JPH04505102A

JPH04505102A - ヒトの腫瘍に附帯した新規な抗原に対する新規なモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH04505102A
Application number: JP2508122A
Authority: JP
Inventors: カールエリックヘルストロム; ヘルストロム　インゲガード; マーカード　ハンス
Original assignee: オンコーゲン　リミテッド　パートナーシップ
Priority date: 1989-04-17
Filing date: 1990-03-26
Publication date: 1992-09-10
Also published as: AU639458B2; PT93776A; FI914908A0; US5171665A; GR900100221A; IL93840A; NZ233325A; GR1000477B; EP0597829A4; IL93840A0; KR920700692A; AU5671490A; CA2014304A1; WO1990012594A1; EP0597829A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトの腫瘍に附帯した新規な抗原に対する新規なモノクローナル抗体発明の技術分野本発明は、新規なモノクローナル抗体及び新規な抗原、並びにヒトの癌腫細胞と反応性を有するこの新規なモノクローナル抗体の調製法及び用途に関する。より具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、結腸及び肺の癌腫を含む種々のヒトの腫瘍と附帯した新規な細胞表面の抗原との反応性を有するものである。

本発明のモノクローナル抗体は、生体内及び生体外での悪性癌腫の検査の如き臨床的診断目的のいずれにも適している。更に、本発明の抗体は、例えば、腫瘍細胞と反応させたり、化学療法剤、毒素、免疫学的応答変更因子及び放射性同位元素（これらに限定されるものではない）を含む抗腫瘍効果を有する種々の薬剤の標的−選択的キャリアーとしての結合体において治療的用途に適している。また、本発明の抗原も治療的及び診断的目的に適している。

発明の背景毎年、癌腫によって数百万人が死亡している。例えば、肺の癌腫は、男性における癌による死亡原因の大多数を占めており、女性における癌による死亡の最大原因である乳癌を追い抜いている。

癌腫の殆どのケースでは、疾患の早期の時点で徹底的に除去しなければ、化学療法及び放射線療法によっても治癒しない。従って、黒色腫及び肉腫の如き他の悪性腫瘍と同様に、乳癌層、結腸癌腫、卵巣癌腫及び肺癌腫の診断及び治療方法が非常に必要とされているのである。

癌腫に附帯した抗原と反応性を有するモノクローナル抗体は公知である〔例えば、バブシブｏ　（Ｐａｐｓｉｄｅｒｏ）によるＳｅｍ１ｎ、　Ｓｕｒｇ、　０ｎｃｏ１．、１　（４）：１７１−８１　（１９８５）　；シュロム（Ｓｃｈｌｏｍ）らによるｒｍｐｏｒｔａｎｔ　Ａｄｖ、０ｎｃｏ１．、１７０−９２　（１９８５）　；アラム（Ａｌｌｕｍ）らによるＳｕｒｇ、　Ａｎｎ、、　１８：４１−６４　（１９８６）：／’−フトン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）らによるＳｅｍ１ｎ、　０ｎｃｏ１．、１３　（２）：１６５−７９　（１９８６）　；癌におけるモノクローナル抗体：診断と治療の発展（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ：　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｆｏｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔ−ｍｅｎｔ）、ロス（Ｒｏｔｈ）纒、　Ｆｕｔｕｒａ、　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｍｔ、　Ｋ１５ｃｏ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８６）　；り（Ｋｕｐｃｈｉｋ）纒、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、、　ＮｅｗＹｏｒｋ　（２９８８）を参照のこと〕。

公知のモノクローナル抗体の殆どは多くのタイプのヒトの癌腫と反応性を有するが、僅かな抗体は、例えば、肺、乳房、卵巣、結腸、胃または膵臓といった身体の特定の器官由来の癌腫と反応する。標的の抗原は、通常、糖蛋白または糖脂質である〔例えば、ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）らによるＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４６：３９１７−２３　（１９８６）　；及びフィフク（Ｆｉｎｋ）らによるＰｒｏｇ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、。

９：Ｉ２１−３３　（１９８４）を参照のこと〕。例えば、特定のタイプの癌腫上に存在する糖蛋白抗原と反応性を有するモノクローナル抗体として、米国特許第４．７３７．５７９号（非小細胞肺癌腫に対するモノクローナル抗体）；米国特許第４．７５３．８９４号（ヒト乳癌に対するモノクローナル抗体）：米国特許第４．５７９．８２７号（ヒト消化器系癌に対するモノクローナル抗体）；及び米国特許第４．７１３．３５２号（ヒト腎臓癌腫に対するモノクローナル抗体）がある。あるモノクローナル抗体は、粘液と思われる高分子量の抗原と反応する。

例えば、モノクローナル抗体８７２．３は、多くの異なる癌腫上で選択的に発現する分子量１．０００ｋｄより大きい腫瘍−附帯胎児腫瘍性糖蛋白抗原を認識するものと思われる。かくして、Ｂ７ｚ３は、乳癌層の８４％、結腸癌腫の９４％、卵巣癌腫の１００％及び非小細胞肺癌腫の９６％と反応することが明らかにされてきた〔ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）によるＡｃｔａ　Ｃｙｔｏｌ、、　ｌ　（５）：５３７−５６　（１９８７）及びシュロム（Ｓｃｈｌｏｍ）らに対して付与された米国特許第４．６１２．２８２号を参照のこと〕。同じく、モノクローナル抗体ＫＣ−４は、結腸、前立腺、肺及び乳癌層の如き多くの癌腫上で発現される約４００〜５００ｋｄの蛋白質抗原を認識するＣ米国特許第４．７０８．９３０号を参照のこと〕。

一定の腫瘍細胞に附帯していると考えられている糖脂質抗原と反応性を育するモノクローナル抗体も開示されている。例えば、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）らによるＪ、　Ｂｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５０：１００８−１９　（１９７９）は、アジアｃ＋　（ａｓｉａｌｏ）　ＧＭｔ　、キルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）　ｖウス肉腫ウィルスによって形質転換されたＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞のマーカーとして定着した細胞表面グリコスフィンゴリピド抗原に特異的な２つのモノクローナル抗体の調製を開示している。二−ブ（Ｋｎｉｅｐ）らによるＪ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．、１３１　（３）：１５９１−９４　（１９８３）及び米国特許第４．５０７．３９１号（ヒト黒色腫に対するモノクローナル抗体）も参照のこと。

更に、特定のタイプの癌腫細胞に見い出された糖脂質抗原と反応性を育するモノクローナル抗体として、ローゼン（Ｒｏｓｅｎ）らによるＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４４：２０５２−６１　（１９８４）　（ヒト小細胞肺癌腫に対するモノクローナル抗体）；バルキ（ＶａｒｋＤらによる第４．５７９．８２７号（ヒト結腸腺癌層に対するモノクローナル抗体）に開示されたものがある。また、ヒト非小細胞肺癌腫、乳癌腫及び結腸癌腫の表面上で発現される糖質抗原を認識するＬ６モノクローナル抗体を開示しているヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）　ラＧ：：ヨるＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ、　８３ニア０５９−６３　（１９８６）も参照のこと。

種々の腫瘍細胞上に見出される抗原に対して反応性を発揮する更なるモノクローナル抗体が非常に必要とされている。これは、同じ腫瘍塊に向けられた異なるモノクローナル抗体の組み合わせを用いることを診断及び治療においてしばしば必要としている殆どの腫瘍の抗原異質性のためである。その上、正常な組織との反応性を有さないかまたは極めて微弱であると同時に、広範囲な腫瘍との高度な反応性を発揮するモノクローナル抗体は一般的ではない。そのような抗体は明らかに作用である。

従って、種々の腫瘍によって高濃度に発現される抗原と反応性を存するモノクローナル抗体は、より進んだ癌治療方法の開発のためだけでなく、癌の早期発見、癌の転移のより正確な特定、癌患者の免疫学的監視にも有用なものとなるだろう。また、新規な細胞表面分子に対するモノクローナル抗体は、癌ワクチンの形で免疫原を調製する価値があり、しかも、例えば、ホルモンまたは成長因子の受容体としてまたは細胞内及び細胞間連絡に他の状態で含まれる分子として重要な細胞性作用も持っているかもしれない分子を更に特定するのに使用できると思われる。その抗原ですらそれ単独で酵素的または成長因子的活性を育しているかも知れないのである。

本発明は、ヒトの腫瘍細胞、特に肺及び結腸癌腫由来の細胞に附帯した細胞表面糖蛋白抗原（Ｃ１抗原）の決定基に特異的であるモノクローナル抗体（ＣＩ）を提供するものである。従って、本発明の抗体は、抗体Ｃ１によって特定されたＣ１抗原を発現する腫瘍の診断及び治療に有用であり得る。本発明のＣ１抗体は、クラスＩｇＧ及びＩｇＧ１サブクラスに属するものであり、正常なヒト細胞には有意な反応性を示さない。

