性が強く示唆されるが、いままで大腸癌を診断できるような具体的な系は作られてはいなかった。
しかし、GlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6STの基質特異性はHEC-GlcNAc6STよりも狭いことが判明している（非特許文献３，４）。このため、GlcNAc6ST-1やI-GlcNAc6STであまり合成されず、HEC-GlcNAc6STだけが合成できる6-硫酸化糖鎖が存在する可能性が強く示唆されるが、いままで大腸癌を診断できるような具体的な系は作られてはいなかった。
一方、リンパ球の免疫学的ホーミングリセプターに対する抗体として市販されているモノクローナル抗体（MECA-79抗体）（非特許文献５）が化学合成品のGlcNAc 6-硫酸化糖鎖と反応することが知られている（非特許文献６）。更に、マウスのHEC-GlcNAc6ST酵素を、CHO細胞(ハムスターの卵巣の細胞)に遺伝子導入すると、細胞表面にこの抗体(MECA-79)が認識する抗原が出現することが報告されている（非特許文献７）。しかし、ヒトの癌細胞においてこのMECA-79抗体が認識する抗原が存在しているかどうかについては知られていなかった。
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Bruehl, R.E. et al., J. Biol. Chem. 275: 32642-32648, 2000
Yeh, J.C. et al., Cell 105: 957-969, 2001
本発明は、高率で大腸癌患者及び大腸癌の危険度の高い患者を検出することができる大腸癌及び大腸腺腫の診断に役立つ検査方法及び検査薬を提供する。
本発明者等は検討の結果、糖鎖硫酸化酵素GlcNAc-6-硫酸基転移酵素のアイソザイムの分布に非癌大腸組織と大腸癌及び大腸腺腫組織との間で顕著な差異があることを見出し、GlcNAc6ST-1やI-GlcNAc6STであまり合成されず、HEC-GlcNAc6STだけが合成できる6-硫酸化糖鎖を患者組織や糞便検体から検出することにより大腸癌及び大腸腺腫を特異的に検出できることを明らかにした。
従来GlcNAc-6-硫酸化糖鎖と反応する抗体として、AG223 (Biochem. (Tokyo), 124: 670-678, 1998)、G152, G72, AG97, AG107, AG273, G2706, G27011, G27039 (以上、J. Biol. Chem., 273: 11225-11233, 1998)等多数が知られている。一方、リンパ球の免疫学的ホーミングリセプターに対する抗体として市販されているMECA-79抗体（ファーミンジェン社製カタログ番号09961D、ベクトン・ディッキンソン社販売）もまた何らかのGlcNAc-6-硫酸化糖鎖と反応することが知られている（非特許文献６）。これらの抗体のうち、正常大腸上皮細胞に見られるGlcNAc-6-硫酸化糖鎖をよく発現する細胞とは反応性が弱いかあるいは皆無であり、癌で増加するGlcNAc-6-硫酸化糖鎖をよく発現する細胞との反応性が高い抗体を求めてスクリーニングし、得られた抗体を患者由来の検体を対象に用いて検索したところ、大腸癌に高率に陽性となることが判明し、本発明を完成させるに至った。
従来GlcNAc-6-硫酸化糖鎖と反応する抗体として、AG223 (Biochem. (Tokyo), 124: 670-678, 1998)、G152, G72, AG97, AG107, AG273, G2706, G27011, G27039 (以上、J. Biol. Chem., 273: 11225-11233, 1998)等多数が知られている。一方、リンパ球の免疫学的ホーミングリセプターに対する抗体として市販されているMECA-79抗体（ファーミンジェン社製カタログ番号09961D、ベクトン・ディッキンソン社販売）もまた何らかのGlcNAc-6-硫酸化糖鎖と反応することが知られている（非特許文献６）。これらの抗体のうち、正常大腸上皮細胞に見られるGlcNAc-6-硫酸化糖鎖をよく発現する細胞とは反応性が弱いかあるいは皆無であり、癌で増加するGlcNAc-6-硫酸化糖鎖をよく発現する細胞との反応性が高い抗体を求めてスクリーニングし、得られた抗体を患者由来の検体を対象に用いて検索したところ、大腸癌に高率に陽性となることが判明し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、被検者の組織、体液若しくは糞便又はこれらの抽出物に対する抗体の反応性の有無又は反応強度を検査することから成る大腸癌及び大腸腺腫の検査方法であって、該抗体が、GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を発現する細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を発現する細胞には存在しないか又は微量にしか存在しない抗原と特異的に反応することを特徴とする検査方法である。
