KR20240035629A - 단백질의 당 프로파일링을 위한 표준물질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당단백질을 위한 표준물질로서 신당단백질(neoglycoprotein)을 이용하여 신호를 상대화하는 방법 및 상기 신당단백질의 상응하는 용도에 관한 것으로, 상기 신당단백질은 비오틴을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함한다. 따라서, 특정 글리칸 구조(A)가 목적 단백질에 존재하는지 여부를 설명하는 것이 가능하다. 암, 자가면역질환 또는 염증성 질환과 같은 질병 진단에 대한 응용이 개시된다.

Description

단백질의 당 프로파일링을 위한 표준물질
본 발명은 당단백질을 위한 표준물질로서 신당단백질(neoglycoprotein)을 이용하여 신호를 상대화하는 방법 및 상기 신당단백질의 상응하는 용도에 관한 것으로, 상기 신당단백질은 비오틴을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나, 바람직하게는 4개의 미리 정의된 글리칸 결정자(들)(glycan determinant(s))에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함한다. 따라서, 특정 글리칸 구조(A)가 목적 단백질에 존재하는지 여부를 설명하는 것이 가능하다. 암, 자가면역질환 또는 염증성 질환과 같은 질병 진단에 대한 응용이 개시된다.
글리칸은 다양한 상이한 단백질들에 존재하며 단백질 이동, 안정성 및 폴딩에 영향을 미치고 궁극적으로 이의 생화학적 및 생물리학적 특성들을 변경한다. 또한, 글리칸은 단백질분해 패턴을 중재하거나 리간드-수용체 상호 작용, 발암성 신호전달(signaling transduction), 면역 인지, 이동 및 세포-세포와 세포-기질 접착 모두를 직접 중재할 수 있다. 이처럼, 특정 글리칸은 종양 세포에 대해 선택적 이점을 발휘할 수 있다. 따라서 특정 글리칸의 존재 또는 특정 단백질 상의 특정 글리칸의 존재는 예를 들어 암 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있다.
글리칸 구조는 특정 글리칸 구조에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 사용하여 분석될 수 있다. 글리칸 구조에 특이적인 항체 외에 렉틴도 사용될 수 있다. 렉틴은 다른 분자의 일부인 당 그룹에 매우 특이적인 탄수화물 결합 단백질이다. 이들 결합 분자는 특정 글리칸 구조의 존재 또는 부재를 분석하기 위해 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 효소 결합 렉틴 분석(ELLA), 자기 ELLA(MELLA)와 같은 분석에 사용될 수 있다.
그러나 이러한 방법을 적용하여 얻은 신호는 특정 글리칸 구조가 존재하는지 여부에 대한 유효한 설명을 위해 또는 샘플에서 이를 정량화하기 위해 (양성) 대조군 또는 표준물질에 의해 상대화되어야 힌다. 상업적으로 이용 가능한 당단백질 표준물질에는 목적하는 글리칸 구조와 동일하지 않은 단 하나의 글리칸 구조만 포함되어 있다. 즉, 이는 질병과 관련된 글리칸 구조가 목적 단백질에 존재하는지 여부를 평가하는 데 사용될 수 없다. 따라서 특정 글리칸 구조를 포함하는 단백질 표준물질은 쉽게 이용할 수 없다. 이러한 대조군을 얻을 수 있는 한 가지 가능성은 목적하는 글리칸 구조를 목적 단백질에 컨쥬게이트시키는 것이다. 그러나 이는 복잡하고 노동집약적이며 비용이 많이 든다. 또한, 이는 목적하는 글리칸 구조와 목적 단백질의 모든 새로운 조합에 대해 반복되어야 한다.
결과적으로, 신뢰할 수 있고 저렴하며 다양한 당단백질 표준물질에 대한 지속적인 요구가 있다. 본 발명은 이러한 요구를 해결하는 것을 목표로 한다.
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이러한 필요성은 청구범위 및 본 명세서에 기술된 구체예에 정의된 요지에 의해 해결된다.
본 발명자들은 놀랍게도 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 결정함으로써 얻은 신호를 상대화하기 위해 이러한 변형된 목적 (당)단백질을 제공할 필요 없이 대신에 신당단백질이 표준물질로 사용될 수 있음을 발견하였다. 이 표준물질은 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)를 제공한다. 신당단백질은 비오틴을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함한다. 따라서 스트렙타비딘은 그 자체로 상대화를 위한 표준물질로서 작용하는 신당단백질의 스캐폴드로 볼 수 있다. 실시예에 도시된 바와 같이, 비오틴화된 글리칸 구조(A)가 로딩된 스트렙타비딘이 표준물질로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상대화하는 방법에 관한 것으로, 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호를 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하되, 상기 신당단백질은 비오틴을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하고, 이로써, 상기 신호(1)을 상기 신호(2)에, 또는 그 반대로 상대화하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상대화하는 방법에 관한 것으로, 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호를 표준물질로서 작용하는 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되, 상기 신당단백질은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하고, 상대화는 신호(1)을 표준물질로부터의 신호(2)와 비교하여, 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시킴으로써, 상기 신호(1)을 상기 신호(2)에, 또는 그 반대로 상대화하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)에 상대화하기 위해, 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 실제로 포함하는 적어도 하나의 미리 결정된 글리칸 결정자에 비오틴을 통해 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하는 신당단백질의 용도에 관한 것으로, 상기 신당단백질은 스트렙타비딘-결합 분자를 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 결정된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함한다.
또한, 본 발명은 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)에 상대화하기 위해 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 실제로 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 비오틴을 통해 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하는 표준물질로서 작용하는 신당단백질의 용도에 관한 것으로, 상기 신당단백질은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하고, 상대화는 신호(1)을 표준물질로부터의 신호(2)와 비교하여 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시키는 것을 포함한다.
상대화는 신호(1)을 표준물질로부터의 신호(2)와 비교하여 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시키는 것을 포함할 수 있다. 유리하게는, 이러한 비교로, 신호(1)은 상기 신호(2)에, 또는 그 반대로 상대화된다.
상대화는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호를 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되, (i) 신호(1)이 신호(2)보다 낮은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하지 않음을 나타내고, 또는 (ii) 신호(1)이 신호(2)와 같거나 높은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재함을 나타낸다.
상대화는 또한 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)과 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)의 농도 시리즈를 결정하여 얻은 신호(2)를 비교하는 것을 포함할 수 있다.
농도 시리즈는 상기 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 알려진 미리 결정된 임계 농도 이상에 상응하는 농도를 포함할 수 있다.
신호는 신호 강도일 수 있다.
신호(1) 및 신호(2)는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 효소 결합 렉틴 분석(ELLA), 자기 ELLA(MELLA), 바람직하게는 ELLA 또는 MELLA에 의해 얻을 수 있다.
글리칸 구조(A)는 코어 푸코스(core fucose), 안테나 푸코스(antennary fucose), N-결합 올리고당을 함유하는 Fucα1-6GlcNAc-N-Asn, Fucα1-6/3GlcNAc, a-L-Fuc, Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Fucα1-2Gal, Fuca1-6GlcNAc, Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc, 분지형 N-결합 육당류(branched N-linked hexa-saccharide), Manα1-3Man, α-D-Man, (GlcNAcβ1-4)2-4, Galβ1-4GlcNAc, GlcNAcα1-4Galβ1-4GlcNAc, (GlcNAcβ1-4)2-5, Neu5Ac(시알산), Galβ1-3GalNAc-세린/트레오닌, Galα1-3GalNAc, Galβ1-6Gal, Galβ1-4GlcNAc, Galβ1-3GalNAc, GalNAcα1-3GalNAc, GalNAcα1-3Gal, GalNAcα/β1-3/4Gal, α-GalNAc, GalNAcβ1-4Gal, GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal, GalNAcα1-2Gal, GalNAcα1-3GalNAc, GalNAcβ1-3/4Gal, GalNAc-Ser/Thr(Tn 항원), Galβ1-3GalNAc-Ser/Thr(T 항원), GalNAcβ1-4GlcNAc(LacdiNAc), α-2,3Neu5Ac(α2-3 결합 시알산), α-2,6Neu5Ac(α2-6 결합 시알산), α-2,8Neu5Ac(α2-8 결합 시알산), 시알산(α-2,3Neu5Ac, α-2,6Neu5Ac 또는 α-2,8Neu5Ac), Neu5Acα4/9-O-Ac-Neu5Ac, Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc/GlcNAc, Neu5Acα2-6Gal/GalNAc, N-결합 이중 안테나(N-linked bi-antennary), N-결합 삼중/사중 안테나(N-linked tri/tetra-antennary), 분지형 β1-6GlcNAc, Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3/4GlcNAc, Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, 고 만노스(high mannose), 시알릴 루이스a(sialyl Lewisa)(시알릴 Lea) 항원, 시알릴 루이스x(시알릴 Lex) 항원, 루이스x(Lex) 항원, 시알릴 Tn 항원, 시알릴 T 항원, 루이스y(Ley) 항원, 황산화 코어1 글리칸(sulfated core1 glycan), Tn 항원, T 항원, 코어 2 글리칸, 루이스a(Lea) 항원, (GlcNAcβ1-4)n, β-D-GlcNAc, GalNAc, Gal-GlcNAc, GlcNAc, Galα1-3Gal, Galβ1-3GalNAc, α-Gal, α-GalNAc, (GlcNAc)n, 분지형 (LacNAc)n로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
목적 단백질은 암 바이오마커 단백질, 자가면역질환 바이오마커 단백질 또는 염증성 질환 바이오마커 단백질일 수 있다. 상기 암 바이오마커 단백질은 난소암 바이오마커 단백질, 유방암 바이오마커 단백질, 대장암(colorectal cancer) 바이오마커 단백질, 췌장암 바이오마커 단백질, 전립선암 바이오마커 단백질, 갑상선암 바이오마커 단백질, 간암 바이오마커 단백질, 폐암 바이오마커 단백질, 위암 바이오마커 단백질, 고환암 바이오마커 단백질 또는 방광암 바이오마커 단백질 수 있다. 상기 전립선암 바이오마커 단백질은 β-합토글로빈, TIMP-1, PSA, fPSA 또는 tPSA일 수 있다.
상기 글리칸 구조(A)의 존재는 암의 지표일 수 있다.
본 발명은 비제한적인 실시예 및 첨부 도면과 함께 고려할 때 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 본 발명의 예시 구체예의 예시적인 도식을 묘사한다. MAA-II 렉틴 및 선택적으로 BSA와 같은 차단제는 ELISA 플레이트 웰의 바닥에 물리적으로 흡착된다. 함께 고정된 항스트렙타비딘 항체와 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 있는 자성 입자는 분석물(이 경우 글리칸-스트렙타비딘 바이오컨쥬게이트)를 선택적으로 제거하는 데 사용되며 이후 렉틴-생체인식 인터페이스에 적용된다. o-페닐렌디아민과 과산화수소를 사용하면 광학 신호가 생성되고 일반적인 ELISA 판독기(예: λ = 450-490 nm)로 검출되는 착색 산물인 2,3-디아미노페나진을 형성한다.
도 2A는 스트렙타비딘(왼쪽 열) 및 MAA-II 렉틴(오른쪽 열)에 대한 pH 스카우팅 중 기울기 값을 묘사한다. 도 2B는 CM5 칩을 사용하여 pH 4.0 아세테이트 완충액에서 3종의 상이한 리간드의 고정화를 묘사하는 센서그램을 도시한다.
도 3은 스트렙타비딘 변형된 CM5 칩에 대한 항스트렙타비딘 항체의 SCK(단일 주기 동역학) 분석을 보여준다.
도 4는 11-메르캅토운데칸산(B) 또는 카르복시메틸-덱스트란(C)의 자기 조립 단층에 의해 변형되어 각각 2D 및 3D 매트릭스를 생성하는 한 부위에 프리즘이 있는 노출된 Au SPR 칩(A)을 묘사한다. 소멸파 진폭은 기하급수적으로 감소하기 때문에(빨간색 화살표), 높은 음전하 농도, 입체 장애물 및 해리 단계 중 재결합 가능성이 높은 3D 매트릭스는 샌드위치 구성, 즉, MAA-II/신당단백질/Ab의 제조를 관찰하는 데 적합하지 않았다.
도 5는 각 단계 후 표면의 도식적 프레젠테이션(도 5A)과 항스트렙타비딘 항체의 결합 분석 및 신당단백질(글리코컨쥬게이트) 캡처의 센서그램(도 5B)을 포함하여 2D 구성에 사용되는 분석 워크플로우를 묘사한다.
도 6은 링커 밀도(2D 구성의 경우, 즉 매트릭스에 확산 장벽이 없는 경우)가 Au 표면 근처와 인터페이스에서 동일할 때 평면 표면(예를 들어, SPR 칩 A)의 모델 상황을 묘사한다. 그러나 구형 인터페이스(예를 들어, MNP, B)의 경우 상황이 다르다. 3종 샘플의 NTA 분석은 성공적인 고정화 및 신당단백질과의 상호작용을 도시한다(C).
도 7은 변형되지 않은 MNP(어두운 선) 및 MNP + Ab(과량의 항체가 사용된 경우, 밝은 선)의 NTA 분석을 묘사한다 - 표면에 고정된 항체로 인해 피크 최대값이 명백히 증가하는 것이 관찰되었다.
도 8은 신당단백질(단백질 표준물질)의 MS 분석을 묘사하며, ~13 kDa(단일 스트렙타비딘 단량체)에서 피크에 대한 최고 강도를 도시한다.
도 9는 다른 피크를 보여주는 MS 분석을 묘사한다(도 8에 비해 강도가 낮음). (A); 비오틴화된 글리칸에 해당하는 ~1030 Da의 피크는 순수한 스트렙타비딘이 포함된 샘플에서는 검출될 수 없지만(B), 글리칸/스트렙타비딘 비율이 낮고 탈염 절차 후에도 다른 모든 샘플에는 존재함으로써, 글리칸이 스트렙타비딘에 존재함을 함축한다(C) - 이는 SPR을 사용하여 이미 확인된 사실이다. 이 피크의 강도는 글리칸/스트렙타비딘 비율이 증가함에 따라 증가한다(D). ELLBA는 컨쥬게이트되지 않고 비오틴화된 MAA-II 렉틴(E)을 사용하여 경쟁적 구성에서 글리칸의 포화 밀도를 갖는 신당단백질을 제조하기 위한 최적의 비율을 찾는 데 사용되었으며, 여기서 1+5 이상의 비율이 최적인 것으로 입증되었다(F).
본 발명은 하기에 상세히 기술되며 또한 첨부된 실시예 및 도면에 의해 추가로 예시될 것이다.
가능한 경우, 선행기술에서 사용된 표준물질은 일반적으로 목적 단백질에 있는 것으로 의심되는 (목적) 글리칸 구조(A)로 표지된 목적 단백질이다. 따라서 선행기술의 표준물질은 글리칸 구조(A)를 포함하는 목적 단백질 그 자체이다. 그러나 그러한 표준물질을 합성하는 것은 복잡하고 시간 소모적이며 비용이 많이 든다. 따라서 본 발명은 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조를 결정하여 얻은 신호를 상대화하기 위한 신뢰할 수 있고 저렴하며 다용도의 글리칸 구조 또는 당단백질 표준물질을 제공하는 것을 목표로 한다.
