JPH1052269A - シアリル化されたLewis(X)エピトープに対するモノクローナル抗体の断片 - Google Patents
シアリル化されたLewis(X)エピトープに対するモノクローナル抗体の断片Info
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- JPH1052269A JPH1052269A JP9113911A JP11391197A JPH1052269A JP H1052269 A JPH1052269 A JP H1052269A JP 9113911 A JP9113911 A JP 9113911A JP 11391197 A JP11391197 A JP 11391197A JP H1052269 A JPH1052269 A JP H1052269A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Lewisx エピトープに対する新規なモノ
クローナル抗体断片の提供。 【解決手段】 モノクローナル抗体の断片であって、該
断片はシアリル化されたLex ハプテンに対して特異的
であり且つ該ハプテンと結合することができ、そして検
出可能なシグナルを提供することができる標識に結合し
ており、そして該モノクローナル抗体はハイブリドーマ
ATCC No. HB8580から得られるCSLEX1
であることを特徴とする、モノクローナル抗体の断片。
クローナル抗体断片の提供。 【解決手段】 モノクローナル抗体の断片であって、該
断片はシアリル化されたLex ハプテンに対して特異的
であり且つ該ハプテンと結合することができ、そして検
出可能なシグナルを提供することができる標識に結合し
ており、そして該モノクローナル抗体はハイブリドーマ
ATCC No. HB8580から得られるCSLEX1
であることを特徴とする、モノクローナル抗体の断片。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】腫瘍関連抗原に向けられたモ
ノクローナル抗体について今まで多くの報告がある。し
かしながら、これらのうち少数の抗体のみが血清中の腫
瘍関連抗原を検出するために有用であると知られてい
る。大部分、抗原が腫瘍性組織に関連しているが、隣接
の正常組織には関連しないことが見出される場合におい
て、その抗原は他の部位では正常組織に存在しているこ
とがその後見出される。従って、多くの場合誤った陽性
の程度が診断として抗原の検出に対してどんな価値をも
破壊する。技術の現状において、生理液体中の抗原の検
出が癌の完全な予言者であることは必要でない。
ノクローナル抗体について今まで多くの報告がある。し
かしながら、これらのうち少数の抗体のみが血清中の腫
瘍関連抗原を検出するために有用であると知られてい
る。大部分、抗原が腫瘍性組織に関連しているが、隣接
の正常組織には関連しないことが見出される場合におい
て、その抗原は他の部位では正常組織に存在しているこ
とがその後見出される。従って、多くの場合誤った陽性
の程度が診断として抗原の検出に対してどんな価値をも
破壊する。技術の現状において、生理液体中の抗原の検
出が癌の完全な予言者であることは必要でない。
【0002】腫瘍が取り除かれる多くの場合、腫瘍の効
果的除去又は腫瘍が引き続き存在しているかの診断とし
て、特異エピトピックマーカーの生理液体中における存
在の変化をだれでもがモニターすることができる。他の
場合において、確実に腫瘍状態を見分けるために2又は
それ以上のマーカーが使用されるかも知れない。さらに
他の場合において、腫瘍を見分けるために、マーカーが
正常な細胞と比較して腫瘍細胞の表面上に、十分に多く
分布することのみが必要であるということが想像され
る。
果的除去又は腫瘍が引き続き存在しているかの診断とし
て、特異エピトピックマーカーの生理液体中における存
在の変化をだれでもがモニターすることができる。他の
場合において、確実に腫瘍状態を見分けるために2又は
それ以上のマーカーが使用されるかも知れない。さらに
他の場合において、腫瘍を見分けるために、マーカーが
正常な細胞と比較して腫瘍細胞の表面上に、十分に多く
分布することのみが必要であるということが想像され
る。
【0003】従って、腫瘍に関する特異エピトープを定
義することができることは非常に価値があり、このエピ
トープとは、生理液体(たとえば血液又は血清)におけ
る腫瘍の診断を、合理的な正確さで可能にし、この場
合、マーカーは単独で又は、他のマーカーと接合におい
て用いられる。
義することができることは非常に価値があり、このエピ
トープとは、生理液体(たとえば血液又は血清)におけ
る腫瘍の診断を、合理的な正確さで可能にし、この場
合、マーカーは単独で又は、他のマーカーと接合におい
て用いられる。
【0004】
【従来の技術】コプロウスキィ、など、ランセット(La
ncet)(1982)i:1332〜1333は、消化管
癌の指標としてのLewis血液型の診断に関する19
−9と称するモノクローナル抗体を報告している。この
抗体は、結腸癌患者からの血清の約60%と反応する。
マグナニ、など、キャンサーリサーチ(Cancer Researc
h)(1983)43:5489〜92は、19−9が結
合する抗原が、癌患者の血清中に放出されるムチン上に
存在するエピトープ又はリアリレイトLewis a 構造
であることを報告した。
ncet)(1982)i:1332〜1333は、消化管
癌の指標としてのLewis血液型の診断に関する19
−9と称するモノクローナル抗体を報告している。この
抗体は、結腸癌患者からの血清の約60%と反応する。
マグナニ、など、キャンサーリサーチ(Cancer Researc
h)(1983)43:5489〜92は、19−9が結
合する抗原が、癌患者の血清中に放出されるムチン上に
存在するエピトープ又はリアリレイトLewis a 構造
であることを報告した。
【0005】バスト、など、ニューイングランドジャー
ナルオブメディスン(New EnglandJournal of Medicin
e)(1983)309:883〜887は、高分子量グ
リコタンパク質でありそして卵巣癌腫をもつ患者の血清
中に82%見出されるCA125と称する抗原と反応す
るモノクローナル抗体を報告している。ラウバラ、ジャ
ーナルオブザバイオロジカルケミストリイ(Journal of
the Biological Chemistry)(1976)251:75
17〜7520は、ヒト腎臓の新しいガングリオシドと
してラクト−N−フコペンタオースIII のシアリル化
(Sialylated)誘導体(これはシアリル化L
ex と呼ばれる)を公表してる。
ナルオブメディスン(New EnglandJournal of Medicin
e)(1983)309:883〜887は、高分子量グ
リコタンパク質でありそして卵巣癌腫をもつ患者の血清
中に82%見出されるCA125と称する抗原と反応す
るモノクローナル抗体を報告している。ラウバラ、ジャ
ーナルオブザバイオロジカルケミストリイ(Journal of
the Biological Chemistry)(1976)251:75
17〜7520は、ヒト腎臓の新しいガングリオシドと
してラクト−N−フコペンタオースIII のシアリル化
(Sialylated)誘導体(これはシアリル化L
ex と呼ばれる)を公表してる。
【0006】新生物におけるシアリル化(Sialyl
ation)の重要性は多くの報告の主題であった。た
とえば次の文献を参照のこと:ウオレン、など、プロヌ
ィーディングオブザナショナルアカデミィオブサイアン
スオブザUSA(Proceedings ot the National Academ
y of Sciences of the USA)(1972)69:183
8〜1842;ヴァンビーク、など、ブリティッシュジ
ャーナルオブキャンサー(British Journal of Cancer)
(1977)36:157〜165;ウォレン、など、
バイオケミカバイオフィジカアクタ(Biochemica et Bi
ophysica Acta)(1978)516:97〜127;グ
リック、バイオケミストリイ(Biochemistry)(197
9)18:2525〜2532;及びユージィースウォ
レン及びタオ、バイオケミカルアンドバイオフィジカル
リサーチコミュニケーション(Biochemical and Biophy
sical Research Communications)(1980)95:1
452〜1460。
ation)の重要性は多くの報告の主題であった。た
とえば次の文献を参照のこと:ウオレン、など、プロヌ