この抗原は、GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞には存在しないか又は微量にしか存在しないものであってもよい。
この抗原は、GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞には存在しないか又は微量にしか存在しないものであってもよい。
この抗原は下記一般式
R1-Galβ1-3/4(SO3-6)GlcNAcβ1-R2
（式中、R1は他の酵素群によって付加される糖残基であり特に構造は限定されない。Galβはβガラクトースを表し、GlcNAcβはβN-アセチルグルコサミンを表し、Galβ1−3/4は、Galβの1位とGlcNAcβの3位及び／又は4位とが結合することを示し、(SO3-6)はGlcNAcβの6位に硫酸基が付加していることを示し、R2は−3GalNAcα、−3Galβ又は−2Manαを表し、GlcNAcβの1位に結合する。）で表される糖鎖を有する。
この抗体として、MECA-79抗体（ファーミンジェン社カタログ番号09961D、図６及び図７に示す。）が好ましい。
また、本発明は、被検者の組織、体液若しくは糞便又はこれらの抽出物に対する、MECA-79抗体又はこれの同等物の反応性を検査することから成る大腸癌及び大腸腺腫の検査方法である。
R1-Galβ1-3/4(SO3-6)GlcNAcβ1-R2
（式中、R1は他の酵素群によって付加される糖残基であり特に構造は限定されない。Galβはβガラクトースを表し、GlcNAcβはβN-アセチルグルコサミンを表し、Galβ1−3/4は、Galβの1位とGlcNAcβの3位及び／又は4位とが結合することを示し、(SO3-6)はGlcNAcβの6位に硫酸基が付加していることを示し、R2は−3GalNAcα、−3Galβ又は−2Manαを表し、GlcNAcβの1位に結合する。）で表される糖鎖を有する。
この抗体として、MECA-79抗体（ファーミンジェン社カタログ番号09961D、図６及び図７に示す。）が好ましい。
また、本発明は、被検者の組織、体液若しくは糞便又はこれらの抽出物に対する、MECA-79抗体又はこれの同等物の反応性を検査することから成る大腸癌及び大腸腺腫の検査方法である。
また、本発明は、更にこの抗体に標識を付したプローブを反応させ、この標識を定性的又は定量的に検出することから成る上記いずれかの検査方法である。
好ましい検査方法は、患者の組織、体液若しくは糞便又はこれらの抽出物中に存在する抗原を支持体に固定し、これに抗体を反応させ、これに標識を付したプローブを反応させ、この標識を検出することから成る。各工程間に適宜洗浄工程を入れることが好ましい。このプローブとしては、抗ヒトIgG抗体、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬなどが挙げられる。このプローブには通常標識を付す。この標識としては、放射性同位元素（１２５Ｉ）、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。酵素抗体を用いた場合には、基質を反応させてその変化（着色等）を観察すればよい。
好ましい検査方法は、患者の組織、体液若しくは糞便又はこれらの抽出物中に存在する抗原を支持体に固定し、これに抗体を反応させ、これに標識を付したプローブを反応させ、この標識を検出することから成る。各工程間に適宜洗浄工程を入れることが好ましい。このプローブとしては、抗ヒトIgG抗体、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬなどが挙げられる。このプローブには通常標識を付す。この標識としては、放射性同位元素（１２５Ｉ）、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。酵素抗体を用いた場合には、基質を反応させてその変化（着色等）を観察すればよい。
また、本発明は、GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を発現する細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を発現する細胞には存在しないか又は微量にしか存在しない糖鎖を有する抗原と特異的に反応する抗体(但し、MECA-79抗体を除く。)である。
