ES2950740T3 - Medios y métodos para el glicoperfilado de una proteína - Google Patents

Medios y métodos para el glicoperfilado de una proteína Download PDF

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Abstract

La presente invención proporciona portadores magnéticos, anticuerpos antiglicoproteína, sus porciones de unión a antígeno, una o más lectinas, composiciones, kits, métodos y usos basados en los mismos, incluidos usos en métodos para glicoperfilado de glicoproteínas usando lectinas, por ejemplo, en diagnóstico de cáncer. Los portadores magnéticos, los anticuerpos antiglicoproteína, sus porciones de unión a antígeno, una o más lectinas, composiciones, kits, métodos y usos basados en los mismos son aplicables a cualquier glicoproteína. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Medios y métodos para el glicoperfilado de una proteína
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para determinar el perfil de glicosilación de una proteína, a métodos para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria, así como a usos de kits para realizar dichos métodos de diagnostico
Antecedentes de la invención
El análisis del Antígeno Prostático Específico (PSA) revolucionó el escrutinio del cáncer de próstata (CaP), ya que un nivel elevado de PSA en suero puede preceder al diagnóstico clínico de la enfermedad del CaP entre 5 y 10 años o incluso más. Sin embargo, el PSA también está elevado en muchas afecciones benignas, lo que da como resultado una gran cantidad de pruebas de PSA falsas positivas. Además, el PSA no discrimina tumores significativos e insignificantes. Por lo tanto, en un subgrupo significativo de pacientes diagnosticados de CaP, la enfermedad será de crecimiento lento y clínicamente inofensiva. Estos pacientes están expuestos al riesgo de efectos secundarios de un tratamiento innecesario. Por lo tanto, el problema principal del escrutinio de CaP basado en PSA son los exámenes innecesarios, además de costosos, y engorrosos para el paciente (p. ej., generación de imágenes, biopsias de próstata, etc.). Por estas razones, el Grupo de Trabajo de Servicios Preventivos de los Estados Unidos (USPSTF, por sus siglas en inglés) sugirió no utilizar el PSA para el escrutinio del CaP en 2012. La misma agencia emitió en 2017 una guía para utilizar el PSA para el escrutinio del CaP de forma individual para hombres de 55 a 69 años.
Kuno et al. (2009), en Molecular and Cellular Proteomics, 8.1:99-108, divulgan un análisis diferencial de glicanos dirigido con una plataforma de perfiles de lectina asistida por anticuerpos para la verificación de biomarcadores relacionados con los glicanos. Meany et al. (2011), en Journal of Proteome Research, 10(3):1425-1431, divulgan una amplificación de señal de tiramida para micromatriz de lectina con exceso de anticuerpo. Fujita et al. (2014), en Prostate, 74(10):1052-1058, divulgan haptoglobina fucosilada en suero como un nuevo biomarcador de pronóstico que predice el cáncer de próstata con alto Gleason. Hakomori et al. (2010), International Journal of Oncology, 36(1): 193­ 203, divulgan el estado de N-glicosilación de la p-haptoglobina en sueros de pacientes con cáncer de próstata frente a enfermedades benignas de la próstata. El documento US 2007/178538 A1 divulga métodos para medir los niveles de glicano de proteínas.
Entre los pacientes con CaP diagnosticados después de una prueba de escrutinio de PSA moderadamente positiva (4-10 ng/ml), casi 75% de los tumores están limitados al órgano y son potencialmente curables, mientras que para los pacientes con un nivel de PSA superior a 10 ng/ml, la proporción de tumores limitados al órgano y CaP curable cae por debajo de 50%. Por lo tanto, detectar CaP curable con alta especificidad (evitando procedimientos de examen de seguimiento innecesarios) es un desafío diagnóstico. Además, el sobrediagnóstico/sobretratamiento puede provocar complicaciones, incluyendo incontinencia urinaria, disfunción sexual y problemas intestinales en pacientes con CaP inofensivo. Por lo tanto, una prueba de escrutinio mejorada también debería permitir clasificar los tumores según su importancia clínica.
Es escrutinio de CaP generalmente se recomienda para hombres mayores de 55 años mediante la medición de PSA en el suero. Los métodos existentes utilizados por los laboratorios clínicos en todo el mundo no son lo suficientemente sensibles y específicos, por lo que en muchos casos es muy difícil identificar correctamente a las personas sanas de los pacientes con CaP en un estadio inicial y potencialmente curable. Por lo tanto, los médicos/urólogos necesitan nuevos biomarcadores diagnósticos de CaP.
Compendio de la invención
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención se refiere a un método para determinar el perfil de glicosilación de una proteína, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprende dicha proteína con un anticuerpo dirigido contra dicha proteína para formar un complejo anticuerpo-proteína; (b) aislar el complejo anticuerpo-proteína obtenido en la etapa (a); y (c) poner en contacto el complejo anticuerpo-proteína con una o más lectinas para determinar el perfil de glicosilación de dicha proteína, en donde dicho anticuerpo de la etapa (a) no se inmoviliza sobre una superficie sólida, y dicha proteína no se libera de dicho anticuerpo mientras se realiza el método.
La presente invención además se refiere a un método para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir cáncer, que comprende
(a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto, comprendiendo dicha muestra una proteína biomarcadora de cáncer, con un anticuerpo dirigido contra dicha proteína biomarcadora de cáncer para formar un complejo anticuerpo-proteína biomarcadora de cáncer; y
(b) aislar el complejo anticuerpo-proteína obtenido en la etapa (a); y
(c) poner en contacto el complejo anticuerpo-proteína biomarcadora de cáncer con una o más lectinas para determinar el perfil de glicosilación de dicha proteína biomarcadora de cáncer,
en donde una desviación de dicho perfil de glicosilación del perfil de glicosilación saludable de dicha proteína biomarcadora de cáncer es indicativa de que dicho sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir cáncer, en donde dicho anticuerpo de la etapa (a) no está inmovilizado sobre una superficie sólida, y dicha proteína no se libera de dicho anticuerpo mientras se realiza el método.
La presente invención también se refiere a un método para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir una enfermedad autoinmunitaria, que comprende
(a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto, comprendiendo dicha muestra una proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria, con un anticuerpo dirigido contra dicha proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria para formar un complejo anticuerpo-proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria; y
(b) aislar el complejo anticuerpo-proteína obtenido en la etapa (a); y
(c) poner en contacto el complejo anticuerpo-proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria con una o más lectinas para determinar el perfil de glicosilación de dicha proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria,
en donde una desviación de dicho perfil de glicosilación del perfil de glicosilación saludable de dicha proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria es indicativa de que dicho sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir una enfermedad autoinmunitaria, en donde dicho anticuerpo de la etapa (a) no está inmovilizado sobre una superficie sólida, y dicha proteína no se libera de dicho anticuerpo mientras se realiza el método.
La presente invención se refiere por otra parte a un método para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir una enfermedad inflamatoria, que comprende
(a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto, comprendiendo dicha muestra una proteína biomarcadora de enfermedad inflamatoria, con un anticuerpo dirigido contra dicha proteína biomarcadora de enfermedad inflamatoria para formar un complejo anticuerpo-proteína biomarcadora inflamatoria; y
(b) aislar el complejo anticuerpo-proteína obtenido en la etapa (a); y
(c) poner en contacto el complejo anticuerpo-proteína biomarcadora inflamatoria con una o más lectinas para determinar el perfil de glicosilación de dicha proteína biomarcadora de enfermedad inflamatoria,
en donde una desviación de dicho perfil de glicosilación del perfil de glicosilación saludable de dicha proteína biomarcadora de enfermedad inflamatoria es indicativa de que dicho sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir una enfermedad inflamatoria, donde dicho anticuerpo de la etapa (a) no está inmovilizado sobre una superficie sólida, y dicha proteína no se libera de dicho anticuerpo mientras se realiza el método.
Además, la presente divulgación proporciona un kit para realizar el método de determinación del perfil de glicosilación de una proteína como se describe en el presente documento, que comprende un anticuerpo específico para dicha proteína como se describe en el presente documento y una lectina como se describe en el presente documento.
Asimismo, la presente invención proporciona el uso de un kit para realizar el método para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir cáncer, que comprende un anticuerpo específico para una proteína biomarcadora de cáncer como se describe en el presente documento y una o más lectinas como se describe en el presente documento.
Además, la presente invención proporciona el uso de un kit para realizar el método para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir una enfermedad autoinmunitaria, que comprende un anticuerpo específico para una proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria que es IgG y una o más lectinas como se describe en el presente documento.
Por otra parte, la presente invención proporciona el uso de un kit para realizar el método para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir una enfermedad inflamatoria, que comprende un anticuerpo específico para una proteína biomarcadora inflamatoria que es IgG, IgA o PCR y una o más lectinas como se describe en el presente documento.
La presente divulgación se refiere adicionalmente a un portador magnético que comprende: i) un anticuerpo antiglicoproteína inmovilizado o la porción de unión a antígeno del mismo y ii) un polipéptido inmovilizado que tiene actividad peroxidasa, en donde dicho polipéptido inmovilizado que tiene actividad peroxidasa tiene un peso molecular de menos de 2 kDa. La presente divulgación se refiere adicionalmente a un anticuerpo anti-glicoproteína o la porción de unión a antígeno del mismo inmovilizados sobre un portador magnético, en donde dicho portador magnético comprende adicionalmente un polipéptido que tiene actividad peroxidasa inmovilizado sobre dicho portador magnético, en donde dicho polipéptido tiene un peso molecular inferior a 2 kDa.
Otras lectinas adecuadas (incluidas las formas maduras y procesadas postraduccionalmente de las mismas) dentro del significado de la presente invención incluyen, adicionalmente:
Aglutinina (SNA-I) específica de Neu5Ac(a2-6)Gal/GalNAc (a2-6Neu5Ac) de Sambucus nigra, Número de acceso UniProtKΒ: Q945S3.
Aglutinina de Agaricus bisporus (ABA) que se une a Galp1-3GalNAc , número de acceso UniProtKΒ: Q00022. Aglutinina de Allomyrina dichotoma (AlloA) que se une a Neu5Aca2-3Galp1-4GlcNAc, sin número de acceso UniProtKΒ actualmente disponible, pero que, por ejemplo, se puede purificar como describen Umetsu et al., 1984, es decir, mediante un método de purificación que comprende cromatografía de afinidad sobre agarosa (Sepharose) en forma de cuentas entrecruzadas tratadas con ácido y cuentas de dietilaminoetanol- celulosa esféricas (DEAE-Cellulofine).
Aglutinina de Amaranthus caudatus (ACA) que se une a Galp1 -3GalNAc, número de acceso UniProtKΒ: Q6YNX3 o Q71QF2.
Aglutinina de Arachis hypogaea (AHA) que se une a Galp1-3GalNAc = Aglutinina de cacahuete (PNA), Número de acceso UniProtKΒ: P02872.
Aglutinina de Artocarpus integrifolia (AIA) que se une a Galp1-3GalNAc = Jacalina, Número de Acceso UniProtKΒ: P18670.
Lectina de Aspergillus oryzae (AOL) que se une a fucosa, número de acceso UniProtKΒ: Q2UNX8.
Lectina de Musa paradisíaca (BanLec) que se une a manosa/glucosa, Número de acceso UniProtKΒ: Q8L5H4 (p. ej., también disponible en el banco de datos de proteínas RCSB (https://www.rcsb.org) con el código de acceso PDB 1X1V; Fecha de publicación: 08-11-2005; Versión 1.2: 13-07-2011, también mencionado por Singh et al., 2005).
Aglutinina de Datura stramonium (Jacalina) que se une a (GlcNAcp1-4)2-4, Galp1-4GlcNAc (DSA), número de acceso UniProtKΒ: A0A089ZWN7.
Aglutinina de Dolichos biflorus (DBA) que se une a GalNAca1-3GalNAc, número de acceso UniProtKΒ: P05045 o P19588.
Lectina de Erythrina cristagalli (ECL) que se une a Galp4GlcNAc, Número de Acceso UniProtKΒ: P83410. Galectina 3 que se une a galactosa, número de acceso UniProtKΒ: P17931.
Galectina 4 que se une a galactosa y lactosa, número de acceso UniProtKΒ: P56470.
Lectina I de Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia (GSL I) que se une a a-GalNAc, a-Gal, Número de Acceso UniProtKΒ: P24146.
Lectina II de Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia (GSL II) que se une a a-GlcNAc, p-GlcNAc y GlcNAca1-4Galp1-4GlcNAc, Número de Acceso UniProtKΒ: Q41263.
Lectina de Hippeastrum hybrid (Amaryllis) (HHL) que se une a a-manosa, Número de Acceso UniProtKΒ: Q39990.
Aglutinina de Helix pomatia (HPA) que se une a a-GalNAc y GalNAcp1-4Gal, número de acceso UniProtKΒ: Q2F1K8.
Lectina de Lycopersicon esculentum (tomate) (LEL) que se une a (GlcNAcp-4)1-4, número de acceso UniProtKΒ: G9M5T0 o B3XYC5.
Aglutinina de Lens culinaris (LCA) específica de D-manosa o Fuca1-6GlcNAc-N-Asn que contiene oligosacáridos unidos a N, Número de Acceso UniProtKΒ: P02870.
Lectina de Lotus tetragonolobus (LTA) específica de Fuca1-2Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAc, Número de Acceso UniProtKΒ: P19664.
Aglutinina I de Maackia amurensis (MAA I) específica de Galp1-4GlcNAc, número de acceso UniProtKΒ: P0DKL3.
Lectina 1 que se une a galactosa de macrófagos (MGBL 1) que se une a Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc y Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAc, número de acceso UniProtKΒ: P49300.
Lectina 2 que se une a galactosa de macrófagos (MGBL 2) que se une a GalNAc y galactosa, número de acceso UniProtKΒ: A9XX86.
Lectina de Narcissus pseudonarcissus (Narciso) (NPA) que se une a a-manosa, Número de Acceso UniProtKΒ: Q40423.
Aglutinina de Phaseolus lunatus (judía de lima, LBA) que se une a GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Gal, Número de Acceso UniProtKΒ: P16300.
Aglutinina E de Faseolus vulgaris (PHA E) que se une a bi-antenario unido a N, Número de Acceso UniProtKΒ: P05088.
Aglutinina L de Faseolus vulgaris (PHA L) que se une a tri/tetra-antenario unido a N, Número de Acceso UniProtKΒ: P05087.
Lectina de Pholiota squarrosa (PhoSL) específica de Fuca1 -6 purificada como describen Kobayashi et al., 2012 (p. ej., también SEQ ID NO: 58 en el presente documento), sin número de acceso UniProtKΒ actualmente disponible.
Aglutinina de Phytolacca americana (PWM) que se une a GicNAc , número de acceso UniProtKΒ: Q9AVB0. Lectina de Pisum sativum (PSL) que se une a a-manosa, a-glucosa o Fuca1-6GlcNAc, número de acceso UniProtKΒ: P02867.
Lectina I de Psophocarpus tetragonolobus (PTA I) que se une a GalNAc o galactosa, Número de Acceso UniProtKΒ: O24313.
Lectina II de Psophocarpus tetragonolobus (PTA II) que se une a GalNAc o galactosa, Número de Acceso UniProtKΒ: Q9SM56.
Aglutinina I de Ricinus communis (RCA I) que se une a galactosa, Número de Acceso UniProtKΒ: P06750. Aglutinina II de Ricinus communis (RCA II) que se une a galactosa y GalNAc, número de acceso UniProtKΒ: B9SPG3.
Lectina 1 similar a inmunoglobulina que se une a ácido siálico (Siglec 1), unión preferencial de Neu5Aca2-3Galp1-4Glc/GlcNAc sobre Neu5Aca2-6Galp1-4Glc/GlcNAc por Siglec 1, número de acceso UniProtKΒ: Q9BZZ2. Lectina 4 similar a inmunoglobulina que se une a ácido siálico (Siglec 4), unión preferencial de Neu5Aca2-3Galp1 -4Glc/GlcNAc sobre Neu5Aca2-6Galp1-4Glc/GlcNAc por Siglec 4, número de acceso UniProtKΒ: P20916. Lectina 8 similar a inmunoglobulina que se une a ácido siálico (Siglec 8), unión preferencial de Neu5Aca2-3Galp1-4Glc/GlcNAc sobre Neu5Aca2-6Galp1-4Glc/GlcNAc por Siglec 8, número de acceso UniProtKΒ: Q9NYZ4. Lectina 11 similar a inmunoglobulina que se une al ácido siálico (Siglec 11), unión preferencial de Neu5Aca2-8Neu5Ac (ácido polisiálico) por Siglec 11, número de acceso UniProtKΒ: Q96RL6.
Aglutinina de soja (SBA) que se une a GalNAca1-3GalNAc, número de acceso UniProtKΒ: P05046.
Aglutinina de Sophorajaponica (SJA) que se une a pGalNAc, Número de Acceso UniProtKΒ: P93535.
Aglutinina de Sambucus sieboldiana (SSA) que se une a Neu5Ac(a2-6)Gal/GalNAc, purificada como describen Kaku et al., 1996 (p. ej., también SEQ ID NO: 59 en el presente documento), sin número de acceso UniProtKΒ actualmente disponible.
Lectina de Salvia esclarea que se une a GalNAc, purificada como describen Wu AM., 2005; sin número de acceso UniProtKΒ actualmente disponible.
Aglutinina de Triticum vulgaris (TVA) que se une a (GlcNAcp1-4)2-5 y Neu5Ac = aglutinina de germen de trigo WGA, número de acceso UniProtKΒ: P02876, P10968 o P10969.
Aglutinina de Ulex europaeus (UEA) que se une a Fuca1-2Gal, número de acceso UniProtKΒ: P22972.
Lectina de Vicia villosa (VVL) que se une a GalNAc-serina, Número de Acceso UniProtKΒ: P56625.