ィーディングオブザナショナルアカデミィオブサイアン
スオブザUSA(Proceedings ot the National Academ
y of Sciences of the USA)(1972)69:183
8〜1842;ヴァンビーク、など、ブリティッシュジ
ャーナルオブキャンサー(British Journal of Cancer)
(1977)36:157〜165;ウォレン、など、
バイオケミカバイオフィジカアクタ(Biochemica et Bi
ophysica Acta)(1978)516:97〜127;グ
リック、バイオケミストリイ(Biochemistry)(197
9)18:2525〜2532;及びユージィースウォ
レン及びタオ、バイオケミカルアンドバイオフィジカル
リサーチコミュニケーション(Biochemical and Biophy
sical Research Communications)(1980)95:1
452〜1460。
【0007】癌細胞に対して生ずる多くのモノクローナ
ル抗体はシアリル化されたLewisa 〔マグナニ、な
ど、ジャーナルオブザバイオロジカルケミストリイ(Jo
urnal of the Biological Chemistry)(1982)25
7:14365〜14369;〕;Lewisb 〔ブロ
ックハウス、など、上記(1981)256:1322
3〜13225〕;及びLewisx 〔ハコモリ、な
ど、バイオケミカルアンドバイオフィズィカルリサーチ
コミュニィケーション(Biochemical and Biophysical
Research Communications)(1981)100:157
8〜1586〕のような末端炭水化物構造に対してその
主たる活性を持つものとして報告されている。
ル抗体はシアリル化されたLewisa 〔マグナニ、な
ど、ジャーナルオブザバイオロジカルケミストリイ(Jo
urnal of the Biological Chemistry)(1982)25
7:14365〜14369;〕;Lewisb 〔ブロ
ックハウス、など、上記(1981)256:1322
3〜13225〕;及びLewisx 〔ハコモリ、な
ど、バイオケミカルアンドバイオフィズィカルリサーチ
コミュニィケーション(Biochemical and Biophysical
Research Communications)(1981)100:157
8〜1586〕のような末端炭水化物構造に対してその
主たる活性を持つものとして報告されている。
【0008】
【発明の要約】血清中のシアリル化されたLex エピト
ープ又は構造を含む分子の検出が診断として使用され
る。シアリル化されたLex (構造)に対するモノクロ
ーナル抗体は、種々の用途において、すなわち診断及び
治療におけるin vitro及びin vivoの両
者において使用されうる。モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは、他の細胞を形質転換し、その細胞
をモノクローナル抗体産生性にするために、又は免疫グ
ロブリンの発現のための遺伝子源として用いられること
ができる。
ープ又は構造を含む分子の検出が診断として使用され
る。シアリル化されたLex (構造)に対するモノクロ
ーナル抗体は、種々の用途において、すなわち診断及び
治療におけるin vitro及びin vivoの両
者において使用されうる。モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは、他の細胞を形質転換し、その細胞
をモノクローナル抗体産生性にするために、又は免疫グ
ロブリンの発現のための遺伝子源として用いられること
ができる。
【0009】
【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体の断
片は、次の構造、
片は、次の構造、
【化1】 により特徴付けられるシアリル化されたLex エピトー
プと特異的に結合する。このエピトープは腫瘍細胞、及
び相当数の正常組織上に高発生率で存在していることが
見出される。
プと特異的に結合する。このエピトープは腫瘍細胞、及
び相当数の正常組織上に高発生率で存在していることが
見出される。
【0010】エピトープはLewisx 構造のシアリル
化型であることによって特徴づけられている。それは一
般的にCSLEX1抗体による、細胞性テストによって
決定されるように顆粒球上に見つけられるがしかし、同
じ細胞毒性テストによって明らかなように、リンパ球、
単球、血小板及び赤血球細胞に関連していることは見出
されない。それは、またほとんどの白血病−リンパ腫系
上でも、明らかでない。シアリル化されたLex エピト
ープは、正常組織及び食道の腺と粘膜、いくらか膵臓の
腺房細胞及び結腸の深陰窩の限定部位、及びHenle
の近位細管及び下降係蹄において見出すことができる。
抗原は、胃、肺、脳、胸腺、皮膚、卵巣、子宮、副腎、
及び筋肉のテストされた正常組織においては検出されな
い。
化型であることによって特徴づけられている。それは一
般的にCSLEX1抗体による、細胞性テストによって
決定されるように顆粒球上に見つけられるがしかし、同
じ細胞毒性テストによって明らかなように、リンパ球、
単球、血小板及び赤血球細胞に関連していることは見出
されない。それは、またほとんどの白血病−リンパ腫系
上でも、明らかでない。シアリル化されたLex エピト
ープは、正常組織及び食道の腺と粘膜、いくらか膵臓の
腺房細胞及び結腸の深陰窩の限定部位、及びHenle
の近位細管及び下降係蹄において見出すことができる。
抗原は、胃、肺、脳、胸腺、皮膚、卵巣、子宮、副腎、
及び筋肉のテストされた正常組織においては検出されな
い。
【0011】シアリル化されたLex エピトープは、
胃、結腸及び膵臓の腺癌を含むいろいろな癌、並びに食
道、胸、及び卵巣の腫瘍上に存在する。エピトープは、
またCFU−C上のCSLEX1抗体の効果によって立
証されているように、顆粒球の前駆細胞上に見つけられ
る。シアロシルラクトフコペンタオシル(III)セラミド
及びシアロシルジフコシルガングリオシド(VIB)と
してシアリレイトLex 構造は、検出されそして、他の
多くのガングリオシド類、セラミド類及びグロボシド類
から区別され得る。
胃、結腸及び膵臓の腺癌を含むいろいろな癌、並びに食
道、胸、及び卵巣の腫瘍上に存在する。エピトープは、
またCFU−C上のCSLEX1抗体の効果によって立
証されているように、顆粒球の前駆細胞上に見つけられ
る。シアロシルラクトフコペンタオシル(III)セラミド
及びシアロシルジフコシルガングリオシド(VIB)と
してシアリレイトLex 構造は、検出されそして、他の
多くのガングリオシド類、セラミド類及びグロボシド類
から区別され得る。
【0012】シアリル化されたLex 構造はヒト腎臓に
存在するグリコリピッド上で検出された(ラウバラ、ジ
ャーナルオブザバイオロジカルケミストリ(Journal of
theBiological Chemistry)(1976)251:75
17〜7520)。そしてプロナーゼによる活性の部分
的低下及び結腸腺癌における管の管腔含有物中における
そのムチンの存在によって明確なようにたぶんムチン上
に存在する。
存在するグリコリピッド上で検出された(ラウバラ、ジ
ャーナルオブザバイオロジカルケミストリ(Journal of
theBiological Chemistry)(1976)251:75
17〜7520)。そしてプロナーゼによる活性の部分
的低下及び結腸腺癌における管の管腔含有物中における
そのムチンの存在によって明確なようにたぶんムチン上
に存在する。
【0013】シアリル化された型のLex は、広く種々
の方法において用いられ得る。シアリル化されたLex
に対するポリクローナル抗血清の生成のための又は好ま
しくはシアリル化されたLex に対するモノクローンナ
ル抗体のための免疫原を得るための抗原と接合したハプ
テンとして、それを用いることができる。この抗体はI
gM,IgG又はIgA、特にIgM又はIgGであ
る。抗体は、血液中に存在する補体又は他の細胞溶解活
性との組み合せにおいて、細胞毒性又は非細胞毒性を示
すかも知れない。
の方法において用いられ得る。シアリル化されたLex
に対するポリクローナル抗血清の生成のための又は好ま
しくはシアリル化されたLex に対するモノクローンナ
ル抗体のための免疫原を得るための抗原と接合したハプ
テンとして、それを用いることができる。この抗体はI
gM,IgG又はIgA、特にIgM又はIgGであ
る。抗体は、血液中に存在する補体又は他の細胞溶解活
性との組み合せにおいて、細胞毒性又は非細胞毒性を示
すかも知れない。
