JPH0693A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH0693A JPH0693A JP4221431A JP22143192A JPH0693A JP H0693 A JPH0693 A JP H0693A JP 4221431 A JP4221431 A JP 4221431A JP 22143192 A JP22143192 A JP 22143192A JP H0693 A JPH0693 A JP H0693A
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- antibody
- monoclonal antibody
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、Ｌｅb及びＬｅyの両者を認識し、Ｌ
ｅa及びＬｅxとは反応しないことを特徴とするモノクロ
ーナル抗体を提供するものである。 【効果】本発明抗体は、例えばこれを免疫組織染色法に
利用して、殊に大腸癌の組織染色において癌部と非癌部
の染め分けを行ない得、陽性率も高く、従って、癌、特
に大腸癌の診断及び／又はスクリーニングに極めて有効
である。
ｅa及びＬｅxとは反応しないことを特徴とするモノクロ
ーナル抗体を提供するものである。 【効果】本発明抗体は、例えばこれを免疫組織染色法に
利用して、殊に大腸癌の組織染色において癌部と非癌部
の染め分けを行ない得、陽性率も高く、従って、癌、特
に大腸癌の診断及び／又はスクリーニングに極めて有効
である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、腫瘍乃至癌（以下単に
「癌」という）に関連する新規なモノクローナル抗体、
殊に大腸癌に関連する新しいモノクローナル抗体に関す
る。
「癌」という）に関連する新規なモノクローナル抗体、
殊に大腸癌に関連する新しいモノクローナル抗体に関す
る。
【０００２】
【従来の技術及び課題】本発明の目的は、新規なモノク
ローナル抗体、より詳しくはＬｅb（ルイスｂ型抗原：
Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３〔Ｆｕｃα１→４〕Ｇｌ
ｃＮＡｃ）及びＬｅy（ルイスＹ：Ｆｕｃα１→２Ｇａ
ｌβ１→４〔Ｆｕｃα１→３〕ＧｌｃＮＡｃ）として特
定される糖鎖構造（抗原）の両者を認識し、Ｌｅa（ル
イスａ型抗原：Ｇａｌβ１→３〔Ｆｕｃα１→４〕Ｇｌ
ｃＮＡｃ）及びＬｅx（ルイスＸ：Ｇａｌβ１→４〔Ｆ
ｕｃα１→３〕ＧｌｃＮＡｃ）として特定される糖鎖構
造（抗原）のいずれにも反応性を有しない新規なモノク
ローナル抗体を提供することにある。
ローナル抗体、より詳しくはＬｅb（ルイスｂ型抗原：
Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３〔Ｆｕｃα１→４〕Ｇｌ
ｃＮＡｃ）及びＬｅy（ルイスＹ：Ｆｕｃα１→２Ｇａ
ｌβ１→４〔Ｆｕｃα１→３〕ＧｌｃＮＡｃ）として特
定される糖鎖構造（抗原）の両者を認識し、Ｌｅa（ル
イスａ型抗原：Ｇａｌβ１→３〔Ｆｕｃα１→４〕Ｇｌ
ｃＮＡｃ）及びＬｅx（ルイスＸ：Ｇａｌβ１→４〔Ｆ
ｕｃα１→３〕ＧｌｃＮＡｃ）として特定される糖鎖構
造（抗原）のいずれにも反応性を有しない新規なモノク
ローナル抗体を提供することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、上記目的に合致するモノクローナル抗体を得るに
成功し、ここに本発明を完成するに至った。
結果、上記目的に合致するモノクローナル抗体を得るに
成功し、ここに本発明を完成するに至った。
【０００４】即ち本発明によれば、Ｌｅb及びＬｅyの両
者を認識し、Ｌｅa及びＬｅxとは反応しないことを特徴
とするモノクローナル抗体か提供される。
者を認識し、Ｌｅa及びＬｅxとは反応しないことを特徴
とするモノクローナル抗体か提供される。
【０００５】本明細書において、ＧａｌはＤ−ガラクト
ース残基を、ＦｕｃはＬ−フコース残基を、またＧｌｃ
ＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基をそれぞ
れ示す。
ース残基を、ＦｕｃはＬ−フコース残基を、またＧｌｃ
ＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基をそれぞ
れ示す。
【０００６】本発明モノクローナル抗体の製造につき詳
述すれば、本発明抗体はＬｅb及びＬｅyを免疫抗原とし
て製造することができる。かかる免疫抗原を利用する抗
体の製造法は、一般的方法に従うことができる（例えば
Hanfland, P., Chem. Phys. Lipids, 15, 105 (1975) ;
Hanfland, P., Chem.Phys. Lipids, 10, 201 (1976) ;
Koscielak, J., Eur. J. Biochem., 37, 214 (1978)等
参照）。
述すれば、本発明抗体はＬｅb及びＬｅyを免疫抗原とし
て製造することができる。かかる免疫抗原を利用する抗
体の製造法は、一般的方法に従うことができる（例えば
Hanfland, P., Chem. Phys. Lipids, 15, 105 (1975) ;
Hanfland, P., Chem.Phys. Lipids, 10, 201 (1976) ;
Koscielak, J., Eur. J. Biochem., 37, 214 (1978)等
参照）。
【０００７】該方法は、より具体的には、例えば上記免
疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺
乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞(hybridoma）を作
成し、これより所望の抗体を産生するクーロンを選択
し、該クーロンを培養することにより実施できる。
疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺
乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞(hybridoma）を作
成し、これより所望の抗体を産生するクーロンを選択
し、該クーロンを培養することにより実施できる。
【０００８】かくして得られる抗体は抗体産生ハイブリ
ドーマ培養上清あるいはマウス腹水を抗体溶液としてそ
のままで使用できるものであり、更には硫酸アンモニウ
ム分画やイオン交換クロマトグラフィーあるいはプロテ
ィンＡカラム等によるアフイニティクロマトグラフイー
により精製したものも抗体溶液として使用することも可
能である。
ドーマ培養上清あるいはマウス腹水を抗体溶液としてそ
のままで使用できるものであり、更には硫酸アンモニウ
ム分画やイオン交換クロマトグラフィーあるいはプロテ
ィンＡカラム等によるアフイニティクロマトグラフイー
により精製したものも抗体溶液として使用することも可
能である。
【０００９】上記方法において用いられる免疫抗原とし
てのＬｅb及びＬｅyとしては、之等糖鎖構造自体、該糖
鎖構造を有するオリゴ糖、糖脂質及び糖蛋白質等を使用
でき、更に之等のいずれかを発現し得る細胞自体や該細
胞からの抽出抗原等を使用することもできる。之等の内
では、特に矢澤らの方法〔Immunol. Invest., 1990,19
(4),319-327〕に従って、Ｌ−フコース特異性レクチン
の親和性クロマトグラフィーにより調製された抗原が好
ましいものとして例示できる。尚、之等のＬｅb及びＬ
ｅyは公知の方法に従い調製することができ、また市販
品としても入手可能である。更に、免疫抗原としては、
上記各種の物質を適当なアジュバンドと混合して利用す
ることもできる。
てのＬｅb及びＬｅyとしては、之等糖鎖構造自体、該糖
鎖構造を有するオリゴ糖、糖脂質及び糖蛋白質等を使用
でき、更に之等のいずれかを発現し得る細胞自体や該細
胞からの抽出抗原等を使用することもできる。之等の内
では、特に矢澤らの方法〔Immunol. Invest., 1990,19
(4),319-327〕に従って、Ｌ−フコース特異性レクチン
の親和性クロマトグラフィーにより調製された抗原が好
ましいものとして例示できる。尚、之等のＬｅb及びＬ
ｅyは公知の方法に従い調製することができ、また市販
品としても入手可能である。更に、免疫抗原としては、
上記各種の物質を適当なアジュバンドと混合して利用す
ることもできる。
【００１０】上記免疫抗原で免疫される哺乳動物として
は、特に制限はないが、細胞融合に使用する形質細胞腫
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
にはマウス、ラット等が有利に用いられる。
は、特に制限はないが、細胞融合に使用する形質細胞腫
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
にはマウス、ラット等が有利に用いられる。
【００１１】免疫は一般的方法により、例えば上記免疫
抗原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等に
より投与することにより実施できる。
抗原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等に
より投与することにより実施できる。
【００１２】上記免疫は、例えばマウスの場合、免疫抗
原をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）や生理食塩水等
で適当な濃度に希釈し、所望により通常のアジュバント
と併用して、供試動物に２〜１４日毎に数回投与し、総
投与量が１００〜５００μｇ／マウス程度になるように
して実施するのが好ましい。最終免疫後、摘出した脾臓
より所望の免疫細胞を収得できる。尚、上記アジュバン
トとしては百日咳ワクチン、完全又は不完全フロインド
アジュバントあるいはアラムを用いるとよい。
原をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）や生理食塩水等
で適当な濃度に希釈し、所望により通常のアジュバント
と併用して、供試動物に２〜１４日毎に数回投与し、総
投与量が１００〜５００μｇ／マウス程度になるように
して実施するのが好ましい。最終免疫後、摘出した脾臓
より所望の免疫細胞を収得できる。尚、上記アジュバン
トとしては百日咳ワクチン、完全又は不完全フロインド
アジュバントあるいはアラムを用いるとよい。
【００１３】上記免疫細胞と融合される他方の親細胞と
しての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の
種々のもの、例えばP3/X63-Ag8(X63) （Nature, 256, 4
95-497 (1975))、P3/X63-Ag8. U1 (P3U1) （Current To
pics in Microbiology andImmunology, 81, 1-7 (197
8)) 、P3/NSI-1- Ag4-1(NS-1) （Eur. J. Immunol.,6,
511-519 (1976)）、Sp2/0-Ag14(Sp2/0) （Nature, 27
6,269-270 (1978)）、FO（J. Immuno. Meth., 35, 1-21
(1980) ）等や、ラットにおける210.RCY3.Agl.2.3.(Y
3) （Nature, 277, 13l-133, (1979)）等の骨髄腫細胞
等を使用できる。
しての哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の
種々のもの、例えばP3/X63-Ag8(X63) （Nature, 256, 4
95-497 (1975))、P3/X63-Ag8. U1 (P3U1) （Current To
pics in Microbiology andImmunology, 81, 1-7 (197