본 발명자들은 놀랍게도 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 결정함으로써 얻은 신호를 상대화하기 위해 그러한 변형된 목적 (당)단백질을 제공할 필요가 없고, 대신 신당단백질이 표준물질로서 사용될 수 있음을 발견하였다. 신당단백질 상의 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 이 신호(2)는 신호(1)의 상대화를 가능케한다. 신당단백질은 비오틴을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함한다. 그리하여, 스트렙타비딘은 목적하는 글리칸 구조(A)가 결합될 수 있는 신당단백질의 스캐폴드로 볼 수 있다.
실시예에 도시된 바와 같이, 비오틴화된 글리칸 구조(A)가 로딩된 스트렙타비딘은 표준물질로 사용될 수 있다. 이는 단백질/스트렙타비딘 스캐폴드 상에 4개의 글리칸을 갖는 신당단백질을 형성하기 위해 최대 4개의 비오티닐-글리칸에 결합된 스트렙타비딘 분자로 구성된 본 명세서에 기술된 글리코컨쥬게이트 또는 예시적인 신당단백질을 개발하기 위한 첫 번째 연구이다. 동시에 본 발명의 컨셉은 비오틴화된 글리칸을 이용하여 스트렙타비딘의 표면에 존재하는 정의된 글리칸 구조(A)를 갖는 임의의 종류의 신당단백질을 제조할 수 있도록 한다. 그러한 (최대) 4개의 글리칸을 갖는 신당단백질은 그리고 나서 예를 들어 WO　2019/185515 A1에 개시된 MELLA 기술을 사용하여 상기 글리칸 구조(A)를 결정하기 위한 단백질 표준물질로서 사용될 수 있다. 예시 구체예에서, 그러한 신당단백질은 동시에 렉틴 및 항-스트렙타비딘 항체에, 즉, 샌드위치 구성으로 결합하여 광학 신호를 제공할 수 있으며, 이는 전립선암(무엇보다도) 진단학을 위한 Glycanostics's MELLA 프로토콜을 이용하여 샘플 분석 신호가 상대화될 수 있는 신호인 것으로 간주된다(도 1).
따라서, 본 발명은 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상대화하는 방법에 관한 것으로, 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호를 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하되, 상기 신당단백질은 비오틴을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하고, 이로써 상기 신호(1)을 상기 신호(2)에, 또는 그 반대로 상대화하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상대화하는 방법에 관한 것으로, 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호를 표준물질로서 작용하는 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되, 상기 신당단백질은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트펩타비딘 분자를 포함하고, 상대화는 신호(1)을 표준물질로부터의 신호(2)와 비교하여 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시킴으로써, 상기 신호(1)을 상기 신호(2)에, 또는 그 반대로 상대화하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)에 상대화하기 위해, 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 실제로 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 비오틴을 통해 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하는 신당단백질의 용도에 관한 것으로, 상기 신당단백질은 스트렙타비딘-결합 분자를 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함한다.
또한, 본 발명은 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)에 상대화하기 위해, 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 실제로 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 비오틴을 통해 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하는 표준물질로서 작용하는 신당단백질의 용도에 관한 것으로, 상기 신당단백질은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하고, 상대화는 신호(1)을 표준물질로부터의 신호(2)와 비교하여 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시키는 것을 포함한다.
"상대화(relativizing)"는 하나의 신호(1)을 다른 신호(2)와 비교하여 신호(1)이 신호(2)와 어떻게 연관되는 지에 대한 정보를 제공하는 공정을 설명하는 것으로 볼 수 있다. 신호(2)는 본 발명의 맥락에서 표준물질로 볼 수 있다. 다른 말로, 신호(2)는 신호(1)에서 얻은 정보, 예를 들어, 신호 강도를 맥락에 맞게 또는 연관시킨다. 그리하여, 신호(2)는 양성대조군으로서 작용하여 신호(1)을 양성으로 간주하는데 필요한 신호에 대한 정보를 제공할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 신호(2)는 양성대조군뿐만 아니라 농도 시리즈의 결과일 수 있으므로, 신호(1)을 상이한 농도의 신호(2)의 시리즈와 비교하여 글리칸 구조(A)의 양을 정량화할 수 있다. 이러한 맥락에서, 본 발명의 방법 및 용도는 또한 목적 단백질을 당 프로파일링하는 것으로 설명될 수 있다.
위와 같은 맥락에서, "상대화"는 신호(1)을 표준물질로부터의 신호(2)와 비교하여 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시키는 것을 포함할 수 있다. 유리하게는, 그러한 비교를 통해 신호(1)을 상기 신호(2)에, 또는 그 반대로 상대화한다.
용어 "단백질의 당 프로파일(glycoprofile)"은 목적 단백질의 탄수화물 구조, 예를 들어, 공유적으로 결합된 탄수화물의 조성 및/또는 구조, 예를 들어, 공유적으로 결합된 탄수화물의 양, 존재 또는 부재를 의미한다. 용어 "당 프로파일링(glycoprofiling)"은 목적 단백질의 탄수화물 구조를 결정하는 것(예를 들어, 공유적으로 결합된 탄수화물의 조성 및/또는 구조, 예를 들어, 공유적으로 결합된 탄수화물의 양, 존재 또는 부재)을 의미한다.
신호(1) 및 신호(2)에 의해 제공된 정보는 글리칸 구조(A)가 목적 단백질에 존재하는지 여부에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 신호(1)(상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은)은 표준물질/신호(2)(상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은)와 비교(상대화) 된다. 신호(1)이 신호(2)와 같거나 높은 경우, 상기 글리칸 구조(A)는 목적 단백질에 존재하는 것으로 간주됨을 나타낸다. 따라서, 상대화는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되, 신호(1)이 신호(2)보다 낮으면, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하지 않음을 나타낸다.
그렇지 않으면, 신호(1)이 신호(2)보다 낮으면, 상기 글리칸 구조(A)는 목적 단백질에 존재하지 않는 것으로 간주됨을 나타낸다. 따라서, 상대화는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함할 수 있으며, 신호(1)이 신호(2)와 같거나 높은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재함을 나타낸다.
그러나, 본 발명의 방법 및 용도는 정성적 설명으로 제한되지 않는다. 반대로, 신호(1)이 신당단백질의 상이한 농도 시리즈에서 결정되는 신호(2)의 시리즈와 비교되는 경우, 샘플에서 목적 단백질에 있는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)의 양을 정량적으로 분석할 수 있다. 따라서, 상대화(본 발명의 방법 및 용도에서)는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)의 농도 시리즈를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 "농도 시리즈"는 신당단백질의 둘 이상의 상이한 농도에서 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)의 데이터 세트에 관한 것이다. 데이터 세트는 예를 들어 선형 회귀에 의해 표준 곡선을 제공하거나 계산하는데 사용되어 샘플에서 신호(강도)로부터 글리칸 구조(A)의 실제 수준 또는 양에 대한 결론을 내릴 수 있게 한다. 농도 시리즈는 또한 글리칸 구조(A)가 목적 단백질에 존재하는 것으로 간주되는 신호(강도)를 제공하는 미리 결정된 임계값을 설정할 수 있다. 다르게 말하면, 농도 시리즈는 신당단백질이 분석될 샘플에 (농도 시리즈에서) 추가되지 않은 데이터 포인트에 대한 기준선(임계값)을 설정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 농도 시리즈는 또한 상기 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 알려진 미리 결정된 임계 농도 이상에 상응하는 농도를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "신당단백질"은 스트렙타비딘 분자에 관한 것으로, 적어도 1개 및 최대 4개, 즉, 1, 2, 3 또는 4개, 바람직하게는 4개의 비오틴화된 글리칸 구조(A)가 비오틴-스트렙타비딘 상호작용에 의해 비공유적으로 결합된다. 따라서, 신당단백질은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 결합된다. 그리하여 스트렙타비딘은 원하는 글리칸 구조(A)에 결합될 수 있는 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 그리하여, 매우 다양하고 빠르게 이용 가능한 신당단백질 표준물질이 제공될 수 있다. 따라서, 글리칸 구조(A)는 스트렙타비딘에 바람직하게는 과량으로, 예를 들어, 적어도 4:1(글리칸 구조(A):스트렙타비딘), 적어도 5:1, 적어도 7.5:1 또는 적어도 10:1의 몰 비율로 추가된다. 바람직하게는, 글리칸 구조(A)는 4.5:1 내지 5.5:1의 몰 비율, 가장 바람직하게는 5:1의 몰 비율로 스트렙타비딘에 추가된다.
"스트렙타비딘"은 세균 스트렙토마이세스 아비디니이(Streptomyces avidinii)로부터 정제된 단백질이다. 스트렙타비딘 동형-사량체(homo-tetramer)는 비오틴(비타민 B7 또는 비타민 H로도 알려져 있음)에 대해 매우 높은 친화도를 갖는다. 약 10-14 mol/L 정도의 해리 상수(Kd)를 갖는 스트렙타비딘에 대한 비오틴의 결합은 자연에서 알려진 가장 강한 비-공유 상호작용 중 하나이다. 야생형 스트렙타비딘의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다: MRKIVVAAIAVSLTTVSITASASADPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ (SEQ ID NO: 1). 스트렙타비딘의 예시적인 야생형 서열은 또한 1991년 8월 1일자로 UniProt database entry P22629, version 1에 도시되어 있다. 본 명세서에 사용된 스트렙타비딘은 예를 들어 본 명세서에 기술된 방법 또는 용도의 맥락에서 또한 스트렙타비딘 뮤테인을 포함한다. 스트렙타비딘 뮤테인은 예를 들어, WO　2017/186669 또는 WO　2014/076277에 개시되어 있다. 본 발명의 방법 또는 용도에 사용된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 N- 또는/및 C-말단이 짧아진 스트렙타비딘 변이체로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩타이드는 N-말단이 아미노산 위치 10 내지 16의 영역에서 시작하고, C-말단이 아미노산 위치 133 내지 142의 영역에서 끝나는 최소 스트렙타비딘의 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 스트렙타비딘 뮤테인 폴리펩타이드는 바람직하게는 위치 Ala13 내지 Ser139의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 Ala13 대신 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 돌연변이 영역 외의 최소 스트렙타비딘에 상응한다. 본 출원에서 아미노산 위치의 넘버링은 또한 전부 등록번호 UniProtKB - P22629, v1(1991.08.01)로 기탁된 성숙한 wt-스트렙타비딘의 넘버링을 지칭한다(Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871-1882, SEQ ID NO: 1 참조). 본 명세서에 사용된 "스트렙타비딘"은 본 명세서에 기술된 방법 또는 용도의 맥락에서 또한 스트렙타비딘 이외의 다른 비오틴-결합 모이어티, 예를 들어 비오틴에 결합하는 단백질 또는 압타머에 관한 것일 수 있다.
스트렙타비딘은 실질적으로 SEQ ID NO:　1과 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 스트렙타비딘은 SEQ ID NO:　1과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 스트렙타비딘은 SEQ ID NO:　1과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 사용될 때, 용어 "동일한 퍼센트(%)" 또는 "퍼센트(%) 동일성"은 둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 둘 이상의 서열 또는 하위서열이 동일한 정도를 지칭한다. 그들이 비교되는 영역에 대해 아미노산 또는 뉴클레오티드의 같은 서열을 갖는 경우, 두 서열은 "동일"하다. 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 육안 검사를 통해 측정된 대로 비교 창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 대응을 위해 비교 및 정렬된 경우, 두 서열이 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 비율이 동일한 경우(즉, 특정 영역 또는 특정되지 않은 전체 서열에 대해 60% 동일성, 선택적으로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성), 두 서열은 "실질적으로 동일"하다. 선택적으로, 동일성은 적어도 약 30개의 뉴클레오티드(또는 10개의 아미노산) 길이인 영역, 보다 바람직하게는 100 내지 500 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드(또는 20, 50, 200 또는 그 이상의 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 상동성 또는 서열 동일성의 퍼센트는 예를 들어 프로그램 BLASTP, version blastp 2.2.5 (November 16, 2002)(cf. Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997)를 사용하여 본 명세서에서 결정될 수 있다. 이 구체예에서, 상동성의 퍼센트는 바람직하게는 쌍별 비교에서 야생형 단백질 스캐폴드를 레퍼런스로 사용하여 프로펩타이드 서열을 포함하는 전체 폴리펩타이드 서열(매트리스: BLOSUM 62; 갭 코스트: 11.1; 컷-오프 값은 10-3로 설정됨)의 정렬에 기초한다. 이는 BLASTP 프로그램 출력의 결과로 표시된 "양성"(상동 아미노산) 수의 퍼센트를 정렬을 위해 프로그램에서 선택한 총 아미노산 수로 나누어 계산된다.
"글리칸" 또는 "글리칸 구조(A)"는 글리코시드 방식으로 결합된 단당류로 구성된 화합물에 관한 것이며, 또한 비록 탄수화물이 단지 단당류 또는 올리당일지라도 글리코컨쥬게이트, 예컨대 당단백질, 당지질, glycoRNA(예를 들어, Flynn et al, Cell, 184(12):3109-3124 참조) 또는 프로테오글리칸의 탄수화물 부분을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 기술된 신당단백질에서 스트렙타비딘에 결합된 글리칸 구조(A)는 유리하게는 비오틴화되어 있다. "비오틴화"는 단백질, 핵산 또는 다른 분자, 특히 본 명세서에 기술된 글리칸 구조(A)에 비오틴을 공유적으로 부착시키는 공정이다. 글리칸 구조(A)를 비오틴화하는 다양한 방법들이 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 비오틴화는 1차 아민이 히드라지드기로서 존재하는 경우 알데히드에 커플링되어 이민 또는 히드라존을 형성한다. 이러한 이민(히드라존)은 그리고 나서 2차 아민으로 환원되어 형성된 결합(아래 도식을 참조)을 안정화한다. 이 반응 절차를 이용하여, 비오틴-LC-히드라지드는 임의의 탄수화물의 환원 말단에 쉽게 커플링되어 안정한 비오틴-표지된 산물을 형성할 수 있다. 예를 들어, 여기에 그 전체 내용이 참조로 포함된 Grunet al. (2006), Analytical Biochemistry, 354(1):54-63를 참조할 것.