【0014】シアリル化されたLex は、診断検定にお
いて試薬として使用のために修飾することができる。す
なわち検出可能なシグナルを供給するラベルに、受容体
(たとえば抗体)を通して共有的に又は非共有的にハプ
テンが接合される。例示的ラベルは、放射性同位元素
(たとえば 3H, 125I, 131I);螢光物(たとえば
フルオレスセイン、フィコビリタンパク質、稀土類キレ
ート、ダンシル、ロダミン、等);酵素基質及び酵素阻
害物質;酵素(たとえばホースラディシュパーオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−6−ホス
フェートデヒドロジナーゼ、アセチルコリン−エステラ
ーゼ、等);粒子(たとえば、デキストラン、アガロー
ズ、金属粒子、磁気粒子、ポリスチレン粒子、等)もし
くは、同様の物を含んでいる。種々のラベルにハプテン
を接合する方法は、広く文献に記載されている。
いて試薬として使用のために修飾することができる。す
なわち検出可能なシグナルを供給するラベルに、受容体
(たとえば抗体)を通して共有的に又は非共有的にハプ
テンが接合される。例示的ラベルは、放射性同位元素
(たとえば 3H, 125I, 131I);螢光物(たとえば
フルオレスセイン、フィコビリタンパク質、稀土類キレ
ート、ダンシル、ロダミン、等);酵素基質及び酵素阻
害物質;酵素(たとえばホースラディシュパーオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−6−ホス
フェートデヒドロジナーゼ、アセチルコリン−エステラ
ーゼ、等);粒子(たとえば、デキストラン、アガロー
ズ、金属粒子、磁気粒子、ポリスチレン粒子、等)もし
くは、同様の物を含んでいる。種々のラベルにハプテン
を接合する方法は、広く文献に記載されている。
【0015】たとえば、アメリカ特許番号3,817,
837;4,134,792;及び4,220,722
を参照のこと。結合の部位は、シアリル化されたラクト
−N−フコペンタオースIII である必要はないが、しか
しLex 抗原に接触した基(たとえばホスフォリピッ
ド、結合基、もしくは同様の物)に接触した基を通し
て、結合されるかも知れない。
837;4,134,792;及び4,220,722
を参照のこと。結合の部位は、シアリル化されたラクト
−N−フコペンタオースIII である必要はないが、しか
しLex 抗原に接触した基(たとえばホスフォリピッ
ド、結合基、もしくは同様の物)に接触した基を通し
て、結合されるかも知れない。
【0016】すでに指摘したようにハプテンは、抗体を
誘発するだろうイムノゲンを供給する抗原と接合するこ
とができる。一方、ハプテンを担持する細胞(元のまま
の又はフラグメントとしていづれかの)は、適切な背椎
動物において免疫反応を誘発するために、使用され得
る。特に、通常の技法(コフラー及びミルスティン、ネ
イチュアー(Nature)(1975)256:49
5〜497)に従ってハプテンに対して特異なモノクロ
ーナル抗体を産生することが望ましいだろう。
誘発するだろうイムノゲンを供給する抗原と接合するこ
とができる。一方、ハプテンを担持する細胞(元のまま
の又はフラグメントとしていづれかの)は、適切な背椎
動物において免疫反応を誘発するために、使用され得
る。特に、通常の技法(コフラー及びミルスティン、ネ
イチュアー(Nature)(1975)256:49
5〜497)に従ってハプテンに対して特異なモノクロ
ーナル抗体を産生することが望ましいだろう。
【0017】どの種かが、モノクローナル抗体を調製す
るために用いられる場合、最とも便利であり及び有用に
利用可能な融合パートナーを持つので、大部分マウスが
使用されるだろう。しかしながら、人間の治療において
又は人間においてインビボイメージングにおいて使用の
ために、ヒトモノクローナル抗体を調製することが望ま
しいかも知れない。例示的なヒト融合パートナーは、1
981年3月26日に提出された出願番号247,65
2及び1982年1月27日に公表されたヨーロッパ特
許出願0044722に見い出される。宿主の免疫化、
融合、クローン化、選択及びモノクローナル抗体の単離
のための技法は、十分に確立されていてそしてさらにこ
こで説明する必要はない。この目的のために、この開示
を引用によりこの明細書中に組み入れる。
るために用いられる場合、最とも便利であり及び有用に
利用可能な融合パートナーを持つので、大部分マウスが
使用されるだろう。しかしながら、人間の治療において
又は人間においてインビボイメージングにおいて使用の
ために、ヒトモノクローナル抗体を調製することが望ま
しいかも知れない。例示的なヒト融合パートナーは、1
981年3月26日に提出された出願番号247,65
2及び1982年1月27日に公表されたヨーロッパ特
許出願0044722に見い出される。宿主の免疫化、
融合、クローン化、選択及びモノクローナル抗体の単離
のための技法は、十分に確立されていてそしてさらにこ
こで説明する必要はない。この目的のために、この開示
を引用によりこの明細書中に組み入れる。
【0018】モノクローナル抗体は診断、治療、イン−
ビボイメージング、もしくは同様の事に使用される。特
定の使用に依存して、抗体は、独自に又は、共有的に又
は非共有的に抗体に接合した他の物質と共に用いること
ができる。ハプテンと共に使用のために、すでに記載し
たのと同タイプのラベルを、診断決定において用いるた
めに、抗体と共に使用することができる。イン−ビトロ
イメージングのために、ここで記載されたもの以外の放
射性核種(特にテクネチウム、ヨードもしくは同様の
物)が使用されるだろう。
ビボイメージング、もしくは同様の事に使用される。特
定の使用に依存して、抗体は、独自に又は、共有的に又
は非共有的に抗体に接合した他の物質と共に用いること
ができる。ハプテンと共に使用のために、すでに記載し
たのと同タイプのラベルを、診断決定において用いるた
めに、抗体と共に使用することができる。イン−ビトロ
イメージングのために、ここで記載されたもの以外の放
射性核種(特にテクネチウム、ヨードもしくは同様の
物)が使用されるだろう。
【0019】使用されるラベル化は通常の技法に従いそ
して抗体当りのラベルの数は、ラベルの性質、所望のシ
グナルの感度、ラベル化の目的、及び同様の事に依存し
て変わるだろう。血液、血清又は血漿中のシアリル化さ
れたLex ハプテンを含む分子の検出のための多くの種
々の診断検定においてモノクローナル抗体が使用され
る。多くの検定は、広範囲ないろいろのハプテン(これ
はこの発明において適用される)の検出のために抗体と
ともに使用する方向に開発されている。上で引用したア
メリカ特許を参照のこと。
して抗体当りのラベルの数は、ラベルの性質、所望のシ
グナルの感度、ラベル化の目的、及び同様の事に依存し
て変わるだろう。血液、血清又は血漿中のシアリル化さ
れたLex ハプテンを含む分子の検出のための多くの種
々の診断検定においてモノクローナル抗体が使用され
る。多くの検定は、広範囲ないろいろのハプテン(これ
はこの発明において適用される)の検出のために抗体と
ともに使用する方向に開発されている。上で引用したア
メリカ特許を参照のこと。
【0020】調製されるハイブリドマは、種々の方法に
おいて、たとえば特定の抗体についての遺伝子コード源
として所望の抗体を作る新ハイブリドマを付与する他の
融合パートナーとの融合のために、ハイブリドマ以外の
ものによる抗体の製造法を開発するために使用するため
に、又はハイブリドマの結合部位が検定に使用される場
合の試薬としての使用目的のために使用することができ
る。完全な抗体を、使用する必要はなく、むしろ単にフ
ラグメント(たとえばFab,(Fab′)2 ,Fv、
もしくは同様のもの)が使用される。ネズミモノクロー
ナルIgM(CSLEX1と命名された)が特に興味の
対照である。次の例は、限定的でなく、例示的に提供さ
れる。
おいて、たとえば特定の抗体についての遺伝子コード源
として所望の抗体を作る新ハイブリドマを付与する他の
融合パートナーとの融合のために、ハイブリドマ以外の
ものによる抗体の製造法を開発するために使用するため
に、又はハイブリドマの結合部位が検定に使用される場
合の試薬としての使用目的のために使用することができ
る。完全な抗体を、使用する必要はなく、むしろ単にフ
ラグメント(たとえばFab,(Fab′)2 ,Fv、
もしくは同様のもの)が使用される。ネズミモノクロー
ナルIgM(CSLEX1と命名された)が特に興味の
対照である。次の例は、限定的でなく、例示的に提供さ
れる。
【0021】実験方法及び材料 免疫化及び体細胞の雑種形成 生後4〜6週間の雌のBALB/cマウスを、フロイン