Las lectinas se pueden aislar y opcionalmente purificar utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, cuando se aísla de su fuente natural, la lectina se puede purificar hasta la homogeneidad en matrices de carbohidratos inmovilizados apropiadas y eluir con los haptenos apropiados. Véanse, Goldstein & Poretz (1986) en The lectins. Properties, functions and applications in biology and medicine (ed. Liener et al.), pág. 33-247. Academic Press, Orlando, Fla.; Rudiger (1993) en Glycosciences: Status and Perspectives (ed. Gabius & Gabius), pág. 415-438. Chapman y Hall, Weinheim, Alemania. Alternativamente, la lectina se puede producir mediante métodos recombinantes según métodos establecidos. Véase Streicher & Sharon (2003) Methods Enzymol. 363:47-77. Como otra alternativa más, las lectinas pueden generarse utilizando tecnología convencional de síntesis de péptidos o utilizando métodos de escisión química bien conocidos en la técnica basados en las secuencias de aminoácidos de lectinas conocidas o la lectina divulgada en el presente documento (p. ej., documento US 9169327 B2). Otra alternativa, pueden ser las lectinas artificiales preparadas por modificación química de cualquiera de las lectinas especificadas anteriormente (véase Y.W. Lu, C.W. Chien, P.C. Lin, L. D. Huang, C.Y. Chen, S.W. Wu, C.L. Han, K. H. Khoo, C.C. Lin, Y.J. Chen, BAD-Lectins: Boronic Acid-Decorated Lectins with Enhanced Binding Affinity for the Selective Enrichment of Glycoproteins, Analytical Chemistry, 85 (2013) 8268-8276).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: PSA con la composición de glicanos (A) de hombres sanos y de (B) pacientes con CaP (se muestra una de muchas estructuras de glicanos posibles diferentes). Protocolo de ensayo para la detección de (C) nivel de PSA, (D) glicoperfilado de PSA en formato ELLA, (E) glicoperfilado de PSA en formato MELLA (es decir, ELLA magnético). Abreviaturas: PSA - antígeno prostático específico; Ab1: el anticuerpo anti-PSA 1 se marca con peroxidasa de rábano picante (HRP); Ab2 - anticuerpo anti-PSA 2, L - lectina, HRP - peroxidasa de rábano picante.
Figura 2: ROC para glicoperfilado de PSA en formato ELLA magnético frente a PSA en formato ELISA con dos lectinas diferentes: AAL (izquierda), Con A (derecha); Muestras de HPB frente a CaP.
Figura 3: ROC para glicoperfilado de PSA en formato ELLA magnético frente a PSA en formato ELISA con dos lectinas diferentes: MAA-II (izquierda) y SNA-I (derecha); Muestras de HPB frente a CaP.
Figura 4: ROC para glicoperfilado de PSA en formato ELLA magnético frente a PSA en formato ELISA con lectina WFA (izquierda) y cuatro lectinas diferentes: AAL (predictor negativo), Con A (predictor negativo), MAA-II (predictor positivo) y SNA-I (predictor negativo); Muestras de HPB frente a CaP.
Figura 5: ROC para glicoperfilado de PSA en formato ELLA magnético vs. PSA utilizando biomarcadores dobles. Muestras de HPB frente a CaP.
Figura 6: ROC para glicoperfilado de PSA en formato ELLA magnético vs. PSA utilizando biomarcadores triples. Muestras de HPB frente a CaP.
Figura 7: ROC para glicoperfilado de PSA en formato ELLA magnético frente a PSA utilizando biomarcadores únicos (AAL y Con A). Muestras de CaP- frente a CaP+.
Figura 8: ROC para el glicoperfilado de PSA en formato ELLA magnético frente a PSA utilizando biomarcadores únicos (MAA II y SNA-I). Muestras de CaP- frente a CaP+. CaP- significa cáncer de próstata sin metástasis y CaP+ significa cáncer de próstata con metástasis.
Figura 9: Diagramas de caja que muestran la capacidad de diferenciar dos biomarcadores diferentes (PSA y MAA) en varios tipos de muestras, incluidas HPB, CaP+, CaP- y CaP (CaP+ y CaP- combinados). CaP- significa cáncer de próstata sin metástasis y CaP+ significa cáncer de próstata con metástasis.
Figura 10: Gráficos de caja que muestran la capacidad de diferenciar muestras con biomarcador PSA en varios tipos de muestras, incluidas HPB, CaP+, CaP- y CaP (combinación de CaP+ y CaP-). CaP- significa cáncer de próstata sin metástasis y CaP+ significa cáncer de próstata con metástasis.
Figura 11: Curva ROC para el análisis de muestras de suero humano para distinguir pacientes con HPB (hiperplasia prostática benigna) de pacientes con CaP (cáncer de próstata) utilizando partículas magnéticas (PM) sin anticuerpos inmovilizados.
Figura 12: Curva ROC para el análisis de muestras de suero humano para distinguir pacientes con HPB de pacientes con CaP utilizando partículas magnéticas con anticuerpos inmovilizados y con PSA liberado de las PM para el subsiguiente glicoperfilado basado en lectina.
Figura 13: Curva ROC para el análisis de muestras de suero humano para distinguir pacientes con HPB de pacientes con CaP utilizando anticuerpos inmovilizados sobre placas de ELISA con glicoperfilado posterior basado en lectina.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Las abreviaturas de carbohidratos empleadas en el presente documento incluyen: "Neu5Ac" para ácido nacetilneuramínico; "Fuc" para fucosa, "GalNAc" para n-acetilgalactosamina; "GIcNAc" para N-acetilglucosamina; "Gal" para galactosa (p. ej., Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, Hart GW, E. ME., Essentials of Glycobiology, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (NY), 2009).
Además, tal como se emplean en el presente documento, los siguientes términos se definen a continuación:
"fucosa del núcleo" significa que la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C6 de la N-acetilglucosamina,
"fucosa antenaria" significa que la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina o la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C2 de la fucosa vecina,
"Fuca1-6GlcNAc-N-Asn que contiene oligosacáridos unidos a N': significa oligosacáridos que tienen fucosa conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C6 de la N-acetilglucosamina, que está conectada a la asparragina a través de enlace N-glicosídico,
"Fuca1 -6/3GlcNAc" significa que la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C6 (C3) de la N-acetilglucosamina,
"a-L-Fuc" significa a-L-fucosa,
"Fuca1 -2Galp1 -4(Fuca1 -3)GlcNAc" significa que la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C2 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la segunda fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina,
"Fuca1 -2Gal" significa que la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C2 de la galactosa,
"Fuca1-6GlcNAc" significa que la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C6 de N-acetilglucosamina,
"Manp1 -4GlcNAcp1 -4GlcNAc" significa que la manosa está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina, que está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina,
"hexa-sacárido unido a N' significa glicano no lineal compuesto por seis carbohidratos conectados a asparragina por un enlace N-glicosídico
"Mana1-3Man" significa que la manosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la manosa,
"a-D-Man" significa a-D-manosa,
"(GlcNAcp1-4)2-4" significa que la N-acetilglucosamina está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina repetidamente,
"Galp1-4GlcNAc" significa que la galactosa está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina,
"GlcNAca1-4Galp1-4GlcNAc" significa que la N-acetilglucosamina está conectada a través de un enlace aglicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina,
"N-acetilglucosamina" significa la amida entre glucosamina y ácido acético,
"(GlcNAcp1-4)2-5" significa que la N-acetilglucosamina está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de N-acetilglucosamina repetidamente,
"Neu5Ac" (o ácido siálico) significa ácido N-acetilneuramínico,
"Galp1-3GalNAc-serina/treonina" significa que la galactosa está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina, que está conectada a serina/treonina,
"Gala1-3GalNAc" significa que la galactosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de N-acetilgalactosamina,
"Galp1-6Gal" significa que la galactosa está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C6 de la galactosa,
"Galp1-4GlcNAc" significa que la galactosa está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de N-acetilglucosamina,
"Galp1-3GalNAc" significa que la galactosa está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de N-acetilgalactosamina,
"GalNAca1-3GalNAc" significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilgalactosamina,
"GalNAca1-3Gal" significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la galactosa,
"GalNAca/p1-3/4Gal" significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a través de un enlace a- o pglicosídico de su átomo C1 al átomo C3 o C4 de la galactosa,
"a-GalNAc" significa la amida entre a-galactosamina y ácido acético,
"GalNAcp1-4Gal" significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la galactosa,
"GalNAca1-3(Fuca1-2)Gal" significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a través de un enlace aglicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de galactosa, al mismo tiempo que la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C2 de la galactosa,
"GalNAca1-2Gal" significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la galactosa,
"GalNAca1-3GalNAc" significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de N-acetilgalactosamina,
"GalNAcp1-3/4Gal" significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 o C4 de la galactosa,
"GalNAc-Ser/Thr" (o antígeno Tn) significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a la serina/treonina a través de un enlace O-glicosídico,
"Galp1-3GalNAc-Ser/Thr" (antígeno T o antígeno de Thomsen-Friedenreich) significa que la galactosa está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de N-acetilgalactosamina, que está conectada a serina/treonina a través de un enlace O-glicosídico,
"GalNAcp1-4GlcNAc" (o LacdiNAc) significa que la N-acetilgalactosamina está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina,
"a2-3Neu5Ac" (o ácido siálico conectados por a2-3) significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C3 de un sacárido vecino,
"a2-6Neu5Ac" (o ácido siálico conectado por a2-6) significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C6 de un sacárido vecino,
"a2-8Neu5Ac" (o ácido siálico conectado por a2-8) significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C8 de un N-ácido acetilneuramínico vecino, "Neu5Aca4/9-O-Ac-Neu5Ac" significa que el ácido N- acetilneuramínico está conectado a través de un enlace aglicosídico de su átomo C4 al átomo C9 de un ácido O-acetil N-acetilneuramínico vecino,
"Neu5Aca2-3Galp1-4Glc/GlcNAc" significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C3 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace pglicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la glucosa o la N-acetilglucosamina,
"Neu5Aca2-6Gal/GalNAc" significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace aglicosídico de su átomo C2 al átomo C6 de la galactosa o la N-acetilgalactosamina,
"bi-antenario unido a W significa glicano no lineal con dos antenas (cadenas de carbohidratos) conectadas a la asparragina por un enlace N-glicosídico,
"tri/tetra-antenario unido a W significa glicano no lineal con tres/cuatro antenas (cadenas de carbohidratos) conectadas a la asparragina por N-enlace glicosídico,
"p1 -6GlcNAc ramificado" significa que la N-acetilglucosamina está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C6 del sacárido vecino,
"Gala1-3(Fuca1-2)Galp1-3/4GlcNAc" significa que la galactosa está conectada a través de un enlace aglicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 o C4 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C2 de la N-acetilglucosamina,
"Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc" significa que la galactosa está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina,
"NeuAca2-3Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc" significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C3 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace pglicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina,
"Fuca1 -2Galp1-3(Fuca1 -4)GlcNAc" significa que la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C2 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la segunda fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina,
"Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAc" significa que la galactosa está conectada a través un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina,
"NeuAca2-3Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAc" significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C3 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace pglicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina,
"Fuca1 -2Galp1-4(Fuca1 -3)GlcNAc" significa que la fucosa está conectada a través un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C2 de la galactosa, que está conectada a través un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la segunda fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina,
"alto contenido de manosa" significa glicano que contiene más de tres unidades de manosa,
el antígeno "sialil Lewisa" (sialil Lea) es Neu5Aca2-3/6Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc, lo que significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C3 o C6 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina,
el antígeno "sialil LewisX" (sialil LeX) es Neu5Aca2-3/6Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAc, lo que significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C3 o C6 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina,
el antígeno "LewisX" (LeX) es "Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAc", lo que significa que la galactosa está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina,
el "antígeno sialil Tn" es "Neu5Aca2-3/6GalNAc-Ser/Thr" lo que significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C3 o C6 de la N-acetilgalactosamina, que está conectada a serina/treonina a través de un enlace O-glicosídico,
el "antígeno sialil T" es "Neu5Aca2-3/6Galp1 -3GalNAc-Ser/Thr" lo que significa que el ácido N-acetilneuramínico está conectado a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C2 al átomo C3 o C6 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilgalactosamina, que está conectada a serina/treonina a través de un enlace O-glicosídico,
el antígeno "Lewisy" " (Ley) es "Fuca1 -2Galp1-4(Fuca1 -3)GlcNAc", lo que significa que la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C2 de la galactosa, que está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo de C4 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la segunda fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina,
"glicano del núcleo 1 sulfatado" es un glicano basado en la forma extendida sulfatada del antígeno T,
"glicano del núcleo 2" es un glicano basado en una forma extendida de Galp1 -3(GlcNAcp1-6)GalNAc-Ser/Thr lo que significa una forma extendida de glicano que tiene galactosa conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilgalactosamina, al mismo tiempo la N-acetilglucosamina está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C6 de la N-acetilgalactosamina, que está conectada a serina/treonina
"Lewisa" (Lea) el antígeno es Galp1-3(Fuca1 -4)GlcNAc, lo que significa que la galactosa está conectada a través un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la N-acetilglucosamina; al mismo tiempo, la fucosa está conectada a través de un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina, "(GlcNAcp1-4)n" significa que la N-acetilglucosamina está conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina repetidamente,
"p-D-GIcNAc" significa la amida entre p-D-glucosamina y ácido acético,
"GalNAc" significa la amida entre galactosamina y ácido acético,
"Gal-GlcNAc" significa que la galactosa está conectada a la N-acetilglucosamina a través de una conexión no especificada,
"GIcNAc" significa la amida entre glucosamina y ácido acético.
"Gala1 -3Gal" significa que la galactosa está conectada a través un enlace a-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de la galactosa,
"Galp1-3GalNAc" significa que la galactosa está conectada a través un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C3 de N-acetilgalactosamina,
"a-Gal" significa a-galactosa,
"a-GalNAc" significa la amida entre a-D-galactosamina y ácido acético,
"(GlcNAc)n" significa que la N-acetilglucosamina está conectada a la N-acetilglucosamina a través de una conexión no especificada,
"(LacNAc)n ramificada" es una forma ramificada y repetida de Galp1,4-GlcNAc, lo que significa una forma ramificada y repetida de galactosa conectada a través de un enlace p-glicosídico de su átomo C1 al átomo C4 de la N-acetilglucosamina.
El término "glicoproteína" (o "proteína glicosilada") como se emplea en el presente documento significa una proteína que contiene uno o más carbohidratos conectados covalentemente a N, O, S o C de varios tipos, por ejemplo, que varían de monosacáridos a polisacáridos ramificados (incluidas sus modificaciones, tales como el anclaje de grupos sulfo o fosfo). Los glicanos conectados a N son carbohidratos unidos al grupo -NH2 de la asparragina. Los glicanos conectados a O son carbohidratos unidos al grupo -OH de serina, treonina o aminoácidos hidroxilados. Los glicanos conectados a S son carbohidratos unidos al grupo -SH de la cisteína. Los glicanos conectados a C son carbohidratos unidos a triptófano a través de enlace C-C.
El término "carbohidratos" significa compuestos (p. ej., tales como aldosas y cetosas) que tienen la fórmula estequiométrica Cn(H2O)n. El término genérico "carbohidrato" incluye monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos, así como sustancias derivadas de monosacáridos por reducción del grupo carbonilo (alditoles), por oxidación de uno o más grupos terminales a ácidos carboxílicos, o por sustitución de uno o más grupos hidroxi por un átomo de hidrógeno, un grupo amino, un grupo tiol o grupos similares. También incluye derivados de estos compuestos. El término "perfil de glicosilación de una proteína" significa una estructura de carbohidrato de una proteína, p. ej., composición y/o estructura de carbohidratos conectados covalentemente, p. ej., cantidad, presencia o ausencia de carbohidratos conectados covalentemente.
El término "glicoperfilar" significa determinar la estructura de un carbohidrato (p. ej., composición y/o estructura de carbohidratos conectados covalentemente, p. ej., cantidad, presencia o ausencia de carbohidratos conectados covalentemente) de un producto glicoconjugado, tal como una glicoproteína, un glicolípido o un proteoglicano.
El término "DART" significa anticuerpos de redireccionamiento de doble afinidad, que son moléculas biespecíficas basadas en anticuerpos que pueden unirse a 2 moléculas distintas de la superficie celular simultáneamente (p. ej., Sung JAM et al., 2015).
El término "adnectina" (o "monoanticuerpo") significa proteína de unión sintética capaz de unirse a antígenos, p. ej., pueden construirse utilizando un dominio de fibronectina tipo III (FN3) como armazón molecular. Los monoanticuerpos son una alternativa simple y robusta a los anticuerpos para crear proteínas que se unen a dianas.
El término "anticuerpo de dominio único" (o "nanoanticuerpo") significa un fragmento de anticuerpo que consiste en un solo dominio de anticuerpo monomérico variable.
El término "armazón de FN3" significa armazón de dominio de fibronectina tipo III (FN3) que se puede utilizar como armazón sin anticuerpo para generar proteínas de unión (p. ej., proteínas de unión a antígeno) (p. ej., Koide A. et al., 2012).
El término "aficuerpo" se refiere a una clase de proteínas de afinidad genomodificadas que pueden unirse a proteínas o péptidos diana con alta afinidad que imitan anticuerpos monoclonales y, por lo tanto, son miembros de la familia de miméticos de anticuerpos (p. ej., Lofblom J et al., 2010).