8)) 、P3/NSI-1- Ag4-1(NS-1) （Eur. J. Immunol.,6,
511-519 (1976)）、Sp2/0-Ag14(Sp2/0) （Nature, 27
6,269-270 (1978)）、FO（J. Immuno. Meth., 35, 1-21
(1980) ）等や、ラットにおける210.RCY3.Agl.2.3.(Y
3) （Nature, 277, 13l-133, (1979)）等の骨髄腫細胞
等を使用できる。
【００１４】上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反
応は、公知の方法、例えばマイルスタイン（Milstein）
らの方法(Method in Enzymology, 73, 3 (1981))等に準
じて行なうことができる。より具体的には上記融合反応
は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下
に、通常の培地中で実施され、培地には更に融合効率を
高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に
応じて添加することもできる。また、電気処理（電気融
合）による方法等を適宜採用することもできる。免疫細
胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法と変わり
なく、例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細胞を約１〜
１０倍程度用いるのが普通である。融合反応時の培地と
しては、形質細胞腫細胞の増殖に通常使用される各種の
もの、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、そ
の他のこの種細胞培養に一般に利用されるものを例示で
き、通常これら培地は牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補
液を抜いておくのがよい。
応は、公知の方法、例えばマイルスタイン（Milstein）
らの方法(Method in Enzymology, 73, 3 (1981))等に準
じて行なうことができる。より具体的には上記融合反応
は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下
に、通常の培地中で実施され、培地には更に融合効率を
高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に
応じて添加することもできる。また、電気処理（電気融
合）による方法等を適宜採用することもできる。免疫細
胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法と変わり
なく、例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細胞を約１〜
１０倍程度用いるのが普通である。融合反応時の培地と
しては、形質細胞腫細胞の増殖に通常使用される各種の
もの、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、そ
の他のこの種細胞培養に一般に利用されるものを例示で
き、通常これら培地は牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補
液を抜いておくのがよい。
【００１５】融合は上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との
所定量を、上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に
加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６０
００程度のものを、通常培地に約３０〜６０ｗ／ｖ％程
度で加えて混ぜ合わせることにより行なわれる。以後、
適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作
を繰り返すことにより所望のハイブリドーマが形成され
る。
所定量を、上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に
加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６０
００程度のものを、通常培地に約３０〜６０ｗ／ｖ％程
度で加えて混ぜ合わせることにより行なわれる。以後、
適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作
を繰り返すことにより所望のハイブリドーマが形成され
る。
【００１６】得られる所望のハイブリドーマの分離は、
通常の選別培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、
アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）で培養する
ことにより行なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的
とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死
滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよ
い。かくして得られるハイブリドーマは、通常の限界希
釈法により目的とする抗体の検索及び単一クーロン化に
供される。
通常の選別培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、
アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）で培養する
ことにより行なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的
とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死
滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよ
い。かくして得られるハイブリドーマは、通常の限界希
釈法により目的とする抗体の検索及び単一クーロン化に
供される。
【００１７】目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳ
Ａ法（Engvall, E., Meth. Enzymol., 70, 419-439 (19
80) ）、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクタ
ロニー(Ouchterlony) 法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方
法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式
会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０〜５３頁、昭和５７
年３月５日）に従い実施でき、この検索には前記免疫抗
原やＬｅa、Ｌｅx、之等の構造を有する同様の抗原等が
利用できる。かくして得られる本発明のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培
養でき、また液体窒素中で長期保存できる。
Ａ法（Engvall, E., Meth. Enzymol., 70, 419-439 (19
80) ）、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクタ
ロニー(Ouchterlony) 法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方
法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式
会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０〜５３頁、昭和５７
年３月５日）に従い実施でき、この検索には前記免疫抗
原やＬｅa、Ｌｅx、之等の構造を有する同様の抗原等が
利用できる。かくして得られる本発明のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培
養でき、また液体窒素中で長期保存できる。
【００１８】上記ハイブリドーマからの本発明モノクロ
ーナル抗体の採取は、該ハイブリドーマを、常法に従っ
て培養してその培養上清として得る方法やハイブリドー
マをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、
その腹水として得る方法が採用される。前者の方法は、
高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗
体の大量生産に適している。また上記のごとくして得ら
れる抗体は、更に塩析、ゲル濾過法、アフィニティクロ
マトグラフィー等の通常の手段により精製できる。
ーナル抗体の採取は、該ハイブリドーマを、常法に従っ
て培養してその培養上清として得る方法やハイブリドー
マをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、
その腹水として得る方法が採用される。前者の方法は、
高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗
体の大量生産に適している。また上記のごとくして得ら
れる抗体は、更に塩析、ゲル濾過法、アフィニティクロ
マトグラフィー等の通常の手段により精製できる。
【００１９】かくして得られる本発明モノクローナル抗
体は、Ｌｅb及びＬｅyを認識し（之等と反応性を有す
る）、Ｌｅa及びＬｅxとは反応しないことにより特徴付
けられる。
体は、Ｌｅb及びＬｅyを認識し（之等と反応性を有す
る）、Ｌｅa及びＬｅxとは反応しないことにより特徴付
けられる。
【００２０】従って、本発明抗体の利用によれば、例え
ば免疫組織染色法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免
疫測定法（ＥＩＡ）、凝集法等の通常の免疫学的手段に
より、高感度、高精度に且つ高い特異性をもってＬｅb
及びＬｅyの両者抗原の存在乃至局在を簡易に測定する
ことができる。殊に、本発明者らの知見によれば、かか
るＬｅb及びＬｅyの両者に反応性を有し、Ｌｅa及びＬ
ｅxとは反応しないタイプの抗体、特に本明細書に「抗
体ＹＢ−２」として記載の抗体、を利用した免疫組織染
色法によれば、該抗体が癌部に極めて高い特異性を有す
るという結果が得られている。殊に本発明抗体の利用に
よれば、上記大腸癌の組織染色において、癌部と非癌部
の染め分けが非常に良好になされ、また陽性率も高いと
いう結果が得られている。更に、本発明モノクローナル
抗体の反応性は、大腸癌細胞の生物学的悪性度と強い相
関が認められており、従って、該抗体は癌、特に大腸癌
の診断及び／又はスクリーニングに極めて有効であると
認められる。尚、本発明によって提供されるかかる特定
の抗体を利用した測定系の設定、改良乃至応用は当業者
にとり自明である。
ば免疫組織染色法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免
疫測定法（ＥＩＡ）、凝集法等の通常の免疫学的手段に
より、高感度、高精度に且つ高い特異性をもってＬｅb
及びＬｅyの両者抗原の存在乃至局在を簡易に測定する
ことができる。殊に、本発明者らの知見によれば、かか
るＬｅb及びＬｅyの両者に反応性を有し、Ｌｅa及びＬ
ｅxとは反応しないタイプの抗体、特に本明細書に「抗
体ＹＢ−２」として記載の抗体、を利用した免疫組織染
色法によれば、該抗体が癌部に極めて高い特異性を有す
るという結果が得られている。殊に本発明抗体の利用に