ト完全アジュバント中に乳化された胃腺癌組織(32−
OP−T−ST)からの0.5mg膜タンパク質を用いて
皮下に免疫化した。同量の膜タンパク質による2回の追
加免疫注入を、2週間隔で行なった。3日後、脾臓細胞
の融合を、脾臓ブラスト細胞のPercollグラジィ
エント濃縮を使用しながら、Kohler及びMllsteinの修飾
された方法によって骨髄腫P3−X63−Ag8.65
3(カーニイ、など、ジャーナルオブザイミュノロジイ
(Journal of the Immunology)(1979)123:1
548〜1550)と共に行なった。
ト完全アジュバント中に乳化された胃腺癌組織(32−
OP−T−ST)からの0.5mg膜タンパク質を用いて
皮下に免疫化した。同量の膜タンパク質による2回の追
加免疫注入を、2週間隔で行なった。3日後、脾臓細胞
の融合を、脾臓ブラスト細胞のPercollグラジィ
エント濃縮を使用しながら、Kohler及びMllsteinの修飾
された方法によって骨髄腫P3−X63−Ag8.65
3(カーニイ、など、ジャーナルオブザイミュノロジイ
(Journal of the Immunology)(1979)123:1
548〜1550)と共に行なった。
【0022】融合の後2週間、上清液を、ELISA及
び微細胞毒性テストによって、抗体生成について分析し
た。138の肉眼的なクローンを、融合の後同定し、こ
れらのうち17個は、免疫組織と反応するが、しかし正
常な胃及び結腸とは反応しない。このハイブリドクロー
ンを、限界希釈法によって二度サブクローンし、そして
BALB/cマウス中に継代接種し、腹水を生成せしめ
た。組織 いろいろな器官からのヒト腫瘍組織を手術で得、そして
−80℃で保存した。正常なヒト組織を、死体腎臓提供
者及び腫瘍性疾患を有しない患者の死体解剖から得、そ
の次即座にイソペンタンドライアイスの混合物中で冷凍
しそして−80℃に保存した。
び微細胞毒性テストによって、抗体生成について分析し
た。138の肉眼的なクローンを、融合の後同定し、こ
れらのうち17個は、免疫組織と反応するが、しかし正
常な胃及び結腸とは反応しない。このハイブリドクロー
ンを、限界希釈法によって二度サブクローンし、そして
BALB/cマウス中に継代接種し、腹水を生成せしめ
た。組織 いろいろな器官からのヒト腫瘍組織を手術で得、そして
−80℃で保存した。正常なヒト組織を、死体腎臓提供
者及び腫瘍性疾患を有しない患者の死体解剖から得、そ
の次即座にイソペンタンドライアイスの混合物中で冷凍
しそして−80℃に保存した。
【0023】細胞系 胃癌細胞系(H.ホンジョーによって確立されたMKN
1,MKN28,MKN45、及びMKN74並びに
M.セキグチによって確立されたKATO−III)を、日
本の新潟大学(H.ワタナベ教授)の第1病理学課から
得た。胃癌系MK−92はS.ムカイ及びY.クロス
(日本大学、日本)によって確立された。肺及び結腸癌
系(PC−1,PC−3,PC−6,PC−7,PC−
8,PC−9,PC−10,PC−12,PC−13,
PC−14,QG−56及びC−1)を、Y.ハヤタ
(東京医科大学、日本)及びK.タナカ(九州大学、日
本)から得た。結腸細胞系M−7609を、M.フクシ
マ(弘前大学、日本)から得た。
1,MKN28,MKN45、及びMKN74並びに
M.セキグチによって確立されたKATO−III)を、日
本の新潟大学(H.ワタナベ教授)の第1病理学課から
得た。胃癌系MK−92はS.ムカイ及びY.クロス
(日本大学、日本)によって確立された。肺及び結腸癌
系(PC−1,PC−3,PC−6,PC−7,PC−
8,PC−9,PC−10,PC−12,PC−13,
PC−14,QG−56及びC−1)を、Y.ハヤタ
(東京医科大学、日本)及びK.タナカ(九州大学、日
本)から得た。結腸細胞系M−7609を、M.フクシ
マ(弘前大学、日本)から得た。
【0024】食道癌系(TE−1及びSH1)は、T.
ニシヒラ(東北大学、日本)及びイイズカ(国立癌セン
ター、日本)によって確立された。この研究において使
用される他の細胞系を、American type Culture Collec
tionから得た。すべての細胞系を15%の子牛の胎児血
清(FCS)、ペニシリン及びストレプトマイシンによ
って補われたRPMI−1640培地での培養によって
維持した。
ニシヒラ(東北大学、日本)及びイイズカ(国立癌セン
ター、日本)によって確立された。この研究において使
用される他の細胞系を、American type Culture Collec
tionから得た。すべての細胞系を15%の子牛の胎児血
清(FCS)、ペニシリン及びストレプトマイシンによ
って補われたRPMI−1640培地での培養によって
維持した。
【0025】膜調製法 粗膜分画を、冷凍組織から分離した。要約すれば、検体
を、1mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド(P
MSF)及び2mM塩化カルシウムを含む、pH7.4で、
4℃のPBS中で、解凍した。細かくした後、細胞を、
細胞破壊ボンベにおいて破壊し、次に破壊された細胞の
分別遠心分離を行なった。この粗膜分画を、PBS中に
再懸濁しそして−80℃で保存した。
を、1mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド(P
MSF)及び2mM塩化カルシウムを含む、pH7.4で、
4℃のPBS中で、解凍した。細かくした後、細胞を、
細胞破壊ボンベにおいて破壊し、次に破壊された細胞の
分別遠心分離を行なった。この粗膜分画を、PBS中に
再懸濁しそして−80℃で保存した。
【0026】ELISAによるモノクローナル抗体のス
クリーニング ミクロ−ELISAテストのために、テラサキ組織培養
平板(Falcon)を種々の膜分画(pH9.6の重炭
酸塩緩衝液において25μg/mlで)により4℃で1晩
被覆した。PBS−0.05% Tween20中で洗
浄の後、ウエルを重炭酸塩緩衝液中、1%オバルブミン
により、37℃で1時間被覆オバルブミンの除去の後、
5μlのサンプルを添加しそして37℃で2時間インキ
ュベートした。
クリーニング ミクロ−ELISAテストのために、テラサキ組織培養
平板(Falcon)を種々の膜分画(pH9.6の重炭
酸塩緩衝液において25μg/mlで)により4℃で1晩
被覆した。PBS−0.05% Tween20中で洗
浄の後、ウエルを重炭酸塩緩衝液中、1%オバルブミン
により、37℃で1時間被覆オバルブミンの除去の後、
5μlのサンプルを添加しそして37℃で2時間インキ
ュベートした。
【0027】3回の洗浄(PBS−0.05% Twe
en20により)の後、5μlのパーオキシダーゼでラ
ベルされたヤギ抗マウスIg(IgG+IgM)(KPL
ラボラトリイズ)を、反応させるために37℃で1時間
放置した。5回の洗浄の後、5μlのO−フェニレンジ
アミンを、室温で添加し15分間置いた。この反応を
2.5M硫酸で止められた。光学濃度を、Dynate
ch TR200リーダーにより492nmで測定した。
en20により)の後、5μlのパーオキシダーゼでラ
ベルされたヤギ抗マウスIg(IgG+IgM)(KPL
ラボラトリイズ)を、反応させるために37℃で1時間
放置した。5回の洗浄の後、5μlのO−フェニレンジ
アミンを、室温で添加し15分間置いた。この反応を
2.5M硫酸で止められた。光学濃度を、Dynate
ch TR200リーダーにより492nmで測定した。
【0028】マイクロサイトトキシティテスト 補体依存のマイクロサイトトキシティテストを、標準ミ
クロ技法(テラサキ、など、アメリカンジャーナルオブ
クリニカルパソロジイ(American Journal ofClinical
Pathology)(1978)69:103〜120)によ
り実施した。要約すれば、1μlの抗体を、約1500
目標細胞と30分間インキュベートし、次にウサギ補体
と共に25℃で1時間インキュベートした。生存は、染
料排除によって査定された。
クロ技法(テラサキ、など、アメリカンジャーナルオブ
クリニカルパソロジイ(American Journal ofClinical
Pathology)(1978)69:103〜120)によ
り実施した。要約すれば、1μlの抗体を、約1500
目標細胞と30分間インキュベートし、次にウサギ補体
と共に25℃で1時間インキュベートした。生存は、染
料排除によって査定された。
【0029】間接的免疫螢光検定 50μlのおおまかに希釈した抗体と、細胞を室温で3
0分間反応することによって、間接的免疫螢光法を実施
した。PBS−0.01%ナトリウムアジドによる3回