本発明の抗体は、ヒト肺組織及び他のヒト組織における悪性状態の存在を測定する生体外での診断方法において用いてもよい。

その方法は、抗体Ｃ１との反応性を有する６６．０００ダルトンの０１抗原糖蛋白の特質を有する抗原の存在について、組織を試験する方法を含んでいる。例えば、組織を、ＣＩ抗原の特質を存する細胞附帯抗原の決定基を特定する本発明のＣＩモノクローナル抗体、この抗体の機能的等価物またはフラグメントと接触させてもよく、前記抗体と抗原決定基のいかなる相互作用も検出される。かかる方法の１つは、そのような細胞を含む疑わしい検体中での癌腫細胞の存在を測定することを含んでいる。

検体は、その検体中に存在することができる他のタイプの細胞からそのような細胞を区別することができるモノクローナル抗体と接触される。該接触は、抗体がそのような細胞と結合できる条件下で行われる。接触後、抗体の該細胞への結合があったかなかったかが決定される。この結合は、検体中の癌腫細胞の存在または不存在に関連している。一般に、検体は該モノクローナル抗体についての標識化された特定の結合パートナ−と接触される。この標識は検出可能なシグナルを発することができるものである。

また、該モノクローナル抗体それ自身を標識することも可能である。

もう１つの診断法は、検出可能なシグナルを発する試剤で標識化された本発明の精製した抗体または該抗体のフラグメントを患者に投与することによって、生体内で腫瘍の位置を確認することを含む。次いで、その位置は、外部シンチグラフィー、ｘｍｉ層撮影法または放射性核スキャン法を使用して探知される。この方法は、疾患の程度に関して癌患者の状態を推し量ったり、治療効果をモニターしたりするよりよい方法をも提供する。

本発明は、また、Ｃｔ抗体及び類似の抗体が腫瘍細胞表面で高濃度に発現するＣＩ抗原と反応することができるので、治療への応用をも含む。本発明のモノクローナル抗体を腫瘍治療のための組成物のｌ１ｉ１！に使用することもできる。該組成物は、薬学的に許容し得る非経口賦形剤と共に治療学的に有効量の該抗体を含む。

また、本発明の抗体は、化学療法剤、毒素、免疫学的応答変更因子及び放射性同位元素（これらに限定されるものではない）を含む抗腫瘍効果を有する種々の作用剤のキャリアーとして、免疫複合体で使用することもできる。

本発明は、また、分子量か約６６．０００ダルトンであり、しかもアミノ末端アミノ酸配列Ｘ−Ｅ−Ｌ−Ｔ−［−Ｌ−Ｈ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｖ−Ｈ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｔ− Ｓ−Ｘ（Ｘは未確認アミノ酸を表す）を有することによって特徴付けられる新規なＣＩ抗原及びその等価物であって、抗体ＣＩ及びこの抗原と結合する抗体のクラスによって特定されるものをも含む。

本発明は、一定の腫瘍に対して免疫になるワクチンとして精製されまたはクローン化されたＣＩ抗原を使用する方法を含む。

発明の詳細な説明ここに記載された本発明がより十分に理解されるように、以下に詳細に説明する。

本発明は、ヒト腫瘍細胞、特に肺及び結腸の癌腫由来の細胞上に位置する抗原（ＣＩ抗原）と特異的に反応するＣ１で示される新規なモノクローナル抗体、Ｃ１モノクローナル抗体の調製法及び該抗体を使用する診断法及び治療法に関する。

該Ｃ１抗体は一定の範囲の腫瘍とは反応するものの、正常なヒトの組織または黒色腫、リンパ腫の如き他のタイプの腫瘍との反応性は実質的に示さない。

本発明は、更に、Ｃ１抗原で示されかつヒトの肺または結腸の腫瘍に主として附帯した新規な細胞表面糖蛋白抗原及び該Ｃ１抗原を使用する方法に関する。

本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ融合技術またはＥＢＶ−不滅化法（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）テクノロジーを利用する技術によって調製され得る。

ハイブリドーマ融合技術は、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって初めて導入された〔コーラ−及びミルこれらの技術は、動物（例えば、マウス）の中での望ましい免疫欠乏反応（つまり、抗原の生成）を引き起こすために動物内にある免疫原（例えば、精製した抗原または抗原を保持している細胞または細胞抽出物）を注入することを含む。例えば、胸膜滲出液由来のヒト肺癌腫細胞、外植されたヒト非小細胞肺癌腫由来の培養細胞（ＮＳＣＬＣ）　、または正常胎児の肺由来の細胞またはそのような細胞由来の溶解産物を免疫原として使用することができる。後記の実施例１において、Ｈ３０５９で示される結腸のヒト腺癌由来の膜試料及び結腸癌腫セルライン３３４７由来の細胞が免疫原として使用されている。例えば、その膜試料を、マウスの体内に注入し、充分な時間が経過した後、該マウスを犠牲にして０抗体−生成リンパ球を得ている。抗体−生成細胞は、リンパ結節、膵臓及び感作された動物の末梢血から誘導してもよい。膵臓細胞が好ましい。マウスリンパ球は高い割合で以下に説明するマウスのミエローマと安定な融合を行う。ラット、ウサギ及びカエルの体細胞を使用することも可能である。望ましい免疫グロブリンをコードする膵臓細胞染色体は、一般にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の如き融合剤の存在下で、膵臓細胞をミエローマ細胞と融合させることによって不滅化される。いかなるミエローマセルラインも標準的技術に従って融合パートナ−として使用することができる。例えば、Ｐ３−ＮＳ　１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ３．６５３またはＳｐ２／○−Ａｇ１４ミエローマラインがある。これらのミエローマラインはメリーランド州のロックビルにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手することができる。

次いで、目的とするハイブリドーマを含む、得られた細胞を、ＨＡＴ培地の如き選択培地で生育させる。融合しなかった親ミエローマまたはリンパ球細胞は最終的にそこで死滅する。ハイブリドーマ細胞だけが生き残り、限界希釈条件下で成長することかでき、分離したクローンが取得できる。該ハイブリドーマの上溝を、例えば、免疫化に用いた抗原を使用する免疫学的試験に付して、望ましい特異性を有する抗体をふるい分ける。次いで、陽性のクローンが限界希釈条件下でサブクローン化され、生成したモノクローナル抗体が単離され得る。モノクローナル抗体から他の蛋白及び他の不純物を除くために、モノクローナル抗体の単離及び精製には多様な慣用的方法がある。モノクローナル抗体の精製に通常使用される方法には、硫酸アンモニウム沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー法、及びアフィニティクロマトグラフィー法がある〔例えば、シラ（Ｚｏ　ｌａ）ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、フレル（Ｈｕｒａｌｌ）　Ｉｌ、　ｐｐ、　５ｌ−５２（ＣＲＣＰｒｅｓｓ　１９８２）を参照〕。これらの方法で生成したハイブリドーマは、当該分野で公知の技術を使用して生体外または生体内（腹水中）で増殖され得る〔一般的には、フィフク（Ｆｉｎｋ）らによる上記文献の１２３頁の図６−１を参照〕。

一般に、個々のセルラインは、例えば、実験室の培養容器中で生体外で増殖してもよく、単独の特異的モノクローナル抗体を高濃度で含有する培地が、デカンテーション、濾過または遠心分離によって採取され得る。また、モノクローナル抗体の収量は、初めの融合に、０抗体及びミエローマ細胞を供給するために用いられたタイプの組織適合動物の体内に該ハイブリドーマのサンプルを注入することによって向上させ得る。融合細胞ハイブリッドによって生成した特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍が、注入された動物の体内で増える。腹水または血清の如き該動物の体液が高濃度でモノクローナル抗体を提供する。上記の文献でコール（Ｃｏｌｅ）らが議論しているように、ヒトハイブリドーマまたはＥＢＶ− ハイブリドーマを使用する場合は、マウスのような動物の体内に注入される異種移植体による拒絶反応を避けることが必要である。免疫不全のまたはヌードのマウスを用いてもよく、または、まず、ハイブリドーマを、生体外で培養された固形の皮下腫瘍として、照射ヌードマウスの体内に継代接種し、次いで、大量の特異的ヒトモノクローナル抗体を分泌する腹水腫瘍が大きくなった、初めに接種した照射ヌードマウスに、腹腔内注入してもよい（コールらによる上記の文献を参照のこと〕。

マウスの抗体で治療した患者はヒト抗マウス抗体を生じているので、一定の治療への適用には、キメラ（マウス−ヒト）モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体がマウスの抗体に対して好ましいかも知れない〔シャウラ−（Ｓｈａｗｌｅｒ）らによるＪ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３５：　１５３０−３５　（１９８５）　）　、　ＣＩ抗原と反応性を有するキメラマウス−ヒトモノクローナル抗体は、例えば、キメラ抗体の調製のために最近発展した技術によって調製することができる。

