JP2006284298A - 大腸腫瘍の診断方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 自然糞便中のプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の存在を検出することを含む、大腸腫瘍の診断方法。
【選択図】 なし
Description
Gahlen et al.Lasers in Surgery and Medicine 26:302-307 (2000)
(2)本発明は、自然糞便中のプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の存在を大腸腫瘍マーカーとして検出する方法に関する。
(3)本発明は、自然糞便中のプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の存在の検出を蛍光測定により実施する、(1)または(2)に記載の方法に関する。
(4)本発明は、自然糞便中のプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の存在の検出を、励起波長350〜700nm、蛍光波長550〜750nmにおける蛍光測定により実施する、(1)〜(3)のいずれか1つに記載の方法に関する。
(5)本発明は、自然糞便中からプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体を抽出する工程を含む、(1)〜(4)のいずれか1つに記載の方法。
(6)本発明は、自然糞便中からのプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の抽出を、水非混和性極性有機溶媒を用いて実施する、(1)〜(5)のいずれか1つに記載の方法に関する。
(7)本発明は、自然糞便中からのプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の抽出を、さらに塩基性条件下で実施する、(1)〜(6)のいずれか1つに記載の方法に関する。
(8)本発明は、塩基性液、プロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体、または大腸腫瘍の診断指標のいずれか1つを含む大腸腫瘍の診断キットに関する。
で示されるポルフィリン環に種々の側鎖や官能基や金属が導入された誘導体およびそれらの異性体並びに前駆体を意味し、例えば、クロリン、フロリン、ポルホジメテン、ポルホメテン、バクテリオクロリン、イソバクテリオクロリン、ポルフィリノゲン、ホルビン、ポルフィラジン、フタロシアニン、フィトポルフィリン、シトポルフィリン、ウロポルフィリンI〜IV、コプロポルフィリンI〜IV、ヘマトポルフィリン、メソポルフィリン、プロトポルフィリンI〜IX、ロドポルフィリン、フィロポルフィリン、エチオポルフィリンI〜IV、ピロポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、フィトクロリン、ロドクロリン、フィロクロリン、ピロクロリン、ヘム、フェロヘム、フェリヘム、ヘモクロム、フェロヘモクロム、フェリヘモクロム、ヘミン、ヘマチン、ビタミンB12、クロロフィル、シトクロム、ポルホビリノーゲン、5−アミノレブリン酸、スクシニルCoA、グリシンなどが挙げられる。
で示されるプロトポルフィリンIXおよびその異性体であるプロトポルフィリンI〜VIIIを意味する。そして、プロトポルフィリンの誘導体とは、プロトポルフィリンI〜IXに種々の側鎖や官能基が導入された化合物、またはプロトポルフィリンI〜IXもしくは種々の側鎖や官能基が導入されたプロトポルフィリンI〜IXにさらに金属が導入された金属錯体を意味する。プロトポルフィリンの関連化合物とは、式(II)と同様に式(I)のポルフィリン環にカルボキシル基(−COOH)を含む側鎖を2個有する化合物を意味し、ヘマトポルフィリン、メソポルフィリン、プロトポルフィリン、ロドポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、ヘム、ロドクロリン、ホトフィリンII(商標)などが挙げられ、これらにはそれらの異性体やさらに種々の側鎖や官能基が導入された誘導体やそれらの金属錯体が含まれる。なお、ここで誘導体に導入される種々の側鎖や官能基や金属錯体の金属は特に限定されない。
Inertsil ODS-3 3.0 mmΦ×150 mm 5μm particle(GL science社製)
流速:
1mL/min、
温度:
25℃、
溶液:
溶液A=(アセトニトリル:酢酸:50mM酢酸アンモニウム=80:7:3)、
溶液B=(アセトニトリル:酢酸:50mM酢酸アンモニウム=10:4:86)、
40分間でA:B(20:80)−A:B(100:0)の直線勾配、20分間溶液Aで維持、
試料容量:
20μL
試料溶媒:
酢酸エチル:酢酸(2:1/容量:容量)の混合溶液
以下の実施例で用いたプロトポルフィリンとしてALDRICH社製プロトポルフィリンIXを用いた。蛍光光度計として日立製作所製F−4010を用いた。
水溶液中のプロトポルフィリンIX(PP)を有機溶媒へ高効率で抽出するための有機溶媒を決定した。
i)6μM PP溶液(pH7及びpH10.9)の調製
PP 1mgを0.2Mリン酸二水素カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液(pH7)296.2mL(組成を表1に示す)に溶解させて、6μM PP溶液(pH7)を調製した。同様にPP 1mgを0.1M塩酸−炭酸ナトリウム緩衝液(pH10.9)296.2mL(組成を表1に示す)に溶解させて、6μM PP溶液(pH10.9)を調製した。