비오틴은 또한 글리칸과 비오틴 사이에 폴리에틸렌 글리콜 링커, 예컨대 트리에틸렌 글리콜(PEG3) 스페이서에 의해 글리칸에 커플링될 수 있다. 예시 글리칸 구조(A)는 글리칸과 비오틴 사이에 베타-결합된 트리에틸렌 글리콜(PEG3) 스페이서를 갖는 비오틴화된 3'-시알화된 N-아세틸락토사민(3'-Sialylated N-acetyllactosamine)(LacNAc = LN = Galβ1, 4GlcNAc), 3'-시알릴락토사민-PEG3-비오틴(3'-sialyllactosamine-PEG3-biotin)(단일 암, ~1100 Da)이다. 그러한 비오틴화된 글리칸은 예를 들어, Sussex Chemicals, Ottawa, Canada로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 발명은 임의의 특정 글리칸 구조(A)로 제한되지 않는다. 반대로, 신당단백질의 모듈식 구성은 본 명세서에 기술된 신당단백질의 스캐폴드인 스트렙타비딘에 사실상 임의의 글리칸 구조(A)를 비공유적으로 부착하도록 한다. 예시적인 글리칸 구조(A)는 코어 푸코스, 안테나 푸코스, N-결합 올리고당을 함유하는 Fucα1-6GlcNAc-N-Asn, Fucα1-6/3GlcNAc, α-L-Fuc, Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Fucα1-2Gal, Fucα1-6GlcNAc, Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc, 분지형 N-결합 육당류(N-linked hexa-saccharide), Manα1-3Man, α-D-Man, (GlcNAcβ1-4)2-4, Galβ1-4GlcNAc, GlcNAcα1-4Galβ1-4GlcNAc, (GlcNAcβ1-4)2-5, Neu5Ac (시알산), Galβ1-3GalNAc-세린/트레오닌, Galα1-3GalNAc, Galβ1-6Gal, Galβ1-4GlcNAc, Galβ1-3GalNAc, GalNAcα1-3GalNAc, GalNAcα1-3Gal, GalNAcα/β1-3/4Gal, α-GalNAc, GalNAcβ1-4Gal, GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal, GalNAcα1-2Gal, GalNAcα1-3GalNAc, GalNAcβ1-3/4Gal, GalNAc-Ser/Thr(Tn 항원), Galβ1-3GalNAc-Ser/Thr(T 항원), GalNAcβ1-4GlcNAc (LacdiNAc), α-2,3Neu5Ac(α2-3 결합 시알산), α-2,6Neu5Ac(α2-6 결합 시알산), α-2,8Neu5Ac(α2-8 결합 시알산), 시알산(α-2,3Neu5Ac, α-2,6Neu5Ac 또는 α-2,8Neu5Ac), Neu5Acα4/9-O-Ac-Neu5Ac, Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc/GlcNAc, Neu5Acα2-6Gal/GalNAc, N-결합 이중-안테나, N-결합 삼중/사중-안테나, 분지형 β1-6GlcNAc, Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3/4GlcNAc, Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, 고 만노스, 시알릴 루이스a(시알릴 Lea) 항원, 시알릴 루이스x(시알릴 Lex) 항원, 루이스x(Lex) 항원, 시알릴 Tn 항원, 시알릴 T 항원, 루이스y(Ley) 항원, 황산화 코어1 글리칸(sulfated core1 glycan), Tn 항원, T 항원, 코어 2 글리칸, 루이스a(Lea) 항원, (GlcNAcβ1-4)n, β-D-GlcNAc, GalNAc, Gal-GlcNAc, GlcNAc, Galα1-3Gal, Galβ1-3GalNAc, α-Gal, α-GalNAc, (GlcNAc)n, 분지형 (LacNAc)n를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 탄수화물 약어는 다음을 포함한다: N-아세틸뉴라민산은 "Neu5Ac"; 푸코스는 "Fuc", N-아세틸갈락토사민은 "GalNAc"; N-아세틸글루코사민은 "GlcNAc"; 갈락토스는 "Gal"(예를 들어, Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, Hart GW, E. ME., Essentials of Glycobiology, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (NY), 2009).
추가로, 본 명세서에 사용된 다음 용어들은 아래 정의된다:
"코어 푸코스(core fucose)"는 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C6 원자에 연결된 것을 의미한다.
"안테나 푸코스(antennary fucose)"는 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결되거나, 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 이웃하는 푸코스의 C2 원자에 연결된 것을 의미한다.
"N-결합 올리고당을 함유하는 Fucα1-6GlcNAc-N-Asn(Fucα1-6GlcNAc-N-Asn containing N-linked oligosaccharides)"는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C6 원자에 연결된 푸코스를 가지며, N-글리코시드 결합을 통해 아스파라긴에 연결되는 올리고당을 의미한다.
"Fucα1-6/3GlcNAc"는 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C6 (C3) 원자에 연결된 것을 의미한다.
"α-L-Fuc"는 α-L-푸코스를 의미한다.
"Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc"는 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C2 원자에 연결되고, C1 원자의 β 글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결되며, 동시에 제2 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Fucα1-2Gal"는 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C2 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Fucα1-6GlcNAc"는 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C6 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc"는 만노스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결되고, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"분지형 N-결합 육당류(branched N-linked hexa-saccharide)"는 N-글리코시드 결합에 의해 아스파라긴에 연결된 몇몇 탄수화물로 구성된 비-선형 글리칸을 의미한다.
"Manα1-3Man"는 만노스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 만노스의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"α-D-Man"는 α-D-만노스를 의미한다.
"(GlcNAcβ1-4)2-4"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 반복적으로 연결된 것을 의미한다.
"Galβ1-4GlcNAc"는 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"GlcNAcα1-4Galβ1-4GlcNAc"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C4 원자에 연결되고, N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"N-아세틸글루코사민"은 글루코사민 및 아세트산 사이의 아미드를 의미한다.
"(GlcNAcβ1-4)2-5"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 반복적으로 연결된 것을 의미한다.
"Neu5Ac" (또는 시알산)은 N-아세틸뉴라민산을 의미한다.
"Galβ1-3GalNAc-세린/트레오닌"은 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결되고, 세린/트레오닌에 결합된 것을 의미한다.
"Galα1-3GalNAc"는 갈락토스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Galβ1-6Gal"는 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C6 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Galβ1-4GlcNAc"는 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Galβ1-3GalNAc"는 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"GalNAcα1-3GalNAc"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"GalNAcα1-3Gal"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"GalNAcα/β1-3/4Gal"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 α- 또는 β-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 또는 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"α-GalNAc"는 α-갈락토사민 및 아세트산 사이의 아미드를 의미한다.
"GalNAcβ1-4Gal"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 원자에 연결되고, 동시에 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C2 원자에 연결된 것을 의미한다.
"GalNAcα1-2Gal"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"GalNAcα1-3GalNAc"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"GalNAcβ1-3/4Gal"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 또는 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"GalNAc-Ser/Thr" (또는 Tn 항원)은 N-아세틸글루코사민이 O-글리코시드 결합을 통해 세린/트레오닌에 연결된 것을 의미한다.
"Galβ1-3GalNAc-Ser/Thr" (T 항원 또는 Thomsen-Friedenreich 항원)은 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결되고, O-글리코시드 결합을 통해 세린/트레오닌에 연결된 것을 의미한다.
"GalNAcβ1-4GlcNAc" (또는 LacdiNAc)는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"α2-3Neu5Ac" (또는 α2-3-결합 시알산)은 N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 이웃하는 당류의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"α2-6Neu5Ac" (또는 α2-6-결합 시알산)은 N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 이웃하는 당류의 C6 원자에 연결된 것을 의미한다.
"α2-8Neu5Ac" (또는 α2-8-결합 시알산)은 N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 이웃하는 N-아세틸뉴라민산의 C8 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Neu5Acα4/9-O-Ac-Neu5Ac"는 N-아세틸뉴라민산이 C4 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 이웃하는 O-아세틸 N-아세틸뉴라민산의 C9 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc/GlcNAc"는 N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 원자에 연결되고, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 글루코스 또는 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Neu5Acα2-6Gal/GalNAc"는 N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민의 C6 원자에 연결된 것을 의미한다.
"N-결합 이중 안테나(N-linked bi-antennary)"는 N-글리코시드 결합에 의해 아스파라긴에 연결된 2개의 안테나(탄수화물 사슬)를 갖는 비-선형 글리칸을 의미한다.
"N-결합 삼중/사중-안테나"는 N-글리코시드 결합에 의해 아스파라긴에 연결된 3개/4개의 안테나(탄수화물 사슬들)을 갖는 비-선형 글리칸을 의미한다.
"분지형 β1-6GlcNAc"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 이웃하는 당류의 C6 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3/4GlcNAc"는 갈락토스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 원자에 연결되고, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 또는 C4 원자에 연결되며, 동시에 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C2 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc"는 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결되고, 동시에 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc"는 N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 원자에 연결되고, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결되며, 동시에 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc"는 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C2 원자에 연결되고, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결되며, 동시에 제2 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc"는 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결되고, 동시에 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc"는 N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 원자에 연결되고, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결되며, 동시에 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc"는 푸코스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C2 원자에 연결되고, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결되며, 동시에 제2 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"고 만노스(high mannose)"는 3개 이상의 만노스 유닛을 포함하는 글리칸을 의미한다.
"시알릴 루이스"(시알릴 Lea) 항원은 Neu5Acα2-3/6Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc이며, N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 또는 C6 원자에 연결되고, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결되며, 동시에 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"시알릴 루이스x" (시알릴 Lex) 항원은 Neu5Acα2-3/6Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc이며, N-아세틸뉴라민산이 갈락토스의 C3 또는 C6 원자에 이의 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 연결되어 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 이의 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 연결되며, 동시에 푸코스는 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 이의 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 연결된 것을 의미한다.
"루이스x" (Lex) 항원은 "Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc"이며, 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결되며, 동시에 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"시알릴 Tn 항원"은 "Neu5Acα2-3/6GalNAc-Ser/Thr"이며, N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 또는 C6 원자에 연결되고, O-글리코시드 결합을 통해 세린/트레오닌에 연결된 것을 의미한다.
"시알릴 T 항원"은 "Neu5Acα2-3/6Galβ1-3GalNAc-Ser/Thr"이며, N-아세틸뉴라민산이 C2 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 또는 C6 원자에 연결되고, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결되며, O-글리코시드 결합을 통해 세린/트레오닌에 연결된 것을 의미한다.
"루이스y" (Ley) 항원은 "Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc"이며, 푸코스는 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결되며, 동시에 제2 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"황산화 코어1 글리칸(sulfated core1 glycan)"은 T 항원의 황산화 확장 형태에 기초한 글리칸이다.
"코어 2 글리칸"은 Galβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc-Ser/Thr의 확장 형태에 기초한 글리칸이며, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결된 갈락토스를 가지며, 동시에 N-아세틸글루코사민은 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C6 원자에 연결되며, 세린/트레오닌에 연결된 글리칸의 확장 형태를 의미한다.
"루이스a" (Lea) 항원은 Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc이며, 갈락토스는 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C3 원자에 연결되며, 동시에 푸코스는 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 것을 의미한다.
"(GlcNAcβ1-4)n"는 N-아세틸글루코사민이 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 반복적으로 연결된 것을 의미한다.
"β-D-GlcNAc"는 β-D-글루코사민 및 아세트산 사이의 아미드를 의미한다.
"GalNAc"는 갈락토사민 및 아세트산 사이의 아미드, 즉, N-아세틸갈락토사민을 의미한다.
"Gal-GlcNAc"는 갈락토스가 비특이적 결합을 통해 N-아세틸글루코사민에 연결된 것을 의미한다.
"GlcNAc"는 글루코사민 및 아세트산 사이의 아미드, 즉 N-아세틸글루코사민을 의미한다.
"Galα1-3Gal"은 갈락토스가 C1 원자의 α-글리코시드 결합을 통해 갈락토스의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"Galβ1-3GalNAc"은 갈락토스가 C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸갈락토사민의 C3 원자에 연결된 것을 의미한다.
"α-Gal"는 α-갈락토스를 의미한다.
"α-GalNAc"는 α-D-갈락토사민 및 아세트산 사이의 아미드를 의미한다.
"(GlcNAc)n"는 N-아세틸글루코사민이 비특이적인 결합을 통해 N-아세틸글루코사민에 연결된 것을 의미한다.
"분지형 (LacNAc)n"은 Galβ1,4-GlcNAc의 분지형 및 반복 형태이며, C1 원자의 β-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸글루코사민의 C4 원자에 연결된 갈락토스의 분지형 및 반복 형태를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "신호"는 목적 단백질에 (존재하는 것으로 의심되는) 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 정보에 관한 것이다. 이 정보는 전형적으로 예를 들어, 특정 파장 길이에서 흡광도 또는 특정 파장 길이에서 형광 방출의 신호 강도이다. 신호 강도는 바람직하게는 목적 단백질에 존재하는 글리칸 구조(A)의 양에 달려있다. 따라서, 신호는 또한 목적 단백질의 당 프로파일에 대한 정보를 제공하는 것으로 볼 수 있다.
본 명세서에 기술된 신당단백질은 본 발명의 방법 및 용도에서 표준물질로서 작용한다. 이들은 신호(1) 또는 신호(2)를 제공하는 글리칸 구조(A)를 결정하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 "글리칸 구조(A)를 결정하는 것"은 특정 글리칸 구조(A)가 목적 단백질에 존재하는지 여부를 분석하기에 적당한, 바람직하게는 (샘플에서) 글리칸 구조(A)의 양을 결정하기에 적당한 임의의 방법에 관한 것이다. 다른 말로, 글리칸 구조(A)를 결정하는 것은 또한 그것에 글리칸 구조(A)를 갖는 것으로 의심되는 목적 단백질의 당 프로파일링 방법으로 보일 수 있다. 따라서, 이 방법은 상대화되거나(신호 (1)), 상대화하기 위한 근거(신호 (2))인 신호를 제공한다. 적당한 방법은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 효소 결합 렉틴 분석(ELLA), 자기 ELLA(MELLA), 바람직하게는 ELLA 또는 MELLA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 신호(1) 및 신호(2)는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 효소 결합 렉틴 분석(ELLA), 자기 ELLA(MELLA), 바람직하게는 ELLA 또는 MELLA에 의해 얻을 수 있다. 바람직하게는, 신호(1) 및 신호(2)는 동일한 농도의 동일한 시약을 포함하여 동일한 조건에서 얻는다. 그러나 본 발명은 이들 방법에 제한되지 않고 글리칸 분석을 포함하는 임의의 다른 분석 방법을 포함할 수 있다.
ELISA는 다양한 유사 또는 ELISA 유사 분석의 출발점으로 볼 수 있다. ELISA는 목적 단백질에 있는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)와 같은 목적 분자와 면역글로불린의 특이적인 상호작용에 기초하되, 특이적인 상호작용은 분석되는 샘플에서 목적 분자의 농도에 상응하는 목적 분자의 존재 및 신호(강도)에서만 신호가 발생하도록 한다. ELISA, ELLA 및 MELLA과 같은 분석은 당업자에게 공지되어 있다. 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA 및 역상 ELISA와 같은 다양한 ELISA 변형들 역시 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 1차 면역글로불린, 즉, 목적 분자에 결합하는 면역글로불린은 목적 단백질에 있는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)에 결합한다. 따라서, 1차 면역글로불린, 바람직하게는 항체 또는 이의 단편은 목적하는 글리칸 구조(A)에 특이적으로 결합한다. ELLA에서, 1차 면역글로불린은 글리칸 구조(A)에 특이적으로 결합하는 렉틴으로 대체된다. 자기 ELLA (MELLA)는 WO　2019/185515 A1에 기술된 ELLA의 진일보한 발전이며, 전체 내용이 참조로 여기에 포함된다. 이들 분석의 판독, 예를 들어, 신호 강도는 본 발명의 맥락에서 신호(1) 또는 신호(2)로 볼 수 있다. 전형적으로, 판독은 목적 단백질(목적 당단백질의 단백질 백본) 또는 렉틴에 대해 1차 면역글로불린에 결합하는 2차 면역글로불린에 커플링된 효소의 효소적 반응의 결과이다. 대안으로, 효소는 렉틴에 (직접적으로) 커플링될 수 있다. 빈번하게 사용되는 판독은 종종 컨쥬게이트 단백질로 사용되는 HRP(Horseradish Peroxidase)를 검출하기 위해 호박색으로 변하는 OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride); HRP를 검출하면 파란색으로 변하고 황산이나 인산을 첨가하면 노란색으로 변하는 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine); HRP를 검출하면 녹색으로 변하는 ABTS(2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt); 또는 알칼라인 포스파타제를 검출하면 노란색으로 변하는 PNPP(p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 비색 판독 외에도 방사성 표지, 형광 표지, 전기화학 표지, 화학 발광 표지, 비색 접근법 또는 표지없는 형식(예를 들어, SPR)도 사용할 수 있다. 또 다른 예는 과산화수소(H2O2) 또는 퍼옥시다제 활성을 검출하기 위한 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(Amplex® Red 시약)이다. 퍼옥시다제가 있는 경우, Amplex® Red 시약은 1:1 화학량론으로 H2O2와 반응하여 적색 형광 산화 산물인 레조루핀을 생성한다. 레조루핀은 약 571 nm 및 585 nm의 여기 및 방출 최대값을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 경우, 용어 "렉틴"은 탄수화물-결합 단백질을 지칭한다. 렉틴은 전형적으로 탄수화물 모이어티 또는 탄수화물 모이어티들(예를 들어, 그것은 당단백질의 글리칸/들과 같은 다른 분자의 말단 글리코시드 잔기와 특이적으로 반응한다(예를 들어, 당단백질의 분지형 당 분자, 예컨대, 본 발명의 의미 안에서 표적 폴리펩타이드 및 본 명세서의 표 1에 기술된 바이오마커와 같은))에 대해 매우 특이적이다. 렉틴은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 렉틴이 목적하는 탄수화물 모이어티 또는 탄수화물 모이어티들, 예컨대, 단백질에 부착된 글리칸의 탄수화물 모이어티 또는 탄수화물 모이어티들과 결합하는데 이용될 수 있음을 결정하는데 쉽게 이용할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 적용되는 바람직한 렉틴은 본 명세서에 기술된다. 또한 용어 "렉틴"에는 Siglecs(시알산 결합 면역글로불린 유사 렉틴), 갈렉틴(글리칸을 함유한 β-갈락토시드에 특이적으로 결합하는 렉틴) 및 셀렉틴(시알릴 루이스X(SLex) 결정자 NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc 및 관련 시아릴화, 푸코실화 글리칸에 결합)이 포함된다. 특히, 본 명세서에 사용되는 경우, 용어 "렉틴"은 글리칸 결합 항체를 의미하기도 한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "렉틴"은 글리칸 결합 항체뿐만 아니라 렉틴, Siglecs, 갈렉틴, 셀렉틴 등도 포함할 수 있다. 렉틴은 또한 글리칸을 인식하는 DNA/RNA 앱타머도 포함할 수 있다.