〔才イ（Ｏｌ）らによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　４　（３）：　２１４−２２１　（１９８６）：リー（Ｌｉｕ）らによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　８４：３４３９−４３　（＋９８７））。従って、マウスＣＩ抗体分子の一定の領域をコードする遺伝子は、適当な生物学的活性（ヒトの補体及び間接ＡＤＣＣを活性化する能力の如きもの）を有する抗体の一定の領域をコードするヒト遺伝子で置き換えられる。マウスまたはヒト起源の新規な抗体は適当な生物学的機能を有するＣ１抗原から作ることができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、本発明のＣＩ抗原の如き抗原を使用して、生体外で該抗原に対してヒトリンパ球を感作させ、次いで、ポアベック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）らにより説明されているように、マウスまたはヒトのリンパ球で感作された該抗原感作リンパ球をＥＢＶ−形質転換またはハイブリダイゼーションすることによって作ることができる（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。

好ましい態様によれば、ＣＩで示される本発明の抗体は、後記の実施例１に記載しているように、免疫原として結腸腺癌滲出細胞由来の膜及び結腸癌腫セルライン３３４７由来の細胞を使用するハイブリドーマ技術を介して生成される。ＣＩ抗体を生成するＣ１ハイブリドーマは、メリーランド州ロックビルのＡＴＣＣに寄託されており、次のように特定されている。

ＣＩ　受託番号Ｎｏ、：　ＨＢ　９８０３該Ｃ１抗体は、ＩｇＧ１サブクラスに属する。この抗体は、腫瘍細胞、特に結腸及び肺癌腫由来の細胞に非常に強力な反応性を発揮する。該ＣＩ抗体は、リンパ腫セルライン、ＣＥＭＳＭＯＬＴ−４、Ｂ細胞リンパ腫うインＰ３ＨＲ−１、及び黒色腫細胞とは検出できる程度の結合をしない。

更に、本発明の抗体は、主要な器官、例えば、腎臓、膵臓、肝臓、皮膚、肺、乳房、結腸、脳、甲状腺、心臓、リンパ結節または卵巣由来の線維芽細胞、内皮または上皮細胞の如き正常なヒトの組織とは、免疫組織学的に検出できるいかなる結合をも生じない。また、該抗体は末梢血白血球とも反応しない。このように、この抗体は、腫瘍細胞の一定の範囲に対するその特異性において及び正常細胞に比較して腫瘍細胞に高度に特異性である点において、公知の大半の抗腫瘍抗体〔例えば、ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ら１診断及び治療における共有結合で修飾された抗原及び抗体（Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ａｎｔｉｇｅｎｅｓ　Ａｎｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｉｎ　ＤｉａｇｎｏｓｉｓＡｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、フォラシュ／ロッドウェル（Ｑｕａｓｈ／Ｒｏｄｗｅｌｌ）纒。

ｐｐ、　２４−２８　（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、（１９８９）　；およびバッグシャウ（Ｂａｇｓｈａｗｅ）によるＢｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、４８：１６７−７５　（１９８３）を参照のこと〕よりも優れている。

本発明は、上記で説明したＣ】抗体及び該抗体の活性結合領域を含有する、Ｆａｂ、Ｆ　（ａｂ）＊及びＦｖフラグメントの如きいかなるフラグメントも包含するものである。かかるフラグメントは、当該分野で充分に確立されている技術を用いて、Ｃ１抗体から作ることができる〔例えば、ローゼアクラス（Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ）らによるＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１２１：６６３−６９．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８６）を参照のこと〕。

更に、本発明は、ＣＩ抗体と同じ抗原決定基に結合することができ、かっ、該決定基で結合するためにＣ１抗体と競い合うことができる抗体を包含するものである。これらには、Ｃ１抗体と同じ抗原特異性を有するものの、種の起源、アイソタイプ、結合親和性または生物学的機能（例えば、細胞障害作用）において相違する抗体が含まれる。例えば、本発明の抗体のクラス、アイソタイプ及び他の突然変異体を、当該技術分野で公知の組み換え体クラススイッチ技術及び融合技術を使用して構築することができる〔例えば、サマナ（Ｔｈａｍｍａｎａ）らによるεｕｒ、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、、　１３：６１４　（１９８３）　；スピラ（Ｓｐｉｒａ）らによるＪ、［ｍｍｕｍｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、７４：３０７− １５　（１９８４）　；ノイベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）らによるＮａｔｕｒｅ。

３１２：６０４−０８　（１９８４）　：及び才イ（Ｏｌ）らによる上記文献を参照のこと〕。従って、ＣＩ抗体と同じ結合特異性を存するキメラ抗体または他の組み換え抗体（例えば、リンフ才力インの如き第２蛋白と融合した抗体）は、本発明の範囲内のものである。更に、本発明の抗体か結合するＣｔ抗原は新規な腫瘍抗原なので、本発明の抗体は、該ＣＩ抗体が反応する抗原決定基以外の抗原決定基を含む、該ＣＩ抗原上の全ての抗原決定基と結合する抗体を含むものである。

また、本発明の０１抗体の抗イデイオタイプ抗体も本発明の範囲内に含まれる。

これらの抗イデイオタイプ抗体は、免疫原としてＣＩ抗体を使用して作ることができ、腫瘍に対する体液性応答の検出における診断目的及び患者における抗腫瘍応答を誘導するための治療的適用、例えば、ワクチンにおいて有用である〔例えば、ネボム（Ｎｅｐｏｍ）らによるＣａｎｃｅｒ　Ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖｉｅｗｓ。

６：４８７−５０１　（１９８７）　：及びり−（Ｌｅｅ）らによるＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　８２：６２８６−９０　（１９８５）を参照ノコと〕。

ＣＩ抗体は、それが結合するＣ１抗原を単離し特徴付けるのに使用できる。従って、Ｃ１抗体は、該抗体によって認識されたエピトープを同定し特徴付けるためのプローブとして、更に癌腫細胞表面上のＣＩ抗原を特定するのに使用できる〔ハコモリ（Ｈａｋｏｍｏｒｉ）らによるＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　［ｍｍｕｎｏｌ、、　２：１０３−２６　（１９８４）ニブラウン（Ｂｒｏｗｎ）らによるＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２７：５３９−５４６　（１９８１）；ブ参照のこと〕。

本発明のモノクローナル抗体によって認識されるＣ１抗原は、腫瘍細胞、特に結腸及び肺の癌腫由来の細胞に独特な新規な細胞表面糖蛋白抗原を含む。ＣＩ抗原は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのイムノブレシピテーションに付した場合、約６６．０００ダルトンの分子量を有する。

該新規なＣＩ糖蛋白抗原のアミノ末端アミノ酸配列は次の通りである。

１　５　ｔｏ　１５　２０Ｘ−Ｅ−Ｌ−Ｔ−１−Ｌ−Ｈ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｖ−）１−Ｓ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ｔ −Ｓ−Ｘここで、Ｘはまだ同定されていないアミノ酸を表し、残りの文字はアミノ酸の通常の１文字省略型を表す。現在の蛋白質データベース（ＰＩＲリリース１６．１９８８．３　；　Ｇｅｎ　ＢＡＮＫリリース５７．０．１９８８．９；ＮＢＷ、　１９８８．１１．３０　；　ＤＩＦ、　１９８８．１１．３０　；　５ＷｒＳＳＰＲＯＴ、１９８８．１＋、３０、ＬＯＳＰＲＯ，１９８８，１１，３０）に蓄積されているものと該２０残基Ｃ１アミノ末端配列とを比較しても、いかなる他の公知の配列との有意な配列相同性も認められない。

本発明のモノクローナル抗体は、また、生体外及び生体内の両方において、該ＣＩ抗体が特異的に反応するＣ１抗原を保持するヒト癌腫を検出する診断への応用に有用である。生体外での診断法は、当該技術分野において公知であり〔例えば、ロスによる上記文献及びクブチック（Ｋｕｐｃｈｉｋ）による上記文献を参照のこと〕、腫瘍細胞（例えば、ヒト組織、細胞または切除された腫瘍検体）の免疫組織学的検出方法または腫瘍附帯抗原（例えば、血液サンプルまたは他の生物学的分泌物）の血清学的検出法を含むものである。

免疫組織学的技術は、腫瘍組織検体の如き生物学的検体を本発明の抗体と接触させ、次いで、その抗原と複合体を形成した抗体の検体の存在を検出することを含んでいる。検体とのかかる抗体−抗原複合体の形成は、組織中での腫瘍細胞の存在を示している。

検体上での抗体の検出は、免疫ペルオキシダーゼ発色法、アビジン−ビオチン（ＡＢＣ）法または免疫蛍光法の如き当該技術分野で公知の技術を使用して行われる〔例えば、ジオツカ（Ｃｉｏｃｃａ）らによるＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１２１：５６２−７９　（１９８６）　；ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）らによるＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４６：３９１７−２３　（１９８６）；及びＫｉｍｂａｌｌ纒２免疫学入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｏ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（２ｎｄ　Ｅｄ、）、　ｐｐ、　１１３−１１７．　Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌ、　Ｃｏ、　（１９８６）を参照のこと〕。例えば、免疫ペルオキシダーゼ発色法は、以下の実施例３に記載しているように、肺及び結腸の癌腫の０１抗体に反応性かあること、及び正常なヒト組織検体の抗体には反応性かないことを証明するのに使用された。