の洗浄の後、細胞を、FITC−接合されたヤギ抗マウ
スIgMの50μl中において、4℃で、30分間イン
キュベートし、次に3回洗浄した。細胞を螢光顕微鏡法
により試験し、10〜20μg/mlのマウス骨髄腫Ig
Mを負対照として用いた。
0分間反応することによって、間接的免疫螢光法を実施
した。PBS−0.01%ナトリウムアジドによる3回
の洗浄の後、細胞を、FITC−接合されたヤギ抗マウ
スIgMの50μl中において、4℃で、30分間イン
キュベートし、次に3回洗浄した。細胞を螢光顕微鏡法
により試験し、10〜20μg/mlのマウス骨髄腫Ig
Mを負対照として用いた。
【0030】イムパーオキシダーゼ染色法 イムパーオキシダーゼ染色法によって、反応性抗原の免
疫化学的局在定位を検査するために正常な及び腫瘍性の
新鮮な組織を用いた。Tris−緩衝溶液(TBS)
中、4%ホルマリンにおいて、1.5〜5分間固定さ
れ、低温槽で製造された組織断片を、1%ウシ血清アル
ブミン(BSA)を含むTBS中に希釈されたモノクロ
ーナル抗体と共に室温で1時間培養した。5〜10μg
/mlのマウス骨髄腫IgMを、負対照として用いた。
疫化学的局在定位を検査するために正常な及び腫瘍性の
新鮮な組織を用いた。Tris−緩衝溶液(TBS)
中、4%ホルマリンにおいて、1.5〜5分間固定さ
れ、低温槽で製造された組織断片を、1%ウシ血清アル
ブミン(BSA)を含むTBS中に希釈されたモノクロ
ーナル抗体と共に室温で1時間培養した。5〜10μg
/mlのマウス骨髄腫IgMを、負対照として用いた。
【0031】PBS中で洗浄の後1:100に希釈され
た、ヤギ抗マウスIgG+IgM(KPL ラボラトリイ
ズ)のパーオキシターゼ接合F(ab′)2 を、室温で
45分間組織断片に加えた。PBS中で洗浄の後、pH
5.2及び0.01% H2 O2で、0.02M酢酸ナ
トリウム緩衝液中、0.021%w/v 3−アミノ−
9−エチルカルボゾル(Sigma Chemical)において、6
分間スライドを処理し、次に、ヘマトキシリンにより対
比染色しそしてグリセロール/PBSにおいて固定し
た。
た、ヤギ抗マウスIgG+IgM(KPL ラボラトリイ
ズ)のパーオキシターゼ接合F(ab′)2 を、室温で
45分間組織断片に加えた。PBS中で洗浄の後、pH
5.2及び0.01% H2 O2で、0.02M酢酸ナ
トリウム緩衝液中、0.021%w/v 3−アミノ−
9−エチルカルボゾル(Sigma Chemical)において、6
分間スライドを処理し、次に、ヘマトキシリンにより対
比染色しそしてグリセロール/PBSにおいて固定し
た。
【0032】酵素処理 プロナーゼ(60μg/0.1ml,Calbiochem-Behrin
g, San Diego, CA)、トリプシン(500μg/0.1m
l,Worchington Biochemical, Freehold, NJ)、フィシ
ン(10μg/0.1ml,Sigma Chemical, St. Louis,
MO)、ノイラミニダーゼ(0.5IU/ml,0.1IU/m
l,0.02IU/ml,V. Chorea, Calbiochem から
の)、及び過ヨウ素酸ナトリウム(5mM)を使用して、
標準ELISA技法によって、免疫化用胃腺癌組織の酵
素処理を行なった。この酵素反応は、37℃で1時間行
った。イムパーオキシターゼによるノイラミニダーゼ処
理も、ノイラミニダーゼ(アースロバクターウレアファ
シエンス(Arthrobactor ureafaciens )由来、Calbio
chem)を用いて、37℃、2時間のインキュベートによ
り行なった。
g, San Diego, CA)、トリプシン(500μg/0.1m
l,Worchington Biochemical, Freehold, NJ)、フィシ
ン(10μg/0.1ml,Sigma Chemical, St. Louis,
MO)、ノイラミニダーゼ(0.5IU/ml,0.1IU/m
l,0.02IU/ml,V. Chorea, Calbiochem から
の)、及び過ヨウ素酸ナトリウム(5mM)を使用して、
標準ELISA技法によって、免疫化用胃腺癌組織の酵
素処理を行なった。この酵素反応は、37℃で1時間行
った。イムパーオキシターゼによるノイラミニダーゼ処
理も、ノイラミニダーゼ(アースロバクターウレアファ
シエンス(Arthrobactor ureafaciens )由来、Calbio
chem)を用いて、37℃、2時間のインキュベートによ
り行なった。
【0033】CFU−C検定 CFU−C検定のために、10%FCSを含むRPMI
1640を培地中3×106 /mlでの骨髄細胞懸濁液5
0μlを、いろいろな希釈のモノクローナル抗体の溶液
25μlと共に37℃で30分間インキュベートした。
正常のウサギ血清を、補体源として添加しそして60分
間続けてインキュベートした。この処理された細胞(1
×105 )を、20%FCS,20%PHA−LCM
(フィトヘムアグルチニン)及び0.3%寒天を含むα
培地と共に混合しそして次にミクロプレート上に置い
た。5%の二酸化炭素空気中、37℃で10日間の培養
の後コロニーにつき40細胞以上を有するコロニーの数
を計数した。この結果は対照と比較してコロニー形成細
胞の%回収として表した。
1640を培地中3×106 /mlでの骨髄細胞懸濁液5
0μlを、いろいろな希釈のモノクローナル抗体の溶液
25μlと共に37℃で30分間インキュベートした。
正常のウサギ血清を、補体源として添加しそして60分
間続けてインキュベートした。この処理された細胞(1
×105 )を、20%FCS,20%PHA−LCM
(フィトヘムアグルチニン)及び0.3%寒天を含むα
培地と共に混合しそして次にミクロプレート上に置い
た。5%の二酸化炭素空気中、37℃で10日間の培養
の後コロニーにつき40細胞以上を有するコロニーの数
を計数した。この結果は対照と比較してコロニー形成細
胞の%回収として表した。
【0034】固層放射免疫測定法 決定は、カアーニギ、など、キャンサーリサチ (Cancer
Research)(1983)43:4997〜5005によ
り記載された方法によりなされた。おのおののウエル
を、10ngの糖脂質、並びに50ngのレシチン及び30
ngのクロレステロールにより被覆した。この固層放射免
疫測定法において使用される種々の糖脂質の構造並び
に、下記のTLC免疫染色検定において使用される種々
の糖脂質の構造は、第6表に示されている。
Research)(1983)43:4997〜5005によ
り記載された方法によりなされた。おのおののウエル
を、10ngの糖脂質、並びに50ngのレシチン及び30
ngのクロレステロールにより被覆した。この固層放射免
疫測定法において使用される種々の糖脂質の構造並び
に、下記のTLC免疫染色検定において使用される種々
の糖脂質の構造は、第6表に示されている。
【0035】TLC免疫染色法 TLC免疫染色法を、マグナニ、など、アナライティカ
ルバイオケミストリイ(Analytical Biochemistry)(1
980)109:399〜402の方法を用いて、Bake
r のHPTLCミニ−プレート(5×6cm)上で行なっ
た。抗体を300倍に希釈しそして非特異染色を最小に
するためにTLCプレート上に適用した。
ルバイオケミストリイ(Analytical Biochemistry)(1
980)109:399〜402の方法を用いて、Bake
r のHPTLCミニ−プレート(5×6cm)上で行なっ
た。抗体を300倍に希釈しそして非特異染色を最小に
するためにTLCプレート上に適用した。
【0036】結果 正常な末梢血液細胞及び白血病−リンパ腫系に対する反
応性 表1に示めされるように正常なパネル細胞及び白血病−
リンパ腫系によりCSLEX1モノクローナル抗体の細
胞毒活性を検査した。
応性 表1に示めされるように正常なパネル細胞及び白血病−
リンパ腫系によりCSLEX1モノクローナル抗体の細
胞毒活性を検査した。
【0037】
【表1】
【0038】IgM抗体(腹水力価1:104 )は、テ
ストされる顆粒球に対して細胞毒性を示し、そしてテス
トされるリンパ球、単球、血小板、及び赤血球に対し
て、非サイトトキシィーであった白血病−リンパ腫系に
おいて、それは、2つの細胞系、検定されるAPL系
(HL−60)及び組織球リンパ腫系(U−937)だ
けに反応性を示すが、しかし、検定されるT−ALL系
(8402,CEM,MOLT−4,HPB−ML
T),B−リンパ腫系(Daudi, Ramos, Raji, Wel)、及
びCALL系(KM−3,Reh)には反応性を示さな
かった。これらの白血病−リンパ腫系に対するCSLE
X1の免疫螢光法は同一の結果を得た。