また、本発明は、GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞には存在しないか又は微量にしか存在しない糖鎖を有する抗原と特異的に反応する抗体(但し、MECA-79抗体を除く。)である。
また、本発明は、GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞には存在しないか又は微量にしか存在しない糖鎖を有する抗原と特異的に反応する抗体(但し、MECA-79抗体を除く。)である。
また、本発明は、大腸癌又は大腸腺腫患者の組織、体液若しくは糞便中に存在し、下記一般式
R1-Galβ1-3/4(SO3-6)GlcNAcβ1-R2
（式中、各記号は上記と同様である。）で表される糖鎖を有する抗原と特異的に反応する抗体(但し、MECA-79抗体を除く。)である。
更に、本発明は、MECA-79抗体を含むこれらいずれかの抗体を主成分とする大腸癌及び大腸腺腫の検査薬である。
R1-Galβ1-3/4(SO3-6)GlcNAcβ1-R2
（式中、各記号は上記と同様である。）で表される糖鎖を有する抗原と特異的に反応する抗体(但し、MECA-79抗体を除く。)である。
更に、本発明は、MECA-79抗体を含むこれらいずれかの抗体を主成分とする大腸癌及び大腸腺腫の検査薬である。
GlcNAc6ST-1やI-GlcNAc6STであまり合成されず、HEC-GlcNAc6STだけが合成できる6-硫酸化糖鎖の構造は、一般式
R1−Galβ1−3/4(SO3 -−6)GlcNAcβ1−R2
で表される。
R1−Galβ1−3/4(SO3 -−6)GlcNAcβ1−R2
で表される。
体内にはGlcNAc-6-硫酸化酵素が働く相手であるGlcNAcβは、様々な糖鎖担体に担われている。R2はその担体を示す。
我々及び他の研究者による研究から、HEC-GlcNAc6STはこれまで試されたすべてのGlcNAcβ1−R2に硫酸基を転移する能力を持つことが判明している（非特許文献４、７等）。これに対してGlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6STは、特定のR2部分を持つ場合のみ硫酸基を転移する能力を持つ。
HEC-GlcNAc6STが硫酸基を転移するが、GlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6STがあまり硫酸基を転移できないのは、R2が−3GalNAcαである場合(硫酸化後の構造はSO3-−6GlcNAcβ1−3GalNAcαとなる)と、−3Galβである場合(硫酸化後の構造はSO3-−6GlcNAcβ1−3Galβとなる)と、−2Manαである場合(硫酸化後の構造はSO3-−6GlcNAcβ1−2Manαとなる)であることが判明している（J. Biol. Chem., 277: 3979-3984, 2002及びGlycobiology, 12: 379-388, 2002）。本発明の検査法においては、これら三者のいずれかに特異的な抗体を用いてもよいし、また三者の糖鎖のすべてと交叉反応する抗体でもよい。
我々及び他の研究者による研究から、HEC-GlcNAc6STはこれまで試されたすべてのGlcNAcβ1−R2に硫酸基を転移する能力を持つことが判明している（非特許文献４、７等）。これに対してGlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6STは、特定のR2部分を持つ場合のみ硫酸基を転移する能力を持つ。
HEC-GlcNAc6STが硫酸基を転移するが、GlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6STがあまり硫酸基を転移できないのは、R2が−3GalNAcαである場合(硫酸化後の構造はSO3-−6GlcNAcβ1−3GalNAcαとなる)と、−3Galβである場合(硫酸化後の構造はSO3-−6GlcNAcβ1−3Galβとなる)と、−2Manαである場合(硫酸化後の構造はSO3-−6GlcNAcβ1−2Manαとなる)であることが判明している（J. Biol. Chem., 277: 3979-3984, 2002及びGlycobiology, 12: 379-388, 2002）。本発明の検査法においては、これら三者のいずれかに特異的な抗体を用いてもよいし、また三者の糖鎖のすべてと交叉反応する抗体でもよい。