렉틴은 콩과 식물의 씨앗뿐만 아니라 다른 식물과 동물에서도 얻을 수 있다. 렉틴은 특정 단당류 및 올리고당(예를 들어, 당단백질의 글리칸)에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다. 그들은 막 당단백질의 특정 당 잔기에 결합하여 세포를 응집시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 렉틴은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 렉틴 II(MAA II); 콘카나발린 A(Con A); 알류리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴(AAL); 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra)(SNA-I) 렉틴; 본 명세서에 정의된 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 렉틴(WFL).
본 발명의 보다 바람직한 렉틴은 아래 표 1에 도시된다.
본 발명의 특히 바람직한 렉틴은 다음의 UniProtKB 등록 번호를 갖는 렉틴이다: P0DKL3, P02866, P18891, O04366, A0A218PFP3, Q945S3, Q00022, Q6YNX3, Q71QF2, P02872, P18670, Q2UNX8, Q8L5H4, A0A089ZWN7, P05045, P19588, P83410, P17931, P56470, P24146, Q41263, Q39990, Q2F1K8, G9M5T0, B3XYC5, P02870, P19664, P0DKL3, P49300, A9XX86, Q40423, P16300, P05088, P05087, Q9AVB0, P02867, O24313, Q9SM56, P06750, B9SPG3, Q9BZZ2, P20916, Q9NYZ4, Q96RL6, P05046, P93535, P02876, P10968, P10969, P22972 또는 P56625 뿐만 아니라 이의 상응하는 성숙 형태.
본 발명의 예시 렉틴은 추가로 다음을 포함한다:
마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 렉틴 II(MAA II)는 다릅나무 씨앗에서 추출한 헤마글루티닌 이소렉틴이다. 이웃하는 갈락토스 잔기에 α2-3 결합을 통해 연결된 말단 시알산을 포함하는 올리고당을 인식하는 시알산 결합 렉틴은 삼당류 서열 Neu5Acα2-3-Gal-β-1-4-GlcNAc에 결합한다. 바람직하게는 MAA II는 SEQ ID NO:2(또는 이의 성숙 형태)를 갖는다.
콘카나발린 A(Con A)는 카나발리아 엔시포미스(Canavalia ensiformis)에서 원래 추출된 D-만노스 특이적인 렉틴이다. 바람직하게는 Con A의 경우 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4(Con A 함유, 성숙 형태)를 갖는다.
알류리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴(AAL)은 알류리아 아우란티아(Aleuria aurantia)(오렌지 껍질 버섯)에서 추출된 푸코스 특이적인 렉틴이다. 바람직하게는 AAL은 SEQ ID NO: 5(또는 이의 성숙 형태)를 갖는다. AAL의 분리는 예를 들어 (Debray et al., Kochibe et al.)에 기술되어 있다.
삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra)(SNA-I) 렉틴은 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra)(유럽 딱총나무)에서 추출된 Neu5Acα2-6)Gal/GalNAc 특이적인 응집소(agglutinin)이다. 바람직하게는 SNA-1은 SEQ ID NO: 6(또는 이의 성숙 형태)을 갖는다.
위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 렉틴(WFL)은 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda)(일본 등나무)에서 추출된 응집소이다. 바람직하게는 WFL은 SEQ ID NO: 7(또는 이의 성숙 형태)을 갖는다.
또한, 본 발명의 의미 안에서 적합한 렉틴은 본 명세서에 개시된 바와 같이 번역 후 프로세스된 성숙 형태의 렉틴을 명시적으로 포함할 수 있다.
용어 "항체"는 또한 단클론, 단일특이적, 이중특이적 항체와 같은 다중(poly-) 또는 다중(multi-) 특이적인 항체, 인간화, 카멜화, 인간, 단일쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 그래프트 및 바람직한 키메라 또는 인간화 항체를 갖는 인 비트로 생성 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 용어 "인간화 항체"는 일반적으로 HC 및 LC의 CDR을 인코딩하는 특이성이 적당한 인간 가변 프레임워크("CDR 그래프팅")에 전달된 항체에 대해 정의된다. 용어 "항체"는 또한 scFvs, 단일쇄 항체, 디아바디 또는 테트라바디, 도메인 항체(dAbs) 및 나노바디를 포함한다. 본 발명의 용어에서, 용어 "항체"는 또한 여러 항원 결합 부위를 갖는 이중, 삼중 또는 다량체, 또는 이중, 삼중 또는 다기능 항체를 포함해야 한다. 상기 용어는 또한 항원 결합 부분(들)을 포함한다. 용어 "항체"는 또한 FN3 스캐폴드, 애드넥틴(adnectin), 어피바디, 안티칼린, 아비머, 이중고리 펩타이드, DARPin, 쿠니쯔 도메인, 오바디(Obody) 또는 압타머, 예컨대 DNA, RNA 또는 펩타이드 압타머를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 항체는 항-PSA, 항-AFP, 항-MUC16, 항-WFDC2, 항-MUC1, 항-ERBB2, 항-CEACAM5, 항-FUT3 또는 항-TG 항체 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명과 관련된 보다 바람직한 항체는 아래 표 1에 도시된다.
더욱이, 본 발명에 사용된 용어 "항체"는 또한 본 명세서에 기술된 (단편들을 포함하는) 항체의 유도체에 관한 것이다. 항체의 "유도체"는 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가의 도입에 의해 변경된 아미노산 서열을 포함한다. 추가로, 유도체는 항체 또는 단백질에 임의의 유형의 분자의 공유적 부착에 의해 변형된 항체를 포함한다. 그러한 분자의 예시는 당, PEG, 히드록실-, 에톡시-, 카르복시- 또는 아민기를 포함하나, 이들에 제한되지는 않는다. 효과에서, 항체의 공유적 변형은 글리코실화, 페길화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화를 유도하나, 이들에 제한되지 않는다.
목적 단백질은 특정 단백질로 제한되지 않는다. 대조적으로 그리고 신당단백질의 다양성으로 인해, 본 발명의 방법 및 용도는 특정 글리칸 구조(A)가 목적 단백질에 존재하는지 여부를 분석하는데 적용될 수 있다. 그러나, 목적 단백질은 바람직하게는 당단백질이거나, 다르게 말하면 글리칸 구조(A)를 갖는 것으로 의심되는 단백질이다. 목적 단백질의 글리칸 구조(A)의 존재 또는 부재는 질병의 진단 또는 예후예측에 중요할 수 있기 때문에, 목적 단백질은 바람직하게는 당 프로파일이 질병과 관련된 단백질이다. 본 명세서에 사용된 용어 "당단백질"(또는 글리코실화된 단백질)은 하나 이상의 N-, O-, S- 또는 C- 공유 결합된 다양한 유형의 탄수화물, 예를 들어, 단당류에서 분지형 다당류(설포- 또는 포스포-기의 부착과 같은 그들의 변형을 포함하는)에 이르는 하나 이상의 N-, O-, S- 또는 C- 공유 결합된 다양한 유형의 탄수화물을 포함하는 단백질을 의미한다. N-결합 글리칸은 아스파라긴의 -NH2 기에 결합된 탄수화물이다. O-결합 글리칸은 세린, 트레오닌 또는 히드록실화된 아미노산의 -OH 기에 결합된 탄수화물이다. S-결합 글리칸은 시스테인의 -SH 기에 결합된 탄수화물이다. O-결합 글리칸은 C-C 결합을 통해 트립토판에 결합된 탄수화물이다.
용어 "탄수화물"은 화학양론적 공식이 Cn(H2O)n인 화합물(예를 들어, 알도스 및 케토스)을 의미한다. 일반 용어 "탄수화물"은 단당류, 올리고당 및 다당류 뿐만 아니라 카르보닐기의 환원(알디톨), 하나 이상의 말단 기의 카르복실산으로의 산화, 또는 수소 원자, 아미노기, 티올기 또는 유사기에 의한 하나 이상의 히드록시기(들)의 대체에 의해 단당류로부터 유래된 기질을 포함한다. 또한, 이들 화합물의 유도체를 포함한다.
본 명세서에 이미 기술된 바와 같이, 목적 단백질 상의 특정 글리칸 구조(A)의 존재는 암, 자가면역질환 또는 염증성 질환과 같은 특정 질병의 진단과 관련될 수 있다. (목적) 단백질(즉, 바이오마커 단백질) 및 글리칸 구조(A)의 일부 조합은 질병에 대한 지표인 것으로 알려져 있다. 질병에 대한 지표인 목적 단백질과 글리칸의 특정 조합 뿐만 아니라 특정 글리칸 구조에 결합하는 항체 또는 렉틴은 표 1에 예시되어 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 용도는 암, 자가면역질환 또는 염증성 질환과 같은 질병의 진단에 사용될 수 있다. 따라서, 상기 글리칸 구조(A)의 존재는 암, 자가면역질환 또는 염증성 질환과 같은 질병의 지표일 수 있다.
이러한 맥락에서, 목적 단백질은 바람직하게는 암 바이오마커 단백질, 자가면역질환 바이오마커 단백질, 또는 염증성 질환 바이오마커 단백질이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "자가면역질환"은 자신의 조직에 대한 항체 생성과 관련된 질병을 특징으로 하는 질병 그룹을 지칭한다. 자가면역질환의 비제한적인 예는 하시모토병, 원발성 담즙성 간경변, 전신 홍반 루푸스, 류마티스열, 류마티스 관절염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 및 바이러스성 뇌척수염, 애디슨병, 자가면역성 장병증, 원발성 담즙성 간경변증, 굿파스처 증후군, 하시모토 갑상선염, 중증근육 무력증, 점액부종, 유천포창, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 교감성 안염, 두 가지 형태의 홍반성 루푸스, 갑상선중독증, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 복강병, 제1형 당뇨병, 그레이브스병, 염증성 장질환 및 건선이 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "염증성 질환"은 신체의 염증 메커니즘의 손상 및/또는 비정상적인 기능을 특징으로 하는 질병 그룹을 지칭한다. 염증성 질환의 비제한적인 예는 괴사성 장염, 위장염, 골반 염증 질환(PID), 농흉, 흉막염, 신우염, 인두염, 협심증, 관절염, 여드름, 요로 감염, 심상성 여드름, 천식, 소아 지방변증, 만성 전립선염, 대장염, 게실염, 사구체 신염, 화농한선염, 과민증, 염증성 장질환, 간질성 방광염, 비만세포 활성화 증후군, 비만세포증가증, 중이염, 골반 염증 질환, 재관류 손상, 류마티스열, 류마티스 관절염, 비염, 유육종증, 이식 거부, 혈관염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "암"은 신체 내 비정상 세포의 통제되지 않는 성장을 특징으로 하는 질병 그룹을 지칭한다. 조절되지 않은 세포 분열로 인해 악성 종양이 형성되거나 주변 조직을 침범하는 세포가 형성될 수 있으며 림프계나 혈류를 통해 신체의 먼 부위로 전이될 수 있다. 암의 비제한적 예는 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 편평 비소세포 폐암(NSCLC), 비 NSCLC, 신경교종, 위장암, 신장암(예를 들어, 투명 세포 암종), 난소암, 간암, 대장암(colorectal cancer), 자궁내막암, 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종(RCC)), 전립선암(예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 교모세포종(다형성 교모세포종), 자궁경부암, 위암, 방광암, 간종양(hepatoma), 유방암, 결장 암종(colon carcinoma) 및 두경부암(또는 암종), 위암, 생식 세포 종양, 소아 육종, 부비동 자연 살해자, 흑색종(예를 들어, 피부 또는 안내 악성 흑색종과 같은 전이성 악성 흑색종), 골암, 피부암, 자궁암, 항문 부위의 암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형종양, 요관암, 신우암종, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추 축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시육종, 표피암, 편평세포암, T 세포 림프종, 석면에 의해 유발된 암을 포함한 환경적으로 유발된 암, 바이러스 관련 암(예를 들어, 인유두종 바이러스(HPV) 관련 종양), 및 두 가지 주요 혈액 세포 계통, 즉 골수 세포주(과립구, 적혈구, 혈소판, 대식세포 및 비만 세포를 생성함) 또는 림프구 세포주(B, T, NK 및 형질 세포를 생성함) 중 하나에서 유래된 혈액학적 악성 종양, 예컨대, 모든 유형의 백혈병, 림프종 및 골수종, 예를 들어 급성, 만성, 림프구성 및/또는 골수성 백혈병, 예를 들어 급성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 만성 골수성 백혈병(CML), 미분화 AML(MO), 골수모구 백혈병(M1), 골수아구 백혈병(M2, 세포 성숙 포함), 전골수구성 백혈병(M3 또는 M3 변종[M3V]), 골수단구성 백혈병(호산구증가증을 동반한 M4 또는 M4 변종[M4E)]), 단핵구 백혈병(M5), 적백혈병(M6), 거핵구성 백혈병(M7), 단독 과립구 육종 및 녹색종; 호지킨 림프종(HL), 비호지킨 림프종(NHL), B세포 림프종, T세포 림프종, 림프형질세포양 림프종, 단핵구 B세포 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT) 림프종, 역형성(예를 들어, Ki 1+) 거대세포 림프종, 성인 T 세포 림프종/백혈병, 맨틀 세포 림프종, 혈관 면역모세포 T 세포 림프종, 혈관 중심성 림프종, 장 T 세포 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종, 전구체 T-림프구성 림프종, T-림프구성 림프종과 같은 림프종; 및 림프종/백혈병(T-Lbly/T-ALL), 말초 T 세포 림프종, 림프구성 림프종, 이식 후, 림프증식성 질환, 진성 조직구 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 림프구성 림프종(LBL), 림프 계통의 조혈 종양, 급성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B세포 림프종, 버킷 림프종, 여포성 림프종, 미만성 조직구 림프종(DHL), 면역아세포성 대세포 림프종, 전구체 B-림프구성 림프종, 피부 T-세포 림프종(CTLC)(진균증 식육종 또는 세자리 증후군이라고도 함), 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 동반한 림프형질세포양 림프종(LPL); 골수종, 예를 들어 IgG 골수종, 경쇄 골수종, 비분비성 골수종, 무증상 골수종(무통성 골수종이라고도 함), 고립성, 형질세포종 및 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 털상세포 림프종; 골수 계통의 조혈 종양, 섬유육종 및 횡문근육종을 비롯한 중간엽 기원 종양; 정상피종, 기형암종, 성상세포종, 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 정상피종, 갑상선 여포성암 및 기형암종을 포함하는 기타 종양, 림프계 계통의 조혈 종양, 예를 들어 T-세포 및 B-세포 종양(T-전림프구성과 같은 T-세포 장애를 포함하나 이에 제한되지 않음) 소세포 및 뇌세포 유형을 포함하는 백혈병(T-PLL); 바람직하게는 T 세포 유형의 거대 과립 림프구 백혈병(LGL); a/d T-NHL 간비장 림프종; 말초/흉선후 T 세포 림프종(다형성 및 면역모세포 아형); 혈관중심성(비강) T세포 림프종; 두경부암, 신장암, 직장암, 갑상선암; 급성 골수성 림프종뿐만 아니라 상기 암의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 암 역시 표 1에 도시된다.