ストされる顆粒球に対して細胞毒性を示し、そしてテス
トされるリンパ球、単球、血小板、及び赤血球に対し
て、非サイトトキシィーであった白血病−リンパ腫系に
おいて、それは、2つの細胞系、検定されるAPL系
(HL−60)及び組織球リンパ腫系(U−937)だ
けに反応性を示すが、しかし、検定されるT−ALL系
(8402,CEM,MOLT−4,HPB−ML
T),B−リンパ腫系(Daudi, Ramos, Raji, Wel)、及
びCALL系(KM−3,Reh)には反応性を示さな
かった。これらの白血病−リンパ腫系に対するCSLE
X1の免疫螢光法は同一の結果を得た。
【0039】種々の固形腫瘍細胞系に対する反応性 34の種々の腫瘍細胞系が、表2及び表3に示すよう
に、ミクロサイトキシティー、免疫螢光法及び免疫パー
オキシターゼ染色法によって反応性について検定され
た。CSLEX1は、2つの胃癌系(KATO−III 及
びMKN28)、1つの肺腺癌系(PC−3)、3つの
肺鱗状細胞癌系(PC−1,PC−9,QG−56)、
5つの結腸腺癌系(C−1,M7609,COLO20
5,WiDr,COLO320)、2つの肺癌系(SK
−BR−2III 及びBT−20)、及び1つの食道腫瘍
系(TE−1)により生じる。34細胞系のうち合計1
4(41%)と共に陽性反応を示した。特に高頻度の陽
性反応性は、結腸腺癌系に観察された(7のうち6又は
71%)。
に、ミクロサイトキシティー、免疫螢光法及び免疫パー
オキシターゼ染色法によって反応性について検定され
た。CSLEX1は、2つの胃癌系(KATO−III 及
びMKN28)、1つの肺腺癌系(PC−3)、3つの
肺鱗状細胞癌系(PC−1,PC−9,QG−56)、
5つの結腸腺癌系(C−1,M7609,COLO20
5,WiDr,COLO320)、2つの肺癌系(SK
−BR−2III 及びBT−20)、及び1つの食道腫瘍
系(TE−1)により生じる。34細胞系のうち合計1
4(41%)と共に陽性反応を示した。特に高頻度の陽
性反応性は、結腸腺癌系に観察された(7のうち6又は
71%)。
【0040】
【表2】
【0041】
【表3】
【0042】正常及び悪性組織におけるCSLEX1抗
原の組織分布 免疫パーオキシダーゼ染色法によって、CSLEX1抗
体反応性抗原の組織分布は、表4及び表5に示されてい
る。正常組織の強い陽性染色は、食道腺及び食道粘膜に
おいて、並びに腎臓のHenleの近位細管及び下降係
蹄において観察される。弱い染色は、結腸の深陰窩のひ
じょうに限定された部分に、膵臓の腺房細胞に、肝臓の
肝細胞及びKupffer細胞、及び顆粒球において観
察された。抗原は、検定される胃、肺(肺胞のマクロフ
ァージを除く)、脳、胸腺、皮膚、卵巣、子宮、副腎、
筋肉、もしくは結合組織において検出されなかった。
原の組織分布 免疫パーオキシダーゼ染色法によって、CSLEX1抗
体反応性抗原の組織分布は、表4及び表5に示されてい
る。正常組織の強い陽性染色は、食道腺及び食道粘膜に
おいて、並びに腎臓のHenleの近位細管及び下降係
蹄において観察される。弱い染色は、結腸の深陰窩のひ
じょうに限定された部分に、膵臓の腺房細胞に、肝臓の
肝細胞及びKupffer細胞、及び顆粒球において観
察された。抗原は、検定される胃、肺(肺胞のマクロフ
ァージを除く)、脳、胸腺、皮膚、卵巣、子宮、副腎、
筋肉、もしくは結合組織において検出されなかった。
【0043】74の種々のテストされた腫瘍組織が表6
に示されている。驚くことに、CSLEX1抗体によっ
て認識される抗原が多くの癌において検出することがで
きた−17の胃腺癌のうち16、17の結腸腺癌のうち
13、16の肺腫瘍のうち10、4の食道腫瘍のうち
2、3の膵臓腺癌のうち3、8の胸腫瘍のうち2、及び
6の卵巣腫瘍のうち3である。マウス骨髄腫IgM(5
〜10μg/ml)は、コントロールとして用いられそし
てこれらの組織のどれとも反応しなかった。
に示されている。驚くことに、CSLEX1抗体によっ
て認識される抗原が多くの癌において検出することがで
きた−17の胃腺癌のうち16、17の結腸腺癌のうち
13、16の肺腫瘍のうち10、4の食道腫瘍のうち
2、3の膵臓腺癌のうち3、8の胸腫瘍のうち2、及び
6の卵巣腫瘍のうち3である。マウス骨髄腫IgM(5
〜10μg/ml)は、コントロールとして用いられそし
てこれらの組織のどれとも反応しなかった。
【0044】すべてのサンプルは腫瘍組織だけを含んで
いたが、しかし、17の結腸腺癌サンプルのうち6が腫
瘍組織及び隣接の正常組織を含んでいた。これらの6の
サンプルのうち5つにおいて、正常の組織部が染色され
なかった。陽性に反応する結腸腺癌サンプルの癌性部
は、管癌の先端の細胞質及び管腔含有物において染色を
示した。ムチンレイクを含む4の胃サンプルのうち3及
び8の結腸サンプルのうち8が、たぶんムチン上の抗原
の存在によって、この抗体と陽性反応を示した。CSL
EX1による腫瘍組織の高頻度の陽性染色は癌細胞の分
化度には関係なく、腺癌、たとえば胃、結腸、及び肺に
おいて観察された。陽性染色性は、またいくらかの鱗状
細胞癌サンプル中において観察された。CSLEX1抗
体は、テストされる74腫瘍のうち50(68%)と反
応した。
いたが、しかし、17の結腸腺癌サンプルのうち6が腫
瘍組織及び隣接の正常組織を含んでいた。これらの6の
サンプルのうち5つにおいて、正常の組織部が染色され
なかった。陽性に反応する結腸腺癌サンプルの癌性部
は、管癌の先端の細胞質及び管腔含有物において染色を
示した。ムチンレイクを含む4の胃サンプルのうち3及
び8の結腸サンプルのうち8が、たぶんムチン上の抗原
の存在によって、この抗体と陽性反応を示した。CSL
EX1による腫瘍組織の高頻度の陽性染色は癌細胞の分
化度には関係なく、腺癌、たとえば胃、結腸、及び肺に
おいて観察された。陽性染色性は、またいくらかの鱗状
細胞癌サンプル中において観察された。CSLEX1抗
体は、テストされる74腫瘍のうち50(68%)と反
応した。
【0045】
【表4】
【0046】
【表5】
【0047】
【表6】
【0048】CSLEX1反応性抗原の酵素処理 ノイラミニダーゼ及びナトリウムパーヨーデイト免疫性
胃腺癌の処理は、CSLEX1の結合を完全に減じた。
プロナーゼによる処理は、一部、結合を減少させた(表
7−A)。これらの結果は、免疫性組織上の抗原がシア
リル化された糖タンパク質であることを示唆する。CS
LEX1を有する正常な腎臓管及び食道組織のイムノパ
ーオキシダーゼ染色法は、ノイラミニダーゼ処理によっ
て廃止された(表7−B)。Lex に対して向けられた
抗体(CSLEX1)によって検出される抗原は、ノイ
ラミニダーゼ処理によって、影響されなかった。
胃腺癌の処理は、CSLEX1の結合を完全に減じた。
プロナーゼによる処理は、一部、結合を減少させた(表
7−A)。これらの結果は、免疫性組織上の抗原がシア
リル化された糖タンパク質であることを示唆する。CS
LEX1を有する正常な腎臓管及び食道組織のイムノパ
ーオキシダーゼ染色法は、ノイラミニダーゼ処理によっ
て廃止された(表7−B)。Lex に対して向けられた
抗体(CSLEX1)によって検出される抗原は、ノイ
ラミニダーゼ処理によって、影響されなかった。
【0049】
【表7】
【0050】CFU−C検定 モノクローナル抗体がCFU−C上に効果を持ってい
た。CFU−Cの回収率は、ウサギ補体による処理の
後、1:104 の希釈で28%であった。これは、CS
LEX1がCFU−C、すなわち顆粒球の前駆体と反応
するということを示している。
た。CFU−Cの回収率は、ウサギ補体による処理の
後、1:104 の希釈で28%であった。これは、CS
LEX1がCFU−C、すなわち顆粒球の前駆体と反応
するということを示している。
【0051】種々のガングリオシドとのCSLEX1の
反応性 異なった抗体希釈度でのガングリオシドとの反応性を、
固層イムノラジオアッセイによって決定した。シアロシ
ルラクトフコペンタオシル(III)セラミド(Rauva
la)及びシアロシルジフコシルガングリオシド(6
B)と、抗体は反応したが、テストされた他の物とは反
応しなかった。CSLEX1抗体によるガングリオシド
のTLC免疫染色パターンも、決定した。CSLEX1
は、6Bガングリオシド及びRauvalaのガングリ
オシドの両方と反応したが、しかし、シアロシルLea
分画とも他のガングリオシドとも反応しなかった。
反応性 異なった抗体希釈度でのガングリオシドとの反応性を、
固層イムノラジオアッセイによって決定した。シアロシ
ルラクトフコペンタオシル(III)セラミド(Rauva
la)及びシアロシルジフコシルガングリオシド(6