El término "anticalina" se refiere a una proteína artificial capaz de unirse a antígenos, ya sea a proteínas o a moléculas pequeñas. Las anticalinas no están estructuralmente relacionadas con los anticuerpos, lo que las convierte en un tipo de miméticos de anticuerpos. Preferiblemente, "anticalina" es una proteína derivada de una lipocalina (también conocida como proteína de unión a ácidos grasos citosólicos), que se genomodifica para modificar sus propiedades de unión. Las anticalinas tienen la ventaja de la especificidad de un anticuerpo monoclonal para moléculas lipídicas pequeñas (p. ej., esteroides, bilinas, retinoides y lípidos), una mejor penetración tisular y termoestabilidad, pero sin el gran tamaño (p. ej., son 8 veces más pequeñas) y también pueden ser producidas por lotes en E. coli, eliminando la necesidad de extracción animal.
El término "avímero" (p. ej., abreviatura de multímero de avidez) se refiere a una proteína artificial que puede unirse específicamente a antígenos a través de múltiples sitios de unión. Avímero no está relacionado estructuralmente con el anticuerpo y se clasifica como un tipo de mimético de anticuerpo.
El término "péptido cíclico" se refiere a cadenas polipeptídicas que contienen una secuencia circular de enlaces. El término "péptido bicíclico" (p. ej., tal como la amatoxina amanitina y la falotoxina faloidina) se refiere a un péptido cíclico que contiene un grupo puente (p. ej., enlace tioéter o disulfuro), generalmente entre dos de las cadenas laterales del polipéptido. En las amatoxinas, este puente se forma como un tioéter entre los restos de Trp y Cys. Otros péptidos bicíclicos incluyen equinomicina, triostina A y Celogentina C. También hay hormonas peptídicas cíclicas, que se ciclan a través de un enlace disulfuro entre dos cisteínas, por ejemplo, somatostatina y oxitocina. Por ejemplo, un método de escrutinio y producción de "péptido bicíclico" puede hacer uso de una biblioteca de fagos que presenta péptidos que contienen tres restos de Cys. Los fagos se tratan en condiciones suaves con tris-(bromometil)benceno, que reacciona con las tres cisteínas y forma dos bucles peptídicos de seis aminoácidos conectados al anillo de benceno (p. ej., Mund T et al., 2014).
El término "DARPins" (un acrónimo de "proteínas repetidas de anquirina diseñadas") se refiere a proteínas miméticas de anticuerpos modificadas genéticamente que exhiben una unión a proteínas diana altamente específica y de alta afinidad. Se obtienen a partir de proteínas anquirinas naturales, que son responsables de diversas funciones tales como la señalización celular, la regulación y la integridad estructural de la célula. Las DARPins consisten en al menos tres proteínas de motivos repetidos y, por lo general, consisten en cuatro o cinco. Su masa molecular es de aproximadamente 14 o 18 kDa (kilodaltons) para DARPins de cuatro o cinco repeticiones, respectivamente (p. ej., Plückthun A, 2015; Rasool M et al., 2017).
El término "dominio de Kunitz" se refiere a un dominio activo de una proteína capaz de inhibir la función de la enzima degradadora de proteínas (p. ej., un dominio de proteína característico de los inhibidores de la familia de serina peptidasa S1. Los ejemplos preferidos incluyen aprotinina, tripstatina, un inhibidor de la tripsina de mastocitos de rata, e inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPl).
El término "Obody" se refiere a un módulo de proteína de un solo dominio (p. ej., un armazón de un solo dominio) que puede unirse a una molécula diana específica (p. ej., proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y ligandos de moléculas pequeñas) (p. ej., Steemson JD et al. al., 2014).
El término "aptámero" se refiere a moléculas de oligonucleótidos o péptidos que se unen a una molécula diana específica.
El término "aglutinina" significa cualquier sustancia que provoque la aglutinación (es decir, la agrupación) de células, particularmente un anticuerpo específico formado en la sangre en respuesta a la presencia de un agente invasor, o lectinas que tengan tal efecto. Más específicamente, el término "aglutinina" se refiere a la proteína que se une a glicano (lectina, véase 153), cuando se emplea en el presente documento.
El término "glicano" se refiere a compuestos que consisten en monosacáridos conectados glicosídicamente y también puede referirse a la porción de carbohidrato de un producto glicoconjugado, como una glicoproteína, glicolípido o proteoglicano, incluso si el carbohidrato es solo un monosacárido o un oligosacárido.
El término "lectina", cuando se emplea en el presente documento, se refiere a una proteína que se une a carbohidratos. Una lectina puede ser altamente específica para un radical carbohidrato o radicales carbohidrato (p. ej., reacciona específicamente con restos glicosídicos terminales de otras moléculas, tales como uno o varios glicanos de una glicoproteína (p. ej., moléculas de azúcar ramificadas de glicoproteínas, p. ej., tales como polipéptidos diana dentro del significado de la presente invención y biomarcadores como se describe en la Tabla 1 del presente documento). Las lectinas con comúnmente conocidas en la técnica. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué lectina se puede utilizar para la unión a un radical carbohidrato o radicales carbohidrato de interés, p. ej., un radical carbohidrato o radicales carbohidrato de un glicano anclado a una proteína. Las lectinas preferidas aplicadas en el contexto de la presente invención se describen en el presente documento. También se incluyen en el término "lectina" las Siglecs (lectinas similares a inmunoglobulinas que se unen al ácido siálico). Notablemente, el término "lectina" cuando se emplea en el presente documento también se refiere a anticuerpos que se unen a glicanos. Por consiguiente, el término "lectina" cuando se emplea en el presente documento abarca lectinas, Siglecs así como anticuerpos que se unen a glicanos.
Un "anticuerpo", cuando se emplea en el presente documento, es una proteína que comprende uno o más polipéptidos (que comprenden uno o más dominios de unión, preferiblemente dominios de unión a antígeno) codificados de forma sustancial o parcial por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Preferiblemente, un anticuerpo que se dirige contra una proteína cuyo perfil de glicosilación se determina como se describe en el presente documento, no se dirige contra un glicano anclado a dicha proteína. Dicho de otra manera, un anticuerpo que se dirige contra una proteína cuyo perfil de glicosilación se determina como se describe en el presente documento se dirige preferiblemente contra la proteína como tal, es decir, se dirige contra un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína. El epítopo puede ser un epítopo lineal o conformacional. Puede ser un epítopo continuo o discontinuo. El término "inmunoglobulina" (Ig) se utiliza indistintamente con "anticuerpo" en el presente documento. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, así como una miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. En particular, un "anticuerpo" cuando se emplea en el presente documento, consiste típicamente en proteínas glicosiladas tetraméricas compuestas de dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 kDa cada una y dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada una. En los anticuerpos se pueden encontrar dos tipos de cadenas ligeras, denominadas lambda y kappa. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a cinco clases principales: A, D, E, G y M, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, prefiriéndose IgG en el contexto de la presente invención. También se contempla un anticuerpo que tiene un dominio constante de IgE o una porción del mismo que se une al receptor I de Fc épsilon. Un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J, que contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos IgA comprenden de 2 a 5 de las unidades básicas de 4 cadenas que pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes en combinación con la cadena J. En el caso de las IgG, la unidad de 4 cadenas tiene por lo general aproximadamente 150.000 daltons. Cada cadena ligera incluye un dominio variable (V) N-terminal (VL) y un dominio constante (C) (CL). Cada cadena pesada incluye un dominio V N-terminal (VH), tres o cuatro dominios C (CH) y una región bisagra. Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero pueden exhibir varias funciones efectoras, tales como la participación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Si un anticuerpo debe ejercer ADCC, es preferiblemente del subtipo IgG1, mientras que el subtipo IgG4 no tendría la capacidad de ejercer ADCC.
El término "anticuerpo" también incluye, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos o multiespecíficos, tales como anticuerpos biespecíficos, humanizados, camelizados, humanos, monocatenarios, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, injertados y anticuerpos generados in vitro, prefiriéndose los anticuerpos quiméricos o humanizados. El término "anticuerpo humanizado" se define comúnmente para un anticuerpo en el que la especificidad que codifica las CDR de HC y LC se ha transferido a marcos variables humanos apropiados ("injerto de CDR"). El término "anticuerpo" también incluye scFv, anticuerpos monocatenarios, dianticuerpos o tetraanticuerpos, anticuerpos de dominio (dAb) y nanoanticuerpos. En términos de la presente invención, el término "anticuerpo" también comprenderá anticuerpos bi-, tri- o multiméricos o bi-, tri- o multifuncionales que tienen varios sitios de unión a antígeno. Dicho término también incluye una o varias porciones de unión a antígeno. El término "anticuerpo" también incluye el armazón FN3, anectina, aficuerpo, anticalina, avímero, un péptido bicíclico, DARPin, un dominio de Kunitz, un "Obody" o un aptámero, tal como un aptámero de ADN, ARN o péptido.
Los anticuerpos preferidos incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG, etc. Los anticuerpos preferidos adicionales relacionados con la presente invención se muestran en la Tabla 1 a continuación.
Además, el término "anticuerpo", tal como se emplea en la invención, también se refiere a derivados de los anticuerpos (incluidos los fragmentos) descritos en el presente documento. Un "derivado" de un anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido alterada mediante la introducción de sustituciones, deleciones o adiciones de restos de aminoácidos. Además, un derivado abarca anticuerpos que han sido modificados por anclaje covalente de una molécula de cualquier tipo al anticuerpo o proteína. Los ejemplos de tales moléculas incluyen azúcares, PEG, grupos hidroxilo, etoxi, carboxi o amina, pero no se limitan a estos. En efecto, las modificaciones covalentes de los anticuerpos conducen a la glicosilación, pegilación, acetilación, fosforilación, amidación, sin limitarse a éstas.
El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo "aislado". "Aislado", cuando se emplea para describir los anticuerpos divulgados en el presente documento, significa un anticuerpo que ha sido identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción. Preferiblemente, el anticuerpo aislado está libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, como los que resultan de las células transfectadas recombinantes, son materiales que normalmente interferirían en los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos interna o N-terminal mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Normalmente, sin embargo, se preparará un anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.
Como se emplea en el presente documento, el término "porción de unión a antígeno" se refiere a un fragmento de inmunoglobulina (o anticuerpo intacto) y abarca cualquier polipéptido que comprenda un fragmento de unión a antígeno o un dominio de unión a antígeno. Preferiblemente, el fragmento tal como Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, scFv, Fd, Fv unidos por disulfuro (sdFv) y otros fragmentos de anticuerpos conservan la función de unión a antígeno como se describe en el presente documento (p. ej., un fragmento de anticuerpo monocatenario (scAb)). Típicamente, tales fragmentos comprenderían un dominio de unión a antígeno y tendrían las mismas propiedades que los anticuerpos descritos en el presente documento.
Las porciones de unión a antígeno preferidas de los anticuerpos incluyen, pero sin limitarse a, porciones de unión a antígeno de un anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG. Otros anticuerpos preferidos relacionados con la presente invención se muestran en la Tabla 1 a continuación.
Como se emplea en el presente documento, el término "se une específicamente" se refiere a anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos que se unen específicamente a una glicoproteína diana o polipéptido diana y no se unen específicamente a otra proteína o polipéptido. Los anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos se unen a sus respectivas dianas a través del dominio variable del anticuerpo.
El anticuerpo anti-glicoproteína preferido o las porciones de unión a antígeno del mismo se unen específicamente a un polipéptido diana o glicoproteína diana que comprenden un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (p. ej., la glicoproteína diana comprende dicho polipéptido): i) antígeno prostático específico (PSA), preferiblemente SEQ iD NO: 1, 2, 3, 4, 5 o 6; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 6; ii) Alfa-fetoproteína (AFP), preferiblemente SEQ ID NO: 11 o 12; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 12; iii) Mucina-16 (MUC16), preferiblemente SEQ ID NO: 13; vi) proteína 2 del dominio del núcleo de cuatro disulfuros WAP (WFDC2), preferiblemente SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18 o 19; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 19; v) mucina-1 (MUC1), preferiblemente SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o 37; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 37; vii) Receptor tirosina-proteína quinasa erbB-2 (ERBB2), preferiblemente SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44; adicionalmente preferiblemente s Eq ID NO: 44; viii) molécula de adhesión celular 5 relacionada con antígeno carcinoembrionario (CEACAM5), preferiblemente SEQ ID NO: 45, 46 o 47; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 47; ix) Galactósido 3(4)-L-fucosiltransferasa (FUT3), preferiblemente SEQ ID NO: 48; x) tiroglobulina (TG), preferiblemente SEQ ID NO: 49, 50 o 51; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 51. Los anticuerpos preferidos adicionales se muestran en la Tabla 1 a continuación.
El término "epítopo" también se refiere a un sitio en un antígeno (en el contexto de la presente invención, el antígeno es una glicoproteína) al que se une la molécula de anticuerpo. Preferiblemente, un epítopo es un sitio en una molécula (en el contexto de la presente invención, el antígeno es una glicoproteína) contra el cual se producirá un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, preferiblemente un anticuerpo y/o al cual se unirá un anticuerpo. Por ejemplo, un epítopo puede ser reconocido por un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo. El epítopo puede ser un epítopo lineal o conformacional. Puede ser un epítopo continuo o discontinuo. Un "epítopo lineal" es un epítopo en donde una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal incluye típicamente al menos 3, y más normalmente, al menos 5, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única.
Se cree que la unión específica se ve afectada por motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno que se unen entre sí como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria, y también como resultado de modificaciones secundarias de dicha estructura. La interacción específica del sitio de interacción de antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado también una simple unión de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción del antígeno con su antígeno específico puede dar lugar alternativamente al inicio de una señal, p. ej. debido a la inducción de un cambio en la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. Un ejemplo preferido de un dominio de unión según la presente invención es un anticuerpo.
Por lo general, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es superior a 10-6M. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de aproximadamente 10-11 a 10-8 M (Kd), preferiblemente de aproximadamente 10-11 a 10-9 M. Si es necesario, la unión no específica puede reducirse sin afectar sustancialmente a la unión específica variando las condiciones de unión.
En el caso de la unión de glicanos a lectinas, la afinidad de unión está preferiblemente en el rango de 10-3 a 10-6 (Kd). Los métodos de medición correspondientes a las Kd para la unión de glicanos a lectinas son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles para un experto en la técnica.
Se puede someter a prueba fácilmente si el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo reaccionan específicamente como se define en el presente documento anteriormente, entre otras cosas, comparando la reacción de dicho anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo con la glicoproteína diana respectiva con la reacción de dicho anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo con una o varias proteínas no diana.
El término "polipéptido" se emplea igualmente en el presente documento con el término "proteína". Las proteínas (incluidos sus fragmentos, preferiblemente fragmentos biológicamente activos y péptidos, que normalmente tienen menos de 30 aminoácidos) comprenden uno o más aminoácidos acoplados entre sí a través de un enlace peptídico covalente (que da como resultado una cadena de aminoácidos). El término "polipéptido", como se emplea en el presente documento, describe un grupo de moléculas que, por ejemplo, consisten en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar adicionalmente multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula polipeptídica. Las moléculas polipeptídicas que forman tales dímeros, trímeros, etc. pueden ser idénticas o no. Las correspondientes estructuras de orden superior de tales multímeros se denominan, en consecuencia, homo- o heterodímeros, homo- o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de heteromultímero es una molécula de anticuerpo que, en su forma natural, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos "polipéptido" y "proteína" también se refieren a polipéptidos/proteínas modificados de forma natural en donde la modificación se ve afectada, p. ej., por modificaciones postraduccionales como glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Tales modificaciones son bien conocidas en la técnica.
El término "aminoácido" o "resto de aminoácido" típicamente se refiere a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica, tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparragina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (Ile o I): leucina (Leu o L); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V), aunque pueden utilizarse según se desee aminoácidos modificados, sintéticos o raros. En general, los aminoácidos se pueden agrupar por tener una cadena lateral no polar (p. ej., Ala, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada negativamente (p. ej., Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (p. ej., Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar sin carga (p. ej., Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr).
"Anticuerpos policlonales" o "antisueros policlonales" se refieren a suero inmunológico que contiene una mezcla de anticuerpos específicos para uno (antisueros monovalente o específico) o más (antisueros polivalente) antígenos que pueden prepararse a partir de la sangre de animales inmunizados con el antígeno o los antígenos.
Además, el término "anticuerpo", como se emplea en la invención, también se refiere a derivados o variantes de los anticuerpos descritos en el presente documento que presentan la misma especificidad que los anticuerpos descritos. Los ejemplos de "variantes de anticuerpos" incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos "madurados por afinidad" (véanse, p. ej., Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) y mutantes de anticuerpos con funciones efectoras alteradas (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 5.648.260).
Los términos "dominio de unión a antígeno", "porción de unión a antígeno", "fragmento de unión a antígeno" y "región de unión a anticuerpo" cuando se emplean en el presente documento se refieren a una parte de una molécula de anticuerpo que comprende aminoácidos responsables de la unión específica entre anticuerpo y antígeno. La parte del antígeno que se reconoce específicamente y se une al anticuerpo se denomina "epítopo", como se describe anteriormente en el presente documento. Como se mencionó anteriormente, un dominio de unión a antígeno puede comprender típicamente una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo; sin embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y, a menudo, conservan alguna función de unión al antígeno del dominio de unión al antígeno intacto. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab conectados por un puente disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, y (7) un Fv monocatenario (scFv). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH> están codificados por genes separados, se pueden unir mediante métodos recombinantes mediante un conector sintético que les permite formar una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véanse, p. ej., Byrd et al. (1988) Science 242: 423-426; y Houston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 85: 5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando mecanismos convencionales conocidos por los expertos en la técnica, y los fragmentos se evalúan para determinar su función de la misma manera que los anticuerpos intactos.
El término "anticuerpo monoclonal", como se emplea en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales y/o modificaciones posteriores a la traducción (p. ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un solo sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque son sintetizados por el cultivo de hibridomas, no contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se debe interpretar que requieran la producción del anticuerpo por ningún método. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar según la presente invención pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., en Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse por métodos de ADN recombinante (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 4,816, 567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., en Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., en J. Mol. Biol., 222: 581 -597 (1991), por ejemplo.