암은 또한 난소암, 유방암, 대장암(colorectal cancer), 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 간암, 폐암, 위암, 고환암 또는 방광암일 수 있다. 따라서, 바이오마커 단백질(목적 단백질)은 난소암 바이오마커 단백질, 유방암 바이오마커 단백질, 대장암(colorectal cancer) 바이오마커 단백질, 췌장암 바이오마커 단백질, 전립선암 바이오마커 단백질, 갑상선암 바이오마커 단백질, 간암 바이오마커 단백질, 폐암 바이오마커 단백질, 위암 바이오마커 단백질, 고환암 바이오마커 단백질 또는 방광암 바이오마커 단백질일 수 있다.
예시적인 암, 비정상적인 글리코실화를 갖는 암 바이오마커, 렉틴, 항체 및 본 발명의 의미 안에서 상응하는 글리칸 변형이 또한 아래 표 1에 도시된다. 표 1에 사용된 렉틴 약어: 암, 비정상적인 글리코실화를 갖는 상응하는 암 바이오마커, 렉틴 및 항체: AAA - 앵귈라 앵귈라(Anguilla anguilla) 응집소(UniProtKB 접근 번호: Q7SIC1), AAL - 알류리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴, ABA - 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus) 응집소, ACA - 아마란투스 카우다투스(Amaranthus caudatus) 응집소, AHA - 아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea) 응집소 = 땅콩 응집소(PNA), AIA - 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 응집소 = 자칼린(Jacalin), AlloA - 알로미리나 디초토마(Allomyrina dichotoma) 응집소, AOL - 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 렉틴, BanLec - 무사 파라디시아카(Musa paradisiaca) 렉틴, BS-I - 반데이라에아 심플리시폴리아(Bandeiraea simplicifolia) 렉틴 = 그리포니아(반데이라에아 심플리시폴리아(Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia) 렉틴 I, Con A - 콘카나발린 A, DBA - 돌리코스 비플로러스(Dolichos biflorus) 응집소, DSA - 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 응집소(Jacalin), ECL - 에리쓰리나 크리스타갈리(Erythrina cristagalli) 렉틴, GNA - 갈란투스 니발리스(Galanthus nivalis) 응집소, GSA I(GSL I) - 그리포니아(반데이라에아) 심플리시폴리아(Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia) 렉틴 I, GSL II - 그리포니아(반데이라에아) 심플리시폴리아(Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia) 렉틴 II, HHL - 힙페아스트룸 하이브리드(아말릴리스)(Hippeastrum hybrid (Amaryllis)) 렉틴, HPA - 헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소, LBA - 파세올루스 루나투스(Phaseolus lunatus)(리마콩, LBA), LEL - 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)(토마토) 렉틴, LCA - 렌즈 쿨리나리스(Lens culinaris ) 응집소, LTA - 로투스 테트라고놀로부스(Lotus tetragonolobus) 렉틴, MAA I - 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 응집소 I, MAA II - 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis) 응집소 II, MGBL 1 - 대식세포 갈락토스 결합 렉틴 1(macrophage galactose binding lectin 1), MGBL 2 - 대식세포 갈락토스 결합 렉틴 2, NPA - 나르시수스 슈도나르시수스(Narcissus pseudonarcissus)(수선화) 렉틴, PHA E - 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 응집소 E, PHA L - 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 응집소 L, PhoSL - 폴리오타 스쿠아로사(Pholiota squarrosa) 렉틴, PNA - 땅콩 응집소, PSL - 피숨 사티붐(Pisum sativum) 렉틴, PTA I - 소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus) 렉틴 I, PTA II - 소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus) 렉틴 II, PWM - 피토락카 아메리카나(Phytolacca americana), RCA I - 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis) 응집소 I, RCA II - 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis) 응집소 II, SBA - 대두 응집소(글리신 맥스(Glycine max) 응집소), SCA - 삼부쿠스 카나덴시스(Sambucus canadensis) 응집소 = 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소 (SNA), SJA - 소포라 자포니카(Sophora japonica) 응집소 II, SNA - 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 응집소, SSA - 삼부쿠스 시에볼디아나(Sambucus sieboldiana) 응집소, SSL - 살비아 스클라레아(Salvia sclarea) 렉틴, STL - 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 렉틴, TJA-I - 트리코산테스 자포니카(Trichosanthes japonica) 응집소 I, TJA-II - 트리코산테스 자포니카(Trichosanthes japonica) 응집소 (Yamashita et al.), TVA - 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris) 응집소 = WGA - 맥아 응집소, UEA - 울렉스 유로파에우스(Ulex europaeus) 응집소, VVA - 비시아 빌로사(Vicia villosa) 렉틴, WFA - 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 렉틴, WGA - 맥아 응집소 = TVA - 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris) 응집소. 위쪽을 가리키는 화살표인 기호 "↑"는 상응하는 글리칸(들) 또는 복합체(들)(예를 을어, 이량체, 삼량체 등)의 농도 증가를 의미한다. 아래쪽을 가리키는 화살표인 기호 "↓"는 상응하는 글리칸(들) 또는 복합체(들)(예를 들어, 이량체, 삼량체 등)의 농도 증가를 의미한다.
암, 비정상적인 글리코실화를 갖는 상응하는 암 바이오마커, 렉틴 및 항체. 이 표의 조합은 단지 상이한 암 유형에 대한 예일 뿐이다. 본 발명은 이들 예시적인 조합에 제한되지 않는다.
암 바이오마커 글리칸 변형 적용된 렉틴/항체 참고문헌 (기타) 적용가능한 렉틴/항체
전립선 전립선 특이 항원(PSA) ↑α2-3Neu5Ac MAA [1-5] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
fPSA ↑α2-3Neu5Ac SNA* (SNA 친화성 컬럼에서 용출되지 않은 PSA의 결정) [6, 7] 항α2,3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉, HYB4), MAA, Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
fPSA ↑α2-3 Neu5Ac 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4) [8] MAA, Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
PSA [1], tPSA/fPSA [9] ↓이중-안테나 글리칸 Con A [1, 9]
PSA [1], tPSA/fPSA [9] ↓고 만노스 글리칸 Con A [1, 9] GNA, NPA
PSA ↓α2-6Neu5Ac SNA [1] TJA-I, SCA
PSA ↓α2-6Neu5Ac TJA-I [2] SNA, SCA
PSA ↑삼중, 사중 안테나 글리칸 DSA (자칼린) [2] PHA-L, PHA-E
PSA ↑α1-2푸코스, GalNAc TJA-II [2] AAL, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA, HPA, LBA, WFA, VVA
PSA [2], fPSA/tPSA [10] ↑α1-2푸코스 UEA-I [2] [10] TJA II, AAL, LCA, PSL, AAA, LTA
PSA [2], tPSA [11, 12] ↑LacdiNAc, GalNAc WFA [2, 11, 12] DBA, SBA, HPA, LBA, VVA
tPSA ↑α1-3/6푸코스 AAL [13] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA, AOL, PhoSL
소변 내 PSA ↓α1-3/6 푸코스 AAL [14] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA. AOL, PhoSL
소변 내 PSA ↓코어 푸코스 (α1-6푸코스) PhoSL [14] AOL
fPSA ↓코어 푸코스 (α1-6푸코스) PhoSL [6] AOL
메탈로펩티다제 1의 조직 억제제(TIMP1) ↑α1-3/6푸코스 AAL [13] AOL, PhoSL, TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑코어 푸코스(α1-6푸코스) 렉틴을 사용하지 않았지만 MS [15] PhoSL, AOL
β-합토글로빈 ↑코어/안테나 푸코스 AAL [16, 17] AOL, PhoSL, TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑α2-6Neu5Ac SNA [16, 17] TJA-I, SCA
β-합토글로빈 ↑삼중, 사중 안테나 글리칸 PHA-L [16, 17] PHA-E, DSA (자칼린)
β-합토글로빈 ↑시알릴 루이스a 글리칸 시알릴 루이스a 글리칸에 대한 항체 -[16] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 I 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-합토글로빈 ↑시알릴 루이스x 글리칸 시알릴 루이스x 글리칸에 대한 항체 [17] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 렉틴을 사용하지 않았지만 MS [18] TJA II, AAL, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑삼중-,사중-안테나 글리칸 렉틴을 사용하지 않았지만 MS [18] PHA-L, PHA-E, DSA
β-합토글로빈 ↑시알릴 루이스a 및 시알릴 루이스x 글리칸 렉틴을 사용하지 않았지만 MS [18] 시알릴 루이스a 및 루이스x 글리칸에 대한 항체, SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 AAL [19] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
난소 α1-산 당단백질 ↑삼중-, 사중- 안테나 글리칸 모세관 전기영동 (CE) [20] PHA-L, PHA-E, DSA
α1-산 당단백질 ↑코어 푸코스 CE [20] PhoSL, AOL
α1-산 당단백질 ↑α2-6Neu5Ac 2D PAGE 및 LC [21] TJA-I, SNA
α1-산 당단백질 ↑시알릴 Lex 2D PAGE 및 LC [21] sLex에 대한 항체, SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
α1-산 당단백질 ↓α2-3Neu5Ac 2D PAGE a및 LC [21] MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
C1 에스테라제 억제제 ↑Lex CE [20] Lex에 대한 항체, LTA
C1 에스테라제 억제제 ↑삼중-안테나 글리칸 CE [20] DBA, PHA-E, PHA-L
2-HS 당단백질 ↑삼중-, 사중-안테나 글리칸 CE [20] DBA, PHA-E, PHA-L
β-합토글로빈 ↑삼중-, 사중-안테나 글리칸 CE [20] DBA, PHA-E, PHA-L
β-합토글로빈 ↑Lex CE [20] Lex에 대한 항체, LTA
β-합토글로빈 ↑시알릴 Lex 2D PAGE 및 LC [21] sLex에 대한 항체, SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-합토글로빈 ↑α2-6Neu5Ac 2D PAGE 및 LC [21] SNA, TJA-I
β-합토글로빈 ↓α2-3Neu5Ac 2D PAGE 및 LC [21] MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-합토글로빈 ↑삼중-, 사중-안테나 글리칸 LTA 친화성 분리 및 PAGE [22] DBA, PHA-E, PHA-L
β-합토글로빈 ↑α2-3Neu5Ac LTA 친화성 분리 및 PAGE [22] MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-합토글로빈 ↓α2-6Neu5Ac LTA 친화성 분리 및 PAGE [22] SNA, TJA-I
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 LTA 친화성 분리 및 PAGE [22] TJA II, AAL, UEA-I, LCA, PSL, AAA, AAL
β-합토글로빈 ↓이중-안테나 글리칸 Con A [22] NPA, GNA
β-합토글로빈 ↑α2-3Neu5Ac MAA [22] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
α-1-항트립신 ↑사중-안테나 글리칸 CE [20] DBA, PHA-E, PHA-L
α-1-항트립신 ↑Lex CE [20] Lex에 대한 항체, LTA
α-1-항트립신 ↓삼중-, 사중-안테나 글리칸 LTA 친화성 분리 및 PAGE [22] DBA, PHA-E, PHA-L
α-1-항트립신 ↓α2-3Neu5Ac LTA 친화성 분리 및 PAGE [22] MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
α-1-항트립신 ↑α2-6Neu5Ac LTA 친화성 분리 및 PAGE [22] SNA, TJA-I
α-1-항트립신 ↑코어 푸코스 LTA 친화성 분리 및 PAGE [22] AOL, PhoSL
α-1-항트립신 ↑이중 안테나 글리칸 Con A [22] NPA, GNA
α-1-항트립신 ↑α2-6Neu5Ac SNA [22] TJA-I, SCA
α-1-항트립신 ↓α2-3Neu5Ac MAA [22] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
α-1-항키모트립신 ↑사중-안테나 글리칸 CE [20] DBA, PHA-E, PHA-L
α-1-항키모트립신 ↑Lex CE [20] Lex에 대한 항체, LTA
α-1-항키모트립신 ↑시알릴 Lex 2D PAGE 및 LC [21] sLex에 대한 항체, SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
α-1-항키모트립신 ↑α2-6Neu5Ac 2D PAGE 및 LC [21] SNA, TJA-I
α-1-항키모트립신 ↓α2-3Neu5Ac 2D PAGE 및 LC [21] MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
트랜스페린 ↓삼중-안테나 글리칸 CE [20] DBA, PHA-E, PHA-L
헤모펙신 ↑Lex CE [20] Lex에 대한 항체, LTA
IgG ↓갈락토스 2D PAGE 및 LC [21] RCA, RCA120, ABA, 자칼린(DSA), AlloA, ECL, PNA
IgG ↓시알산 2D PAGE 및 LC [21] SNA, TJA-I, MAA, 항-α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CA125 (MUC16) ↑시알릴 Tn 항원 시알리다제 검출 후 VVA 렉틴 [23] SNA, TJA-I, MAA, 항-α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CA125 (MUC16) ↑시알릴 T 항원 시알리다제 검출 후 항탄수화물 IgM 항체 3C9 [23] SNA, TJA-I, MAA, 항-α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4, 즉 HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CA15-3 (MUC1) ↑시알릴 Tn 항원 시알리다제 검출 후 VVA 렉틴 [23] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CA15-3 (MUC1) ↑코어 푸코스 PAGE/LC [24] PhoSL, AOL
CA15-3 (MUC1) ↑이중-안테나 글리칸 PAGE/LC [24] Con A
CA15-3 (MUC1) ↓삼중-, 사중-안테나 글리칸 PAGE/LC [24] PHA-E, PHA-L, DBA
CA15-3 (MUC1) ↑안테나 푸코스 PAGE/LC [24] AAL, TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
인간 부고환 단백질 4(HE4) ↑Ley 항원 루이스y 글리칸에 대한 항체 [25] UEA-I
클러스테린 ↑α2-6Neu5Ac SNA [26] TJA-I, SCA
루신 풍부 α-2-당단백질 ↑α2-6Neu5Ac SNA [26] TJA-I, SCA
유방 CA15-3 (MUC1) ↑황산화 코어1 글리칸 갈렉틴 4 [27] SBA, ABA, VVA, 자칼린(DSA), BPL, PNA, GSL1, SJA
CA15-3 (MUC1) ↑Tn, 시알릴 Tn 항원 -[28] SBA, DBA, VVA, SNA, SNA, TJA-I, MAA, 항-α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4)
CA15-3 (MUC1) 시알릴 T, Tn 항원의 변화 LC [29] SNA, TJA-I, MAA, 항-α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8; SBA, ABA, VVA, BPL, 자칼린, PNA
CA15-3 (MUC1) α2-8Neu5Ac의 변화 LC [29] 폴리(시알산)에 대한 항체, Siglec 7 또는 Siglec 11
CA15-3 (MUC1) 시알화의 변화 LC [29] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CA15-3 (MUC1) 코어2 글리칸의 변화 LC [29] RCA, RCA120, ABA, 자칼린(DSA), PNA, WGA
CA15-3 시알화의 변화 MAA [30] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CA15-3 (MUC1) 시알화의 변화 MAA, SNA, TVA=WGA [30] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CA27.29 시알화의 변화 MAA [30] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
HER2 안테나 푸코스의 변화 UEA [30] TJA II, AAL, LCA, PSL, AAA, LTA
HER2 시알화의 변화 MAA, SNA, TVA=WGA [30] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CEA 삼중-, 사중-안테나 글리칸의 변화 [31] PHA-E, PHA-L, DBA
대장 β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 AAL [32] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 AAL [33] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑이중-안테나 글리칸 PHA-E [32] Con A, PHA-L, DBA
β-합토글로빈 ↑안테나/코어 푸코스 AAL, AOL, LTA [34] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, PhoSL
β-합토글로빈 ↑이량체: Lea on Lea 마우스 단클론 항체 NCC-ST-421, [35]
β-합토글로빈 ↑Galβ1-4GlcNAc 갈렉틴 3 [36] ECA, AlloA
암배아 항원 (CEA) ↑Lex LTA, 시알릴 루이스x 글리칸에 대한 항체 [37]
CEA ↑Ley UEA-I, 시알릴 루이스y 글리칸에 대한 항체 [37]
CEA ↑α2-3Neu5Ac MAA [37] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CEA ↑α-D-Man NPA [37] Con A, GNA
CEA ↑삼중-, 사중-안테나 글리칸 PHA-L [37] PHA-E, DBA
CEA ↑만노스, 푸코스 DC-SIGN [37] NPA, Con A, GNA, AAL, TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA, AOL, PhoSL
CEA ↓말단 GalNAc MGBL [37] DBA, SBA, VVA, HPA, WFA
CEA ↑Galβ1-4GlcNAc 갈렉틴 3
CA 19-9 (MUC1) ↑T 항원 SBA [37] ABA
CA 19-9 (MUC1) ↑Galβ1-3GalNAc PNA [37] ABA, 자칼린
CA 19-9 (MUC1) ↑안테나 푸코스 UEA [37] TJA II, AAL, LCA, PSL, AAA, LTA
CA 19-9 (MUC1) ↑α2-3Neu5Ac MAA [37] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
CA 19-9 (MUC1) ↑α2-6Neu5Ac SNA [37] TJA-I
CA 19-9 (MUC1) ↓삼중-, 사중-안테나 글리칸 PHA-E, PHA-L [37] DBA