B)と、抗体は反応したが、テストされた他の物とは反
応しなかった。CSLEX1抗体によるガングリオシド
のTLC免疫染色パターンも、決定した。CSLEX1
は、6Bガングリオシド及びRauvalaのガングリ
オシドの両方と反応したが、しかし、シアロシルLea
分画とも他のガングリオシドとも反応しなかった。
【0052】表8及び表9は、CSLEX1抗体に対し
てテストされたフコガングリオシドを示している。モノ
クローナル抗体は、シアロシルLewisx ハプテンを
含む、最初の2つのガングリオシドと反応したことが見
られる。この抗体は、表8及び表9に示されたようにわ
ずかに異なった化学構造をもつ類似の誘導体とは反応し
なかった。
てテストされたフコガングリオシドを示している。モノ
クローナル抗体は、シアロシルLewisx ハプテンを
含む、最初の2つのガングリオシドと反応したことが見
られる。この抗体は、表8及び表9に示されたようにわ
ずかに異なった化学構造をもつ類似の誘導体とは反応し
なかった。
【0053】
【表8】
【0054】
【表9】
【0055】赤血球凝集テストを、2倍に希釈した血清
の0.05ml及び1%の敏感にされたオックス赤血球細
胞の0.05mlを含んでいるU−型ウェルにおいて実施
した。反応性は室温で2時間のインキュベーションの
後、読み取った。感作された赤血球を添加する前に、患
者の血清及びCSLEX1と共にインキュベートするこ
とにより確認テストを実施した。表10を参照のこと。
の0.05ml及び1%の敏感にされたオックス赤血球細
胞の0.05mlを含んでいるU−型ウェルにおいて実施
した。反応性は室温で2時間のインキュベーションの
後、読み取った。感作された赤血球を添加する前に、患
者の血清及びCSLEX1と共にインキュベートするこ
とにより確認テストを実施した。表10を参照のこと。
【0056】CSLEX1抗体が、癌患者からの313
の血清のうち23%の血清と反応するが一方、80の正
常人からのどの血清とも反応しないということを、次の
データは証明している。シアリル化されたLea の場合
のように、シアリル化された形のLex は癌患者の血清
中に存在するが、しかし正常な患者の血清中には存在し
ない(マグナニイ、キャンサーリサーチ (Cancer Resea
rch)(1983)43:5489〜5492)。従っ
て、腫瘍の存在を検出し、腫瘍をうまく除去するために
モニターに写し、及び、さらに腫瘍の位置の徴候をもた
らすために診断テストにおいて、CSLEX1抗体は使
用され得る。
の血清のうち23%の血清と反応するが一方、80の正
常人からのどの血清とも反応しないということを、次の
データは証明している。シアリル化されたLea の場合
のように、シアリル化された形のLex は癌患者の血清
中に存在するが、しかし正常な患者の血清中には存在し
ない(マグナニイ、キャンサーリサーチ (Cancer Resea
rch)(1983)43:5489〜5492)。従っ
て、腫瘍の存在を検出し、腫瘍をうまく除去するために
モニターに写し、及び、さらに腫瘍の位置の徴候をもた
らすために診断テストにおいて、CSLEX1抗体は使
用され得る。
【0057】この発明は、例示の方法及び明確に理解す
るために例によっていく分詳しく記載されたけれども、
ある変更及び改変を行うことができる。なお、ハイブリ
ドーマCSLEX1は、1984年6月20日にNo. H
B8580としてA.T.C.C.に寄託された。
るために例によっていく分詳しく記載されたけれども、
ある変更及び改変を行うことができる。なお、ハイブリ
ドーマCSLEX1は、1984年6月20日にNo. H
B8580としてA.T.C.C.に寄託された。
【0058】
【表10】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 ヒロタ,マサキ アメリカ合衆国,カリフォルニア 90247, ガーデナ,ウェスト ファースト ストリ ート 1903 (72)発明者 フクシマ,キヨヤス アメリカ合衆国,カリフォルニア 90247, ガーデナ,ウェスト ガーデナ ブールバ ード 1619 (72)発明者 ワキサカ,アケミ アメリカ合衆国,カリフォルニア 90504, トーランス,フェアビュー レーン 18224 (72)発明者 イグロ,タカシ アメリカ合衆国,カリフォルニア 90503, トーランス,7,ガーネット 3730
Claims (7)
- 【請求項1】 モノクローナル抗体の断片であって、該
断片はシアリル化されたLex ハプテンに対して特異的
であり且つ該ハプテンと結合することができ、そして検
出可能なシグナルを提供することができる標識に結合し
ており、そして該モノクローナル抗体はハイブリドーマ
ATCC No. HB8580から得られるものであるこ
とを特徴とする、モノクローナル抗体の断片。 - 【請求項2】 Fab断片である、請求項1に記載のモ
ノクローナル抗体の断片。 - 【請求項3】 (Fab′)2 断片である、請求項1に
記載のモノクローナル抗体の断片。 - 【請求項4】 Fv断片である、請求項1に記載のモノ
クローナル抗体の断片。 - 【請求項5】 前記標識が螢光物質である、請求項1〜
4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体の断片。 - 【請求項6】 前記標識が酵素である、請求項1〜4の
いずれか1項に記載のモノクローナル抗体の断片。 - 【請求項7】 前記標識がラジオアイソトープである、
請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗
体の断片。
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US623309 | 1984-06-21 | ||
US06/623,309 US4752569A (en) | 1984-06-21 | 1984-06-21 | Sialylated Lewisx epitope, antibodies and diagnosis |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH1052269A true JPH1052269A (ja) | 1998-02-24 |
JP2950792B2 JP2950792B2 (ja) | 1999-09-20 |
Family
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---|---|---|---|
JP60133139A Expired - Lifetime JPH0630618B2 (ja) | 1984-06-21 | 1985-06-20 | シアリル化されたLewisxエピト−プ,抗体及び診断 |
JP9113911A Expired - Lifetime JP2950792B2 (ja) | 1984-06-21 | 1997-05-01 | シアリル化されたLewis(X)エピトープに対するモノクローナル抗体の断片 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60133139A Expired - Lifetime JPH0630618B2 (ja) | 1984-06-21 | 1985-06-20 | シアリル化されたLewisxエピト−プ,抗体及び診断 |
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---|---|
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ES (1) | ES8609731A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011046097A1 (ja) * | 2009-10-13 | 2011-04-21 | 日東紡績株式会社 | T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体の製造方法、T細胞非依存性抗原に対するIgG型抗体を産生する遺伝子組換えカイコおよびその製造方法 |
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EP0248147A3 (en) * | 1986-03-04 | 1989-02-15 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method of determining the presence of cancer cells |