Además, el término "anticuerpo monoclonal" tal como se emplea en la invención también se refiere a anticuerpos monoclonales específicos producidos por la empresa DB Biotech (http://www.dbbiotech.com/about-us.html), incluyendo dicho método la tecnología de clonación in vitro que permite la producción de una fracción de inmunoglobulina pura correspondiente a un solo clon de linfocitos B, en donde la inmunoglobulina obtenida reconoce solo un epítopo lineal único en la molécula de antígeno.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la cadena o las cadenas es o son idénticos u homólogos a las secuencias correspondientes en anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la deseada actividad biológica (Patente de Estados Unidos Núm. 4.816. 567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (p. ej., Mono del Viejo Mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humana.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígenos) de secuencias humanas, que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región hipervariable (también CDR) del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como el ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los restos no humanos correspondientes. Además, los "anticuerpos humanizados", como se emplea en el presente documento, también pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. De manera óptima, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323­ 329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas en la técnica, incluidas, por ejemplo, las descritas por Kabat et al. (Véase Kabat, et al. (1991) loc. cit.). Los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR, y en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones reemplazadas con un resto de aminoácido que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana.
Como se emplea en el presente documento, "anticuerpo generado in vitro" se refiere a un anticuerpo en donde toda o parte de la región variable (p. ej., al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunitarias (p. ej., una presentación en fagos in vitro, un chip de proteínas o cualquier otro método en donde las secuencias candidatas puedan probarse en cuanto a su capacidad para unirse a un antígeno). Por lo tanto, este término excluye preferiblemente secuencias generadas por reordenamiento genómico en una célula inmunitaria.
Un "anticuerpo biespecífico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la conexión de fragmentos Fab'. Véanse, p. ej., Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Inmunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). En una realización, el anticuerpo biespecífico comprende un primer polipéptido de dominio de unión, tal como un fragmento Fab', conectado a través de una región constante de inmunoglobulina a un segundo polipéptido de dominio de unión.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden utilizarse para formar moléculas biespecíficas. Un anticuerpo anti-PSA, o sus porciones de unión a antígeno, pueden derivatizarse o conectarse a otra molécula funcional, p. ej., otro péptido o proteína (p. ej., otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une al menos a dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. El anticuerpo descrito en el presente documento puede, de hecho, derivatizarse o conectarse a más de una molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; también se pretende que tales moléculas multiespecíficas queden abarcadas por el término "molécula biespecífica" como se emplea en el presente documento. Para crear una molécula biespecífica descrita en el presente documento, un anticuerpo descrito en el presente documento se puede conectar funcionalmente (p. ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que resulte una molécula biespecífica.
Productos inmunoconjugados y derivados de anticuerpos. Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden utilizar con fines de diagnóstico, incluido el análisis de muestras y la obtención de imágenes in vivo, y para este fin, el anticuerpo (o su fragmento de unión) se puede conjugar con un agente detectable apropiado para formar un producto inmunoconjugado. Para propósitos de diagnóstico, los agentes apropiados son marcas detectables que incluyen radioisótopos, para generar imágenes de todo el organismo, y radioisótopos, enzimas, marcas fluorescentes y otras etiquetas de anticuerpos adecuadas para análisis de muestras. Las marcas detectables pueden ser cualquiera de los diversos tipos utilizados actualmente en el campo del diagnóstico in vitro, incluidos marcas particuladas que incluyen soles metálicos tales como oro coloidal, isótopos, cromóforos que incluyen marcadores fluorescentes, biotina, marcadores luminiscentes, marcadores fosforescentes y similares, así como marcas enzimáticas que convierten un sustrato dado en un marcador detectable, y etiquetas de polinucleótidos que se revelan después de la amplificación, tal como mediante reacción en cadena de la polimerasa. En ese caso, un anticuerpo biotinilado sería detectable mediante la unión de avidina o estreptavidina. Las marcas enzimáticas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y similares. Por ejemplo, la marca puede ser la enzima fosfatasa alcalina, detectada midiendo la presencia o formación de quimioluminiscencia después de la conversión de sustratos de 1,2-dioxetano tales como adamantil metoxi fosforiloxi fenil dioxetano (AMPPD), 3-(4-(metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo{3,3,1,1 3,7}decan}-4-il)fenilfosfato de disodio (CSPD), así como CDP y CDP-star® u otros sustratos luminiscentes bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, los quelatos de lantánidos adecuados tales como terbio (III) y europio (III). El medio de detección está determinado por la marca elegida. La apariencia de la marca o sus productos de reacción se puede lograr a simple vista, en el caso de que la marca sea una partícula y se acumule en niveles apropiados, o utilizando aparatos tales como un espectrofotómetro, un luminómetro, un fluorímetro y similares, todo en acuerdo con la práctica convencional.
Están disponibles numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica para obtener anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir utilizando métodos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos Núm. 4.816.567). Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir mediante la generación de hibridomas (véase, p. ej., Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-499) según métodos conocidos. Los hibridomas formados de esta manera se escrutan a continuación utilizando métodos convencionales, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y análisis por resonancia de plasmón superficial (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno específico. Puede utilizarse cualquier forma del antígeno especificado como inmunógeno, p. ej., antígeno recombinante, formas naturales, cualquier variante o fragmento del mismo, así como péptido antigénico del mismo.
Un método ilustrativo para producir anticuerpos incluye el escrutinio de bibliotecas de expresión de proteínas, p. ej., bibliotecas de expresión en fagos o ribosomas. La presentación en fagos es descrita, por ejemplo, por Ladner et al., en la Patente de Estados Unidos Núm. No. 5.223.409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581 -597; los documento WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; y WO 90/02809.
Además del uso de bibliotecas de presentación, el antígeno especificado se puede utilizar para inmunizar a un animal no humano, p. ej., un roedor, p. ej., un ratón, un hámster o una rata. En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con fragmentos grandes de loci de Ig humana. Usando la tecnología de hibridoma, se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales específicos de antígeno obtenidos de los genes con la especificidad deseada. Véase, p. ej., XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, documentos US 2003- 0070185, WO 96/34096, y WO96/33735.
En otra realización, se obtiene un anticuerpo monoclonal del animal no humano, y después se puede producir modificado, p. ej., humanizado, desinmunizado, quimérico, utilizando mecanismos de ADN recombinante conocidos en la técnica. Se han descrito una variedad de enfoques para producir anticuerpos quiméricos. Véanse, p. ej., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., Patente de Estados Unidos Núm. 4.816.567; Boss et al., Patente de Estados Unidos Núm. 4.816.397; Tanaguchi et al., documentos EP 171496; EP 173494, GB 2177096. Los anticuerpos humanizados también se pueden producir, por ejemplo, utilizando ratones transgénicos que expresan genes de cadena pesada y ligera humana, pero son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de ratón endógenos. Winter describe un método de injerto de CDR ilustrativo que se puede utilizar para preparar los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento (Patente de Estados Unidos Núm. 5.225.539). Todas las CDR de un anticuerpo humano particular pueden reemplazarse por al menos una porción de una CDR no humana, o solo algunas de las CDR pueden reemplazarse con CDR no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDR requeridos para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.
Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos pueden generarse reemplazando secuencias del dominio variable Fv que no están directamente involucradas en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de dominios variables Fv humanos. Los métodos ilustrativos para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos son proporcionados por Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; y por los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; y u S 6.407.213. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina de al menos uno de una cadena pesada o ligera. Tales ácidos nucleicos se pueden obtener de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, como se describe anteriormente, así como de otras fuentes. A continuación, el ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado se puede clonar en un vector de expresión apropiado.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo humanizado se optimiza mediante la introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de línea germinal y/o retromutaciones. Tales moléculas de inmunoglobulina alteradas se pueden preparar mediante cualquiera de varios mecanismos conocidos en la técnica (p. ej., Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Met. Enzymol., 92: 3-16, 1982), y se pueden preparar según las enseñanzas de los documentos WO 92/06193 o EP 239400).
Un anticuerpo o fragmento del mismo también pueden modificarse mediante la eliminación específica de epítopos de células T humanas o "desinmunización" mediante los métodos divulgados en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, los dominios variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo pueden analizarse en busca de péptidos que se unen al MHC de clase II; estos péptidos representan epítopos potenciales de células T (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de posibles epítopos de células T, se puede aplicar un enfoque de modelado informático denominado "enhebrado de péptidos" y, además, se pueden buscar motivos presentes en las secuencias VH y VL en una base de datos de péptidos de unión al MHC de clase II humano, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de MHC de clase II DR y, por lo tanto, constituyen epítopos de células T potenciales. Los epítopos de células T potenciales detectados pueden eliminarse mediante la sustitución de pequeñas cantidades de restos de aminoácidos en los dominios variables o, preferiblemente, mediante sustituciones de un único aminoácido. Por lo general, se realizan sustituciones conservativas. A menudo, pero no exclusivamente, se puede utilizar un aminoácido común a una posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana, p. ej., son divulgadas por Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today vol. 16 (5): 237-242; Chothia, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. El directorio V BASE proporciona un directorio completo de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, LA. et al. Centro MRC de Ingeniería de Proteínas, Cambridge, Reino Unido). Estas secuencias pueden utilizarse como fuente de secuencia humana, p. ej., para regiones marco y CDR. También se pueden utilizar regiones marco humanas consenso, p. ej., como se describe en Patente de Estados Unidos Núm.6.300.064.
Los mecanismos para la producción de anticuerpos, incluidos los anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados, se conocen en la técnica, algunos de las cuales se ilustran a continuación.
Anticuerpos heteroconjugados
Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención.
Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos covalentemente (p. ej., conectados). Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el producto heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Se contempla que los anticuerpos puedan prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluidos los que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los divulgados, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Núm. 4.676.980. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar utilizando cualquier método de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la técnica y se divulgan en la Patente de Estados Unidos Núm. 4.676.980, junto con una serie de mecanismos de entrecruzamiento.
Para los mecanismos adicionales de producción de anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Laboratory Cold Spring Harbor, 1988. La presente invención no se limita necesariamente a ninguna fuente particular, método de producción u otras características especiales de un anticuerpo.
El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo "aislado". "Aislado", cuando se emplea para describir los anticuerpos divulgados en el presente documento, significa un anticuerpo que ha sido identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción. Preferiblemente, el anticuerpo aislado está libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tales como los que resultan de las células transfectadas recombinantes, son materiales que normalmente interferirían en los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos interna o N-terminal mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Normalmente, sin embargo, se preparará un anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.
El término "posición", cuando se emplea según la presente invención, significa la posición de un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos representada en el presente documento. El término "correspondiente", como se emplea en el presente documento, también incluye que una posición no solo está determinada por el número de nucleótidos/aminoácidos precedentes.
La posición de un aminoácido dado según la presente invención puede sustituirse debido a la deleción o adición de aminoácidos en otra parte de un polipéptido.
Por lo tanto, bajo una "posición correspondiente" según la presente invención, debe entenderse que los aminoácidos pueden diferir en el número indicado, pero aún pueden tener aminoácidos vecinos similares. Dichos aminoácidos que pueden intercambiarse, eliminarse o añadirse también están comprendidos en el término "posición correspondiente".
Para determinar si un resto de aminoácido en una secuencia de aminoácidos dada corresponde a una determinada posición en la secuencia de aminoácidos, el experto en la técnica puede utilizar medios y métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., alineamientos, ya sea manualmente o utilizando programas informáticos tales como BLAST2.0, que significa Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básica o ClustalW o cualquier otro programa adecuado que sea adecuado para generar alineamientos de secuencias.
Como se emplea en el presente documento, el término "% de identidad" se refiere al porcentaje de restos de aminoácidos idénticos en la posición correspondiente dentro de la secuencia cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos con un alineamiento de secuencia óptimo como se ilustra mediante las técnicas ClustalW o X disponibles en www.clustal.org, o técnicas equivalentes. En consecuencia, ambas secuencias (secuencia de referencia y secuencia de interés) se alinean, se identifican restos de aminoácidos idénticos entre ambas secuencias y el número total de aminoácidos idénticos se divide por el número total de aminoácidos (longitud de aminoácidos). El resultado de esta división es un valor porcentual, es decir, un valor/grado de identidad porcentual.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación para su uso como composición de diagnóstico. Por consiguiente, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se pueden utilizar en ensayos de diagnóstico para su antígeno, p. ej., detectando su expresión en células, tejidos o suero específicos.
Se pueden utilizar varios mecanismos de ensayo de diagnóstico conocidos en la técnica, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pág.
147-158). El anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo utilizado en los ensayos de diagnóstico se puede marcar con un radical detectable. Por ejemplo, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo puede modificarse con marcadores detectables, incluidos grupos de ligandos (p. ej., biotina), fluoróforos y cromóforos, radioisótopos, reactivos densos en electrones o enzimas. Las enzimas se detectan por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante se detecta por su capacidad para convertir la tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. Otros compañeros de unión adecuados incluyen biotina y avidina, IgG y proteína A, y otros pares de receptor-ligando conocidos en la técnica.
El radical detectable debe ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el radical detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P 35S o 125I un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo con el radical detectable.
El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, cuando se administran a un sujeto, están preferiblemente en forma de una composición. La composición es preferiblemente adecuada para uso farmacéutico y administración a sujetos.
En consecuencia, se prevé que el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación se utilicen en terapia. En consecuencia, la presente divulgación contempla una composición farmacéutica (o medicamento) que comprende el anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo descritos en el presente documento.
En otro aspecto más, la divulgación proporciona un método para tratar a un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, en donde el sujeto tiene cáncer.
Como se emplea en el presente documento, "cáncer" se refiere a un amplio grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento descontrolado de células anormales en el organismo. La división celular no regulada puede dar como resultado la formación de tumores malignos o células que invaden los tejidos vecinos y pueden producir metástasis en partes distantes del organismo a través del sistema linfático o del torrente sanguíneo.
Los cánceres cuyo crecimiento se puede inhibir utilizando los anticuerpos de la divulgación incluyen cánceres típicamente sensibles a la inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de cánceres para el tratamiento incluyen carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) escamosas, no CPCNP, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal (p. ej., carcinoma de células claras), cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (p. ej., carcinoma de células renales [CCR]), cáncer de próstata (p. ej., adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas), cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de páncreas, glioblastoma (glioblastoma multiforme), cáncer de cuello uterino, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer (o carcinoma) de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor de células germinales, sarcoma pediátrico, sinonasal de células asesinas naturales, melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico, tal como melanoma maligno cutáneo o intraocular), cáncer de huesos, cáncer de piel, cáncer uterino, cáncer de la región anal, cáncer testicular, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de glándula paratiroides, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma de tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos por el medio ambiente, incluidos los inducidos por amianto, cánceres relacionados con virus (p. ej., tumor relacionado con el virus del papiloma humano (VPH)) y neoplasias malignas hematológicas derivadas de cualquiera de los dos principales linajes de células sanguíneas, es decir, la línea celular mieloide (que produce granulocitos, eritrocitos, trombocitos, macrófagos y mastocitos) o la línea celular linfoide (que produce células B, T, NK y plasmáticas), tales como todos los tipos de leucemias, linfomas y mielomas, p. ej., leucemias agudas, crónicas, linfocíticas y/o mielógenas, tales como leucemia aguda (LLA), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC) y leucemia mielógena crónica (LML), MLA indiferenciada (MO), leucemia mieloblástica (MI), leucemia mieloblástica (M2; con maduración celular), leucemia promielocítica (M3 o variante M3 [M3V]), leucemia mielomonocítica (M4 o variante M4 con eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocíticoa aislado y cloroma; linfomas, tales como linfoma de Hodgkin (LH), linfoma no Hodgkin (LNH), linfomas de células B, linfomas de células T, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de células B monocitoides, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT), linfoma de células grandes anaplásico (p. ej., Ki 1+), linfoma/leucemia de células T adultas, linfoma de células del manto, linfoma de células T angioinmunoblástico, linfoma angiocéntrico, linfoma de células T intestinal, linfoma de células B mediastínico primario, linfoma linfoblástico de precursores de células T, linfoma linfoblástico de células T ; y linfoma/leucemia (T-Lbly/T-LLA), linfoma de células T periféricas, linfoma linfoblástico, postrasplante, trastorno linfoproliferativo, linfoma histiocítico verdadero, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de derrame primario, linfoma linfoblástico (LLB), tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (LHD), linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores de células B, linfoma cutáneo de células T (LCCT) (también llamado micosis fungoide o síndrome de Sezary) y linfoma linfoplasmacitoide (LLP) con macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tales como mieloma tipo IgG, mieloma de cadena ligera, mieloma no secretor, mieloma latente (también llamado mieloma indolente), plasmocitoma solitario y mielomas múltiples, leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de células pilosas; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma, rabdomiosacaroma y osteosarcoma; y otros tumores, incluidos melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma, tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, por ejemplo, tumores de células T y células B, incluidos, pero sin limitarse a, trastornos de células T tales como leucemia prolinfocítica de células T (T-LPL), incluyendo del tipo de células pequeñas y células cerebriformes; leucemia de linfocitos granulares grandes (LLG) preferiblemente del tipo de células T; linfoma hepatoesplénico T-LNH a/d; linfoma de células T periférico/postímico (subtipos pleomórfico e inmunoblástico); linfoma de células T angiocéntrico (nasal); cáncer de cabeza o cuello, cáncer renal, cáncer rectal, cáncer de la glándula tiroides; linfoma mieloide agudo, así como cualquier combinación de dichos cánceres. Los métodos descritos en el presente documento también se pueden utilizar para el tratamiento de cánceres metastásicos, cánceres refractarios (p. ej., cánceres refractarios a inmunoterapia previa, p. ej., con un anticuerpo bloqueador CTLA-4 o PD-1 o PD-L1) y cánceres recurrentes.
Los cánceres preferidos también se muestran en la Tabla 1 a continuación.