血清学的診断技術は、癌に罹っていると考えられる患者の血清または他の分泌物の中に分泌されたかまたは「放たれた」腫瘍附帯抗原の検出及び定量を含む。このような抗原は、放射性免疫測定法（ＲＩ　Ａ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の如き当該技術分野で公知の技術を利用して、体液中で検出され得る。これらの方法では、「放たれた」抗原と反応性を有する抗体が、分泌物サンプル中の抗原の存在を検出するのに使用される〔例えば、ウオチラ（Ｕｏｔｉｌａ）らによる、ｒ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　ＭｅｔｈＱｄＳ。

４２：１１　（１９８１）及びアラム（Ａｌｌｕｍ）らによる上記文献、　ｐｐ、４８−５１を参照のこと〕。それ故、本明細書に開示されたＣ１抗体を使用するこれら測定法は、該ＣＩ抗体が反応するＣＩ抗原の生物学的分泌物中での検出に使用することができ、従って、患者の様々な癌腫の検出に使用することができる。従って、上記のことから、本発明のＣＩ抗体が抗原−抗体反応を包含する殆どの測定法に使用できることが明らかである。これら測定法は、ＥＬＩＳＡ測定法、免疫蛍光測定法、及び他の免疫細胞化学測定法のほか、液相及び固相の両方の標準ＲＩＡ法を含み、これらに限定されるものではない〔例えば、シコラ（Ｓｉｋｏｒａ）ら扁、モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ｐｐ、３２−５２．　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　（１９８４））。

本発明の抗体は、また、ヒトの腫瘍を検出するための生体内診断法への応用にも有用である。そのような取り組みの１つに、検出可能なシグナルを発する適当なイメージング剤で標識化した抗体を使用する腫瘍イメージング技術による生体内での腫瘍の検出法がある。そのような試剤で抗体を標識化するイメージング剤及び操作はよく知られている〔例えば、ウエンセル（Ｗｅｎｓｅｌ）及び化した抗体は、放射性核スキャン法の如き技術によって検出することができる〔例えば、ブラッドウェル（Ｂｒａｄｗｅｌｌ）ら。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ、ブラッドウィン（Ｂｌａｄｗｉｎ）ら纏、　ｐｐ、　６５−８５．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと〕。

本発明のＣＩ抗体を使用して、多くの生体内での治療的応用が可能である。腫瘍細胞を標的にするのに単独で使用してもよいのに加えて、該抗体をヒトの癌を治療する適当な治療剤と結合させて使用してもよい。例えば、該抗体を、治療剤を癌の部位に送達するために治療薬または毒素と結合または連結させて使用してもよい。そのような治療剤を抗体に結合させる技術は、よく知られ−５６，Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、、　（１９８５）　；ヘルストロム（Ｈｅ　ｌ　Ｉｓ　ｔｒｏｍ）ら。

Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　（２ｎｄ　ｅｄ、）、　ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら編、ＰＩ）、６２３−５３．　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、（１９８７）　；　トーぺを参照のこと〕。ＣＩ抗体は、細胞を生体外でそれにさらした場合、簡単に内在化しないので、例えば、直接化学結合または組み換えＤＮＡ技術を使用して抗体を一定の酵素と結合させることによって、化学療法剤を腫瘍細胞に向かわせるのが好ましいかも知れない。そのような結合体か腫瘍に集まると、該酵素は、該結合体が腫瘍細胞と結合したあとに投与されるある不活性（非毒性）プロドラッグを活性な抗癌剤に変化させることができるものであまた、該抗体は、それが腫瘍部位に集まると、幾つかの細胞径（ｃｅｌｌ　ｄｉａｍｅｔｅｒｓ）を殺す高エネルギー放射線源、例えば、１２１１の如き放射性同位元素と結合し得る〔例えば、オーダー（０ｒｄｅｒ）ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ。

ブラッドウィンら編、　ｐｐ、　３０３−１６．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８５）を参照のこと〕。いまひとつの態様に従えば、該ＣＩ抗体に、米国特許出願第４．６７６、９８０号にセーガル（Ｓｅｇａｌ）によって記載された腫瘍細胞の治療のための抗体異質結合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊ−ｕｇａｔｅ　）を形成させるために第２の抗体を結合させてもよい。

本発明のＣＩ抗体についての他の治療への応用としては、補体の存在下であるか、または抗体−薬剤結合体または抗体−毒素結合体の一部としてかのいずれかで、癌患者の骨髄由来の腫瘍細胞を除去する用途がある。このアプローチに従えば、自己由来の骨髄は、患者に戻された該抗体と骨髄による治療によって、半ビポで除去され得る〔例えば、ラムゼイ（Ｒａｍ５ａｙ）ら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　８　（２）：８１−８８　（１９８８）を参照のこと〕。

更にまた、先に説明したように、本発明のキメラなまたは他の組み換えＣＩ抗体は、治療に使用することができる。例えば、抗腫瘍活性を有する第２蛋白、例えば、リンフ才力インまたはオンコスタチン（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）の少なくとも１つの機能的に活性な部分に結合したＣＩ抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合蛋白は、生体内でヒトの腫瘍を治療するのに使用することができる。

更に、Ｃ１の抗原結合領域がヒトＦＣ領域、例えば、ＩｇＧ１と結合しているキメラＣ１抗体を、抗体依存細胞性の細胞障害作用または補体媒介細胞障害作用を促進するのに使用することができる。更にまた、当該技術分野で公知の組み換え技術を、該抗体の結合特異性の１つがＣＩ抗体の結合特異性である二重特異性抗体を構築するのに使用することができる〔例えば、米国特許第４，４７４、８９３号を参照のこと〕。

最後に、ＣＩ抗体の抗イデイオタイプ抗体を、活性腫瘍免疫法及び腫瘍治療法において使用することができる〔例えば、ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）　ら、　Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ａｎｄＡｎｔｉｌ＋ｏｄｉｅｓ　Ｉｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ、上記文献、　ｐｐ、　３５−４１中の「腫瘍治療モノクローナル抗体、腫瘍ワクチン、及び抗イデイオタイプへの免疫学的アプローチ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ＡｐｐｒｏａｃｈｅｓＴｏ　Ｔｕｍｏｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｔｕｍｏｒ　Ｖａｃｃｔｉｎｅｓ。

Ａｎｄ　Ａｎｔｉ（ｄｉｏｔｙｐｅｓ）　Ｊを参照のこと〕。

従って、本発明は、医薬組成物、ヒトの腫瘍の治療のための組み合わせ及びヒトの腫瘍の治療方法を包含する。例えば、本発明は、薬学的に有効量のＣｔ抗体及び薬学的に許容し得るキャリアーを含むヒトの腫瘍を治療するための医薬組成物を包含する。該組成物は、未修飾ＣＩ抗体、治療剤（例えば、薬剤、毒素、酵素または第２の抗体）と結合したＣＩ抗体及び組み換え体（キメラまたは二重特異性ＣＩ）の形でのＣＩ抗体のいずれのＣ１抗体を含んでもよい。該組成物は、更に、癌腫を治療するための他の抗体または結合体（例えば、抗体カクテル）を含んでもよい。

本発明の抗体組成物は、静脈内、腹腔内、経口、リンパ内投与または腫瘍内への直接投与を含む通常の様式を使用して投与することかでき、これらに限定されるものではない。静脈内投与か好ましい。

本発明の抗体組成物は、溶液剤または懸濁剤、錠剤、ビル剤、散剤、坐剤、重合体マイクロカプセル剤またはマイクロ小胞剤、リポソーム剤、及び注射または注入可能な溶液剤を含む様々な服用形態をとり得る。好ましい形態は投与及び治療への応用の様式に依存する。

また、本発明の抗体組成物は、好ましくは、ヒト血清アルブミン；イオン交換体；アルミナ；レシチンニリン酸塩、グリシン、ソルビン酸の如き緩衝物質；及び塩または硫酸プロタミンの如き電解質の如き当該技術分野で公知の通常の薬学的に許容されるキャリアー及びアジュバントも含む。

本発明の組成物の投与及び投薬の最も有効な様式は、疾患の重さ及び経過、患者の健康状態及び治療に対する応答、及び担当医師の判断に依存する。従って、該組成物の投薬量は個々の患者に応じて定められるべきである。さもなければ、本発明の抗体組成物の有効な投薬量は、約１〜約５０００　ｍｇ／ｍ”としてもよい。