細胞内でGlcNAc-6-硫酸化酵素は、糖鎖末端のGlcNAcに硫酸基を付加して上記のように6-硫酸化GlcNAc(即ち、SO3 -−6GlcNAc)を合成する。しかし、糖鎖末端に6-硫酸化GlcNAcが生じた後にも、細胞内では他の酵素群によってさらにこれに糖残基(R1)が付加されるので、最終的に合成され細胞から産生される糖鎖の構造と抗原性は多種多様となる。通常6-硫酸化GlcNAcにまず付加される構造はGalβ1−4及びGalβ1−3である(Galβ1−3/4と表記する)。さらにこれに加えて、NeuAcα2−3/6、SO3 -−3/6、Fucα1−2/3/4が付加することが一般的に知られている。このR1部分はGlcNAc-6-硫酸化酵素による6-硫酸化GlcNAcの合成が終わったのちに、あとになって付加されるものである。このためR1部分はHEC-GlcNAc6ST、GlcNAc6ST-1やI-GlcNAc6STなどのGlcNAc-6-硫酸化酵素の基質特異性とは関わりがない。
このような糖鎖を有する抗原は、大腸癌患者から生検あるいは外科手術で得られたがん組織や、それに由来する物質を含む血清・腹水・糞便などの検体に存在する。またこれらから、この抗原をリン酸緩衝食塩水などで簡単に抽出することが出来る。またこの糖鎖抗原に対する抗体は公知の抗体産生技術(たとえばMethods in Enzymology, 312: 160-179, 2000; Methods in Molecular Biology, 199: 203-218, 2002など)を用いて得ることが出来る。
本法で検出されるGlcNAc-6-硫酸化糖鎖は大腸癌のみならず大腸癌の発生母地とされる大腸腺腫にも陽性を示し、スクリーニング検査に用いることによって、内視鏡などの精査や経過観察を要する大腸腺腫患者群を検出できる。大腸癌のスクリーニング検査に現在よく用いられる抗ヘモグロビン抗体による潜血検査に比べて大腸腺腫の検出率が高い。また、本法で検出される6-硫酸化糖鎖は大腸を右半と左半とに分けるともともと右半大腸に多いため、上記の診断は右半大腸に出来た大腸癌及び大腸腺腫の診断にとくに有用と考えられる。右半大腸癌は、普通用いられている抗ヘモグロビン抗体を用いた便潜血検査で陽性に出ないことが多いので、本発明の方法を併用すれば、右半大腸癌の診断率の上昇に飛躍的に貢献すると考えられる。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
まず、ヒト由来の大腸癌細胞株と正常大腸上皮細胞株についてRT-PCR法を用いてGlcNAc-6-硫酸化酵素アイソザイムの遺伝子発現をしらべた。
RT-PCR解析において、HEC-GlcNAc6ST遺伝子(Genebank AF131235)発現の検出用のPCRプライマーとしてupper strand側は配列番号１、lower strand側は配列番号２の合成オリゴヌクレオチドを用い(Tm=59℃)、GlcNAc6ST-1遺伝子(Genebank AB011451)発現検出用のプライマーとしてupper strand側は配列番号３、lower strand側は配列番号４の合成オリゴヌクレオチドを用い(Tm=62℃)、I-GlcNAc6ST遺伝子(Genebank AF176838)発現検出用のPCRプライマーとして、upper strand側は配列番号５、lower strand側は配列番号６の合成オリゴヌクレオチドを用いた(Tm=60℃)。
その結果を図１ａに示す。HEC-GlcNAc6ST遺伝子を強く発現し、GlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6ST遺伝子をほとんど発現しない細胞として、COLO201細胞が典型的な大腸癌パターンを示す細胞であることが判明した。また、HEC-GlcNAc6ST遺伝子をほとんど発現せず、GlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6ST遺伝子を有意に発現する細胞として、SW480細胞をトリコスタチンＡ処理したTSA-SW480細胞が典型的な正常上皮パターンを示す細胞であることが判明した。
RT-PCR解析において、HEC-GlcNAc6ST遺伝子(Genebank AF131235)発現の検出用のPCRプライマーとしてupper strand側は配列番号１、lower strand側は配列番号２の合成オリゴヌクレオチドを用い(Tm=59℃)、GlcNAc6ST-1遺伝子(Genebank AB011451)発現検出用のプライマーとしてupper strand側は配列番号３、lower strand側は配列番号４の合成オリゴヌクレオチドを用い(Tm=62℃)、I-GlcNAc6ST遺伝子(Genebank AF176838)発現検出用のPCRプライマーとして、upper strand側は配列番号５、lower strand側は配列番号６の合成オリゴヌクレオチドを用いた(Tm=60℃)。