よれば、上記大腸癌の組織染色において、癌部と非癌部
の染め分けが非常に良好になされ、また陽性率も高いと
いう結果が得られている。更に、本発明モノクローナル
抗体の反応性は、大腸癌細胞の生物学的悪性度と強い相
関が認められており、従って、該抗体は癌、特に大腸癌
の診断及び／又はスクリーニングに極めて有効であると
認められる。尚、本発明によって提供されるかかる特定
の抗体を利用した測定系の設定、改良乃至応用は当業者
にとり自明である。
【００２１】上記測定系において検体としては、大腸等
の各種組織や、例えば血液、細胞組織液、リンパ液、胸
水、腹水、羊水、胃液、尿、膵液、髄液、唾液等の各種
体液等をいずれも利用できる。
の各種組織や、例えば血液、細胞組織液、リンパ液、胸
水、腹水、羊水、胃液、尿、膵液、髄液、唾液等の各種
体液等をいずれも利用できる。
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば癌細胞、殊に大腸癌に特
異反応性を有する抗体が提供される。本発明抗体の利用
によれば大腸癌患者等の血清診断、組織診断法、大腸癌
組織等のイメージング法、大腸癌部位等への薬物のター
ゲティング法、大腸癌等の抗体による治療法等が提供さ
れる。
異反応性を有する抗体が提供される。本発明抗体の利用
によれば大腸癌患者等の血清診断、組織診断法、大腸癌
組織等のイメージング法、大腸癌部位等への薬物のター
ゲティング法、大腸癌等の抗体による治療法等が提供さ
れる。
【００２３】
【実施例】本発明を更に詳しく説明するため、以下に実
施例を挙げるが本発明はこれらに限定されるものではな
い。
施例を挙げるが本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００２４】
【実施例１】モノクローナル抗体の製造 ハイブリドーマの樹立 矢澤らの方法〔Immunol. Invest., 1990, 19 (4),319-3
27〕に従って得られたヒト由来フコシル糖鎖抗原と、フ
ロインド完全アジュバントとを等量混合し、ＢＡＬＢ／
ｃマウスに０．１ｍｌずつ腹腔内注射して免疫し、４週
及び８週後に追加注射して免疫した。
27〕に従って得られたヒト由来フコシル糖鎖抗原と、フ
ロインド完全アジュバントとを等量混合し、ＢＡＬＢ／
ｃマウスに０．１ｍｌずつ腹腔内注射して免疫し、４週
及び８週後に追加注射して免疫した。
【００２５】最終免疫から３日後、脾臓を摘出し、ＲＰ
ＭＩ−１６４０粉末培地（ギブコ社製）１袋にピルビン
酸ナトリウム１１０ｍｇ、Ｌ−グルタミン２９２ｍｇ、
炭酸水素ナトリウム１．８ｇ、硫酸カナマイシン（明治
製薬社製）１／１６ｇ力価及び１Ｎ塩酸２ｍｌを加えて
蒸留水で１ｌに調整したもの（以下「ＲＰＭＩ培地」と
いう）に１／９容量のウシ胎児血清（ＦＢＳ：ギブコ社
製）を加えた培地（以下「１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培
地」という）中で上記脾臓をよくほぐし、８．４×１０
7 個の脾細胞を得た。
ＭＩ−１６４０粉末培地（ギブコ社製）１袋にピルビン
酸ナトリウム１１０ｍｇ、Ｌ−グルタミン２９２ｍｇ、
炭酸水素ナトリウム１．８ｇ、硫酸カナマイシン（明治
製薬社製）１／１６ｇ力価及び１Ｎ塩酸２ｍｌを加えて
蒸留水で１ｌに調整したもの（以下「ＲＰＭＩ培地」と
いう）に１／９容量のウシ胎児血清（ＦＢＳ：ギブコ社
製）を加えた培地（以下「１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培
地」という）中で上記脾臓をよくほぐし、８．４×１０
7 個の脾細胞を得た。
【００２６】上記脾細胞と抗体非結合型マウスミエロー
マ細胞Ｘ６３−Ａｇ８−６５３とを、オリとハーゼンバ
ーグ（Oi and Herzenberg ）の方法に従って、ポリエチ
レングリコールを用いて細胞融合させた。即ち、ＲＰＭ
Ｉ培地で洗浄した脾細胞浮遊液に、予め培養しておいた
上記ミエローマ細胞１／４量（３．２×１０7 個）の浮
遊液を混合し、遠心後、沈殿細胞を３７℃に加温した５
０％ポリエチレングリコール１０００（半井化学社製）
のＲＰＭＩ培地溶液１ｍｌを１分間かけて沈殿をほぐし
ながら徐々に加え、更に１分間穏やかにかき混ぜた後、
ＲＰＭＩ培地１０ｍｌをゆっくりと加えた。細胞を遠心
沈殿後、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地に浮遊させ、フィ
ーダー細胞として４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから取っ
た胸腺細胞３×１０8 個を混合し、９６穴平底マイクロ
テストプレート（ファルコン社製）に１００μｌずつ播
き、３７℃、５％ＣＯ2 の条件で一夜培養した。
マ細胞Ｘ６３−Ａｇ８−６５３とを、オリとハーゼンバ
ーグ（Oi and Herzenberg ）の方法に従って、ポリエチ
レングリコールを用いて細胞融合させた。即ち、ＲＰＭ
Ｉ培地で洗浄した脾細胞浮遊液に、予め培養しておいた
上記ミエローマ細胞１／４量（３．２×１０7 個）の浮
遊液を混合し、遠心後、沈殿細胞を３７℃に加温した５
０％ポリエチレングリコール１０００（半井化学社製）
のＲＰＭＩ培地溶液１ｍｌを１分間かけて沈殿をほぐし
ながら徐々に加え、更に１分間穏やかにかき混ぜた後、
ＲＰＭＩ培地１０ｍｌをゆっくりと加えた。細胞を遠心
沈殿後、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地に浮遊させ、フィ
ーダー細胞として４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから取っ
た胸腺細胞３×１０8 個を混合し、９６穴平底マイクロ
テストプレート（ファルコン社製）に１００μｌずつ播
き、３７℃、５％ＣＯ2 の条件で一夜培養した。
【００２７】翌日、１００×ＨＡＴ（ギブコ社製）を１
０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地に１／１００容量加えた培地