抗原Ｃ１として示される本発明の新規な抗原も、治療的応用に使用することができる。該抗原は、腫瘍から精製することも、組み換えＤＮＡ技術によって作ることもできる〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）らによる係属中の米国特許出願第８２７．３１３号：代理人ドケット、１９８６年２月７日に出願された第５６２４−００８号。これらは参照文献として本明細書に含まれる。〕。Ｃ１抗原をコードする遺伝子は、ＣＩ抗原のｍＲＮＡをまず豊富化する方法によってクローン化することかできる。このような方法によって、未完成鎖上のＣ１抗原決定基を認識する抗体とのイムノアフィニティーク口マトグラフィーによって、ポリソーム（ｍＲＮＡリポソームと未完成ポリペプチド鎖からなる）を精製することができる。該ｍＲＮＡは、例えば、Ｃ１抗体でのイムノブレシビテーションによって単離され、そのｃＤＮＡが適当な発現ベクター中でクローン化される。

また、ある発現ベクターを使用してｃＤＮＡライブラリーをふるい分けするのに、ＣＩ抗体またはＣＩ抗原に対する抗血清を使用できるかも知れない。精製またはクローン化されたＣ１抗原は、免疫原として単独で投与しても、適当な免疫学的アジュバントと一緒に投与してもよい。

精製またはクローン化されたＣ１抗原は、本発明の方法において、一定の腫瘍に対して免疫するワクチンとして使用してもよい。

そのようなワクチンの調製操作は、当該技術分野で公知であるローン化された腫瘍附帯抗原、例えば、Ｃ１抗原の発現のために　、構築されるのである。該組み換えウィルスに感染した細胞は、宿主不適合性抗原及び免疫ウィルス性蛋白とともに、該細胞の表面で腫瘍抗原を発現するであろう。このことは、腫瘍拒絶において中心的役割を演する細胞性免疫の誘導に有利である。好適なウィルス、例えば、ライニス（Ｗｙｅｔｈ）痘癒ワクチン〔ニューヨーク市健康株協会（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｃ１ｔｙ　Ｂｏａｒｄ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｔｒａｉｎ）　）のプラーク精製ウィルスから誘導したワクシニアウィルスを、ワクシニアウィルスｒ７．５Ｋ」プロモーター〔ツー（Ｈｕ）らによるムＶｉｒｏ１．．６２：１７６−１８０（１９８８）　）制御下、Ｃ１抗原をコードする配列を含む組み換えウィルスを構築するのに使用する。次いで、その組み換えウィルスを、癌を防ぐワクチンとして静脈内に投与してもよい。

ここに記載した発明がより深く理解されるように、以下の実施例を記載する。これら実施例は説明だけを目的としたものであり、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定するものと解釈されないことが理解されるべきである。

実施例ＩＣＩモノクローナル抗体の調製本発明のモノクローナル抗体を、以前にイエ−らにより上記のＰｒｏｃ、Ｎａｔ ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　（１９７９）に記載された／％イブリドーマ融合技術を使用して調製した。以下の実施例で使用した全てのセルラインは、固形の腫瘍または滲出液のいずれかとして、ヒトから得た腫瘍のサンプルからワシントン州シアトルのオンコジーンで発育させたものである。即ち、Ｈ３Ｏ５９で示されるヒトの結腸腺癌の膜試料を使用して４回、及び結腸癌腫セルライン３３４７由来の細胞を使用して３回、３力月齢Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを免疫した。該膜試料は以下のようにして調製した。腫瘍は腹水滲出液から得た。１０ｍ１の溶解緩衝液（ｌｙｓｉｇ　ｂｕｆｆｅｒ）　（１９，８ｍｌの脱イオン水＋０．１ｍｌの０．２　Ｍ　ＮａＨＣＯ，＋　Ｏ，ｌ　ｍｌの０．２ＭＰＭＳＦ（プロテアーゼ抑制剤）エタノール溶液〕をその細胞に加え、２５〜５０回氷の上で粉砕した。次いで、該混合物を１５ｍ１試験管に移し、０°Ｃ，２０００ＸＧで２分間回転した。上溝を分離し、５ｍｌのセルロース管に移した。細胞溶解を確認するため、ペレットを顕微鏡でチェックした。次いで、上溝を限外遠心分離器で、４°Ｃ，３７０００ＸＧて１５分間遠心分離に付した。次いで、上清を吸引し、ペレットを少なくとも１ｍｌのＰＢＳ中に再分散した。該分散体を５ｍｌの試験管に移し、氷上で１分間音波処理した。ｉ　：　ｉｏｏ希釈液を作り、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の操作〔ブラッドフォード、　Ａｎａｌｙｔｉｃ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７２：２４８−２５４（１９７６））を使用して蛋白濃度を測定した。膜試料（ま、レブコ（Ｒｅｖｃｏ）冷凍装置（−７０°Ｃ）で０．２ｍｌのアリコートとして冷凍保存した。

以下のようにして、マウスに７回注入した。

第１注入、１００μｇ膜試料＋１００μｇムラミルジペプチド（ＭＤＰ）１５０ μｍ＋５０μｍ不完全フロインドアジュバントを４か所に皮下注射し；第２注入：１００μｇの膜試料を４か所に皮下注射し；第３注入：１００μｇの膜試料を腹腔内注射し：第４注入：　ｉｏｏμｇの膜試料を腹腔内注射及び４か所に皮に皮下注射し；第６注入：１０７個の３３４７細胞を腹腔内注射及び４カ１所に皮下注射し；第７注入＝１０６個の３３４７細胞を腹腔内注射及び４カＡ所に皮下注射した。

最終の免疫化から３日後、その膵臓を取り出して膵臓細胞を培地中に分散させた。次いで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヲ使用シテ、該牌ＵＡ細胞ヲＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０．　Ｐ３　Ｘ　６３−　Ａｇ８．６５３細胞ト融合サセ、イエーラニよる上記のＰｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）、に記載されているように、ＨＡＴ選択培地中のマイクロ１ノブターウエル中で成育させた。該混合物を接種して単一の融合細胞またはクローンから発生する低密度培養物を生成させた。

１１ａｒｄ）らのＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　９２：１６８−７４　（１９８３）に記載された分析法と類似のＥＬＩＳＡ分析法を使用して、結腸癌セルライン３３４７の直接結合活性についてふるい分けした。この分析法に従えば、その抗原（ふるい分けされる抗体はこの抗原と反応性である）をマイクロタイタブレート上に固定化し、次いで、ハイブリドーマの上清とインキュベートする。

もし、上溝が目的とする抗体を含有しているなら、その抗体は固定化抗原と結合し、抗免疫グロブリン抗体−酵素結合体及び光学密度で測定可能な変換を起こす該酵素に対する基質との添加によって検出されるであろう。

この例として、９６ウ工ル組織培養プレート（テンプ１ルノジのコースタ−１ＭＡ）中に結腸癌細胞を配分し、加湿３７°Ｃインキュベーター（５％ＣＯ□）内で一夜インキユベートした。次１．ｚで、新しく調製した１００μｍの１．０％グルタルアルデヒドで該細胞を固着して、最終的なウェル濃度を０．５％とし、室温で１５分間インキュベートした後、ＩＸ　ＰＢＳで３回洗浄した。次に、該細胞を、ＰＢＳ中５％ＢＳＡで１時間ブロックし、再びＰＢＳで３回洗浄した。

次いで、ハイブリドーマ培養物からの上溝を１００μｍ／ウェルで加え、該ウェルを室温で１時間インキュベートし、該細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次に、０．１％ＢＳＡ及びＰＢＳで希釈したヤギ抗マウスホースラディツシュペルオキシダーゼ（Ｚｙｍｅｄ、　ＣＡ）を加え、１００μｌ／ウエルの濃度にした。室温で１時間または３７°Ｃで３０分間、該反応混合物をインキュベートし、次いで、該細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を１００μｍ／ウェルで加え、暗所にて室温で５〜４５分間インキュベートした。該細胞に結合した抗体を、ウェル中で１０〜２０分間内に起きた色の変化（こよって検出した。１００μｌ／ウエルのＨ，Ｓｏ、を加えて該反応を停止させ、ダイナチック（アレキサンドリア、ＶＡ）マイクロエリザ・オートリーダーで４９２ｎｍの吸収を読み取った。

次に、カバーグラスに付着し、かつ、フルオレセインで発色した３３４７細胞を使用して、該抗体を蛍光分析法で試験した。殺菌したカバーガラスのついた２４ウ工ル組織培養プレートに、各ウェルに付き１〜２Ｘ１０’個の密度で培養した３３４７細胞を配分し、７５〜９０％の集合体（ｃｏｎｆ　１ｕｅｎｃｙ）に成長させた。細胞を３％バラホルムアルデヒドで５分間を要して固定し、結合緩衝液で洗浄した。結合緩衝液でｌ：２に希釈した２５０μｍの抗体含有上溝液を各ウェルに添加し、室温または３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を３回洗浄した。２５０μｌのＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（バーリンガムのＴＡＧＯｌＣＡ）の最適希釈液を各ウェルに加え、前記のようにインキュベートした。次いで、洗浄工程を繰り返し、カバーグラスを除去して顕微鏡のスライドに載せた。蛍光顕微鏡を使用して発色パターンを読み取った。