CA 19-9 (MUC1) ↑말단 GalNAc MGBL [37] DBA, SBA, HPA, WFA
보체 C3 (UniProtKB: P01024) ↑안테나 푸코스 AAL [38] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
보체 C3 (UniProtKB: P01024) ↑Galβ1-3GalNAc PNA [38] ABA, 자칼린
보체 C3 (UniProtKB: P01024) ↑α2-3Neu5Ac MAA [38] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
보체 C3 (UniProtKB: P01024) ↑α2-6Neu5Ac SNA [38] TJA-I
키니노겐-I (UniProtKB: P01042) ↑고 만노스 Con A [38] NPA, GNA
키니노겐-I (UniProtKB: P01042) ↑안테나 푸코스 AAL [38] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
키니노겐-I (UniProtKB: P01042) ↑Galβ1-3GalNAc PNA [38] ABA, 자칼린
키니노겐-I (UniProtKB: P01042) ↑α2-3Neu5Ac MAA [38] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
키니노겐-I(UniProtKB: P01042) ↑α2-6Neu5Ac SNA [38] TJA-I
히스티딘-풍부 당단백질 (UniProtKB: P04196) ↑안테나 푸코스 AAL [38] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
히스티딘-풍부 당단백질 (UniProtKB: P04196) ↑α2-6Neu5Ac SNA [38] TJA-I
췌장 α1-β-당단백질 ↑Neu5Ac SNA [39] TJA-I, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
아밀로이드 p-보체 ↑Neu5Ac SNA [39] TJA-I, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-2-당단백질 1 (P02749) ↑안테나 푸코스 AAL [40] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-2-당단백질 1 (UniProtKB: P02749) ↑α2-3Neu5Ac MAA [40] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-2-당단백질 1 (UniProtKB: P02749) ↑α2-6Neu5Ac SNA [40] TJA-I
β-2-당단백질 1 (UniProtKB: P02749) ↑고 만노스 Con A [40] NPA, GNA
β-2-당단백질 1 (UniProtKB: P02749) ↑Galβ1-3GalNAc PNA [40] ABA, 자칼린
헤모펙신 (UniProtKB: P02790) ↑안테나 푸코스 AAL [40] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
헤모펙신 (UniProtKB: P02790) ↑α2-3Neu5Ac MAA [40] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
헤모펙신 (UniProtKB: P02790) ↑α2-6Neu5Ac SNA [40] TJA-I
헤모펙신 (UniProtKB: P02790) ↑고 만노스 Con A [40] NPA, GNA
합토글로빈-관련 단백질(UniProtKB: P00739) ↑안테나 푸코스 AAL [40] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
합토글로빈-관련 단백질(UniProtKB: P00739) ↑α2-3Neu5Ac MAA [40] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
합토글로빈-관련 단백질(UniProtKB: P00739) ↑α2-6Neu5Ac SNA [40] TJA-I
합토글로빈-관련 단백질(UniProtKB: P00739) ↑고 만노스 Con A [40] NPA, GNA
합토글로빈-관련 단백질(UniProtKB: P00739) ↑Galβ1-3GalNAc PNA [40] ABA, 자칼린
혈청 아밀로이드 P-보체(UniProtKB: P02743) ↑안테나 푸코스 AAL [40] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
혈청 아밀로이드 P-보체(UniProtKB: P02743) ↑α2-3Neu5Ac MAA [40] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
혈청 아밀로이드 P-보체(UniProtKB: P02743) ↑α2-6Neu5Ac SNA [40] TJA-I
혈청 아밀로이드 P-보체(UniProtKB: P02743) ↑고 만노스 Con A [40] NPA, GNA
혈청 아밀로이드 P-보체(UniProtKB: P02743) ↑Galβ1-3GalNAc PNA [40] ABA, 자칼린(DSA)
클러스테린 (UniProtKB: P10909) ↑안테나 푸코스 AAL [40] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
클러스테린 (UniProtKB: P10909) ↑α2-3Neu5Ac MAA [40] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
클러스테린 (UniProtKB: P10909) ↑α2-6Neu5Ac SNA [40] TJA-I
클러스테린 (UniProtKB: P10909) ↑Galβ1-3GalNAc PNA [40] ABA, 자칼린
항트롬빈-III (UniProtKB: P01008) ↑안테나 푸코스 AAL [40] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
항트롬빈-III (UniProtKB: P01008) ↑α2-3Neu5Ac MAA [40] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
항트롬빈-III (UniProtKB: P01008) ↑α2-6Neu5Ac SNA [40] TJA-I
항트롬빈-III (UniProtKB: P01008) ↑고 만노스 Con A [40] NPA, GNA
항트롬빈-III (UniProtKB: P01008) ↑Galβ1-3GalNAc PNA [40] ABA, 자칼린 (DSA)
키니노겐-1 (UniProtKB: P01042) ↑안테나 푸코스 AAL [40] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
키니노겐-1 (UniProtKB: P01042) ↑α2-3Neu5Ac MAA [40] 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
키니노겐-1 (UniProtKB: P01042) ↑α2-6Neu5Ac SNA [40] TJA-I
키니노겐-1 (UniProtKB: P01042) ↑고 만노스 Con A [40] NPA, GNA
키니노겐-1 (UniProtKB: P01042) ↑Galβ1-3GalNAc PNA [40] ABA, 자칼린 (DSA)
혈장 프로테아제 C1 억제제(UniProtKB: P05155) ↑α2-6Neu5Ac SNA [40] TJA-I
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 AAL [41] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 AAL [42] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑코어 푸코스 AOL [41] PhoSL
β-합토글로빈 ↑코어 푸코스 PhoSL [43] AOL
α-1-항키모트립신 ↑안테나 푸코스 AAL [42] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
트롬보스폰딘-1 ↑안테나 푸코스 AAL [42] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
α-1-항트립신 ↑안테나 푸코스 AAL [42] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
뮤신(CAM 17.1) ↑β-D-GlcNAc, Neu5Ac WGA [44, 45] DSA, LEL, SNA, TJA-I
MUC16 ↑안테나 푸코스 AAL [46, 47] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
MUC16 ↓T 항원 BPL, 자칼린 (DSA), PNA [46] SBA, VVA, ABA, GSL1, SJA
MUC16 ↓Gal-GlcNAc ECL, PHA-L [46] PHA-E, AlloA, ECA,
MUC16 ↓GalNAc DBA, GSL1, SBA, VVL, SJA [46] ABA, BPL, PNA
MUC16 ↓GlcNAc GSL2, STL [46] DSA, LEL, WGA
MUC16 ↓만노스 Con A [46] GNA, NPA
MUC5ac ↑T 항원 자칼린 [46] SBA, ABA, VVA, BPL, PNA
MUC5ac ↑안테나 푸코스 AAL [46] TJA II, EA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
MUC5ac ↑T 항원 자칼린(DSA) [46] SBA, ABA, VVA, BPL, PNA, GSL1, SJA
MUC5ac ↓Gal-GlcNAc ECA, PHA-L, RCA120 [46] PHA-E, RCA
MUC5ac ↓GalNAc DBA, VVA, SJA [46] GSL1, SBA, ABA, BPL, PNA
MUC5ac ↓GlcNAc GSL 2, LEL, STL [46] DSA, LEL, WGA, GSL2, STL
MUC1 ↓Gal-GlcNAc, 사중-안테나 글리칸 PHA-L [46] ECA, PHA-L, RCA120, PHA-E, RCA; DBA
MUC1 ↓T 항원 자칼린(DSA) [46] SBA, ABA, VVA, BPL, PNA, GSL1, SJA
MUC1 ↓GalNAc DBA [46] VVA, SJA, GSL1, SBA, ABA, BPL, PNA
MUC1 ↑Galα1-3Gal GSL 1 [46]
MUC1 ↓GlcNAc GSL 2, LEL, STL [46] DSA, LEL, WGA, GSL2, STL
갑상선 티로글로불린(TG) ↓안테나 푸코스 LCA [48, 49] TJA II, AAL, UEA-I, PSL, AAA, LTA
TG ↑ 말단 갈락토스 RCA [50] RCA120, ABA, AlloA, 자칼린 (DSA), ECL, PNA
TG ↑Gal-GlcNAc LC 분석 [50] ECA, PHA-L, RCA120, PHA-E, RCA
TG ↑삼중-안테나 글리칸 LC 분석 [50] PHA-E, PHA-L, DBA
TG ↑안테나 푸코스 LC 분석 [50] TJA II, AAL, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
TG ↑만노스 LC 분석 [50] Con A, NPA, GNA
간 α1-항트립신 (AAT) ↑안테나 푸코스 LCA [51] TJA II, UEA-I, AAL, PSL, AAA, LTA
α1-항트립신 (AAT) ↑안테나 푸코스 AAL [52, 53] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
α-페토단백질(AFP) ↑안테나 푸코스 LCA [51, 54] TJA II, AAL, UEA-I, PSL, AAA, LTA
α-페토단백질(AFP) ↑안테나 푸코스 AAL [54] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
AFP-L3 ↑안테나 푸코스 LCA [55, 56] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LTA
트랜스페린 ↑안테나 푸코스 LCA [51] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LTA
α1-항키모트립신 (AAT) ↑안테나 푸코스 AAL [52] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
α-1-산 당단백질 1 ↑안테나 푸코스 AAL [52] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
세룰로플라스민 ↑안테나 푸코스 AAL [52] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
α-2-마크로글로불린 ↑안테나 푸코스 AAL, LCA [54] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LTA
α-2-HS-당단백질 ↑안테나 푸코스 AAL [53] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
페투인 A ↑안테나 푸코스 AAL [57] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
헤모펙신 ↑안테나 푸코스 AAL [54, 57] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
헤모펙신 ↑안테나 푸코스 LCA [54] TJA II, AAL, UEA-I, PSL, AAA, LTA
세룰로플라스민 ↑안테나 푸코스 AAL, LCA [58] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LTA
C3 보체 ↑안테나 푸코스 AAL, LCA [58] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LTA
히스티딘 풍부 당단백질 ↑안테나 푸코스 AAL, LCA [58] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LTA
단핵구 분화 항원 CD14 ↑안테나 푸코스 AAL, LCA [58] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LTA
간세포 성장 인자 활성화제 ↑안테나 푸코스 AAL, LCA [58] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LTA
폐 β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 AAL [59] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LCA, LTA
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 AAL [59] TJA II, UEA-I, PSL, AAA, LCA, LTA
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 MS [60] AAL, TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑코어 푸코스 MS [60] AOL, PhoSL
β-합토글로빈 ↑삼중-, 사중-안테나 글리칸 MS [60] PHA-E, PHA-L, DBA
β-합토글로빈 ↑α2-6Neu5Ac MS [61] SNA, TJA-I
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 MS [61] AAL, TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑시알릴 Lex LC [62] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-합토글로빈 ↑삼중-안테나 LC [62] PHA-E, PHA-L, DBA
β-합토글로빈 ↑시알산 LC [62] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
피브로넥틴 ↑Galβ1-3GalNAc PNA [63] ABA, 자칼린 (DSA)
α1-산 당단백질 ↑안테나 푸코스 AAL [64] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
α1-산 당단백질 ↑시알릴 Lex sLex에 대한 항체 [64] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
α-1-항트립신 ↑안테나 푸코스 AAL [65] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
α-1-항트립신 ↑β-Gal, Galβ1-4GlcNAc RCA120 [65] RCA, ECL, AlloA
α-1-항트립신 ↑α-Gal 및 α-GalNAc BS-I [65] DBA, SBA, HPA
α-1-항트립신 ↑(GlcNAc)n WGA [65] LEL
α-1-항트립신 ↑분지형 (LacNAc)n PWM [65]
α-1-항트립신 ↑고-만노스, Manα1-3Man GNA [65] Con A, NPA
위 α1-산 당단백질 ↑이중-안테나 글리칸 Con A [66] NPA, GNA
α1-산 당단백질 ↓갈락토스 [66] RCA, RCA120, ABA, AlloA, 자칼린(DSA), ECL, PNA
α1-산 당단백질 ↑Lex [66] LTA
β-합토글로빈 ↑시알릴 Lex (sLex) 항-sLeX 마우스 단클론 KM93 항체 '[67] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-합토글로빈 ↑삼중-, 사중-안테나 글리칸 LC/MS [68] PHA-E, PHA-L, DBA
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 LC/MS [68] AAL, TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑시알릴-Lea (sLea) LC/MS [68] sLea에 대한 항체, SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
β-합토글로빈 ↑시알릴-Lea (sLea) LC/MS [68] sLea에 대한 항체, SNA, TJA-I, MAA, 항-α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4)
β-합토글로빈 ↑안테나 푸코스 AAL [68] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
β-합토글로빈 ↑(GlcNAc)n WGA [68] LEL
β-합토글로빈 ↓고 만노스 Con A [68] NPA, GNA
루신-풍부-α2-당단백질 ↑시알릴 Lex (sLex) 항-sLeX 마우스 단클론 KM93 항체 '[67] sLea에 대한 항체, SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
고환 인간 융모막 성선 자극 호르몬-β ↑푸코스 LC-MS [69] AAL, TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA, PhoSL, AOL
인간 융모막 성선 자극 호르몬-β ↑삼중-안테나 글리칸 LC-MS [69] PHA-E, PHA-L, DBA
AFP-L3 ↑안테나 푸코스 LCA [70] AAL, TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
방광 MUC1 ↑안테나 푸코스 AAL [71, 72] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
엔도플라스민(HSP90B1) ↑안테나 푸코스 AAL [71, 72] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
골지체 단백질 1 (GLG1) ↑안테나 푸코스 AAL [71, 72] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
전립선 산 포스파타제 (ACPP) ↑안테나 푸코스 AAL [71, 72] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
Ig 감마-2 체인 C 영역 (IGHG2) ↑안테나 푸코스 AAL [71, 72] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
디옥시리보뉴클레아제-2-알파(DNASE2A) ↑안테나 푸코스 AAL [71, 72] TJA II, UEA-I, LCA, PSL, AAA, LTA
인테그린 ↑시알산 MS [73] SNA, TJA-I, MAA, 항α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4), Siglec 1, Siglec 4 또는 Siglec 8
인테그린 ↑사중-안테나 글리칸 MS [73] PHA-E, PHA-L, DBA
MUC16 ↑시알릴 Tn LC/MS [74] SNA, TJA-I, MAA, 항-α2-3 결합 시알산 항체(즉, HYB4)
α-1-항트립신 ↑고 만노스 Con A [75] NPA, GNA
α-1-항트립신 ↑(GlcNAcβ1-4)n WGA [75] LEL
본 발명은 또한 다음 항목에 관한 것이다:
1. 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상대화하는 방법으로서,
상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호를 바람직하게는 표준물질로서 작용하는 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되,
상기 신당단백질은 비오틴을 통해, 의심할 여지 없이 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하고, 바람직하게는 상대화는 신호(1)을 표준물질로부터의 신호(2)와 비교하여 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시킴으로써, 상기 신호(1)을 상기 신호(2)에, 또는 그 반대로 상대화하는 것을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상대화는
상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되,
(i) 신호(1)이 신호(2)보다 낮은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하지 않음을 나타내고, 또는
(ii) 신호(1)이 신호(2)와 같거나 높은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재함을 나타내는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상대화는
상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)의 농도 시리즈를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 농도 시리즈는 상기 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 알려진 미리 결정된 임계 농도 이상에 상응하는 농도를 포함하는 방법.