En realizaciones preferidas, un cáncer se selecciona de un grupo que consiste en: leucemia, linfoma, mieloma, cáncer de mama, cáncer colorrectal, glioblastoma, cáncer de ovario, cáncer hematológico, cáncer epitelial, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer uterino/cervicouterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de células germinales, cáncer de huesos, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de piel, neoplasia del sistema nervioso central, sarcoma y cáncer relacionado con virus.
Como se emplea en el presente documento, una "enfermedad autoinmunitaria" se refiere a un amplio grupo de enfermedades caracterizadas por enfermedades asociadas con la producción de anticuerpos dirigidos contra los propios tejidos. Los ejemplos no limitantes de una enfermedad autoinmunitaria incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Hashimoto, cirrosis biliar primaria, lupus eritematoso sistémico, fiebre reumática, artritis reumatoide, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática y encefalomielitis posviral, enfermedad de Addison, enteropatía autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, síndrome de Goodpasture, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, mixedema, penfigoide, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, oftalmitis simpática, ambas formas de lupus eritematoso, tirotoxicosis, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, enfermedad celíaca, diabetes mellitus tipo 1, enfermedad de Graves, enfermedad inflamatoria intestinal y psoriasis.
Como se emplea en el presente documento, una "enfermedad inflamatoria" se refiere a un amplio grupo de enfermedades caracterizadas por deterioro y/o funcionamiento anormal de los mecanismos inflamatorios del organismo. Los ejemplos no limitantes de una enfermedad inflamatoria incluyen, pero no se limitan a, enterocolitis necrotizante, gastroenteritis, enfermedad pélvica inflamatoria (EPI), empiema, pleuresía, pielitis, faringitis, angina, artritis, acné, infecciones del tracto urinario, Acné vulgar, Asma, Enfermedad celíaca, Prostatitis crónica, Colitis, Diverticulitis, Glomerulonefritis, Hidradenitis supurativa, Hipersensibilidades, Enfermedades inflamatorias intestinales, Cistitis intersticial, Síndrome de activación de mastocitos, Mastocitosis, Otitis, Enfermedad pélvica inflamatoria, Lesión por reperfusión, Fiebre reumática, Artritis reumatoide, Rinitis, Sarcoidosis, Rechazo de trasplante, Vasculitis.
Se pretende que el término "sujeto" incluya organismos vivos. Los ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, p. ej., seres humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas y animales no humanos transgénicos. En realizaciones preferidas de la invención, el sujeto es un ser humano.
Como se emplea en el presente documento, los términos "trastorno" y "enfermedad" se utilizan indistintamente para referirse a una afección en un sujeto. En particular, el término "cáncer" se utiliza indistintamente con el término "tumor".
Por otra parte, los anticuerpos se pueden utilizar con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o controlar enfermedades o trastornos, en particular cáncer y enfermedades relacionadas con el cáncer. Los anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos pueden utilizarse para someter a ensayo los niveles de glicoproteína en una muestra biológica utilizando métodos inmunohistológicos clásicos como se describe en el presente documento o como conocen los expertos en la técnica (p. ej., véanse Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de proteínas incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA).
Por lo tanto, la presente divulgación se refiere adicionalmente a una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo de la divulgación.
Como se emplea en el presente documento, el término "diagnóstico" se refiere a cualquier uso del anticuerpo para diagnosticar la presencia de un polipéptido o glicoproteína diana en un cáncer o enfermedad relacionada.
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporcionan artículos de fabricación y kits que contienen anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos que se puede utilizar, p. ej., para las aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas descritas anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que incluye un agente activo que es eficaz para aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas, como las descritas anteriormente. El agente activo en la composición es el anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo. La etiqueta del recipiente indica que la composición se utiliza para una terapia específica o una aplicación no terapéutica y también puede indicar instrucciones para el uso in vivo o in vitro, tales como las descritas anteriormente.
El kit comprenderá típicamente el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes distintos que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluidos tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
Como se emplea en el presente documento, el término "inmovilizado" se refiere a un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo o lectina que se han unido, normalmente de forma covalente, a una matriz orgánica o inorgánica insoluble (p. ej., un portador magnético). Sin embargo, cuando se aplica un anticuerpo en un método o uso de la presente invención, no se inmoviliza sobre una superficie sólida.
Como se emplea en el presente documento, el término "portador magnético" se refiere a partículas o cuentas que comprenden material o sustancia magnética (p. ej., hierro o ferritina). Preferiblemente, el portador magnético es una partícula magnética o una cuenta magnética (p. ej., un conjugado de ferritina). Sin embargo, para evitar dudas, cuando se hace referencia al portador magnético en el presente documento, este no es una superficie sólida, tal como una placa, p. una placa ELISA, como se emplea en el presente documento.
Como se emplea en el presente documento, el término "cuenta" se refiere a un objeto esférico pequeño, p. ej., hecho de vidrio, plástico, metal, agarosa, látex, nanopartículas o micropartículas metálicas, nanopartículas o micropartículas de óxido metálico o material magnético.
Como se emplea en el presente documento, el término "microperoxidasa" o "MP" se refiere a una porción peptídica del citocromo c que contiene hemo (p. ej., mostrada como SEQ ID NO: 10, citocromo c derivado de Equus caballus, Secuencia de referencia NCBI: NP_001157486.1) que conserva la actividad peroxidasa (p. ej., actividad enzimática EC 1.11.1.7, p. ej., microperoxidasa-11). Preferiblemente, la porción de péptido que contiene hemo del citocromo c es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%) idéntica a una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 7 (péptido MP-11), SEQ ID NO: 8 (péptido MP-9) y SEQ ID NO: 9 (péptido MP-8), preferiblemente dicho péptido de microperoxidasa (MP) se selecciona del grupo que consiste en: SEQ iD NO: 7 (péptido MP-11), SEQ ID NO: 8 (péptido MP-9) y SEQ ID NO: 9 (péptido MP-8).
Como se emplea en el presente documento, algunas lectinas pueden hacer que las células se aglutinen. Las lectinas se pueden obtener de semillas de plantas leguminosas, pero también de otras fuentes vegetales y animales. Las lectinas pueden contener sitios de unión para monosacáridos y oligosacáridos específicos (p. ej., glicanos de glicoproteínas). Pueden aglutinar células uniéndose a restos de azúcar específicos en glicoproteínas de membrana. Preferiblemente, las lectinas se seleccionan del grupo que consiste en: lectina II de Maackia amurensis (MAA II); Concanavalina A (Con A); lectina Aleuria aurantia (AAL); lectina de Sambucus nigra (SNA-I); lectina Wisteria floribunda (WFL) como se define en el presente documento.
En la Tabla 1 a continuación se muestran otras lectinas preferidas.
Las lectinas particularmente preferidas son las lectinas con los siguientes números de acceso UniProtKΒ: P0DKL3, P02866, P18891, O04366, A0A218PFP3, Q945S3, Q00022, Q6YNX3, Q71QF2, P02872, P18670, Q2UNX8, Q8L5H4, A0A089ZW N7, P05045, P19588, P83410, P17931, P56470, P24146, Q41263, Q39990, Q2F1K8, G9M5T0, B3XYC5, P02870, P19664, P0DKL3, P49300, A9XX86, Q40423, P16300, P05088, P05087, Q9AVB0, P02867, O24313, Q9SM56, P06750, B9SPG3, Q9BZZ2, P20916, Q9NYZ4, Q96RL6, P05046, P93535, P02876, P10968, P10969, P22972 o P56625 así como sus formas maduras correspondientes.
Las lectinas ilustrativas incluyen, adicionalmente:
La lectina II de Maackia amurensis (MAA II) es la hemaglutinina isolectina de semillas de Maackia. Lectina que se une al ácido siálico que reconoce los oligosacáridos que contienen ácido siálico terminal conectado mediante un enlace a2-3 a los penúltimos restos de galactosa. Se une a la secuencia de trisacáridos Neu5Aca2-3-Gal-p-1-4-GlcNAc. Preferiblemente, MAA II tiene SEQ ID NO: 52 (o su forma madura).
La Concanavalina A (Con A) es una lectina específica de D-manosa extraída originalmente de la judía Jack, Canavalia ensiformis. Preferiblemente, Con A tiene SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54 (Con A, forma madura).
La lectina de Aleuria aurantia (AAL) es una lectina específica de fucosa extraída de Aleuria aurantia (Hongo de piel de naranja). Preferiblemente, AAL tiene SEQ ID NO: 55 (o su forma madura). El aislamiento de AAL lo describen, por ejemplo, (Debray et al., Kochibe et al.).
La lectina Sambucus nigra (SNA-I) es una aglutinina específica de Neu5Aca2-6)Gal/GalNAc extraída de Sambucus nigra (Saúco europeo). Preferiblemente, SNA-I tiene SEQ ID NO: 56 (o su forma madura).
La lectina de Wisteria floribunda (WFL) es una aglutinina extraída de Wisteria floribunda (Glicinia japonesa). Preferiblemente, WFL tiene SEQ ID NO: 57 (o su forma madura).
Otras lectinas preferidas también se divulgan en el presente documento en las secciones "Otras lectinas (p. ej., formas maduras y procesadas postraduccionalmente de las mismas) dentro del significado de la presente invención"y en "Lista de secuencias".
Además, las lectinas adecuadas dentro del significado de la presente invención incluyen explícitamente formas maduras y procesadas postraduccionalmente de las lectinas divulgadas en el presente documento.
El problema a resolver por la presente invención puede verse, entre otras cosas, en uno o más de los siguientes: i) Identificar medios novedosos (p. ej., biomarcadores y métodos) para mejorar el diagnóstico del cáncer (p. ej., diagnóstico del cáncer de próstata, etc. Tabla 1); ii) mejorar la sensibilidad de la detección de cáncer (p. ej., detección de cáncer de próstata), p. ej., permitiendo una reducción de la cantidad de muestra necesaria (p. ej., 0,04 ml o menos) para diagnósticos precisos de cáncer (p. ej., diagnóstico de cáncer de próstata); iii) acortar el tiempo de análisis de diagnósticos de cáncer (p. ej., diagnósticos de cáncer de próstata), p. ej., mediante el uso de partículas magnéticas para el enriquecimiento de PSA y/o la generación de señales; iv) aumentar la versatilidad de los diagnósticos de cáncer (p. ej., diagnósticos de cáncer de próstata, etc. Tabla 1), p. ej., mediante la identificación de medios novedosos (p. ej., biomarcadores y métodos) para el glicoperfilado de cualquier proteína (p. ej., biomarcador de cáncer); v) reducir el número de falsos positivos (p. ej., falsos positivos derivados de niveles elevados de glicoproteínas en condiciones benignas) en diagnósticos basados en glicoproteínas (p. ej., basados en PSA) de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); vi) discriminar entre tumores significativos e insignificantes, p. ej., mediante diagnósticos basados en glicoproteínas (p. ej., basados en PSA) de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); vii) discriminar entre tumores de crecimiento lento (p. ej., clínicamente inofensivos) y de rápido crecimiento (p. ej., clínicamente relevantes), p. ej., mediante diagnósticos basados en glicoproteínas (p. ej., basados en PSA) de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); viii) reducir el riesgo de efectos secundarios y/o tratamiento innecesario de la terapia del cáncer (p. ej., terapia del cáncer de próstata, p. ej., efectos secundarios tales como incontinencia urinaria, disfunción sexual y problemas intestinales, etc.) en pacientes con CaP inofensivo); ix) reducir el coste de los diagnósticos de cáncer (p. ej., diagnósticos de cáncer de próstata, p. ej., diagnósticos de cáncer de próstata basados en glicoproteínas (p. ej., basados en PSA)); x) aumentar la conveniencia de los diagnósticos de cáncer (p. ej., diagnósticos de cáncer de próstata, p. ej., diagnósticos de cáncer de próstata basados en glicoproteínas (p. ej., basados en PSA)) para sujetos que los necesitan, p. ej., mediante la reducción del número de exámenes engorrosos (p. ej., generación de imágenes, biopsias de próstata, etc.) necesarios; xi) detectar cánceres curables (p. ej., cáncer de próstata) con una especificidad alta y mejorada (p. ej., evitando procedimientos de examen de seguimiento innecesarios); xii) identificar cánceres limitados a órganos y/o potencialmente curables (p. ej., cáncer de próstata), p. ej., mediante diagnósticos de cáncer basados en glicoproteínas (p. ej., basados en PSA). El problema se resuelve según las reivindicaciones de la presente invención. Los portadores magnéticos, los anticuerpos anti-glicoproteína, las porciones de unión a antígeno de los mismos, una o más lectinas, composiciones, kits y métodos y usos basados en los mismos son aplicables a cualquier glicoproteína, p. ej., a cualquier biomarcador de cáncer con glicosilación aberrante.
Los cánceres preferidos, los biomarcadores de cáncer con glicosilación aberrante, las lectinas, los anticuerpos y las modificaciones correspondientes de glicanos en el sentido de la presente invención también se muestran en Tabla 1 más abajo. Abreviaturas de lectina utilizadas en la Tabla 1: AAA - Aglutinina de Anguilla anguila (Número de acceso UniProtKΒ: Q7SIC1), AAL - Lectina de Aleuria aurantia , ABA - Aglutinina de Agaricus bisporus, ACA - Aglutinina de Amaranthus caudatus, AHA - Aglutinina Arachis hipogaea = aglutinina de cacahuete (PNA), AIA - Aglutinina de Artocarpus integrifolia = Jacalina, AlloA - Aglutinina de Allomyrina dichotoma , AOL - Lectina de Aspergillus oryzae , BanLec - Lectina de Musa paradisíaca , BS-I - Lectina de Bandeiraea simplicifolia = Lectina I de Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia , Con A - Concanavalina A, DBA - Aglutinina de Dolichos biflorus , DSA - Aglutinina de Datura stramonium (Jacalina), ECL - Lectina de Erythrina cristagalli , GNA - Aglutinina de Galanthus nivalis, GSA I (GSL I) - Lectina I de Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia , GSL II - Lectina II de Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia, HHL - Lectina Hippeastrum hybrid (Amarillis), HPA - Aglutinina de Helixpomatia, LBA - Phaseolus lunatus (judía lima, LBA), LEL - Lectina de Lycopersicon esculentum (tomate), LCA - Aglutinina Lens culinaris , LTA - Lectina Lotus tetragonolobus, MAA I - Aglutinina I de Maackia amurensis , MAA II - Aglutinina II de Maackia amurensis, MGBL 1 -Lectina 1 que se une a galactosa de macrófagos, MGBL 2 (lectina 2 que se une a galactosa de macrófagos, NPA - Lectina de Narcissus pseudonarcissus (Narciso), PHA E - Aglutinina E de Faseolus vulgaris, PHA L - Aglutinina L de Faseolus vulgaris, PhoSL - Lectina de Pholiota squarrosa, PNA - Aglutinina de cacahuete, PSL - Lectina de Pisum sativum , PTA I - Lectina I de Psophocarpus tetragonolobus , PTA II - II de Psophocarpus tetragonolobus, PWM - Phytolacca americana, RCA I- Aglutinina I Ricinus communis , RCA II - Aglutinina II de Ricinus communis , SBA -Aglutinina de soja (aglutinina de Glycine max), SCA - Aglutinina Sambucus canadensis = Aglutinina de Sambucus nigra (SNA), SJA - Aglutinina II Sophora japonica , SNA - Aglutinina de Sambucus nigra , SSA - Aglutinina de Sambucus sieboldiana , SSL - Lectina de Salvia esclarea , STL - Lectina de Solanum tuberosum, TJA-I - Aglutinina I de Trichosanthes japónica , TJA-II - Aglutinina de Trichosanthes japónica (Yamashita et al.), TVA - Aglutinina Triticum vulgaris = WGA - Aglutinina de germen de trigo, UEA - Aglutinina Ulex europaeus , VVA - Lectina de Vicia villosa , WFA - Lectina Wisteria floribunda, WGA - Aglutinina de germen de trigo = TVA - Aglutinina de Triticum vulgaris. El símbolo "t", un flecha apuntando hacia arriba significa aumento en la concentración de uno o varios glicanos correspondientes o uno o varios complejos (p. ej., dímero, trímero, etc.). El símbolo "|", un flecha apuntando hacia abajo significa aumento en la concentración de uno o varios glicanos correspondientes o uno o varios complejos (p. ej., dímero, trímero, etc.).
Tabla 1: Cánceres, biomarcadores de cáncer correspondientes con glicosilación aberrante, lectinas y anticuerpos.
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Debido a su sensibilidad y/o especificidad superiores, los métodos y usos de la presente invención son particularmente adecuados para la detección y el análisis de glicoproteínas específicos de isoformas (p. ej., en diagnósticos de cáncer).
En algunos aspectos, un anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., un anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG, preferiblemente anticuerpo anti-PSA) o una porción de unión a antígeno del mismo (p. ej., un fragmento de anticuerpo monocatenario (scAb)) se inmoviliza (p. ej., se conjuga) sobre un portador magnético (p. ej., una partícula magnética o una cuenta magnética), en donde dicho portador magnético comprende adicionalmente un polipéptido que tiene actividad peroxidasa (p. ej., polipéptido que tiene actividad enzimática EC 1.11.1.7, p. ej., microperoxidasa-11). Otros anticuerpos preferidos relacionados con la presente invención se muestran en la Tabla 1.
En algunos aspectos, dicho polipéptido que tiene actividad peroxidasa tiene un peso molecular de menos de 2 kDa (p. ej., aproximadamente 1,5 o aproximadamente 1,6 o aproximadamente 1,9 kDa), preferiblemente un peso molecular entre 1 y 2 kDa.
En algunos aspectos, dicho polipéptido que tiene actividad peroxidasa está inmovilizado (p. ej., conjugado) sobre dicho portador magnético.