PP溶液(pH7およびpH10.9)を内容量50mLのガラス製の遠沈管に10mL加えた。その遠沈管に抽出溶媒として酢酸エチル:酢酸(2:1/容量:容量)10mLを加え2分間激しく混合することにより、有機溶媒へのPP抽出を行った。静置後、分離した水相と有機相をガラス製試料瓶に3mL採り、蛍光測定を行なう試料とした。同様にしてクロロホルム:酢酸(2:1/容量:容量)とn−ヘキサン:酢酸(2:1/容量:容量)を抽出溶媒として抽出を行った。
測定は、分離した水相と有機相のそれぞれ1mlを、蛍光測定用セルに入れ蛍光光度計(日立製作所製F−4010)を用いて測定した。
蛍光測定は、適当な励起波長を固定してから蛍光スペクトルを測定した。その結果得られた最大蛍光波長で固定し励起スペクトルを測定した。その結果得られた最大励起波長で固定し蛍光スペクトルを測定した。
結果を表2に示す。表中のpH7 PP溶液に記述した「−」は、蛍光が観測されなかったことを示す。PP溶液(pH10.9)を酢酸エチル:酢酸混合溶媒で抽出した場合で、最も大きい蛍光強度433.9a.u.が観測された。これより、水溶液中のプロトポルフィリンIX(PP)の有機溶媒による抽出においては、PP溶液のpHが塩基性の方が有機溶媒による抽出には効率が良く、抽出溶媒には酢酸エチル:酢酸混合溶媒(2:1/容量:容量)が好ましいことが明らかとなった。なお、6μM PP溶液(pH10.9)をn−ヘキサン:酢酸(2:1/容量:容量)で抽出したところ、有機相の蛍光強度は非常に小さく1.0a.u.以下の蛍光強度しか観測されなかったので表2には記載していない。
糞便試料中のPPを有機溶媒へ高効率で抽出可能な糞便水分散液のpHを決定する。
i)糞便試料
糞便試料は、和光純薬から便潜血測定用として市販されている分散媒を用いて分散した糞便の糞便水分散液を用いた。
ii)炭酸ナトリウムでのpH調整
糞便水分散液2mLに0.2M炭酸ナトリウム1mLを加え攪拌した後、pHメーターによりpHを測定した。得られた溶液を試料とし、実施例1のii)とiii)に述べた抽出と蛍光測定に用いた。同様の操作を0.3M、0.4M、0.5M炭酸ナトリウムを用いた場合についても行った。
炭酸ナトリウムを用いて糞便水分散液のpHを調整した場合の蛍光強度測定結果を表3および図1に示す。
pH10.7の付近で最も高い蛍光強度が観測された。pH10.7以上のpHでは、急激な蛍光強度の減少が観測された。同様に、pH10.7以下でも徐々に蛍光強度が低下する傾向が観測された。表3より、糞便水分散液に0.3M炭酸ナトリウムを加えることで、最も高い蛍光強度が得られるpH10.7に調製できる。しかしながら、糞便水分散液中の糞便の量にはばらつきがあり、緩衝作用に差が有ることから、pH10.7以降に現れる蛍光強度の急激な減少を避けるため、pH10.6に調製することとした。表3より、糞便試料をpH10.6に調整するには糞便水分散液2mLに0.25M炭酸ナトリウム1mLを加えればよい。従って、糞便水分散液(2mL)のpH調整には0.25M炭酸ナトリウム1mLを用いることとした。
糞便試料からPPを抽出後、PP抽出試料のPPが安定保存可能な条件を決定する。
実施例2において抽出されたPP抽出試料を表4に示す4つの条件で保存した。保存された試料を実施例1のiii)に記述した方法により経時的に蛍光測定を行った。
結果を表5および図2に示す。縦軸の蛍光強度は測定開始日の蛍光強度を100%とした相対強度で示す。蛍光強度値は3回行なった測定値の平均であり、標準偏差をエラーバーで示す。種々の条件で保存した試料の15日後の有機相の相対強度を表5に示す。
室温下遮光無しで保存した場合で、28.8%と最も相対蛍光強度が減少した。また、室温下で遮光保存した場合でも、43.5%と相対蛍光強度が約半分に低下した。これらのことから、PPは高い温度と光に不安定であり、特に光照射に不安定であることがわかった。
4℃恒温下で遮光有り、または無しの条件で保存した場合では、15日後において、ともに高い相対強度が維持された。ここで、「4℃恒温下で遮光無し」とした保存条件は、試料容器を遮光しなかっただけで、保存は遮光された冷蔵庫内で行った。このため、相対蛍光強度の大幅な減少が観測されていなかったものと考えられる。
以上の結果から、PP抽出試料は4℃恒温下の冷蔵庫に保存すると共に、PPが光に非常に弱いことから、遮光を行う条件での保存が望ましいことがわかった。
消化管腫瘍(大腸腫瘍、胃ポリープ、食道がん)患者および非腫瘍患者の糞便について実施例1及び2によって決定された方法に基づいて蛍光測定を行った。また、蛍光測定を実施した糞便試料の便潜血検査の結果も合わせて示す。
i)糞便試料
糞便試料は、下記表6に示す19名の便潜血検査後の糞便水分散液(2mL)が用いられた。
ii)便潜血検査
糞便水分散液の便潜血検査は臨床検査会社に依頼して実施された。ヘモグロビンの量が多ければ、便潜血反応は陽性となり、少なければ陰性となる。
iii)蛍光測定
便潜血検査に用いたのと同じ糞便水分散液(2mL)がpH調整のために0.25M炭酸ナトリウム1mLを添加され、酢酸エチル:酢酸混合溶媒(2:1/容量:容量)2mLを加えて抽出された。抽出後の酢酸エチル:酢酸混合溶媒画分1mlを蛍光測定セルに入れ、蛍光光度計を用い蛍光強度を測定した。蛍光は、励起波長409nm、蛍光波長672nmで測定された。
図3Aは表6の便潜血検査の結果(ヘモグロビン)をまとめたものである。図3Bは表6の蛍光強度の結果をまとめたものである。図3AおよびB中の斜線を引いた棒は、病理診断のある患者由来の糞便試料であることを示す。