5. 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)에 상대화하기 위해, 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 실제로 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 비오틴을 통해 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하는 바람직하게는 표준물질로서 작용하는 신당단백질의 용도로서,
상기 신당단백질은 스트렙타비딘-결합 분자를 통해, 바람직하게는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하고, 바람직하게는 상대화는 신호(1)을 표준물질로부터의 신호(2)와 비교하여, 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시키는 것을 포함하는 용도.
6. 제5항에 있어서, 상대화는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되,
(i) 신호(1)이 신호(2)보다 낮은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하지 않음을 나타내고, 또는
(ii) 신호(1)이 신호(2)와 같거나 높은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재함을 나타내는 용도.
7, 제6항에 있어서, 상대화는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)의 농도 시리즈를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하는 용도.
8. 제7항에 있어서, 농도 시리즈는 상기 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 알려진 미리 결정된 임계 농도 이상에 상응하는 농도를 포함하는 용도.
9. 제1항 내지 제8항에 있어서, 신호는 신호 강도인 방법 또는 용도.
10. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 신호(1) 및 신호(2)는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 효소 결합 렉틴 분석(ELLA), 자기 ELLA(MELLA), 바람직하게는 ELLA 또는 MELLA에 의해 얻는 방법 또는 용도.
11. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 글리칸 구조(A)는 코어 푸코스, 안테나 푸코스, N-결합 올리고당을 함유하는 Fucα1-6GlcNAc-N-Asn, Fucα1-6/3GlcNAc, α-L-Fuc, Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Fucα1-2Gal, Fuca1-6GlcNAc, Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc, 분지형 N-결합 육당류, Manα1-3Man, α-D-Man, (GlcNAcβ1-4)2-4, Galβ1-4GlcNAc, GlcNAcα1-4Galβ1-4GlcNAc, (GlcNAcβ1-4)2-5, Neu5Ac (시알산), Galβ1-3GalNAc-세린/트레오닌, Galα1-3GalNAc, Galβ1-6Gal, Galβ1-4GlcNAc, Galβ1-3GalNAc, GalNAcα1-3GalNAc, GalNAcα1-3Gal, GalNAcα/β1-3/4Gal, α-GalNAc, GalNAcβ1-4Gal, GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal, GalNAcα1-2Gal, GalNAcα1-3GalNAc, GalNAcβ1-3/4Gal, GalNAc-Ser/Thr(Tn 항원), Galβ1-3GalNAc-Ser/Thr(T 항원), GalNAcβ1-4GlcNAc(LacdiNAc), α-2,3Neu5Ac (α2-3 결합 시알산), α-2,6Neu5Ac(α2-6 결합 시알산), α-2,8Neu5Ac(α2-8 결합 시알산), 시알산(α-2,3Neu5Ac, α-2,6Neu5Ac 또는 α-2,8Neu5Ac), Neu5Acα4/9-O-Ac-Neu5Ac, Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc/GlcNAc, Neu5Acα2-6Gal/GalNAc, N-결합 이중 안테나, N-결합 삼중/사중 안테나, 분지형 β1-6GlcNAc, Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3/4GlcNAc, Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, 고 만노스, 시알릴 루이스a(시알릴 Lea) 항원, 시알릴 루이스x(시알릴 Lex) 항원, 루이스x(Lex) 항원, 시알릴 Tn 항원, 시알릴 T 항원, 루이스y(Ley) 항원, 황산화 코어 1 글리칸, Tn 항원, T 항원, 코어 2 글리칸, 루이스a(Lea) 항원, (GlcNAcβ1-4)n, β-D-GlcNAc, GalNAc, Gal-GlcNAc, GlcNAc, Galα1-3Gal, Galβ1-3GalNAc, α-Gal, α-GalNAc, (GlcNAc)n, 분지형 (LacNAc)n로 구성된 군으로부터 선택되는 방법 또는 용도.
12. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질은 암 바이오마커 단백질, 자가면역질환 바이오마커 단백질 또는 염증성 질환 바이오마커 단백질인 방법 또는 용도.
13. 제13항에 있어서, 상기 암 바이오마커 단백질은 난소암 바이오마커 단백질, 유방암 바이오마커 단백질, 대장암(colorectal cancer) 바이오마커 단백질, 췌장암 바이오마커 단백질, 전립선암 바이오마커 단백질, 갑상선암 바이오마커 단백질, 간암 바이오마커 단백질, 폐암 바이오마커 단백질, 위암 바이오마커 단백질, 고환암 바이오마커 단백질 또는 방광암 바이오마커 단백질인 방법 또는 용도.
14. 제14항에 있어서, 상기 전립선암 바이오마커 단백질은 β-합토글로빈, TIMP-1, PSA, fPSA 또는 tPSA인 방법 또는 용도.
15. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리칸 구조(A)의 존재는 암을 나타내는 방법 또는 용도.
16. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 단백질은 대상체로부터 얻은 샘플로부터 얻는 방법 또는 용도.
17. 제16항에 있어서, 샘플은 타액 샘플, 혈청 샘플, 조직 샘플, 혈액 샘플, 소변 샘플, 림프액 샘플, 비인두 세척 샘플, 가래 샘플, 구강 면봉 샘플, 인후 면봉 샘플, 코 면봉 샘플, 기관지 폐포 세척 샘플 또는 기관지 분비물 샘플인 방법 또는 용도.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간인 방법 또는 용도.
****
본 명세서에서 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수형을 포함한다는 점에 유의한다. 따라서, 예를 들어 "시약"에 대한 언급에는 하나 이상의 이러한 상이한 시약이 포함되며, "방법"에 대한 언급에는 본 명세서에 기술된 방법을 위해 변형 또는 치환될 수 있는 당업자에게 공지된 등가의 단계들 및 방법들에 대한 언급이 포함된다.
달리 명시되지 않는 한, 일련의 요소들 앞에 나오는 "적어도"라는 용어는 일련의 요소들 모두를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소들의 전부 또는 다른 조합"의 의미를 포함한다.
용어 "미만" 또는 "초과"는 구체적인 숫자가 포함되지 않는다. 예를 들어 20 미만은 표시된 숫자보다 적음을 의미한다. 마찬가지로, 초과 또는 보다 큰은 표시된 숫자보다 많거나 크다는 것을 의미한다. 예를 들어, 80% 초과는 표시된 수치인 80% 보다 많거나 큼을 의미한다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 뒤따르는 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)"와 변형들, 예컨대 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)"은 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)"이라는 용어로 대체될 수 있으며, 본 명세서에서 사용되는 경우에는 "가지는(having)"이라는 용어로 대체될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "구성된(consisting of)"은 명시되지 않은 모든 요소, 단계 또는 성분을 제외한다.
용어 "포함하는(including)"은 "포함하되 이에 제한되지 않는"을 의미한다. "포함하는(including)"과 "포함하지만 이에 제한되지 않는"은 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "약", "대략" 또는 "본질적으로"는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 15% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 여기에는 구체적인 숫자도 포함된다. 즉, "약 20"에는 20이라는 숫자도 포함된다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 물질, 시약 및 물질 등에 제한되지 않고 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정한 구체예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 모든 간행물(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 지침 등 포함)은 위 또는 아래 여부에 관계없이 전체 내용이 참조로 포함된다. 본 문서의 어떠한 내용도 본 발명이 이전 발명으로 인해 그러한 개시에 앞서는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참조로 포함된 자료가 본 특허명세서와 모순되거나 일치하지 않는 경우, 특허명세서는 임의의 그러한 자료를 대체할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 문서 및 특허 문서의 내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
실시예
본 발명과 그 장점에 대한 더 나은 이해는 단지 설명의 목적으로만 제공되는 다음 실시예를 통해 명백해질 것이다. 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
재료 및 방법
화학물질
컨쥬게이트되지 않은 스트렙타비딘(~55 kDa, 글리코실화되지 않음), MAA-II(~130 kDa) 및 항스트렙타비딘 항체(~150 kDa)는 미국 Vector Labs 사에서 구입하였다. 글리칸 3'-시알릴락토사민-PEG3-비오틴(싱글 암, ~1100 Da)은 캐나다 Sussex Research 사에서 구입하였다. 탈염 컬럼(MWCO = 7000 Da)은 미국 Thermo 사에서 구입하였다. 완충 성분 등과 같은 모든 일반적인 화학물질은 미국 Sigma Merck 사에서 구입하였다. 모든 실험에는 초순수 탈이온수(G = 0.055 μS)를 사용하였다. 모든 완충액은 0.22 ㎛ 멸균 필터를 사용하여 사용하기 전에 여과되었다.
표면 플라즈몬 공명(SPR)
SPR에 사용된 모든 시약은 HBS-P+(완충액 10×; BR-1006-71), 커플링 키트(BR100050), EDC(0.4 M), NHS(0.1 M), 에탄올아민 염산염(1 M; pH 8.5)을 포함하여 GE Healthcare 사에서 구입하였고, 커플링을 위해 아세테이트 완충액 pH 4.0(BR-1003-51)을 사용하였다. SPR 분석은 센서 칩 CM5(29-1496-04) 또는 11-메르캅토운데칸산(UV/VIS 에탄올 중 5 mM, Sigma Merck, 미국; 실온에서 밤새 배양)을 사용하여 변형된 Au 칩을 사용하여 BiacoreX100(GE Healthcare)에서 25℃에서 30 ㎕/min의 일정한 유속으로 실행되었다. 기기를 실행하는 데에는 원본 SW Biacore X100 제어 소프트웨어가 사용되었다.
나노입자 추적 분석(NTA)
모든 샘플을 0.1 M PB(pH 7.4, 0.22 ㎛ 여과됨)에 희석하고 연속 흐름에서 측정하였다(단일 수행을 위해 총 부피 500 ㎕가 준비됨). 제안된 대로 프레임당 이상적인 입자(20-100개 입자/프레임)을 사전테스트하여 측정 농도를 찾았다. NanoSight NS300 제조업체의 소프트웨어 설명서에 따라 다음 설정이 지정되었다. 검출 한계는 10-100개의 적색 십자 기호가 계수되는 제한이 있는 가능한 한 많은 입자를 포함하도록 결정되었다. 파란색 십자 기호 수는 최소로 제한되었다. 불분명한 입자가 발생하지 않도록 자동 초점을 조정하였다. 각 측정에 대해 다음 조건에서 5개의 60초 비디오를 캡처하였다: 셀 온도: 25℃; 주사기 속도: 10 ㎕/min. 캡처 후 비디오는 내장 NanoSight 소프트웨어 NTA 3.1 Build 3.1.46에 의해 검출 한계= 10으로 분석되었다.
결과 및 토론
스트렙타비딘-글리칸 신당단백질 제조
동결건조된 스트렙타비딘 분말을 멸균된 0.1 M PB(pH 7.4)에 재현탁하여 1 mg.ml-1의 농도를 얻었다. 알려진 농도의 비오틴화된 글리칸의 경우, 이 두 용액을 37℃에서 1시간 동안 1+5 분자 비율로 부드럽게 혼합(500 rpm)하면서 혼합하였다. 마지막으로, 이 신당단백질은 7k MWCO(이전에 PB를 사용하여 평형화됨)가 포함된 Zeba Spin 탈염 컬럼을 사용하여 3000 rpm에서 1분 동안 여분의 글리칸을 정제하였다. 신당단백질은 c = ~0.9 mg.ml-1에서 얻었으며 나머지 실험 작업 동안 4℃에서 보관되었다.