（以下「ＨＡＴ培地」という）１００μｌを各ウェルに
加えた。更に４日後に培地の半量をＨＡＴ培地と交換
し、この操作を４日毎に繰り返して、ハイブリドーマ細
胞を選択した。
０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地に１／１００容量加えた培地
（以下「ＨＡＴ培地」という）１００μｌを各ウェルに
加えた。更に４日後に培地の半量をＨＡＴ培地と交換
し、この操作を４日毎に繰り返して、ハイブリドーマ細
胞を選択した。
【００２８】上記融合後１２日目及び１３日目に培養上
清のＬｅb及びＬｅy反応性を調べることによりスクリー
ニングを行ない、特に強い活性を示すウェルについて限
界希釈法に従いクローニングを行なって、所望の抗体を
産生する目的ハイブリドーマを樹立した。
清のＬｅb及びＬｅy反応性を調べることによりスクリー
ニングを行ない、特に強い活性を示すウェルについて限
界希釈法に従いクローニングを行なって、所望の抗体を
産生する目的ハイブリドーマを樹立した。
【００２９】 モノクローナル抗体の作成 上記で得られた所望のハイブリドーマの一つであるク
ローンＮｏ．ＹＢ−２（ＹＢ−２は、通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１３０４４号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３０４４）として寄託されている）
を、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地にて５％ＣＯ2 条件下
で、３７℃にて９６時間培養した。培養液を３０００rp
m 、１０分間遠心分離して、目的モノクローナル抗体Ｙ
Ｂ−２を含む培養上清を得た。
ローンＮｏ．ＹＢ−２（ＹＢ−２は、通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１３０４４号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３０４４）として寄託されている）
を、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地にて５％ＣＯ2 条件下
で、３７℃にて９６時間培養した。培養液を３０００rp
m 、１０分間遠心分離して、目的モノクローナル抗体Ｙ
Ｂ−２を含む培養上清を得た。
【００３０】かくして得られた抗体ＹＢ−２のクラス
は、マウスタイパーキット（バイオラット社製）を用い
て調べた結果、ＩｇＭであった。
は、マウスタイパーキット（バイオラット社製）を用い
て調べた結果、ＩｇＭであった。
【００３１】
【実施例２】本発明抗体ＹＢ−２の反応性 第１表に記載の各糖鎖抗原（各糖鎖結合ＢＳＡ：
“Syntagen”、ケムバイオメド社製）を用いて、その
０．１ｎｇ／ウェルを固相化したプレートに、前記本発
明抗体ＹＢ−２の培養上清のＤ−ＰＢＳ(-)１０倍希釈
液１００μｌ／ウェルを加えて、室温で２時間振盪下に
反応させた。０．０５％ツイーン２０のＤ−ＰＢＳ(-)
で洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体
（anti mouse IgM-HRP溶液、ザイメット社製）の１００
μｌ／ウェルを加えて、同様に反応（室温、２時間、振
盪下）させ、洗浄した。
“Syntagen”、ケムバイオメド社製）を用いて、その
０．１ｎｇ／ウェルを固相化したプレートに、前記本発
明抗体ＹＢ−２の培養上清のＤ−ＰＢＳ(-)１０倍希釈
液１００μｌ／ウェルを加えて、室温で２時間振盪下に
反応させた。０．０５％ツイーン２０のＤ−ＰＢＳ(-)
で洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体
（anti mouse IgM-HRP溶液、ザイメット社製）の１００
μｌ／ウェルを加えて、同様に反応（室温、２時間、振
盪下）させ、洗浄した。
【００３２】発色液（オルトフェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）溶液）をウェル当り５０μｌ加え、室温で３０分間
反応させた後、５０μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応を停止
させ、４９２ｎｍの吸光度（ＯＤ492 ｎｍ）を測定し
た。
Ｄ）溶液）をウェル当り５０μｌ加え、室温で３０分間
反応させた後、５０μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応を停止
させ、４９２ｎｍの吸光度（ＯＤ492 ｎｍ）を測定し
た。
【００３３】結果を第１表に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】第１表より、本発明抗体ＹＢ−２は、Ｌｅ
b及びＬｅy並びにＨタイプＩＩを認識し、Ｌｅa及びＬ
ｅxを含む他の糖鎖抗原とは実質的に反応しないことが
判る。
b及びＬｅy並びにＨタイプＩＩを認識し、Ｌｅa及びＬ
ｅxを含む他の糖鎖抗原とは実質的に反応しないことが
判る。
【００３６】 下記壁深達度別の大腸癌６３例を対象
として、本発明抗体ＹＢ−２を用いた免疫組織染色法を
実施した。
として、本発明抗体ＹＢ−２を用いた免疫組織染色法を
実施した。
【００３７】ｍ（粘膜内）：１４例 ｓｍ（粘膜下層）：１２例 ｐｍ（固有筋層）：１８例 ｓｓ（漿膜層）：１１例 ｓ，ｓｉ（漿膜外）：８例 免疫組織染色法としてはＡＢＣ法（VECTASTAIN（登録商
標）ABC システム実験マニュアル１９８９：フナコシ薬
品社）を用いた。
標）ABC システム実験マニュアル１９８９：フナコシ薬
品社）を用いた。
【００３８】即ち、パラフィン包埋ブロックより厚さ２
μｍの薄切切片を作成し、脱パラフィン後、０．３％Ｈ
2 Ｏ2 付加１００％メタノールにて内因性ペルオキシダ
ーゼを不活化した。次いで、正常ヤギ血清にて二次抗体
由来の非特異反応をブロックした後、抗体ＹＢ−２（１