En algunos aspectos, dicho anticuerpo antiglicoproteína o la porción de unión a antígeno del mismo se unen específicamente a un polipéptido diana que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (p. ej., la glicoproteína diana comprende dicho polipéptido, p. ej., el anticuerpo antiglicoproteína se produce contra dicho polipéptido, p. ej., la glicoproteína antigénica comprende dicho polipéptido): i) Antígeno prostático específico (PSA), preferiblemente SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5 o 6; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 6; ii) Alfa-fetoproteína (AFP), preferiblemente SEQ ID NO: 11 o 12; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 12; iii) Mucina-16 (MUC16), preferiblemente SEQ ID NO: 13; iv) Proteína 2 del dominio del núcleo de cuatro disulfuros WAP (WFDC2), preferiblemente SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18 o 19; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 19; v) Mucina-1 (MUC1), preferiblemente SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o 37; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 37; vi) Receptor tirosina-proteína quinasa erbB-2 (ERBB2), preferiblemente SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41,42, 43 o 44; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 44; vii) Molécula de adhesión celular 5 relacionada con antígeno carcinoembrionario (CEACAM5), preferiblemente SEQ ID NO: 45, 46 o 47; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 47; viii) Galactósido 3(4)-L-fucosiltransferasa (FUT3), preferiblemente SEQ ID NO: 48; ix) Tiroglobulina (TG), preferiblemente SEQ ID NO: 49, 50 o 51; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 51.
En algunos aspectos, dicho polipéptido diana es un antígeno prostático específico (PSA) que tiene actividad peptidasa (p. ej., actividad enzimática EC 3.4.21.77).
En algunos aspectos, dicho anticuerpo anti-glicoproteína o la porción de unión a antígeno del mismo se unen específicamente a un polipéptido diana (p. ej., PSA) que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (p. ej., la glicoproteína diana comprende dicho polipéptido, p. ej., el anticuerpo anti-glicoproteína se genera contra dicho polipéptido, p. ej., la glicoproteína antigénica comprende dicho polipéptido): i) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 6; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 6; ii) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 1; iii) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 2; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 2; iv) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 3; v) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 4; vi) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 5.
En algunos aspectos, dicho polipéptido diana es humano, de conejo, rata o ratón, preferiblemente dicho polipéptido diana es humano.
En algunos aspectos, dicho polipéptido que tiene actividad peroxidasa comprende una microperoxidasa (MP) (p. ej., microperoxidasa-11).
En algunos aspectos, dicha microperoxidasa (MP) es una porción peptídica que contiene hemo del citocromo c (p. ej., mostrada como SEQ ID NO: 10, citocromo c derivado de Equus caballus, Secuencia de referencia NCBI: NP_001157486.1) que conserva la actividad peroxidasa (p. ej., actividad enzimática EC 1.11.1.7, p. ej., microperoxidasa-11).
En algunos aspectos, dicha porción de péptido que contiene hemo del citocromo c es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%) idéntica a una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 7 (péptido MP- 11), SEQ ID NO: 8 (péptido MP-9) y SeQ ID NO: 9 (péptido MP-8), preferiblemente dicho péptido de microperoxidasa (MP) se selecciona del grupo que consiste en: s Eq ID NO: 7 (péptido MP -11), SEQ ID n O: 8 (péptido MP-9) y SEQ ID No : 9 (MP-8 péptido).
En algunos aspectos, dicho portador magnético es una partícula magnética o una cuenta magnética.
En algunos aspectos, dicho anticuerpo anti-glicoproteína o la porción de unión a antígeno del mismo son capaces de unirse simultáneamente a dicho polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG) en una muestra y generar una señal de detección (p. ej., por medios ópticos).
En algunos aspectos, dicho anticuerpo anti-glicoproteína o la porción de unión a antígeno del mismo son capaces de unirse y enriquecer simultáneamente dicho polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG) en una muestra y generar una señal de detección (p. ej., por medios ópticos).
En algunos aspectos, dicha antiglicoproteína o la porción de unión a antígeno de la misma es capaz de detectar dicho polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG) en una muestra (p. ej., muestra de suero) que tiene dicho polipéptido diana en una cantidad correspondiente a 0,04 ml o menos de muestra biológica sin diluir (p. ej., muestra de suero sin diluir), preferiblemente en el rango entre 0,01 y 0,04 ml, adicionalmente preferiblemente en el rango entre 0,02 y 0,04 ml, lo más preferiblemente en el rango entre 0,02-0,04 mL).
En algunos aspectos, dicho anticuerpo anti-glicoproteína es un anticuerpo monoclonal.
En algunos aspectos, dicho anticuerpo anti-glicoproteína se selecciona del grupo que consiste en: anticuerpo quimérico, humanizado o humano.
En algunos aspectos, un portador magnético (p. ej., una partícula magnética o una cuenta magnética) comprende: i) un anticuerpo antiglicoproteína inmovilizado (p. ej., conjugado) (p. ej., un anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG) o una porción de unión a antígeno del mismo (p. ej., un fragmento de anticuerpo monocatenario (scAb)) y ii) un polipéptido con actividad peroxidasa (ej., actividad enzimática EC 1.11.1.7, ej., microperoxidasa-11).
En algunos aspectos, dicho polipéptido que tiene actividad peroxidasa tiene un peso molecular de menos de 2 kDa (p. ej., aproximadamente 1,5 o aproximadamente 1,6 o aproximadamente 1,9 kDa), preferiblemente un peso molecular entre 1 y 2 kDa.
En algunos aspectos, dicho polipéptido que tiene actividad peroxidasa está inmovilizado (p. ej., conjugado) sobre dicho portador magnético.
En algunos aspectos, dicho anticuerpo antiglicoproteína o la porción de unión a antígeno del mismo se unen específicamente a un polipéptido diana que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (p. ej., la glicoproteína diana comprende dicho polipéptido, p. ej., el anticuerpo antiglicoproteína se produce contra dicho polipéptido, p. ej., la glicoproteína antigénica comprende dicho polipéptido): i) Antígeno prostático específico (PSA), preferiblemente SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5 o 6; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 6; ii) Alfa-fetoproteína (AFP), preferiblemente SEQ ID NO: 11 o 12; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 12; iii) Mucina-16 (MUC16), preferiblemente SEQ ID NO: 13; iv) Proteína 2 del dominio central de cuatro disulfuros WAP (WFDC2), preferiblemente SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18 o 19; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 19; v) Mucina-1 (MUC1), preferiblemente SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o 37; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 37; vi) Receptor tirosina-proteína quinasa erbB-2 (ERBB2), preferiblemente SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 44; vii) Molécula de adhesión celular 5 relacionada con antígeno carcinoembrionario (CEACAM5), preferiblemente SEQ ID NO: 45, 46 o 47; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 47; viii) Galactósido 3(4)-L-fucosiltransferasa (FUT3), preferiblemente SEQ ID NO: 48; ix) Tiroglobulina (TG), preferiblemente SEQ ID NO: 49, 50 o 51; adicionalmente preferiblemente SEQ ID NO: 51.
En algunos aspectos, dicho polipéptido diana es un antígeno prostático específico (PSA) que tiene actividad peptidasa (p. ej., actividad enzimática EC 3.4.21.77).
En algunos aspectos, dicho anticuerpo anti-glicoproteína o la porción de unión a antígeno del mismo se unen específicamente a un polipéptido diana (p. ej., PSA) que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (p. ej., la glicoproteína diana comprende dicho polipéptido, p. ej., el anticuerpo anti-glicoproteína se genera contra dicho polipéptido, p. ej., la glicoproteína antigénica comprende dicho polipéptido): i) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 6; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 6; ii) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 1; iii) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 2; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 2; iv) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 3; v) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 4; vi) un polipéptido que es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5; preferiblemente dicho polipéptido tiene SEQ ID NO: 5.
En algunos aspectos, dicho polipéptido diana es humano, de conejo, de rata o de ratón, preferiblemente dicha glicoproteína es humana.
En algunos aspectos, dicho polipéptido que tiene actividad peroxidasa comprende una microperoxidasa (MP) (p. ej., microperoxidasa-11).
En algunos aspectos, dicha microperoxidasa (MP) es una porción peptídica que contiene hemo del citocromo c (p. ej., mostrada como SEQ ID NO: 10, citocromo c derivado de Equus caballus, Secuencia de referencia NCBI: NP_001157486.1) que conserva la actividad de la peroxidasa (p. ej., actividad enzimática EC 1.11.1.7, p. ej., microperoxidasa-11).
En algunos aspectos, dicha porción de péptido que contiene hemo del citocromo c es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%) idéntica a una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 7 (péptido MP-11), SEQ ID NO: 8 (péptido MP-9) y SeQ ID NO: 9 (péptido MP-8), preferiblemente dicho péptido de microperoxidasa (MP) se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 7 (péptido MP-11), SEQ ID NO: 8 (péptido MP-9) y SEQ ID NO: 9 (péptido MP-8).
En algunos aspectos, dicho portador magnético es una partícula o una cuenta magnéticas.
En algunos aspectos, dicho transportador magnético es capaz de unirse simultáneamente a dicho polipéptido diana (p. ej., PSA, a Fp , MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG) en una muestra y generar una señal de detección (p. ej., por medios ópticos).
En algunos aspectos, dicho portador magnético es capaz de unirse y enriquecer simultáneamente dicho polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG) en una muestra y generar una señal de detección (p. ej., por medios ópticos).
En algunos aspectos, en donde dicho portador magnético es capaz de detectar dicho polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG) en una muestra (p. ej., muestra de suero) que tiene dicho polipéptido diana en una cantidad correspondiente a 0,04 ml o menos de muestra biológica sin diluir (p. ej., muestra de suero sin diluir), preferiblemente en el rango entre 0,01 y 0,04 ml, adicionalmente preferiblemente en el rango entre 0,02 y 0,04 ml, lo más preferiblemente en el rango entre 0,02 y 0,04 ml).
En algunos aspectos, dicho anticuerpo anti-glicoproteína es un anticuerpo monoclonal.
En algunos aspectos, dicho anticuerpo anti-glicoproteína se selecciona del grupo que consiste en: anticuerpo quimérico, humanizado o humano.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un método para producir un anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., un anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG) o una porción de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho método conjugar simultáneamente un portador magnético (p. ej., una partícula o cuenta magnéticas) con: i) un anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., un anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG) o una porción de unión a antígeno del mismo, ii) un polipéptido que tiene actividad peroxidasa.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un método para producir un portador magnético, comprendiendo dicho método conjugar simultáneamente dicho portador magnético (p. ej., una partícula o cuenta magnéticas) con: i) un anticuerpo antiglicoproteína (p. ej., un anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anticuerpo anti-TG) o una porción de unión a antígeno del mismo, ii) un polipéptido que tiene actividad peroxidasa.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un método que comprende: a) proporcionar: i) un portador magnético o un anticuerpo antiglicoproteína (p. ej., un anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anticuerpo anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG) o porción de unión a antígeno del mismo; ii) una o más lectinas, preferiblemente dichas una o más lectinas se seleccionan del grupo que consiste en: lectina II de Maackia amurensis (MAA II); lectina de Concanavalina A (Con A); lectina de Aleuria aurantia (AAL); lectina de Sambucus nigra (SNA-I); lectina de Wisteria floribunda (WFL); adicionalmente preferiblemente dichas una o más lectinas que comprenden MAA II, lo más preferiblemente dichas una o más lectinas son dos lectinas que comprenden MAA II, adicionalmente lo más preferiblemente dichas una o más lectinas son dos lectinas que comprenden MAA II combinadas con: aa) AAL, preferiblemente dicho método tiene una sensibilidad de aproximadamente 100% y/o dicho método tiene una especificidad de aproximadamente 81,3%; o bb) Con A, preferiblemente dicho método tiene una sensibilidad de aproximadamente 100% y/o dicho método tiene una especificidad de aproximadamente 93,8%; o cc) SNA-I, preferiblemente dicho método tiene una sensibilidad de aproximadamente 100% y/o dicho método tiene una especificidad de aproximadamente 93,8%; b) determinar la cantidad, presencia o ausencia de cadenas de oligosacáridos (p. ej., glicanos) ancladas covalentemente a un polipéptido diana de dicho anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., polipéptido diana, p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o Tg ), preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA, adicionalmente preferiblemente dicha determinación comprende el uso de un portador magnético y/o un anticuerpo anti-glicoproteína y/o una porción de unión a antígeno del mismo y/o una o más lectinas y/o o una composición y/o kits basados en los mismos.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un método para la detección de un polipéptido glicosilado, en donde la unión y detección (p. ej., por medios ópticos) de dicho polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG) se lleva a cabo simultáneamente, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un método para la detección de un polipéptido glicosilado, en donde la unión, el enriquecimiento y la detección (p. ej., por medios ópticos) de dicho polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, f UT3 o TG) se lleva a cabo simultáneamente, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un método para la detección de un polipéptido glicosilado, en donde dicho método es el método para uno o más de los siguientes: i) para la captura selectiva y/o el enriquecimiento de un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, e Rb B2, CEACAM5, FUT3 o TG), preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA; ii) para la captura selectiva y/o el enriquecimiento de un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA), en donde dicho método para la captura selectiva y/o o el enriquecimiento comprende el uso de una o más lectinas (p. ej., lectinas inmovilizadas); preferiblemente dichas una o más lectinas se inmovilizan en una ubicación de muestra (p. ej., microplaca de Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA), ensayo de lectinas ligadas a enzimas (ELLA) o ensayo magnético de lectinas ligadas a enzimas (MELLA)); iii) para el glicoperfilado de un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, f Ut 3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); iv) para el escrutinio y/o el análisis de cadenas de oligosacáridos (p. ej., glicanos) ancladas covalentemente a un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); v) para el diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); vi) para la predicción positiva y/o negativa de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); vii) para la determinación de un estadio clínico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); viii) para la distinción entre cáncer de próstata y cáncer de próstata metastásico; ix) para la identificación de cáncer de próstata con probabilidad de metástasis (p. ej., con probabilidad de metástasis en el hueso); x) para la distinción entre hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata; xi) para la prevención y/o el tratamiento del cáncer (p. ej., cáncer de próstata); xii) para la discriminación entre tumores significativos e insignificantes, p. ej., mediante diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) basado en glicoproteínas (p. ej. basado en polipéptidos diana, p. ej., basado en PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); xiii) para la discriminación entre tumores de crecimiento lento (p. ej., clínicamente inofensivos) y de rápido crecimiento (p. ej., clínicamente relevantes), p. ej., mediante diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) basado en glicoproteínas (p. ej. basado en polipéptidos diana, p. ej., basado en PSA, a Fp , MUC16, WFDC2 , MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o t G, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); xiv) para la identificación de cánceres limitados a órganos y/o potencialmente curables (p. ej., cáncer de próstata), p. ej., mediante diagnóstico de cáncer basado en glicoproteínas (p. ej., basados en polipéptidos diana, p. ej., basados en PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); xv) para el escrutinio de compuestos.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un método para escrutar compuestos y dicho método comprende: a) proporcionar: i) una muestra de cáncer de próstata con un compuesto de prueba; b) poner en contacto dicha muestra de cáncer de próstata con dicho compuesto de prueba; y c) determinar la probabilidad de que dicha célula de cáncer de próstata haga metástasis basándose en la cantidad, presencia o ausencia determinada de cadenas de oligosacáridos (p. ej., glicanos) ancladas covalentemente a un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA) en dicha muestra de cáncer de próstata antes y después de poner en contacto dicha muestra de cáncer de próstata con dicho compuesto de ensayo.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde dicho método es el método: i) para la predicción positiva del cáncer de próstata y/o ii) para distinguir entre hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata; en donde dichas una o más lectinas comprenden MAA II o WFL, preferiblemente dichas una o más lectinas comprenden MAA II.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde las una o más lectinas utilizadas son MAA II, en donde la sensibilidad y/o especificidad de dicho método es de aproximadamente 87,5%.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde las una o más lectinas utilizadas son dos lectinas que comprenden MAA II combinadas con: i) Con A, en donde dicho método tiene una sensibilidad de aproximadamente 100% y/o dicho método tiene una especificidad de aproximadamente 93,8%; o ii) SNA-I, en donde dicho método tiene una sensibilidad de aproximadamente 100% y/o dicho método tiene una especificidad de aproximadamente 93,8%; o iii) AAL, en donde dicho método tiene una sensibilidad de aproximadamente 100% y/o dicho método tiene una especificidad de aproximadamente 81,3%.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde la lectina utilizada es WFL, en donde la sensibilidad de dicho método es de aproximadamente 50% y/o la especificidad de dicho método es de aproximadamente 75%.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde dicho método es el método: i) para la predicción negativa del cáncer de próstata y/o ii) para distinguir entre hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata; en donde dicha lectina se selecciona del grupo que consiste en: Con A, AAL y SNA-I.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde la lectina utilizada es Con A, en donde la sensibilidad de dicho método es de aproximadamente 50% y/o la especificidad de dicho método es de aproximadamente 75%.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde la lectina utilizada es AAL, en donde la sensibilidad de dicho método es de aproximadamente 50% y/o la especificidad de dicho método es de aproximadamente 75%.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde la lectina utilizada es SNA-I, en donde la sensibilidad de dicho método es de aproximadamente 57% y/o la especificidad de dicho método es de aproximadamente 75%.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde dicho método comprende la etapa de determinar un curso de acción de tratamiento en función de la cantidad, presencia o ausencia determinada de cadenas de oligosacáridos (p. ej., glicanos) ancladas covalentemente a un polipéptido diana de un anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., polipéptido diana, p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1 , e Rb B2, CEACAM5, FUT3 o TG), preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde dicho método es el método para distinguir entre el cáncer de próstata y el cáncer de próstata metastásico en una muestra (p. ej., en una muestra de suero), en donde se utilizan una o más lectinas seleccionadas del grupo formado por: AAL y Con A.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, en donde dicho método se lleva a cabo en una muestra.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un método descrito en el presente documento, se selecciona una muestra adecuada del grupo de muestra de orina, sangre, suero, biopsia y tejido posquirúrgico, preferiblemente una muestra de suero.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a una lectina para su uso en un método de la presente invención, preferiblemente para su uso en un método: i) para la predicción (p. ej., positiva o negativa) del cáncer de próstata; y/o ii) para distinguir entre hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata; y/o iii) para distinguir entre cáncer de próstata y cáncer de próstata metastásico.