SPR 결합 분석 첫 번째 실행에서는 카르복시메틸-덱스트란 CM5 SPR 칩을 사용하여 최적의 고정 pH 값을 찾은 다음 센서 표면에 리간드를 고정하였다. 모든 경우에 대한 최적 pH는 4.0이었다(도 2A). 이는 다양한 pH 값에 대한 센서 인터페이스에 리간드를 사전 농축하는 동안의 기울기 값을 기준으로 한다. 스트렙타비딘과 MAA-II 렉틴의 pI 값은 각각 5.0과 4.7인 반면, 신당단백질에 대해서도 유사한 값이 예측된다. 세 가지 경우 모두, 즉 스트렙타비딘, 신당단백질 및 MAA-II 렉틴의 경우 활성화 및 에탄올아민 차단을 위한 아민 커플링(EDC/NHS 프로토콜)이 사용되었다(도 2B). 샌드위치 구성을 완성하려면 항스트렙타비딘 항체(Ab)와 MAA-II 렉틴이 동시에 신당단백질에 결합해야 한다. 그러나 아마도 입체 장애, 매우 높은 음전하 밀도 및 프리즘/금 인터페이스로부터의 층 두께/거리(및 이러한 요인의 조합)로 인해 단일 주기 동역학(SCK) 동안 스트렙타비딘 변형된 CM5 칩에 결합하는 Ab만 관찰될 수 있다(도 3). 나머지 실험에서는 SCK 중 시료의 농도가 높을수록 일반적으로 신당단백질 변형 칩을 사용한 렉틴 결합 중에도 부정적인 반응이 더 커진다(MAA-II, SNA-I 및 WGA의 경우, 모두 시알릴화/음으로 하전된 글리칸 부분에 결합해야 함).
샌드위치(MAA-II/글리칸-스트렙타비딘/항체)의 성공적인 제조를 확인하기 위해 노출된 Au 칩을 11-메르캅토운데칸산의 5 mM 에탄올 용액(RT, 암 조건, 밤새)에 침지하여 2D 칩을 제조하였다. 이 접근법의 장점은 기본적으로 모든 음전하(카르복시기)가 표면에 국한되어 고정/차단 후에 제거된다는 것이다. 전체 샌드위치 준비와 분석 워크플로우는 도 5A에 도시된다.
각 단계에 적용되는 조건에 대한 자세한 개요는 하기 표 2에 요약되어 있다.
SPR 결합 분석을 사용하여 샌드위치 제조에 적용되는 개별 단계 개요, 즉, 도 4에 도시된 바와 같이 분자 유형, 조건 및 결과. 모든 R.U.는 검출 셀(FC2)에서 공백(플로우 셀 1, FC1)을 뺀 후 계산된다. 표면 재생은 선택 사항이며 Glycanostics MELLBA 분석에는 적용되지 않지만 50 mM NaOH만으로는 표면을 완전히 재생시킬 수 없다.
분석 분자 조건 결과/주석
고정화 MAA-II 렉틴 아세테이트 완충액 pH 4.0, 아민 커플링 FC1 = 433.8 R. U.; FC2 = 545.6 R. U.
캡처 신당당백질 실행 완충액,
c = 0.5 mg/ml,
t = 420초(600초 안정화)		 224.5 R. U.
샘플 항체 실행 완충액,
c = 0.05 mg/ml,
t = 120초(1200초 안정화)		 1457. 3 R. U.
재생 - NaOH,
c = 50　mM,
t = 30 s		 (선택사항)
MNP 변형 및 농축 과정에 대한 NTA 분석
자성 나노입자(MNP, 130 nm COOH 말단, 덱스트란 코팅 나노마그)의 변형을 관찰하기 위한 NTA 분석을 위해, 3종의 샘플 모두, 즉, 노출된 MNP, Ab-변형된 MNP(MNP + Ab) 및 신당단백질-농축된 Ab-변형된 MNP(MNP + Ab + C)는 특정 화학물질/성분을 사용하든 공백의 경우 PB를 사용하든 동일하게 처리되었다 - 3종의 샘플 모두 동일한 방식/동일한 횟수로 분리되었다. 생체 인식을 위해 구형 인터페이스를 사용하면 이 경우 더 높은 신호가 생성된다. 더 긴 링커 분자로 인해 리간드 밀도가 감소하고 위의 SPR 실험에 사용된 평면 표면에 비해 MELLBA의 입체 장애가 감소하기 때문이다(도 6A 및 B; 가설, 그러나 다른 곳에서 발표됨). NTA의 결과는 도 6C에 표시된다. 변형/농축 후 변형된 MNP는 직경이 증가하여 시험관 바닥에 침전물을 형성할 가능성이 더 높다. NTA 분석을 위해 각 샘플을 멸균 PB에 500배 희석하였다.
변형되지 않은(그러나 동일한 횟수로 분리된) MNP는 d ≤ 140 nm인 거의 독점적으로 하나의 단일 피크를 생성했지만, Ab 컨쥬게이트(아민 커플링, 10분, RT) 후에는 2개의 주요 분획이 있다 - 즉 (i) ≤ 120 nm(개질되지 않은 입자에 비해 약간 적음) 및 (ii) ≤ 150 nm의 약 20%이다. 정제된 신당단백질과 함께 이러한 입자를 인큐베이션한 후 적어도 4개의 상이한 분획이 관찰될 수 있다 - ~220 nm에서 훨씬 더 큰 응집체가 발생하였다. 공정 1(ab 고정화)에서 유체역학적 직경(dH)의 감소는 고정화 공정 동안 MNP의 결합 능력이 포화되지 않은 경우 고정화된 ab 주위의 덱스트란 매트릭스의 "압축"으로 인해 발생한다(가설). 그렇지 않으면 도 7과 같이 dH가 증가한다. 이 실험의 중요한 측면은 공정 2의 dH가 ~20 nm 증가한다는 것이다 - 글리칸(삼당류와 PEG3 링커는 수분이 풍부하고 매우 유연함)의 영향을 받는 값이다.
글리칸 함량을 검출하기 위한 MALDI-TOF MS 및 ELLBA
다양한 스트렙타비딘 + 비오티닐-글리칸 비율을 사용하여(즉, 부피당 분자 수의 1+0, 1+1, 1+2, 1+3, 1+4, 1+5, 1+6 및 1+7 비율) 완전히 글리코실화된 단백질 표준물질을 제조하였다. MALDI-TOF 질량 분석기(Bruker, USA) 및 이전에 최적화된 프로토콜(2,5-dihydroxyacetophenone(DHA) 매트릭스 사용)을 사용하여 이전에 다른 곳에서 설명한 대로 이온화된 샘플 구성 요소에 대한 질량 조각(m/z 매개변수)을 검출하였다. 도 9에는 질량 스펙트럼이 자세히 표시되어 있다. 즉 모든 샘플(A)의 스트렙타비딘 단편은 ~55 kDa 동종사량체의 한 하위 단위 질량인 ~13 kDa만큼 다르다. 가장 강렬한 피크는 항상 ~13 kDa였으며(도 8), 다른 피크는 훨씬 낮은 강도를 나타냈다. 이전에 비오티닐-글리칸과 함께 인큐베이션된 샘플(1+0을 제외한 모든 것, 즉 노출된 스트렙타비딘, 도 9B)만이 m/z = ~1300 Da, 3'-시알릴화 글리칸 유도체인 피크의 존재를 보여주었다(도 9C). 더욱이, 이 피크의 강도는 글리칸/스트렙타비딘 비율이 증가함에 따라 증가하였다(도 9D). 그러나 스트렙타비딘은 최대 4개의 비오틴에만 결합할 수 있으므로 이러한 글리칸에 의한 단백질 표준물질의 완전한 포화를 유지하려면 적절한 글리칸/스트렙타비딘 비율을 사용하는 것이 중요하다.
이를 위해 효소 결합 렉틴 결합 분석(ELLBA)을 사용하여 완전 포화 비율을 알아냈다. 분석 구성은 도 9E 왼쪽에 묘사된다 - 단백질 표준물질은 ELISA 플레이트 웰의 바닥에 고정되어 있으며, 결합되지 않은 MAA-II(사용 가능한 모든 글리칸 에피토프를 효과적으로 차단할 수 있는 2,3-시알산/Gal 특이적임)와 함께 인큐베이션한 다음 여러 비오틴 분자를 함유하고 불포화 스트렙타비딘 표준물질의 유리 비오틴 결합 부위에 결합하는 비오틴화된 MAA-II와 함께 인큐베이션된다. 이어서, 스트렙타비딘-퍼옥시다제를 사용하여 광학 신호(OPD/과산화수소)를 생성한다. 스트렙타비딘-HRP는 비오틴화된 MAA-II에 존재하는 유리 비오틴 분자에만 결합하므로 스트렙타비딘에 존재하는 글리칸 분자의 양과 상호 관계에 있다(도 9E 오른쪽).
결론
비오틴화된 글리칸을 스트렙타비딘에 부착하여 만들어진 신당단백질(단백질 표준물질)은 MAA-II 렉틴과 항스트렙타비딘 항체에 의해 동시에 인식되었다. 이 예상치 못한 발견은 그러한 신당단백질이 ELISA와 유사한 분석 형식(MELLA 포함)을 위한 단백질 표준물질로 적용될 수 있음을 보여준다.
실시예 2
실험 작업에 따르면 당단백질 표준물질(본 명세서에서 신당단백질(표준물질) 또는 본 발명의 표준물질, 예를 들어 위의 실시예 1에 적용된 표준물질이라고도 함)은 - 4℃에서 보관 시 최소 1주 동안 안정적임을 보여주었다. 이러한 표준물질은 재현성이 높은 방식, 즉 18주 이내에 17개의 독립적인 준비 배치에서 당단백질 표준물질을 제조하기 위해 RSD 8.17%로 제조될 수 있다.

Claims (15)

  1. 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상대화하는 방법으로서,
    상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호를 표준물질로서 작용하는 신당단백질(neoglycoprotein)에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되,
    상기 신당단백질은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자(glycan determinant)에 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하고,
    상대화는 신호(1)을 표준물질로부터 얻은 신호(2)와 비교하여, 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시킴으로써, 상기 신호(1)을 상기 신호(2)에, 또는 그 반대로 상대화하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상대화는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되,
    (i) 신호(1)이 신호(2)보다 낮은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하지 않음을 나타내고,
    (ii) 신호(1)이 신호(2)와 같거나 높은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재함을 나타내는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상대화는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)의 농도 시리즈를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    농도 시리즈는 상기 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 알려진 미리 결정된 임계 농도 이상에 상응하는 농도를 포함하는 방법.
  5. 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)에 상대화하기 위해, 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 글리칸 구조(A)를 실제로 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 비오틴을 통해 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하는 표준물질로서 작용하는 신당단백질의 용도로서,
    상기 신당단백질은 상기 글리칸 구조(A)를 포함하는 적어도 하나의 미리 정의된 글리칸 결정자에 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 결합된 스트렙타비딘 분자를 포함하고,
    상대화는 신호(1)을 표준물질로부터의 신호(2)와 비교하여 신호(2)를 신호(1)에서 얻은 정보와 연관시키는 것을 포함하는 용도.
  6. 제5항에 있어서,
    상대화는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하되,
    (i) 신호(1)이 신호(2)보다 낮은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)는 상기 목적 단백질에 존재하지 않음을 나타내고,
    (ii) 신호(1)이 신호(2)와 같거나 높은 경우, 상기 의심되는 글리칸 구조(A)는 상기 목적 단백질에 존재함을 나타내는 용도.
  7. 제6항에 있어서,
    상대화는 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 의심되는 상기 글리칸 구조(A)를 결정하여 얻은 신호(1)을 상기 신당단백질에 실제로 포함된 상기 글리칸 구조(A)의 농도 시리즈를 결정하여 얻은 신호(2)와 비교하는 것을 포함하는 용도.
  8. 제7항에 있어서,
    농도 시리즈는 상기 글리칸 구조(A)가 상기 목적 단백질에 존재하는 것으로 알려진 미리 결정된 임계 농도 이상에 상응하는 농도를 포함하는 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    신호는 신호 강도인 방법 또는 용도.
  10. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    신호(1) 및 신호(2)는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 효소 결합 렉틴 분석(ELLA), 자기 ELLA(MELLA), 바람직하게는 ELLA 또는 MELLA에 의해 얻는 방법 또는 용도.
  11. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    글리칸 구조(A)는 코어 푸코스(core fucose), 안테나 푸코스(antennary fucose), N-결합 올리고당을 함유하는 Fucα1-6GlcNAc-N-Asn, Fucα1-6/3GlcNAc, α-L-Fuc, Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Fucα1-2Gal, Fuca1-6GlcNAc, Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc, 분지형 N-결합 육당류, Manα1-3Man, α-D-Man, (GlcNAcβ1-4)2-4, Galβ1-4GlcNAc, GlcNAcα1-4Galβ1-4GlcNAc, (GlcNAcβ1-4)2-5, Neu5Ac(시알산), Galβ1-3GalNAc-세린/트레오닌, Galα1-3GalNAc, Galβ1-6Gal, Galβ1-4GlcNAc, Galβ1-3GalNAc, GalNAcα1-3GalNAc, GalNAcα1-3Gal, GalNAcα/β1-3/4Gal, α-GalNAc, GalNAcβ1-4Gal, GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal, GalNAcα1-2Gal, GalNAcα1-3GalNAc, GalNAcβ1-3/4Gal, GalNAc-Ser/Thr(Tn 항원), Galβ1-3GalNAc-Ser/Thr(T 항원), GalNAcβ1-4GlcNAc(LacdiNAc), α-2,3Neu5Ac(α2-3 결합 시알산), α-2,6Neu5Ac(α2-6 결합 시알산), α-2,8Neu5Ac(α2-8 결합 시알산), 시알산(α-2,3Neu5Ac, α-2,6Neu5Ac 또는 α-2,8Neu5Ac), Neu5Acα4/9-O-Ac-Neu5Ac, Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc/GlcNAc, Neu5Acα2-6Gal/GalNAc, N-결합 이중 안테나, N-결합 삼중/사중 안테나, 분지형 β1-6GlcNAc, Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3/4GlcNAc, Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc, Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, 고 만노스(high mannose), 시알릴 루이스a(시알릴 Lea) 항원, 시알릴 루이스x(시알릴 Lex) 항원, 루이스x(Lex) 항원, 시알릴 Tn 항원, 시알릴 T 항원, 루이스y(Ley) 항원, 황산화 코어 1 글리칸, Tn 항원, T 항원, 코어 2 글리칸, 루이스a(Lea) 항원, (GlcNAcβ1-4)n, β-D-GlcNAc, GalNAc, Gal-GlcNAc, GlcNAc, Galα1-3Gal, Galβ1-3GalNAc, α-Gal, α-GalNAc, (GlcNAc)n, 분지형 (LacNAc)n로 구성된 군으로부터 선택되는 방법 또는 용도.
  12. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    목적 단백질은 암 바이오마커 단백질, 자가면역질환 바이오마커 단백질 또는 염증성 질환 바이오마커 단백질인 방법 또는 용도.
  13. 제13항에 있어서,
    상기 암 바이오마커 단백질은 난소암 바이오마커 단백질, 유방암 바이오마커 단백질, 대장암(colorectal cancer) 바이오마커 단백질, 췌장암 바이오마커 단백질, 전립선암 바이오마커 단백질, 갑상선암 바이오마커 단백질, 간암 바이오마커 단백질, 폐암 바이오마커 단백질, 위암 바이오마커 단백질, 고환암 바이오마커 단백질 또는 방광암 바이오마커 단백질인 방법 또는 용도.
  14. 제14항에 있어서,
    상기 전립선암 바이오마커 단백질은 β-합토글로빈, TIMP-1, PSA, fPSA 또는 tPSA인 방법 또는 용도.
  15. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글리칸 구조(A)의 존재는 암을 나타내는 방법 또는 용도.
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