その結果を図１ａに示す。HEC-GlcNAc6ST遺伝子を強く発現し、GlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6ST遺伝子をほとんど発現しない細胞として、COLO201細胞が典型的な大腸癌パターンを示す細胞であることが判明した。また、HEC-GlcNAc6ST遺伝子をほとんど発現せず、GlcNAc6ST-1及びI-GlcNAc6ST遺伝子を有意に発現する細胞として、SW480細胞をトリコスタチンＡ処理したTSA-SW480細胞が典型的な正常上皮パターンを示す細胞であることが判明した。
次に、多数の抗6-硫酸化糖鎖抗体についてこの二種の細胞との反応性をスクリーニングし、COLO201細胞とよく反応し、TSA-SW480細胞と反応しない抗体を探索した。
細胞と抗体との反応性のスクリーニングには間接蛍光抗体法（一次抗体1.0μg/ml、4℃, 30 min. 二次抗体はZymed Laboratories社のウサギ抗ラットIgM抗体、4℃, 30 min.）で染色したのちにFACScan (Becton Dickinson社) にてフローサイトメトリー解析を行った。
典型的な解析結果を図１ｂに示す。MECA-79抗体（ファーミンジェン社製カタログ番号09961D、ベクトン・ディッキンソン社販売）がCOLO201細胞とよく反応し、TSA-SW480細胞と反応性の低い抗体であり、大腸癌診断の検査に適した抗体であることが判明した。これ対して、対照として用いたG72抗体（J. Biol. Chem. 273:11225-11233, 1998）はCOLO201細胞とTSA-SW480細胞の両方の細胞と有意に反応し、大腸癌診断の検査には適当でないことが分かる。
細胞と抗体との反応性のスクリーニングには間接蛍光抗体法（一次抗体1.0μg/ml、4℃, 30 min. 二次抗体はZymed Laboratories社のウサギ抗ラットIgM抗体、4℃, 30 min.）で染色したのちにFACScan (Becton Dickinson社) にてフローサイトメトリー解析を行った。
典型的な解析結果を図１ｂに示す。MECA-79抗体（ファーミンジェン社製カタログ番号09961D、ベクトン・ディッキンソン社販売）がCOLO201細胞とよく反応し、TSA-SW480細胞と反応性の低い抗体であり、大腸癌診断の検査に適した抗体であることが判明した。これ対して、対照として用いたG72抗体（J. Biol. Chem. 273:11225-11233, 1998）はCOLO201細胞とTSA-SW480細胞の両方の細胞と有意に反応し、大腸癌診断の検査には適当でないことが分かる。
本実施例ではHEC-GlcNAc6ST遺伝子、GlcNAc6ST-1遺伝子、I-GlcNAc6ST遺伝子をそれぞれ導入した細胞を作成した。これらの細胞についてMECA-79抗体を用いてフローサイトメトリー解析を行った。
HEC-GlcNAc6STの遺伝子導入細胞の作成には遺伝子(Genebank AF131235)をpCDNA3.1ベクターに導入したものを用い、GlcNAc6ST-1の遺伝子導入細胞の作成には遺伝子(Genebank AB011451)をpIRES1hygroベクターに導入したものを用い、I-GlcNAc6STの遺伝子導入細胞の作成には遺伝子(Genebank AF176838)をpCDNA3.1ベクターに導入したものを用いた。フローサイトメトリー法は実施例１と同じ方法で行った。
結果を図２に示す。MECA-79抗体はHEC-GlcNAc6ST遺伝子導入細胞と極めて強く反応し、GlcNAc6ST-1遺伝子導入細胞やI-GlcNAc6ST遺伝子導入細胞とはごく弱くしか反応しなかった。
HEC-GlcNAc6STの遺伝子導入細胞の作成には遺伝子(Genebank AF131235)をpCDNA3.1ベクターに導入したものを用い、GlcNAc6ST-1の遺伝子導入細胞の作成には遺伝子(Genebank AB011451)をpIRES1hygroベクターに導入したものを用い、I-GlcNAc6STの遺伝子導入細胞の作成には遺伝子(Genebank AF176838)をpCDNA3.1ベクターに導入したものを用いた。フローサイトメトリー法は実施例１と同じ方法で行った。