En algunos aspectos, dichas una o más lectinas se seleccionan del grupo que consiste en: lectina II de Maackia amurensis (MAA II); lectina de Concanavalina A (Con A); lectina Aleuría aurantia (AAL); lectina de Sambucus nigra (SNA-I); lectina de Wisteria floribunda (WFL), preferiblemente dichas una o más lectinas que comprenden MAA II, adicionalmente preferiblemente dichas una o más lectinas son dos lectinas que comprenden MAA II, lo más preferiblemente dichas una o más lectinas son dos lectinas que comprenden MAA II combinada con AAL, Con A o SNA-I.
En algunos aspectos, dichas una o más lectinas se inmovilizan (p. ej., en una ubicación de muestra, p. ej., en una microplaca, p. ej., en una microplaca de Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA), ensayo de lectinas ligadas a enzimas (ELLA) o ensayo magnético de lectinas ligadas a enzimas (MELLA)).
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a una composición que comprende uno o más de los siguientes: i) un anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., un anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG, preferiblemente anticuerpo anti-PSA) o una porción de unión a antígeno del mismo; ii) un portador magnético; iii) una o más lectinas, preferiblemente dichas una o más lectinas se seleccionan del grupo que consiste en: lectina II de Maackia amurensis (MAA II); lectina de Concanavalina A (Con A); lectina de Aleuria aurantia (AAL); lectina de Sambucus nigra (SNA-I); lectina de Wisteria floribunda (WFL); adicionalmente preferiblemente dichas una o más lectinas que comprenden MAA II, lo más preferiblemente dichas una o más lectinas son dos lectinas que comprenden MAA II, adicionalmente lo más preferiblemente dichas una o más lectinas son dos lectinas que comprenden MAA II combinada con AAL, Con A o SNA-I.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un kit que comprende un anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG), preferiblemente anti-PSA), porción de unión a antígeno del mismo, portador magnético, una o más lectinas o composición.
En algunos aspectos, la divulgación se relaciona con un anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG), preferiblemente anti-PSA), porción de unión a antígeno del mismo, portador magnético, una o más lectinas o composición para su uso como medicamento.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti- TG), preferiblemente anti-PSA), porción de unión a antígeno del mismo, portador magnético, una o más lectinas o composición para su uso en uno o más de los siguientes métodos (p. ej., métodos in vitro, in vivo o ex vivo): i) para la captura selectiva y/o el enriquecimiento de un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG), preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA; ii) para la captura selectiva y/o el enriquecimiento de un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA), en donde dicho método para la captura selectiva y/o o el enriquecimiento comprende el uso de una o más lectinas (p. ej., lectinas inmovilizadas); preferiblemente dichas una o más lectinas se inmovilizan en una ubicación de muestra (p. ej., una microplaca de Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA), ensayo de lectinas ligadas a enzimas (ELLA) o de ensayo magnético de lectinas ligadas a enzimas (MELLA)); iii) para el glicoperfilado de un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, Fu T3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); iv) para el escrutinio y/o análisis de cadenas de oligosacáridos (p. ej., glicanos) ancladas covalentemente a un polipéptido diana (p. ej., pSa , AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); v) para el diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); vi) para predicción positiva y/o negativa de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); vii) para la determinación de un estadio clínico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); viii) para la distinción entre cáncer de próstata y cáncer de próstata metastásico; ix) para la identificación del cáncer de próstata con probabilidad de metástasis (p. ej., con probabilidad de metástasis en el hueso); xi) para la distinción entre hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata; xii) para la prevención y/o el tratamiento del cáncer (p. ej., cáncer de próstata); xiii) para la discriminación entre tumores significativos e insignificantes, p. ej. mediante diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) basado en glicoproteínas (p. ej., basado en glicoproteínas (p. ej. basado en polipéptidos diana, p. ej., basado en PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, Fu T3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); xiv) para la discriminación entre tumores de crecimiento lento (p. ej., clínicamente inofensivos) y de rápido crecimiento (p. ej., clínicamente relevantes), p. ej., mediante diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) basado en glicoproteínas (p. ej., basado en polipéptidos diana, p. ej., basado en PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); xv) para la identificación de cánceres limitados a órganos y/o potencialmente curables (p. ej., cáncer de próstata), p. ej., mediante diagnóstico de cáncer basado en glicoproteínas (p. ej., basado en polipéptidos diana, p. ej., basado en PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); xvi) para el escrutinio de compuestos; xvii) para su uso en un método de la presente invención.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un anticuerpo anti-glicoproteína (p. ej., un anticuerpo anti-PSA, anti-AFP, anti-MUC16, anti-WFDC2, anti-MUC1, anti-ERBB2, anti-CEACAM5, anti-FUT3 o anti-TG, preferiblemente anticuerpo anti-PSA), una porción de unión a antígeno del mismo, un portador magnético, una o más lectinas o una composición para uno o más de los siguientes: i) para la captura selectiva y/o el enriquecimiento de un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, c Ea CAM5, FUT3 o TG), preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA; ii) para la captura selectiva y/o el enriquecimiento de un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA), en donde dicha captura selectiva y/o enriquecimiento comprenden el uso de una o más lectinas (p. ej., lectinas inmovilizadas); preferiblemente dichas una o más lectinas se inmovilizan en una ubicación de muestra (p. ej., una microplaca de Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA), ensayo de lectinas ligadas a enzimas (ELLA) o ensayo magnético de lectinas ligadas a enzimas (MELLA)); iii) para el glicoperfilado de un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); iv) para el escrutinio y/o análisis de cadenas de oligosacáridos (p. ej., glicanos) ancladas covalentemente a un polipéptido diana (p. ej., PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); v) para el diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); vi) para la predicción positiva y/o negativa de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); vii) para la determinación de un estadio clínico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata); viii) para la distinción entre cáncer de próstata y cáncer de próstata metastásico; ix) para la identificación del cáncer de próstata con probabilidad de metástasis (p. ej., con probabilidad de metástasis en el hueso); x) para la distinción entre hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata; xi) para la prevención y/o el tratamiento del cáncer (p. ej., cáncer de próstata); xii) para la discriminación entre tumores significativos e insignificantes, p. ej., mediante diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) basado en glicoproteínas (p. ej., basado en polipéptidos diana, p. ej., basado en PSA, AFP, MUC16, WFDC2 , MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG , preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); xiii) para la discriminación entre tumores de crecimiento lento (p. ej., clínicamente inofensivos) y de rápido crecimiento (p. ej., clínicamente relevantes), p. ej., mediante diagnóstico de cáncer (p. ej., cáncer de próstata) basado en glicoproteínas (p. ej., basado en polipéptidos diana, p. ej., basado en PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG, preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); xiv) para identificar cánceres limitados a órganos y/o potencialmente curables (p. ej., cáncer de próstata), p. ej., mediante diagnóstico de cáncer basado en glicoproteínas (p. ej., basado en polipéptidos diana, p. ej., basado en PSA, AFP, MUC16, WFDC2, MUC1, ERBB2, CEACAM5, FUT3 o TG , preferiblemente dicho polipéptido diana es PSA); xv) para el escrutinio de compuestos; xvi) para su uso en un método de la presente invención.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un uso de la presente invención, en donde dicho uso es un uso in vitro, ex vivo o in vivo o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, dicha lectina es al menos 60% o más (p. ej., al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, lectinas con los siguientes números de acceso UniProtKΒ: P0DKL3, P02866, P18891, O04366, A0A218PFP3, Q945S3, Q00022, Q6YNX3, Q71QF2, P02872, P18670, Q2UNX8, Q8L5H4, A0A089ZWN7, P05045, P19588, P83410, P17931, P56470, P24146, Q41263, Q39990, Q2F1K8, G9M5T0, B3XYC5, P02870, P19664, P0DKL3, P49300, A9XX86, Q40423, P16300, P05088, P05087, Q9AVB0, P02867, O24313, Q9SM56, P06750, B9SPG3, Q9BZZ2, P20916, Q9NYZ4, Q96RL6, P05046, P93535, P02876, P10968, P10969, P22972 o P56625, lectinas como se describe en la Tabla 1 del presente documento, donde dicha lectina es capaz de reaccionar específicamente con el resto glicosídico (p. ej., resto glicosídico terminal) de otra molécula (p. ej., polisacárido de la pared celular y/o glicoproteína (p. ej., polipéptido diana según uno cualquiera de los puntos anteriores o un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en biomarcadores como se describe en la Tabla 1 del presente documento).
En algunos aspectos, dicha lectina se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, lectinas con los siguientes números de acceso UniProtKΒ: P0DKL3, P02866, P18891, O04366, A0A218PFP3, Q945S3, Q00022, Q6YNX3, Q71QF2, P02872, P18670, Q2UNX8, Q8L5H4, A0A089ZWN7, P05045, P19588, P83410, P17931, P56470, P24146, Q41263, Q39990, Q2F1K8, G9M5T0, B3XYC5, P02870, P19664, P0DKL3, P49300, A9XX86, Q40423, P16300, P05088, P05087, Q9AVB0, P02867, 024313, Q9SM56, P06750, B9SPG3, Q9BZZ2, P20916, Q9NYZ4, Q96RL6, P05046, P93535, P02876, P10968, P10969, P22972 o P56625, lectinas como se describe en la Tabla 1 del presente documento.
En algunos aspectos, dicha lectina es madura.
En algunos aspectos, dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: anticuerpos como se describe en la Tabla 1 del presente documento.
En algunos aspectos, un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en biomarcadores como se describe en la Tabla 1 del presente documento.
En algunos aspectos, un cáncer se selecciona del grupo que consiste en cánceres como se describe en la Tabla 1 del presente documento.
En algunos aspectos, dicha lectina se selecciona del grupo que consiste en los correspondientes anticuerpos, biomarcadores, cánceres y lectinas descritos en la Tabla 1 del presente documento.
En algunos aspectos, se selecciona una modificación de glicano correspondiente (p. ej., cambio correspondiente (p. ej., cambio detectable) de un estado de glicano y/o composición de glicano y/o concentración de glicano y/o formación de complejos de glicano (p. ej., dimerización, trimerización, etc.) del grupo que consiste en modificaciones de glicano como se describe en la Tabla 1 del presente documento.
Las referencias que se muestran en la Tabla 1 del presente documento son las siguientes:
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Ejemplos de la invención
En el transcurso de la presente invención, se investigó el potencial innovador de los glicanos modificados (carbohidratos complejos) del PSA en lugar del nivel de PSA en el suero humano (práctica clínica convencional actual) como un nuevo biomarcador potencial para mejorar el diagnóstico del cáncer de próstata (CaP) (p. ej., Figura 1). En la Fig. 1A se muestra una composición típica de glicanos en el PSA de un individuo sano y de un paciente con CaP en la Fig. 1B, indicando cambios de glicanos detectables por lectinas (proteínas de unión a glicanos) para el diagnóstico de CaP. El nivel de PSA en la muestra de suero generalmente se detecta en una configuración sándwich utilizando el anticuerpo de sensibilización (Ab1) y el anticuerpo de sensibilización (Ab2) (Fig. 1C). El glicoperfilado de PSA se realiza en una configuración sándwich (Fig. 1E) con un fragmento de anticuerpo monocatenario (scAb) (o un anticuerpo) y microperoxidasa-11 (MP-11) inmovilizados sobre partículas magnéticas aplicadas para la captura selectiva de PSA del suero con lectinas inmovilizadas sobre una microplaca de Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) (Fig. 1E). Las partículas magnéticas con MP-11 y los anticuerpos tienen una doble función: el enriquecimiento de PSA de una muestra de suero y la aplicación de MP-11 para la generación de señales ópticas (Fig. 1E). El método de la presente invención para el glicoperfilado de PSA difiere significativamente de los métodos descritos en la técnica anterior (p. ej., como se muestra en Fig.1D, pero este método implica muchas etapas y requiere al menos 1,5 mL de suero), por ejemplo, entre otras diferencias en que implementa un doble papel de partículas magnéticas con MP-11 y fragmento de anticuerpo inmovilizados lo que mejora significativamente la sensibilidad de detección, reduciendo la cantidad requerida de muestra necesaria a 0,04 ml y reduce el tiempo de análisis mediante el uso de partículas magnéticas para el enriquecimiento de PSA y la generación de señales.
Además, los métodos de la técnica anterior omiten el glicoperfilado de los analitos investigados. Por otra parte, en el curso de la presente invención se ha implementado una enzima microperoxidasa-11 (MP-11) en lugar de la que se aplica con frecuencia y se ha utilizado peroxidasa de rábano picante (HRP) mucho más grande (1,9 kDa frente a 44 kDa respectivamente). Además, se ha implementado una porción de unión a antígeno del anticuerpo anti-PSA (p. ej., 8x4x3,5 nm) en el método de la presente invención en lugar de un anticuerpo anti-PSA de longitud completa mucho mayor (15x7x3,5 nm). Dicha porción de unión a antígeno del anticuerpo anti-PSA se generó como describen Andris-Widhopf et al. (2000).
El método de la presente invención funciona, por ejemplo, en formato ELLA o MELLA, por lo tanto, no se necesita instrumentación especializada para ejecutar la espectrometría de fluorescencia de plasmón de superficie, una electroforesis capilar con microchip que emplea lectinas, un sistema de matriz en suspensión y citometría de flujo, y el ensayo se puede realizar en Formato ELLA o MELLA (p. ej., similar a ELISA), que es totalmente compatible con la práctica clínica actual.
El método de la presente invención es el primero que describe el doble papel de las partículas magnéticas modificadas para el glicoperfilado de cualquier proteína (p. ej., un biomarcador de cáncer).
Materiales y métodos de los Ejemplos 1 y 2:
ELLA magnético (MELLA) para PSA:
Al principio, se conjugaron durante la noche 30 μg de mezcla de ligandos equimolares (scAb de 38131 Da y MP-11 de 1822 Da, es decir, 28,6 μg de scAb y 1,4 μg de MP-11) por mg de partículas magnéticas (PMN). Se añadieron 100 μl de solución de lectina de 10 μg/ml en PB (0,1 M, pH = 7,4, filtrada con un filtro estéril de 0,2 μm) a cada pocillo de una placa Maxisorp (Thermo Scientific, EE. UU.) y se incubó 1 hora a temperatura ambiente (TA) o a 4°C durante la noche. Después de un procedimiento de lavado (3x con 200 μl de tampón fosfato (PB)), los pocillos se bloquearon con 100 μl de solución de bloqueo libre de carbohidratos (Vector Labs, EE. UU.) durante 1 hora (h). Después de la etapa de lavado, las placas están listas para el análisis MELLA.
Las muestras de suero humano se dividieron en alícuotas y se mantuvieron a -80°C. Antes del análisis, todas las muestras se diluyeron al mismo nivel de PSA, para que los resultados fueran comparables (en PB 0,1 M, pH = 7,4, filtrado con filtro estéril de 0,2 μm), p. ej., 0,7 ng/ml en este caso. Los sueros normalizados se mezclaron a una razón 1+1 (normalmente 20+20 μl) con PMN, se diluyeron 5 veces más utilizando PB (volumen final 200 μl) y se incubaron a TA durante 1 h con agitación. Posteriormente, las PMN se lavaron con posteridad 3 veces con PB, se resuspendieron en 500 μl de PB y se añadieron a los pocillos de la placa (100 μl/pocillo). Después de 10 min de incubación con agitación, se aplicó una etapa de lavado suave con pipeta multicanal y PB. Para crear una señal colorimétrica, se utilizó una solución de 10 mg/ml de OPD (dihidrocloruro de o-fenilendiamina) en tampón de citrato (0,05 M)-fosfato (0,2 M) (pH 4,6) con una adición de 27 μl/20 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. La reacción se detuvo utilizando ácido sulfúrico 3,6 M (100 μl con respecto a 100 μl de solución de OPD en los pocilios) después de 15 min de incubación a TA en la oscuridad. La señal se midió a 490 nm y TA inmediatamente.
Ejemplo 1:
En este ejemplo, se analizaron muestras de HPB (hiperplasia prostática benigna) y muestras de CaP mediante el método de la presente invención.
Resultados
En primer lugar, se analizaron biomarcadores individuales mediante el método de la presente invención.
Para ello, se aplicaron cinco lectinas diferentes (MAA-II, Con A, AAL, SNA-I y WFA, adquiridas de Vector Labs, EE. UU.) para el glicoperfilado de PSA en formato ELLA magnético mediante el método de la presente invención (p. ej., Fig. 1E) para descubrir las mejores lectinas aplicables en el glicoperfilado de PSA (p. ej., Fig. 2, 3 y 4) y comparar los resultados con una prueba convencional basada en PSA. De todas estas lectinas probadas, solo MAA-II fue un predictor positivo de cáncer de próstata (CaP) con Área Bajo la Curva (AUC) = 0,871 y otras tres lectinas fueron un predictor negativo de PCA con AUC = 0,305 para AAL, AUC = 0,395 para Con A y AUC=0,356 para SNA-I. Cuando las curvas de características operativas del receptor (ROC) se invirtieron en un predictor positivo, se encontraron valores de AUC para AAL de 0,695, para Con A de 0,605 y para SNA-I de 0,645 (p. ej., Fig. 2). El número total de muestras en los ejemplos fue el siguiente: 8 HPB (p. ej., Ejemplo 1), 8 muestras de suero CaP sin (p. ej., Ejemplos 1 y 2) y 8 muestras de suero CaP con metástasis (p. ej., Ejemplo 2). Las muestras de suero no fueron pretratadas. Los resultados se resumen en el Tabla 2 a continuación, que muestra los valores de AUC, sensibilidad y especificidad y también se muestran en las Fig. 2, 3 y 4 más abajo.