０倍希釈）と約１５時間冷所（４℃）にて反応させた。
ＰＢＳで洗浄後、二次抗体（ビオチン化ヤギ抗マウスＩ
ｇＭ抗体）と３０分間反応させ、更に洗浄後、ＡＢＣ試
薬（ベクター社製）と３０分間反応させた。洗浄後、Ｄ
ＡＢにて発色させ、ヘマトキシリンで核染色した後、脱
水封入した。
μｍの薄切切片を作成し、脱パラフィン後、０．３％Ｈ
2 Ｏ2 付加１００％メタノールにて内因性ペルオキシダ
ーゼを不活化した。次いで、正常ヤギ血清にて二次抗体
由来の非特異反応をブロックした後、抗体ＹＢ−２（１
０倍希釈）と約１５時間冷所（４℃）にて反応させた。
ＰＢＳで洗浄後、二次抗体（ビオチン化ヤギ抗マウスＩ
ｇＭ抗体）と３０分間反応させ、更に洗浄後、ＡＢＣ試
薬（ベクター社製）と３０分間反応させた。洗浄後、Ｄ
ＡＢにて発色させ、ヘマトキシリンで核染色した後、脱
水封入した。
【００３９】染色度は、ハマダらの報告〔Cancer, 55:
136-141, 1985 〕に従い、陰性（染色度０）及び陽性
（染色度１：Apical type 、染色度２：Cytoplasmic ty
pe及び染色度３：Stromal type）として評価した。
136-141, 1985 〕に従い、陰性（染色度０）及び陽性
（染色度１：Apical type 、染色度２：Cytoplasmic ty
pe及び染色度３：Stromal type）として評価した。
【００４０】得られた結果を、生存率、分化度、リンパ
節転移、リンパ管侵襲、静脈侵襲及び深達度別に、順次
第２表〜第７表に示す。
節転移、リンパ管侵襲、静脈侵襲及び深達度別に、順次
第２表〜第７表に示す。
【００４１】また上記と同様にして、上記各症例の非癌
部（正常組織）及び大腸腺腫の免疫組織染色した結果
を、第８表及び第９表にまとめて示す。
部（正常組織）及び大腸腺腫の免疫組織染色した結果
を、第８表及び第９表にまとめて示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【００４７】
【表７】
【００４８】
【表８】
【００４９】
【表９】
【００５０】以上のように、本発明抗体ＹＢ−２による
免疫染色の結果によれば、抗体ＹＢ−２は癌部に極めて
高い特異性を有し、癌部と非癌部の染め分け性に優れて
おり、その反応性が大腸癌細胞の生物学的悪性度と強く
相関すると認められる。
免疫染色の結果によれば、抗体ＹＢ−２は癌部に極めて
高い特異性を有し、癌部と非癌部の染め分け性に優れて
おり、その反応性が大腸癌細胞の生物学的悪性度と強く
相関すると認められる。
【００５１】かかる本発明抗体を用いた免疫組織染色法
は、大腸癌における陽性率が極めて高く（正常組織との
反応性が低く）、従って該方法は大腸癌診断分野におい
て極めて有用であることが明らかである。
は、大腸癌における陽性率が極めて高く（正常組織との
反応性が低く）、従って該方法は大腸癌診断分野におい
て極めて有用であることが明らかである。
【００５２】 前記に準じて、抗体ＹＢ−２の反応
性を阻害実験により試験した。
性を阻害実験により試験した。
【００５３】即ち、０．１μｇ／ウエルの糖鎖抗原を固
相化したウエルに１２．５ｎｇ／ウエルのＹＢ−２抗体
及び各種濃度の阻害用糖鎖抗原を加えて、室温２時間振
盪下に反応させた。洗浄後、前記と同様にパーオキシタ
ーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を用いて固相化糖鎖抗原に
結合したＹＢ−２抗体を測定した。
相化したウエルに１２．５ｎｇ／ウエルのＹＢ−２抗体
及び各種濃度の阻害用糖鎖抗原を加えて、室温２時間振
盪下に反応させた。洗浄後、前記と同様にパーオキシタ
ーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を用いて固相化糖鎖抗原に
結合したＹＢ−２抗体を測定した。
【００５４】その結果、０．１μｇ／ウエルの固相化Ｌ
ｅbに対するＹＢ−２抗体の反応を５０％阻害するのに
必要な各糖鎖抗原の濃度は次のとおりであった。
ｅbに対するＹＢ−２抗体の反応を５０％阻害するのに
必要な各糖鎖抗原の濃度は次のとおりであった。
【００５５】 Ｌｅy：０．３２ｎｇ／ウエル（約１／３００量） Ｌｅb：０．２８μｇ／ウエル（ほぼ同等量） ＨタイプII：４．２μｇ／ウエル ＨタイプIII ：１．１μｇ／ウエル また、０．１μｇ／ウエルの固相化Ｌｅyに対するＹＢ
−２抗体の反応を５０％阻害するのに必要な各糖鎖抗原
の濃度は次のとおりであった。
−２抗体の反応を５０％阻害するのに必要な各糖鎖抗原
の濃度は次のとおりであった。
【００５６】Ｌｅy：０．１８μｇ／ウエル（ほぼ同等
量） Ｌｅb：１０μｇ／ウエル以上（全く阻害がかからなか
った） ＨタイプII：１０μｇ／ウエル以上（全く阻害がかから
なかった） ＨタイプIII ：１０μｇ／ウエル以上（全く阻害がかか
らなかった） 以上の結果によれば、ＹＢ−２抗体は、阻害実験ではＬ
ｅyにほぼ特異的な反応性を示す、ユニークな特性を有
する抗体であることが判る。
量） Ｌｅb：１０μｇ／ウエル以上（全く阻害がかからなか
った） ＨタイプII：１０μｇ／ウエル以上（全く阻害がかから
なかった） ＨタイプIII ：１０μｇ／ウエル以上（全く阻害がかか
らなかった） 以上の結果によれば、ＹＢ−２抗体は、阻害実験ではＬ
ｅyにほぼ特異的な反応性を示す、ユニークな特性を有
する抗体であることが判る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 8310−2Ｊ 33/574 Ｄ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 申 貞均 徳島県板野郡北島町新喜来字中竿40−20
Claims (1)
- 【請求項１】Ｌｅb及びＬｅyの両者を認識し、Ｌｅa及
びＬｅxとは反応しないことを特徴とするモノクローナ
ル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4221431A JPH0693A (ja) | 1992-04-23 | 1992-08-20 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-104681 | 1992-04-23 | ||