結果を図２に示す。MECA-79抗体はHEC-GlcNAc6ST遺伝子導入細胞と極めて強く反応し、GlcNAc6ST-1遺伝子導入細胞やI-GlcNAc6ST遺伝子導入細胞とはごく弱くしか反応しなかった。
MECA-79抗体を用いて免疫組織学的染色で患者由来の大腸癌組織(31例)を染色した。免疫組織学的染色には、厚さ10μm の凍結切片を用い、一次抗体として1.0μg/mlのMECA-79抗体を用い、抗ラットIgM抗体を二次抗体とするベクター社の試薬キット(Vectastain) を会社の説明書通りに用いて行った。
その結果を図３に示す。本抗体は非癌大腸粘膜（Ｎ）には反応せず(31例中0例、0%)、癌組織（Ｃａ）に31例中10例(32%)に反応が見られた。特に右半大腸に生じた癌に陽性率が比較的高く(60%)、左半大腸での陽性率は低かった(19%)。
その結果を図３に示す。本抗体は非癌大腸粘膜（Ｎ）には反応せず(31例中0例、0%)、癌組織（Ｃａ）に31例中10例(32%)に反応が見られた。特に右半大腸に生じた癌に陽性率が比較的高く(60%)、左半大腸での陽性率は低かった(19%)。
典型的な染色写真を図４に示す。
図４aは、患者大腸癌組織（Ｃａ）と非癌大腸組織（Ｎ）の染色写真を示す。癌組織で強く抗体に強く染まっていが、非癌大腸組織はほとんど染まっていない。
図４ｂは、同じ組織を、AG107抗体を用いて染めたものを示す。AG107抗体は通常のGlcNAc-6-硫酸化糖鎖一般と反応するため、aとは逆に癌組織（Ｃａ）よりも非癌大腸組織（Ｎ）のほうがずっとよく抗体に染まっており、GlcNAc-6-硫酸化糖鎖というだけでは癌を特異的に検出することができないことを示している。即ち、大腸癌及び大腸腺腫に多い特定のGlcNAc-6-硫酸化糖鎖の分子種を検出するMECA-79のような抗体を用いたときにのみ特異的な検出が可能である。
図４ｃは右半由来の大腸癌組織における発現例を示す。癌組織が強染しており、極めて強い発現があることがわかる。
図４ｄは大腸腺腫性ポリープにおける発現を示す。Nは非腺腫大腸組織、Aは腺腫細胞を示す。Aで示す腺腫の部分がMECA-79抗体によってよく染まっている。癌でなくて腺腫性ポリープでも、 MECA-79で検出されるGlcNAc-6-硫酸化糖鎖が多量に出現していることを示す。良性疾患でありながら大腸癌の発生母地とされる腺腫性ポリープを確実に検査できることが分かる。
図４aは、患者大腸癌組織（Ｃａ）と非癌大腸組織（Ｎ）の染色写真を示す。癌組織で強く抗体に強く染まっていが、非癌大腸組織はほとんど染まっていない。
図４ｂは、同じ組織を、AG107抗体を用いて染めたものを示す。AG107抗体は通常のGlcNAc-6-硫酸化糖鎖一般と反応するため、aとは逆に癌組織（Ｃａ）よりも非癌大腸組織（Ｎ）のほうがずっとよく抗体に染まっており、GlcNAc-6-硫酸化糖鎖というだけでは癌を特異的に検出することができないことを示している。即ち、大腸癌及び大腸腺腫に多い特定のGlcNAc-6-硫酸化糖鎖の分子種を検出するMECA-79のような抗体を用いたときにのみ特異的な検出が可能である。
図４ｃは右半由来の大腸癌組織における発現例を示す。癌組織が強染しており、極めて強い発現があることがわかる。
図４ｄは大腸腺腫性ポリープにおける発現を示す。Nは非腺腫大腸組織、Aは腺腫細胞を示す。Aで示す腺腫の部分がMECA-79抗体によってよく染まっている。癌でなくて腺腫性ポリープでも、 MECA-79で検出されるGlcNAc-6-硫酸化糖鎖が多量に出現していることを示す。良性疾患でありながら大腸癌の発生母地とされる腺腫性ポリープを確実に検査できることが分かる。
本実施例では、大腸癌患者の糞便抽出液に対してMECA-79抗体を用いた酵素免疫測定によってほんとうに患者糞便中にこうしたGlcNAc-6-硫酸化糖鎖が出現しているかどうかを簡易な定性法により確認した。糖鎖抗原によっては糞便中細菌の分泌する酵素によって分解を受け、糞便中に検出されないおそれがあるためであり、この点の確認は本発明の実施可能性を考える上で重要である。
ヒト便0.1ｇを便抽出バッファー(10 mM PBS, 1% BSA, pH 7.5)１ml中に分散後、4℃、8000g、15分間遠心分離を行い、得られた上清40μLに同バッファー120μL加えサンプルとした。これをPVDF膜 (Immobilon、ミリポア、Lot K2JN2659B)に吸引ブロットし、非特異反応をブロックしたのち、MECA-79抗体、ウサギ抗ラットIgM抗体、POD標識-ヤギ抗ウサギIgG抗体、アビジン−ビオチン複合体溶液を順次反応させ、NTB基質液にて発色させた。
その結果を図５に示す。大腸癌症例8例中4例(50%)、大腸腺腫症例8例中4例(50%)に陽性であり、良性疾患では1例に弱い陽性を認めるのみで、健常人はほぼ全例陰性であった。