ＥＬＩＳＡ及び蛍光分析法の両方で結腸癌腫セルラインについて陽性のウェルから得た上溝を、後記の実施例■で記載したように、３３４７細胞ペレツト、結腸癌腫組織及び正常な腎臓、肝臓、及び膵臓組織について、免疫組織学的技術によって更に試験した。

完全細胞または精製した可溶性抗原または細胞抽出物を、固定化抗原として使用してＥＬＩＳＡ分析法を行うことができるということに留意すべきである。可溶性抗原または細胞抽出物を抗原として使用した場合は、まず最初に、該抗原をＰＢＳ中５０μｌ／ウェルでプレート上に配分し、分析を始める前に該プレートを室温で一夜インキユベートした。完全細胞を抗原として使用する場合は、新鮮なものを使用しても、固定した後に使用してもよい。

いずれの場合においても、まず、細胞を培地中の１００μｌ／ウエルに１０’個の割合で配分し、−夜または３７°Ｃのインキュベーター（５％Ｃｏｄ）内で集合体が成育するまでインキュベートした。

かくして、結腸癌セルラインと結合しかつ正常組織と結合しない抗体を生成したハイブリドーマを選別し、クローン化し、生体外で増大させ、更に抗体特異性を試験した。ヒト結腸癌と反応性を存する抗体を生成したそれらハイブリドーマを、再クローン化し、増大させ、初回感作された（Ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）　３力月齢ＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに注入した。そこで、それらは腹水腫瘍として生育した。

この操作に続いて、ハイブリドーマセルラインを得、クローン化し、腹水腫瘍として生育させるためにマウスに注入した。上記の如く、該ハイブリドーマはＡＴＣＣに寄託している。腹水中に分泌された抗体を、蛋白Ａ−または蛋白Ｇ−セファローズ上で精製するか〔例えば、エイ（Ｅｙ）らのＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１５：４２９−４３６　（１９７８）を参照のこと〕、または、セファクリル（５ｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００でのゲル濾過によって精製した。精製したＣＩ抗体を更に特徴付けるために使用した。

実施例■ ＣＩモノクローナル抗体の特徴付はアイソタイプの確定Ｃｌハイブリドーマによって生成した免疫グロブリンのクラスを決定するために、以下の技術を利用した。

ａ）オクレルロ二−免疫拡散法Ｃ１ハイブリドーマ細胞の上溝のアリコートを、２５％寒天プレートの中央ウェルに配置した。単一特異性ウサギ抗マウスＩｇアイソタイプ抗体（サザン・バイオテクノロジー、バーリンガム、ＡＬ）を外側のウェルに配置し、該プレートを３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。次いで、沈降線を読み取った。

ｂ）ＥＬＩＳＡアイソタイピングダイナチックイムロン９６−ウェルプレートに、ヤギ抗マウスＩｇ抗体をｊμｍ／ｍｌ濃度でＰＢＳ中５０μｌ／ウェルで被覆し、カバーをしたまま４℃で一夜放置した。該プレートをＰＢＳ／ツイーン２０，０．０５％で洗浄した。プレートを洗浄後、ＣＩ　／％イブリドーマの上溝を加え、室温で１時間インキュベートした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ／ツイーン２０で洗浄後、ペルオキシダーゼ（Ｚｙｍｅｄ）と連結した単一特異性ヤギ抗マウスＩｇ− ＨＲＰアイソタイプ抗体と３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、該プレートを０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４，５）中の１ｍｇ／ｍ１ｏ−フェニレンジアミン及び０．０３％Ｈ１０，でインキュベートした。ダイナチックＥＬＩＳＡプレート・リーダー上で、４９０及び６３０ｎｍの光学密度を測定した。

これらの操作に基づき、Ｃ１モノクローナル抗体はＩｇＧ１のアイソタイプであることを決定した。

非イオン性界面活性剤での浸透の前または後に細胞に結合している抗体を測定することによって、抗原の細胞レベル下（５ｕｂｃｅ−１１ｕｌａｒ）の位置を決定した。完全培養細胞の細胞表面に結合している抗体を、ヘルストロムらによるＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４６：３８１７−３９２３　（１９８６）に記載されているように、蛍光励起細胞分離捕集装置（ＦＡＣ３）を使用して直接蛍光によって同定した。即ち、ＦＡＣ３細胞分離捕集装置を使用して結合分析を行うために、ｌ×ＩＯ−の培養細胞をＩＭＤＭ培地〔グランドアイランドのギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　、ＮＹＥ中の１５％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）中に分取して、総容量を試験管当たり５００μｌとした。該細胞をセロフユージ（Ｓｅｒｏｆｕｇｅ）で１．５分間遠心分離し、上溝を分離した。ｌＯμｍ／ｍｌで、かつ、紅藻素で標識されたモノクローナル抗体１００μｌを各試験管に添加し、次いで、その内容物を混合し、氷上で３０分間インキュベートした。セロフユージで１．５分間遠心分離することによって、該反応混合物をｌｏｌの１５％ＦＢＳ／ＩＭＤＭで３回洗浄した　（３回目の洗浄後に各試験管をプロットした）。各ペレットを５００μｍのＰＢＳに再分散した。各サンプルをクールターエビクラス（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｐｉｃｓ）　ＣＦ　Ａ　ＣＳ　ニかけ、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。ＭＦＭから、線形蛍光当量（ｌｉｎｅａｒ　ｆｌｕｏｒｅ−ｓｃｅｎｃｅ　ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　）　（Ｌ　Ｆ　Ｅ）を決定した。陰性コントロールのＬＦＥで割った各試料のＬＦＥから、特異性によって発色した細胞対コントロール抗体の明度の比率（１，０＝蛍光の差なし、ｚＯ＝蛍光が２倍明るい、等々）を得た。

結合データを以下の表１に示した。ＣＩ抗体をＦＩＴＣと結合させる試みがうま（いかないときは、蛍光性結合剤として紅藻素を使用した。

表１種々のセルラインに対するＣＩ抗体の結合セルライン　ＣＩ抗体の結合比率ＲＣＡ結腸癌腫　２．６３３４７結腸癌腫　７６．０２９６４肺癌腫　１４，１２９８１肺癌腫　ＩＺ４３６０６肺癌腫　Ｚ４３４６４乳癌腫　２．８３６２０黒色腫　１．０２６６９黒色Ｂ７．４３６１４黒色腫　３．７末梢血細胞　１８０ＣＥＭ　Ｔ　リンパ球　１．０Ｍｏｌｔ−４７リンパ球　１．０Ｐ３ｙＨＲ−Ｉ　Ｂ　リンパ腫　１．１表１から分かるように、ＣＩモノクローナル抗体は、肺及び結腸癌腫セルラインと反応するが、ＴまたはＢリンパ腫ラインとも正常な末梢血白血球とも反応しない。３つの黒色腫ラインのうち２つについての弱い反応性も観察された。

免疫組織学ガーリジエス（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ）らの［ｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９：５１１−１５（１９８２）により修正された、ｒｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｐｐ、１０４−６９．　ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７９）に記載されたＬ−Ａ、スターンベルが−（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ）のＰＡＰ技術を、凍結した組織切片の免疫組織学的研究に用いた。手術でこれらの試験に使用する組織を得、液体窒素中で予備冷却したイソペンタンを使用して、切除から４時間以内に凍結した。その後、該組織を使用するまで液体窒素中または一７０°Ｃで保存した。凍結切片を調製し、風乾し、アセトンで処理し、再乾燥した（ガーリジエスらの上記文献を参照のこと）。組織学的評価に使用する切片をヘマトキシリンで発色した。非特異性バックグランドを減少させるため、ＰＢＳで１１５に希釈した正常ヒト血清で該切片を予備インキュベートした（ガーリジエスらの上記文献を参照のこと）。１０％正常ヒト血清及び３％ウサギ血清の溶液で、マウス抗体、ウサギ抗マウスＩｇＧ１及びマウスＰＡＰを希釈した。ウサギ抗マウスｒｇＧｃジャレッツビル（Ｊａｒ−ｅｔｔｓｖｉｌｌｅ）のスターンベルガーーメイヤー免疫化学会社、ＭＤ）は１１５０希釈で使用した。特別に精製したＰ　Ａ　Ｐ　２　ｍｇ／ｍｌを含有するマウスペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体（ＰＡＰ、スターンベルガーーメイヤー免疫化学会社）は】／８０希釈で使用した。

発色操作は、例えば、ＣＩ抗体の如き特異的抗体またはコントロール抗体のいずれかでひと続きの切片（ｓｅｒｉａｌ　５ｅｃＨｏｎｓ）を２．５時間処理し、該切片を１１５０に希釈したウサギ抗マウスＴｇＧと室温で３０分間インキュベートし、次いで、該切片をｌ／８０に希釈したマウスＰＡＰ複合体に室温で３０分間曝すことにより行った。抗体で各々の処理を行ったあと、そのスライドをＰＢＳ中で２回洗浄した。