便潜血検査の結果では、腫瘍患者も非腫瘍患者も最低ヘモグロビン値は160ng/mLでヘモグロビン量と腫瘍との間に関連性が認められない(図3A)。一方、蛍光強度測定では、図3Bに示すように消化管腫瘍患者は全員(7人/7人)が蛍光強度100.00a.u.以上に含まれるのに対し、非腫瘍患者は33.3%(4人/12人)が蛍光強度100.00a.u.以上に含まれるだけであった。これより、糞便中の蛍光強度が100.00a.u.未満であれば、消化管腫瘍、特に大腸腫瘍に罹っていないと診断できるが、100.00a.u.以上である場合には、63.6%(7人/11人)の確率で消化管腫瘍、特に大腸腫瘍に罹っている危険性があると診断できる。
糞便試料中の蛍光物質を同定するためにHPLC分析を実施した。
i)試料
ポルフィリンの標品としてPorphyrin acid chromatographic marker kit (Porphyrin Products)が用いられた。ポルフィリンの標準試料は、上記の1nmolづつ含むポルフィリンマーカー1瓶に3MのHCl 1mLを加え攪拌溶解して調製された。試料は実施例4に従って調製された糞便試料の酢酸エチル:酢酸混合溶媒抽出物が用いられた。
HPLC装置:島津製 LC - 2010C、
カラム:
Inertsil ODS-3 3.0 mmΦ×150 mm 5μm particle(GL science社製)
流速:
1mL/min、
温度:
25℃、
溶液:
溶液A=(アセトニトリル:酢酸:50mM酢酸アンモニウム=80:7:3)、
溶液B=(アセトニトリル:酢酸:50mM酢酸アンモニウム=10:4:86)、40分間の溶液A:溶液B(20:80)から溶液A:溶液B(100:0)の直線勾配、溶液Aで20分間維持、溶液A:溶液B(20:80)で30分間維持(初期溶媒による置換)、
試料容量:
20μL、
試料溶媒:
酢酸エチル:酢酸(2:1/容量:容量)の混合溶液、
蛍光測定:島津RF−550蛍光検出器(励起波長:410nm、蛍光波長:672nm)
図4Aはポルフィリンの標準試料のHPLC分析を示し、図4Bは糞便試料の酢酸エチル: 酢酸2:1/容量:容量)抽出物のHPLC分析を示す。図4Bに示すように腫瘍患者においては複数の大きなピークが認められたのに対し非腫瘍患者では1つの小さなピークが検出されただけであった。腫瘍患者で検出される保持時間37.250分のピークは、標品であるメソポルフィリンIXの保持時間38.249分(図4A)と近くプロトポルフィリンと推測された。
実施例5におけるHPLC分析の図4B腫瘍患者の括弧で囲まれた保持時間37.250分のピークをMASS分析に付した。
i)試料
実施例5におけるHPLC分析の図4B腫瘍患者の括弧で囲まれた保持時間37.250分のピーク画分を蒸留水で10倍希釈したものが試料として用いられた。
ii)MASS分析条件
MASS分析には、Perkin Elmer Sciex社製API 165が用いられた。
図5に示すように実施例5におけるHPLC分析の保持時間37.250分のピーク画分のMASS分析結果は、ALDRICH社製プロトポルフィリンIX標品のMASS分析の結果と同じく537.8に最大ピークを有し、ALDRICH社製プロトポルフィリンIX標品の分析パターンと一致した。このことから、実施例5におけるHPLC分析の図4B腫瘍患者の保持時間37.250分のピークはプロトポルフィリンIXと考えられた。
Claims (8)
- 自然糞便中のプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の存在を検出することを含む、大腸腫瘍の診断方法。
- 自然糞便中のプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の存在を大腸腫瘍マーカーとして検出する方法。
- 自然糞便中のプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の存在の検出を蛍光測定により実施する、請求項1または2に記載の方法。
- 自然糞便中のプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の存在の検出を、励起波長350〜700nm、蛍光波長550〜750nmにおける蛍光測定により実施する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 自然糞便中からプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体を抽出する工程を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 自然糞便中からのプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の抽出を、水非混和性極性有機溶媒を用いて実施する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 自然糞便中からのプロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体の抽出を、さらに塩基性条件下で実施する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 塩基性液、プロトポルフィリンまたはその関連化合物ないしは誘導体、または大腸腫瘍の診断指標のいずれか1つを含む大腸腫瘍の診断キット。
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