ヒト便0.1ｇを便抽出バッファー(10 mM PBS, 1% BSA, pH 7.5)１ml中に分散後、4℃、8000g、15分間遠心分離を行い、得られた上清40μLに同バッファー120μL加えサンプルとした。これをPVDF膜 (Immobilon、ミリポア、Lot K2JN2659B)に吸引ブロットし、非特異反応をブロックしたのち、MECA-79抗体、ウサギ抗ラットIgM抗体、POD標識-ヤギ抗ウサギIgG抗体、アビジン−ビオチン複合体溶液を順次反応させ、NTB基質液にて発色させた。
その結果を図５に示す。大腸癌症例8例中4例(50%)、大腸腺腫症例8例中4例(50%)に陽性であり、良性疾患では1例に弱い陽性を認めるのみで、健常人はほぼ全例陰性であった。
Claims (10)
- 被検者の組織、体液若しくは糞便又はこれらの抽出物に対する抗体の反応性の有無又は反応強度を検査することから成る大腸癌及び大腸腺腫の検査方法であって、該抗体が、GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を発現する細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を発現する細胞には存在しないか又は微量にしか存在しない抗原と特異的に反応することを特徴とする検査方法。
- 前記抗原が、GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞には存在しないか又は微量にしか存在しない請求項１に記載の検査方法。
- 前記抗原が下記一般式
R1-Galβ1-3/4(SO3-6)GlcNAcβ1-R2
（式中、R1は他の酵素群によって付加される糖残基であり特に構造は限定されない。Galβはβガラクトースを表し、GlcNAcβはβN-アセチルグルコサミンを表し、Galβ1−3/4は、Galβの1位とGlcNAcβの3位及び／又は4位とが結合することを示し、(SO3-6)はGlcNAcβの6位に硫酸基が付加していることを示し、R2は−3GalNAcα、−3Galβ又は−2Manαを表し、GlcNAcβの1位に結合する。）で表される糖鎖を有する請求項１又は２に記載の検査方法。 - 前記抗体がMECA-79抗体（ファーミンジェン社カタログ番号09961D）である請求項１〜３に記載の検査方法。
- 被検者の組織、体液若しくは糞便又はこれらの抽出物に対する、MECA-79抗体又はこれの同等物の反応性を検査することから成る大腸癌及び大腸腺腫の検査方法。
- 前記抗体に標識を付したプローブを反応させ、この標識を定性的又は定量的に検出することから成る請求項１〜５のいずれか一項に記載の検査方法。
- GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を発現する細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を発現する細胞には存在しないか又は微量にしか存在しない糖鎖を有する抗原と特異的に反応する抗体(但し、MECA-79抗体を除く。)。
- GlcNAc-6-硫酸基転移酵素HEC-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞に存在し、GlcNAc6ST-1又はI-GlcNAc6ST遺伝子を導入した細胞には存在しないか又は微量にしか存在しない糖鎖を有する抗原と特異的に反応する抗体(但し、MECA-79抗体を除く。)。
- 大腸癌又は大腸腺腫患者の組織、体液若しくは糞便中に存在し、下記一般式
R1-Galβ1-3/4(SO3-6)GlcNAcβ1-R2
（式中、R1は他の酵素群によって付加される糖残基であり特に構造は限定されない。Galβはβガラクトースを表し、GlcNAcβはβN-アセチルグルコサミンを表し、Galβ1−3/4は、Galβの1位とGlcNAcβの3位及び／又は4位とが結合することを示し、(SO3-6)はGlcNAcβの6位に硫酸基が付加していることを示し、R2は−3GalNAcα、−3Galβ又は−2Manαを表し、GlcNAcβの1位に結合する。）で表される糖鎖を有する抗原と特異的に反応する抗体(但し、MECA-79抗体を除く。)。 - MECA-79抗体又は請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗体を主成分とする大腸癌及び大腸腺腫の検査薬。
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