免疫組織化学的反応は、新たに調製した０、　０５　Ｍ　）　ＩＪス緩衝液（ｐＨ７，６）中の０．５％３，３°−ジアミノベンジジン・４塩酸塩（セントルイスのシグマ化学会社、ＭＯ）及び０．０１％Ｈ２０ｚを水中の１％Ｑ　ｓ　Ｏａに２０分間曝すことによって、発色を強くした。該切片を水で濯ぎ、アルコール中で脱水し、キシレン中でクリヤにし、そして、スライド上に載せた。他の切片もヘマトキシリンで発色した。

該スライドを暗号を付してそれぞれ評価し、暗号化したサンプルを別々の観察者がチェックした。典型的なスライドは、微分干渉コントラストオブチクラス〔ゼイスーノマルスキー（Ｚｅｉｓｓ−Ｎｏｍａｒｓｋｉ）　）を使用して写真に撮った。抗体発色の程度は、０（非反応性）、＋（若干陽性の細胞が僅かにある）　、＋＋　（少なくとも１／３の細胞が陽性）　、＋＋＋　（殆どの細胞が陽性）、＋＋＋＋　（全ての細胞が強く陽性）として評価した。十と０の発色間の差は、十と士十の発色間の差よりも明確ではないので、＋＋またはそれより高い程度の発色が、「陽性Ｊと考えられる。

新生細胞及びストロマ細胞の両方が、腫瘍サンプル中に観察された。ストロマ細胞は全くかまたは腫瘍細胞よりも極めて弱い程度しか発色しないので、記録された発色は腫瘍細胞のものである。

以下の表２は、モノクローナル抗体を使用した、種々の腫瘍及び正常組織検体の免疫組織学的発色を表したものである。表から明らかなように、ＣＩ抗体はヒト結腸癌腫及び肺癌腫と反応するが、乳癌腫または黒色腫由来の細胞とは反応せず、試験した卵巣癌腫サンプルだけが陽性であった。ＣＩ抗体は、試験したいかなる正常ヒト組織とも反応性を示さなかった。

表２Ｃ１モノクローナル抗体での腫瘍及び正常組織検体の免疫ペルオキシダーゼ発色組織のタイプ　抗体の結合（陽性腫瘍数／試験腫瘍総数）結腸癌腫　９／９肺癌腫　１２／１７乳癌腫　０／１４卵巣癌腫　１／１黒色腫　０／６肉腫　１１５正常組織：牌［ｉｌ　０／４腎臓　０１５肝臓　０／３心ＩＩ　Ｏ／２卵巣　０／１副腎　０／２１丸　０／２乳房　０／２扁桃腺　０／１皮膚　０１５肺　０１５結腸　０／７脳　０／２表　２　つづき組織のタイプ　抗体の結合（陽性腫瘍数／試験腫瘍総数）甲状腺　０／２リンパ節　０／３網膜　０／１膵臓　０／２実施例■ Ｃ１抗体によって認識されるＣＩ抗原の精製結腸癌腫３３４７細胞、及び肺癌腫２９６４細胞からＣＩ抗原を単離し、イムノアフイニテイクロマトグラフイーで部分的に精製した。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによって精製して均−性にし、５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲルから、膜上への電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｉｕｔｉｏｎ　）または電気プロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）　ｌこよって回収した。

電気泳動のあと、クーマシー・ブリリアント・ブル−で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを発色させ、次し１で、余分な発色剤を取り除いた。発色したＣＩ抗原ノくンド（Ｍｒ＝６．　６０００）をカミソリの刃で切り取り、電気溶出に付した。

によって記載されているように、ミニ−トランスプロット・エレクトロフォレチック・トランスファー・セル（Ｍｉｎｉ−ＴｒａｎｓｂｌｏｔＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｃｅ１ｌ　）　（／＜イオラ・ソド（Ｂｉｏｒａｄ）研究所、リッチモンド、ＣＡ）を使用して、イモピロン膜（Ｉｍｍｏｂ−ｉｌｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）　（ベッドフォードのミリボア（Ｍｉ　１ｌｉｐｏｒｅ）社、ＭＡ）上へ電気プロットすることによっても、ＳＤＳ〜ポリアクリルアミドゲルから、ＣＩ抗原を回収した。酸膜をクーマシー・ブリリアント・ブルーで発色し、余分な発色剤を取り除き、そして、次のアミノ末端配列分析のために、発色したＣＩ抗原バンド（Ｍｒ＝６６．０００）をカミソリの刃で切り取った。

配列分析３３ｐ［１１０１の３３４７細胞由来の抗原、４９ｐｍｏｌの２９６４細胞由来の抗原、及び６　ｐｍｏｌの２９６４細胞由来の抗原と共に、Ｃｔ抗原の３つの処理品について自動エドマン分解を行った。

ＣＩ抗原のアミノ末端配列は次の通りであった。

Ｘ−Ｅ−Ｌ−Ｔ−１−Ｌ−Ｈ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｖ−Ｈ−Ｓ−Ｒ−Ｌ−１１！−Ｑ− Ｔ−Ｓ−Ｘ該ＣＩ抗原のアミノ末端配列を以下のデータベースと比較した。

配列の数１、Ｐ［Ｒ（リリース１８．０．　１９８８年９月）　８．５８８２、ＧｅｎＢＡＮＫ　（リリース５７．０．　１９８８年９月）　１９．０４４３、ＮＥＷ　（１９８８年１１月３０日）　４．１４８４、Ｄ［Ｆ　（１９８８年１１月３０日）　’　２．６１０５、　５ＷｒＳＳＰＲＯＴ　（１９８８年１１月３０日）　７．７２４６、ＬＯＳＰＲＰ　（１９８８年１１月３０日）　１１．３４３この配列の比較では、いかなる他の公知の配列とも有意な一致を示さない。

免疫学的特徴付はウェスタン・プロット分析トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）らによりＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）。

７６：４３５０−４３５４　（１９８８）に記載されているように、イムノアフィニチイ精製ＣＩ抗原を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０％アクリルアミド）に付し、ニトロセルロース膜〔キーン（Ｋｅｅｎｅ）のシュライバー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）　・アンド・シュエル（Ｓｃｈｅｌｌ）　、ＮＨ）上に電気ブトットした。第２抗体としてのアルカリフォスファターゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（ライルのＩＣＮバイオメディカルズ、ＩＬ）及び色素体としての５−ブロモ−４− クロロ−３−インドリルホスフェート・ｐ−トルイジン塩とｐ−ニトロブルーテトラゾリウム・クロライド〔バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）研究所〕を使用して、ＣＩ抗原を免疫検出した。免疫検出（Ｌｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）は、Ｍｒ＝６’６．０００での主要なバンドがＣＩ抗体で特異的に発色することを示した。

放射線免疫沈澱（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）１０％の透析した胎児ウシ血清を追加したＲＰＭ１１６４０培地（グルコース不含有ＲＰＭＩ　１６４０）中で、３７℃で４時間インキュベートすることにより、３３４７細胞を３Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識化した。２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７，５，１００ｍＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、ＰＭＳＦ　（］　Ｏｕ　１／ｍｌ）アプロチニン（１０ｔｔ　１／ｍｌ）で該細胞ペレットを抽出した。ＣＩ抗体で４°Ｃで１時間細胞溶解産物をインキュベートするこによって、Ｃ１抗原を免疫沈澱した。該抗原−抗体複合体をヤギ抗マウスＩｇＧ及びパンソルビン〔カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　、サンディエゴ、ＣＡ）で沈澱させた。還元条件下及び非還元条件下で、洗浄した免疫沈澱物をＳＤＳ　−ＰＡＧＥによって分析し、ＥＮ’ＨＡＮＣＥ”を該ゲルにしみこませた後、蛍光間接撮影で目に見えるようにした。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１３４：２４２−２６４　（１９７１）でビテッタ（Ｖｉｔｅｔｔａ）らが記載しているラクトペルオキシダーゼ法によって、全て肺の腺癌から誘導された２９６４細胞、２７０７細胞、ＣＨ，Ｔ２細胞、及び２９８１細胞を１２５１で表面標識化した。ＣＩ抗原は、ＣＩ抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ及びパンソルビンで１１８　Ｉ−標識化細胞溶解産物から免疫沈澱した。還元条件下で、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによって該免疫沈澱物を分析し、オートラジオグラフィーで目に見えるようにした。

ＣＩ抗体は約６６．０００〜６８，０００のＭｒでＣＩ抗原を特異的に沈澱させた。これらのデータは、ＣＩモノクローナル抗体によって認識される抗原決定基が、約６６．０００のＭｒで独特の一本鎖糖蛋白上に位置していることを示している。該ＣＩ抗原は、様々な腫瘍細胞、特に肺癌腫瘍及び結腸癌腫瘍に附帯しているのである。