US6004761A (en) * | 1986-11-19 | 1999-12-21 | Sanofi | Method for detecting cancer using monoclonal antibodies to new mucin epitopes |
AU613590B2 (en) * | 1986-11-19 | 1991-08-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Hybridomas producing monoclonal antibodies to new mucin epitopes |
US5122112A (en) * | 1986-11-21 | 1992-06-16 | Imre Corporation | Antigen-specific removal of circulating immune complexes |
EP0272792B1 (en) * | 1986-11-21 | 1994-09-14 | Imre Corporation | Antigen-specific removal of circulating immune complexes |
JPS63159763A (ja) * | 1986-12-24 | 1988-07-02 | Fujirebio Inc | 逆受身凝集反応試薬 |
EP0287916A1 (en) * | 1987-04-13 | 1988-10-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Immunoassay |
US5403717A (en) * | 1987-08-11 | 1995-04-04 | Pacific Northwest Research | Diagnosis of premalignant or malignant conditions of human secretory epithelia |
AU2489888A (en) * | 1987-09-08 | 1989-04-17 | Biomembrane Institute, The | Detection of survived, undegraded carbohydrate epitopes as diagnostic of intestinal diseases |
US5206086A (en) * | 1987-10-13 | 1993-04-27 | University Of Rochester | Particle-stabilized epitopes for standardization and control of immunoassays |
US5079353A (en) * | 1987-12-02 | 1992-01-07 | Chembiomed, Ltd. | Sialic acid glycosides, antigens, immunoadsorbents, and methods for their preparation |
US5075218A (en) * | 1987-12-29 | 1991-12-24 | Biomira, Inc. | Screening for antibodies which bind carbohydrate epitopes of tumor-associated antigens, and uses thereof |
EP0380084A3 (en) * | 1989-01-27 | 1991-03-13 | The Biomembrane Institute | Method for the inhibition of cell-cell and cell substratum interactions by the blocking of carbohydrate-carbohydrate interactions |
US6307025B1 (en) | 1989-04-28 | 2001-10-23 | Biogen, Inc. | VCAM fusion proteins and DNA coding therefor |
US5272263A (en) | 1989-04-28 | 1993-12-21 | Biogen, Inc. | DNA sequences encoding vascular cell adhesion molecules (VCAMS) |
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WO1992009293A1 (en) * | 1990-11-23 | 1992-06-11 | The General Hospital Corporation | Inhibition of cell adhesion protein-carbohydrate interactions |
JPH06503177A (ja) * | 1991-06-26 | 1994-04-07 | ザ バイオメンブレイン インスティテュート | 抗―炭水化物抗体の組合せを利用しての肺癌の早期診断 |
SE9102074D0 (sv) * | 1991-07-03 | 1991-07-03 | Kabi Pharmacia Ab | Tomour antigen specific antibody |
WO1994007138A1 (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Fodstad Oystein | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
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CA2162600C (en) | 1993-05-17 | 2000-07-11 | Chrales W. Rittershaus | Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions |
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NO961031D0 (no) | 1996-03-13 | 1996-03-13 | Det Norske Radiumshospital Tum | Fremgangsmåte til å drepe uönskede målceller |
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WO2014178195A1 (ja) | 2013-05-02 | 2014-11-06 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 糖鎖抗原の免疫誘導剤 |
-
1984
- 1984-06-21 US US06/623,309 patent/US4752569A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-06-19 EP EP85304390A patent/EP0165811A2/en not_active Withdrawn
- 1985-06-20 ES ES85544389A patent/ES8609731A1/es not_active Expired
- 1985-06-20 JP JP60133139A patent/JPH0630618B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-21 CA CA000484922A patent/CA1277614C/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-01 JP JP9113911A patent/JP2950792B2/ja not_active Expired - Lifetime
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US4752569A (en) | 1988-06-21 |
ES544389A0 (es) | 1986-07-16 |
CA1277614C (en) | 1990-12-11 |
EP0165811A2 (en) | 1985-12-27 |
ES8609731A1 (es) | 1986-07-16 |
JPH0630618B2 (ja) | 1994-04-27 |
JPS6163700A (ja) | 1986-04-01 |
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