| JP10468192 | 1992-04-23 | ||
| JP4221431A JPH0693A (ja) | 1992-04-23 | 1992-08-20 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0693A true JPH0693A (ja) | 1994-01-11 |
Family
ID=26445099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4221431A Pending JPH0693A (ja) | 1992-04-23 | 1992-08-20 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0693A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002092126A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Scancell Limited | Binding member which binds to both lewis-y and lewis-b haptens, and its use for treating cancer |
| WO2005019827A1 (ja) * | 2003-08-20 | 2005-03-03 | Japan Science And Technology Agency | 大腸癌及び大腸腺腫の検査方法 |
| US8580925B2 (en) | 2005-01-19 | 2013-11-12 | Japan Science And Technology Agency | Method for examining carcinoma and adenoma |
| JP2018538551A (ja) * | 2015-12-02 | 2018-12-27 | ユニベルシテ デ リモージュＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄｅ Ｌｉｍｏｇｅｓ | 癌幹細胞を単離する方法 |
| JP2021525719A (ja) * | 2018-05-31 | 2021-09-27 | グリコネックス インコーポレイテッド | バイアンテナ型ルイスｂおよびルイスｙ抗原に結合する治療抗体 |
-
1992
- 1992-08-20 JP JP4221431A patent/JPH0693A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002092126A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Scancell Limited | Binding member which binds to both lewis-y and lewis-b haptens, and its use for treating cancer |
| JP2004529181A (ja) * | 2001-05-11 | 2004-09-24 | スキャンセル リミテッド | ルイス−ｙおよびルイス−ｂハプテンの双方に結合する結合メンバー、および癌を治療するためのその使用 |
| US7879983B2 (en) | 2001-05-11 | 2011-02-01 | Cephalon Australia Pty Ltd | Binding member which binds to both Lewis-y and Lewis-b haptens, and its use for treating cancer |
| US8273349B2 (en) | 2001-05-11 | 2012-09-25 | Cephalon Australia Pty Ltd | Binding member which binds to both lewis-Y and lewis-B haptens, and its use for treating cancer |
| WO2005019827A1 (ja) * | 2003-08-20 | 2005-03-03 | Japan Science And Technology Agency | 大腸癌及び大腸腺腫の検査方法 |
| US7601348B2 (en) | 2003-08-20 | 2009-10-13 | Japan Science & Technology Agency | Method of examining colon cancer and colon adenoma |
| US8580925B2 (en) | 2005-01-19 | 2013-11-12 | Japan Science And Technology Agency | Method for examining carcinoma and adenoma |
| JP2018538551A (ja) * | 2015-12-02 | 2018-12-27 | ユニベルシテ デ リモージュＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄｅ Ｌｉｍｏｇｅｓ | 癌幹細胞を単離する方法 |
| JP2021525719A (ja) * | 2018-05-31 | 2021-09-27 | グリコネックス インコーポレイテッド | バイアンテナ型ルイスｂおよびルイスｙ抗原に結合する治療抗体 |
| US11643471B2 (en) | 2018-05-31 | 2023-05-09 | Glyconex Inc. | Therapeutic antibodies |
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