Tabla 2: Rendimiento de los biomarcadores individuales sometidos a prueba.
Figure imgf000048_0001
En segundo lugar, se analizaron biomarcadores dobles mediante el método de la presente invención.
Dado que la lectina MAA mostró el mejor rendimiento (véase más arriba) por el método de la presente invención (p. ej., Fig. 1E) las combinaciones de lectina MAA con otras lectinas se analizaron adicionalmente en cuanto a sus respectivas propiedades predictivas y se compararon con los resultados de una prueba convencional basada en PSA. Los resultados mostraron que tres combinaciones diferentes de MAA con otra lectina, es decir, MAA+AAL (AUC=0,91), MAA+Con A (AUC=0,95) y MAA+SNA (AUC=0,95) (p. ej., Tabla 3 a continuación) mostró un mejor rendimiento que MAA sola (a Uc = 0.87) (p. ej., Tabla 2 más arriba). La combinación MAA+WFA (Au C=0,84) (p. ej., Tabla 3) mostró un rendimiento ligeramente inferior en comparación con el biomarcador MAA único (AUC = 0,87) (p. ej., Tabla 2). Los resultados también se muestran en la más abajo.
Tabla 3: Rendimiento de los biomarcadores dobles sometidos a prueba.
Figure imgf000048_0002
En tercer lugar, se analizaron biomarcadores triples mediante el método de la presente invención.
Aquí se probaron combinaciones de tres lectinas diferentes para ver si sería posible predecir mejor el CaP en los pacientes mediante el método de la presente invención (p. ej., Fig. 1E) y comparar los resultados con una prueba convencional basada en PSA. Los resultados mostraron que, al utilizar una combinación de tres lectinas, el AUC estaba en el rango de 0,87 a 0,93 (p. ej., Tabla 4 más abajo), lo que era un peor resultado en comparación con los biomarcadores dobles MAA+Con A (AUC=0,95) y MAA+SNA (AUC=0,95) (p. ej., Tabla 3 más arriba) y se concluyó que era ligeramente mejor utilizar biomarcadores dobles en lugar de biomarcadores triples. Los resultados también se muestran en la Fig. 6 más abajo.
Tabla 4: Rendimiento de los biomarcadores triples sometidos a prueba.
Figure imgf000049_0001
En cuarto lugar, se analizaron biomarcadores cuádruples y pentadruples mediante el método de la presente invención. Aquí se probaron combinaciones de cuatro y cinco lectinas diferentes para ver si sería posible predecir mejor el CaP en los pacientes mediante el método de la presente invención (p. ej., Fig. 1E) y comparar los resultados con una prueba convencional basada en PSA. Los resultados mostraron que al utilizar una combinación de tres lectinas, el AUC estaba en el rango de 0,89 a 0,92 (p. ej., Tabla 5 más abajo), lo que era ligeramente peor en comparación con los biomarcadores dobles MAA+Con A (AUC=0,95) y MAA+SNA (a Uc =0,95) (p. ej., Tabla 3 más arriba) y se concluyó que era ligeramente mejor utilizar biomarcadores dobles en lugar de biomarcadores cuádruples y pentadruples. Los resultados no se muestran en forma de curva ROC.
Tabla 5: Rendimiento de los biomarcadores cuádruples sometidos a prueba.
Figure imgf000049_0002
Conclusión 1
Biomarcadores individuales: Tres de cada cuatro lectinas, es decir, AAL, Con A y SNA-I, son predictores negativos de CaP, mientras que MAA-II es un predictor positivo de la enfermedad. El mejor biomarcador es MAA-II, cuando se tienen en cuenta los valores de AUC (0,87) y la sensibilidad y especificidad del diagnóstico de CaP y el rendimiento de otras lectinas para el diagnóstico es bastante similar en términos de valores de AUC y sensibilidad y especificidad del diagnóstico de CaP.
Biomarcadores dobles: La combinación de MAA+Con A (AUC=0,95) y MAA+SNA (AUC=0,95) mostró el mejor rendimiento y la combinación de MAA+AAL (AUC=0,91) mostró un rendimiento ligeramente mejor en comparación con MAA individual (AUC=0,87).
Biomarcadores triples, cuádruples y pentadruples: La combinación de tres, cuatro y cinco lectinas no superó el rendimiento de los biomarcadores dobles MAA+Con A y MAA+SNA, por lo que estos dos biomarcadores dobles son los mejores biomarcadores para distinguir pacientes con HBP y CaP.
Ejemplo 2:
En este ejemplo, se analizaron muestras de CaP con metástasis (CaP+) y muestras de CaP sin metástasis (CaP-) mediante el método de la presente invención (p. ej., Fig. 1E).
Resultados
Aquí, se investigó la posibilidad de utilizar biomarcadores de glicano para distinguir pacientes con CaP+ de pacientes con CaP- utilizando lectinas y los resultados mostraron que las lectinas AAL (AUC=0,742), Con A (AUC=0,805) (p. ej., Fig. 7 y 8) tenían un mejor valor predictivo que PSA (AUC=0,672). La lectina MAA, que fue capaz de discriminar mejor entre pacientes con HBP y CaP, tuvo el mismo valor predictivo de CaP+ frente a CaP+ (AUC=0,672) que PSA (AUC=0,672) (p. ej., Fig. 7 y 8). La lectina SNA (AUC=0,648) tuvo un valor predictivo ligeramente más bajo en comparación con PSA (AUC=0,672) (p. ej., Fig.7 y 8). Esto significa que las lectinas se pueden aplicar de forma eficaz para el diagnóstico de diferentes estadios del CaP.
El rendimiento del mejor biomarcador individual MAA II se comparó con el rendimiento del PSA en forma de diagrama de caja como se muestra en las Fig.9 y 10. La lectina MAA puede distinguir muy bien entre pacientes con HPB y CaP-(p = 0,0003), mientras que la capacidad para distinguir entre pacientes con CaP- y CaP+ fue ligeramente peor (p>0,05), lo que puede ser causado por el tratamiento de pacientes con CaP+. MAA II también tuvo la capacidad de distinguir muy bien entre pacientes con HPB y CaP (pacientes combinados con CaP- y CaP+) con p = 0,0005. Como ya se discutió, el uso de curvas ROC para MAA II no discrimina muy bien entre pacientes con CaP- y CaP+ con p>0,05 (Fig.
9 y 10). Al considerar el PSA, estos biomarcadores se comportaron ligeramente peor, en comparación con el biomarcador MAA II. (Fig. 9 y 10).
Conclusión 2
Se concluyó que dos lectinas tienen la capacidad de discriminar entre muestras CaP- y CaP+ (es decir, AAL y Con A mejor que PSA) y que existe la posibilidad de aplicar lectinas no solo para distinguir pacientes con HPB frente a CaP, sino también para distinguir varios estadios del CaP.
Ejemplo 3:
En este ejemplo, se llevó a cabo el glicoperfilado de todo el suero sin utilizar un anticuerpo en muestras de HPB y CaP. En primer lugar, las partículas magnéticas (PM) se incubaron con suero humano diluido para tener el mismo nivel de PSA (como en los experimentos anteriores 0,72 ng/ml) utilizando solo 20 μL de una muestra como de costumbre, seguido del análisis de la misma cantidad de muestras de suero humano como de costumbre.
Resultados
Los resultados mostraron un valor de AUC de solo 0,547 (p. ej., Fig. 11), que es un valor muy bajo, lo que indica un poder de discriminación casi nulo entre pacientes con HPB y CaP.
Ejemplo 4:
En este ejemplo, el glicoperfilado de PSA después de su liberación de partículas magnéticas se llevó a cabo utilizando el enfoque de la técnica anterior, es decir, utilizando tampón de elución suave Ag/Ab, pH 6,6
La incubación de suero humano diluido se llevó a cabo como se describe anteriormente para el Experimento 3 con PM con anticuerpo anti-PSA inmovilizado (Abcam, Reino Unido). La liberación de PSA de las partículas magnéticas se repitió 3 veces utilizando un tampón de elución (tampón de elución suave Ag/Ab, pH 6,6). La desalinización del PSA liberado se llevó a cabo utilizando columnas de desalinización por rotación Zeba, MWCO 10 kDa (Thermo). Incubación de PSA liberado y desalinizado con placa ELISA que tiene anticuerpo anti-PSA inmovilizado. La incubación de las placas ELISA se llevó a cabo con un producto conjugado HRP-MAA-II (EYLabs, EE. UU.).
Resultados
Los resultados obtenidos mostraron un valor de AUC de solo 0.523 (p. ej., Fig. 12), que nuevamente es un valor muy bajo, lo que indica que casi no hay poder de discriminación entre pacientes con HBP y CaP.
Ejemplo 5:
En este ejemplo, el glicoperfilado de PSA se llevó a cabo como se describe anteriormente con un anticuerpo inmovilizado sobre una superficie sólida, aquí una placa ELISA. Se utilizó MAA-II como lectina.
Resultados
El valor de AUC para la lectina MAA fue de 0,518 (véase la Fig. 13). Este valor de AUC es inferior a los valores de AUC observados cuando se emplea un anticuerpo que no está inmovilizado sobre una superficie sólida, sino unido a una cuenta, p. ej., una cuenta magnética (véanse, p. ej., las Fig. 3 o 4). El valor bajo de AUC indica que casi no es posible el poder de discriminación entre pacientes con HPB y CaP.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar el perfil de glicosilación de una proteína, que comprende
(a) poner en contacto una muestra que comprende dicha proteína con un anticuerpo dirigido contra dicha proteína para formar un complejo anticuerpo-proteína;
(b) aislar el complejo anticuerpo-proteína obtenido en la etapa (a); y
(c) poner en contacto el complejo anticuerpo-proteína con una o más lectinas para determinar el perfil de glicosilación de dicha proteína,
en donde dicho anticuerpo de la etapa (a) no se inmoviliza sobre una superficie sólida, y en donde dicha proteína no se libera de dicho anticuerpo mientras se realiza el método.
2. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente la etapa (d) comparar el perfil de glicosilación de dicha proteína con un perfil de glicosilación de control de dicha proteína para determinar si el perfil de glicosilación de dicha proteína puede desviarse del perfil de glicosilación de dicho perfil de glicosilación de control.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína es una proteína biomarcadora de cáncer, una proteína biomarcadora de enfermedades autoinmunitarias o una proteína biomarcadora de enfermedades inflamatorias.
4. El método de la reivindicación 3, en donde dicha proteína biomarcadora de cáncer es una proteína biomarcadora de cáncer de ovario, una proteína biomarcadora de cáncer de mama, una proteína biomarcadora de cáncer colorrectal, una proteína biomarcadora de cáncer de páncreas, una proteína biomarcadora de cáncer de próstata, una proteína biomarcadora de cáncer de tiroides, una proteína biomarcadora de cáncer de hígado, una proteína biomarcadora de cáncer de pulmón, proteína biomarcadora de cáncer de estómago, proteína biomarcadora de cáncer testicular o proteína biomarcadora de cáncer de vejiga.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la proteína biomarcadora de cáncer de próstata es p-haptoglobina, TIMP-1, PSA, fPSA o tPSA.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo comprende una cuenta que permite el aislamiento de dicho anticuerpo.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas una o más lectinas son específicas para fucosa del núcleo, fucosa antenaria, Fuca1-6GlcNAc-N-Asn que contiene oligosacáridos unidos a N, Fuca1-6/3GlcNAc, a-L-Fuc, Fuca1-2Galp1-4(Fuca1-3)GlcNAc, Fuca1-2Gal, Fuca1-6GlcNAc, Manp1-4GIcNAcp1-4GIcNAc, Hexa-sacárido unido a N ramificado, Mana1-3Man, a-D-Man, (GlcNAcp1-4)2-4, Galp1-4GlcNAc, GlcNAca1-4Galp1-4GlcNAc, (GlcNAcp1-4)2-5, Neu5Ac (ácido siálico), Galp1-3GalNAc-serina/treonina, Gala1-3GalNAc, Galp1-6Gal, Galp1-4GlcNAc, Galp1-3GalNAc, GalNAca1-3GalNAc, GalNAca1-3Gal, GalNAca/p1-3/4Gal, a-GalNAc, GaINAcp1-4Gal, GalNAca1-3(Fuca1-2)Gal, GalNAca1-2Gal, GalNAca1-3GalNAc, GaINAcp1-3/4Gal, GaINAc-Ser/Thr (antígeno Tn), Galp1-3GalNAc-Ser/Thr (antígeno T), GaINAcp1-4GIcNAc (LacdiNAc), a-2,3Neu5Ac (ácido siálico con enlaces a2-3), a-2,6Neu5Ac (ácido siálico con enlaces a2-6), a-2,8Neu5Ac (ácido siálico con enlaces a2-8), ácido siálico (a-2,3Neu5Ac, a-2,6Neu5Ac o a-2,8Neu5Ac), Neu5Aca4/9-O-Ac-Neu5Ac, Neu5Aca2-3Galp1-4Glc/GlcNAc, Neu5Aca2-6Gal/GalNAc, biantenario unido a N, tri/tetra-antenario unido a N, p1-6GlcNAc ramificado, Gala1-3(Fuca1-2)Galp1-3/4GlcNAc, Galp1 -3(Fuca1 -4)GIcNAc, NeuAca2-3Galp1 -3(Fuca1 -4)GlcNAc, Fuca1 -2Galp1-3(Fuca1 -4)GIcNAc, Galp1 -4(Fuca1 -3)GlcNAc, NeuAca2-3Galp1 -4(Fuca1 -3)GlcNAc, Fuca1 -2Galp1 -4(Fuca1 -3)GlcNAc, alto contenido de manosa, antígeno sialil Lewisa (sialil Lea), antígeno sialil Lewisx (sialil Lex), antígeno Lewisx (LeX), antígeno sialil Tn, antígeno sialil T, antígeno Lewisy (Ley), glicano del núcleo 1 sulfatado, antígeno Tn, antígeno T, glicano del núcleo 2, antígeno Lewisa (Lea), (GlcNAcp1-4)n, p-D-GlcNAc, GaINAc, Gal-GIcNAc, GlcNAc, Gala1-3Gal, Galp1-3GalNAc, a­ Gal, a-GalNAc, (GlcNAc)n, (LacNAc)n ramificado.
8. Un método para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir cáncer, que comprende
(a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto, comprendiendo dicha muestra una proteína biomarcadora de cáncer, con un anticuerpo dirigido contra dicha proteína biomarcadora de cáncer para formar un complejo anticuerpo-proteína biomarcadora de cáncer; y
(b) aislar el complejo anticuerpo-proteína obtenido en la etapa (a); y
(c) poner en contacto el complejo anticuerpo-proteína biomarcadora de cáncer con una o más lectinas para determinar el perfil de glicosilación de dicha proteína biomarcadora de cáncer,
en donde dicho anticuerpo de la etapa (a) no se inmoviliza sobre una superficie sólida, y en donde dicha proteína no se libera de dicho anticuerpo mientras se realiza el método,
en donde una desviación de dicho perfil de glicosilación del perfil de glicosilación saludable de dicha proteína biomarcadora de cáncer es indicativa de que dicho sujeto puede estar en riesgo de, o puede sufrir, cáncer.
9. Un método para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo de, o puede sufrir, una enfermedad autoinmunitaria, que comprende
(a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto, comprendiendo dicha muestra una proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria, con un anticuerpo dirigido contra dicha proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria para formar un complejo anticuerpo-proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria; y
(b) aislar el complejo anticuerpo-proteína obtenido en la etapa (a); y
(c) poner en contacto el complejo anticuerpo-proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria con una o más lectinas para determinar el perfil de glicosilación de dicha proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria,
en donde dicho anticuerpo de la etapa (a) no se inmoviliza sobre una superficie sólida, y en donde dicha proteína no se libera de dicho anticuerpo mientras se realiza el método,
en donde una desviación de dicho perfil de glicosilación del perfil de glicosilación saludable de dicha proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria es indicativa de que dicho sujeto puede estar en riesgo de, o puede sufrir, una enfermedad autoinmunitaria.
10. Un método para diagnosticar si un sujeto puede estar en riesgo de, o puede sufrir, una enfermedad inflamatoria, que comprende
(a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto, comprendiendo dicha muestra una proteína biomarcadora de enfermedad inflamatoria, con un anticuerpo dirigido contra dicha proteína biomarcadora de enfermedad inflamatoria para formar un complejo anticuerpo-proteína biomarcadora inflamatoria; y
(b) aislar el complejo anticuerpo-proteína obtenido en la etapa (a); y
(c) poner en contacto el complejo anticuerpo-proteína biomarcadora inflamatoria con una o más lectinas para determinar el perfil de glicosilación de dicha proteína biomarcadora de enfermedad inflamatoria,
en donde dicho anticuerpo de la etapa (a) no se inmoviliza sobre una superficie sólida, y en donde dicha proteína no se libera de dicho anticuerpo mientras se realiza el método,
en donde una desviación de dicho perfil de glicosilación del perfil de glicosilación saludable de dicha proteína biomarcadora de enfermedad inflamatoria es indicativa de que dicho sujeto puede estar en riesgo o puede sufrir una enfermedad inflamatoria.
11. Un uso de un kit para realizar el método de la reivindicación 8, que comprende un anticuerpo específico para una proteína biomarcadora de cáncer como se define en la reivindicación 4 y una o más lectinas como se define en la reivindicación 7.
12. Un uso de un kit para realizar el método de la reivindicación 9, que comprende un anticuerpo específico para una proteína biomarcadora de enfermedad autoinmunitaria, que es IgG y una o más lectinas como se define en la reivindicación 7.
13. Un uso de un kit para realizar el método de la reivindicación 10, que comprende un anticuerpo específico para una proteína biomarcadora inflamatoria, que es IgG, IgA o PCR y una o más lectinas como se define en la reivindicación 7.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en donde se inmovilizan dichas una o más lectinas.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho anticuerpo se une a un portador magnético.
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