先に記載したように、本発明の精神及び範囲から逸脱することなしに、本発明について多くの修飾及び変更を加えることが可能である。ここに記載した具体的な態様は実施例として与えただけで、本発明は、請求の範囲の文言によってのみ限定されるものである。

国際調査報告１１．＋、、□＋　Ａｓ４−Ｎ−、ＰＣｒ１０５９０１０１６２１ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１６２１ＰＣＴ１０５９０１０１６２１ＡＴＴＡＣ’ＨＩＫＥＮＴ　Ｔ’ＯＦＯＲＮ　ＰＣＴ／工ＳＡ／２１０．　Ｐａｒｔ　工ＬＸＸ、ＦＩＥＬＤＳ　５ＥＡＲＣＨ／５ＥＡＲＣＨＴＫＲＭＳ：（ＪＳＢ工ｏｓｘｓＰＳ工ｎｖｅｎｔｏｒ　Ｎａｍｅ　ＳｅａｒｃｈＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　（ｕ）ａｎｔｉｂｏｄ？Ｌｕｎｇ　（Ｌ）　ｏｒ　（Ｐ）　（ｃｏｌｏｒ　ｏｒ　ｃｏｌｏｒ　＠ｔ　＠１．）（Ｃａｎｃｅｒ？　ｏｒ　Ｃａｒｃｉｎｏｉａ？　ｏｒ　Ｔｕｍｏｒ？）６６？　Ｏｒ　６６　ＩＩＩ　Ｏｒ　６６１１１ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１６２１ＡＴＴＡＣＨＭＩＥＮＴ　Ｔｏ　ＦＯＲＮ　ＰＣＴ／工Ｓ入／２１０．　Ｐａｒｔ　ｖ工。

ｘ、Ｃｌａｉｍｓ　１−６．＋１−１５，１７−２３　ａｎｄ　２フー３１　ａｔＩ　ｄｒａ％ｍ　ｔｏ　ａ　ｆｉｒｓｔｐｒｏｄｕｃｔ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈａｔ　ｂｉｎｄｓ　ｔｏ　ａｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　５ｉｔｅ　ｏｎ　ａ　ｃａｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｔｆｇａｎ　ａｎｄａ　ｈｙｂｒｉｄｃｙｍａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　ａｎｄ　ｔｏ　ａ　ｆｉｒｓｔ　ｐｒｏｃｅｓｓｓ　ｖＭｃｈ　ｉｓ　ａｎｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈ＠ｄ＠ｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍ＋ｏｒｇ、ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎｃｌａｓｕｓｅｇ　４３５．　４３６　ａｎｄ　５コ０゜エエ、　Ｃｌａｉｍｓ　７　ａｎｄ　１６　ａｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｇａｃｏｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ａｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒｓ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓ　ｓｉ４゜Ｉ工１．　Ｃｌａｉｍ　２４　ｉｓ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　５ｅｃｏｎｄ　ｐｒｏｃａｇｓｓ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ａ　ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ　ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒｓ　ｐＬムｔｇ、ｃｌａｓｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓ　４２４゜ＩＶ、　ＣｌａｉｍＩｓ　２５　ａｎｄ　２６　ａｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｔｈｉｒｄ　ｐｒｏｃｅｇｓ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ａｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｔｈ＠ｒａｐｙ　ｆｏｒ　セｈａ　ｔｒｅａセｗｅｎｔ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒｓ。

ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓ　４２４゜Ｖ、　Ｃｌａｉｍ　コ２　ｉｓ　ｄｒａｖｎ　ｔｏ　ａ　ｔｈｉｒｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ａｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎ七ｉｇａｎ　ｉｎ　５ｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｆｏｒｍ。

ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓ　５３ｏ。

Ｖｌ、　Ｃｌａｉｍｓ　３３　ａｎｄ　３４　ａｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｆｏｕｒｔｈ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓａ　ｖａｃｃｉｎ＠、ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓ　４２４゜Ｖｌ工、Ｃｌａｉｍ３５　ｉｓ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｔｏｕｒｔｈｐｒｏｃａｓｓ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ａ　ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ　ｉＤｕｎｌｚｌｎｇ　ａｇａｉｒ＋ｓｓｔ　ｔｕｍｏｒｓ、ｅｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓａｓ　４２４　ａｎｄ９３５゜ＰＣＴ／ＵＳ９０７０１６２１０　・ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｒｏｄｕｃｔ；　（：ｒｏｕｐ　Ｘエエ　ｉｇ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ａ　５ｅｃｏｎｄｐｒｏｃ＠ｇｓ　ｏｆ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈ＠ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ工；　Ｇｒｏｕｐ　Ｖ　ｉｓ　ｄｉｒｅｃｔｅｄｔｏ　ａ　ｔｈｉｒｄ　５ａｐａｒａｔａ　ａｎｄ　ｄｌｓｔｉｎｅｔ　ｐｒｏｄｕｃｔ；　Ｇｒｏｕｐ　ＶＴ　ｉｓｓ　ｄｉｒｅｃｔｅｄａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎ　ｉｓ　ｕｎｄｕ＠、　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　１ｎｓｓｏｆａｒ　ａｔＩ　ｔｈｅａｄｉｔｉｏｎａｌ　、ｐａｒａｎｔ　ｇａａｒｃｈ　ｉｒＫ！１ｃａｔａｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｇ、ｂｕｔ　ａｌｓｏ　１ｎｓｏｆａｒ　ａｓ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ　５ｅａｒｃｈｅｓ　ｃｏｖｓｒｉｎｇ　ｔｈ＠　ｅｎｔｉｒｅ　ｃｌａｓｓｅｓ　ｎｏｔｅｄ　ａｂｏｖｅ。

Claims

【特許請求の範囲】

１．ハイプリドーマセルラインＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９８０３によって産生するモノクローナル抗体であって、ヒト腫瘍細胞の細胞表面糖蛋白抗原上の決定基に結合する抗体、及び前記抗体の機能的等価物、結合フラグメント及び免疫複合体。
２．前記腫瘍細胞が、癌腫細胞である請求項１記載のモノクローナル抗体。
３．前記癌腫細胞が、肺及び結腸の癌腫細胞からなる群から選ばれたものである請求項２記載のモノクローナル抗体。
４．検出可能なシグナルを生ずることのできる標識と結合した請求項１記載のモノクローナル抗体。
５．標識が、放射性核種、酵素、蛍光剤及び発色基からなる群から選ばれたものである請求項４記載のモノクローナル抗体。
６．ハイプリドーマセルラインＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９８０３によって産生するモノクローナル抗体であって、ヒト腫瘍細胞の細胞表面糖蛋白抗原上の細胞決定基に結合し、前記抗原がポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したときに分子量が約６６，０００ダルトンであり、かつ、以下のアミノ末端アミノ酸配列を有することによって特徴付けられる抗原である抗体、及び前記抗体の機能的等価物、結合フラグメント及び免疫複合体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘは未確認アミノ酸を表す）
７．治療学的に有効量の請求項６の抗体を薬学的に許容し得る非経口賦形剤と共に含む腫瘍治療用組成物。
８．ミエローマ細胞と、ヒト腫瘍細胞の細胞表面糖蛋白抗原上の決定基と結合する抗体を産生することのできる細胞との融合によって生成したハイプリドーマセルラインによって産生するモノクローナル抗体であって、前記抗原がポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したときに約６６，０００ダルトンの分子量を有し、かつ、以下のアミノ末端アミノ酸配列を有する抗原であるモノクローナル抗体、及び前記抗体の機能的等価物、結合フラグメント及び免疫複合体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘは未確認アミノ酸を表す）
９．クラスＩｇＧに属する請求項８記載のモノクローナル抗体。
１０．サプクラスＩｇＧｌに属する請求項８記載のモノクローナル抗体。
１１．マウスの抗体である請求項８記載のモノクローナル抗体。
１２．ヒト腫瘍細胞に附帯した細胞表面糖蛋白抗原上の決定基と反応性を有するモノクローナル抗体であって、前記抗原がポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したときに分子量が約６６，０００ダルトンであり、かつ、以下のアミノ末端アミノ酸配列を有することによって特徴付けられる抗原である抗体、及び前記抗体の機能的等価物、結合フラグメント及び免疫複合体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘは未確認アミノ酸を表す）
１３．ハイプリドーマセルラインＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９８０３によって産生するモノクローナル抗体からなる請求項１２記載のモノクローナル抗体。
１４．ヒトの抗体である請求項１２記載のモノクローナル抗体。
１５．マウス−ヒト抗体である請求項１２記載のモノクローナル抗体。
１６．薬学的に許容し得る非経口賦形剤と共に治療学的に有効量の請求項１２記載の抗体を含む腫瘍治療用組成物。
１７．ヒトの腫瘍を検出するための免疫学的検定法であって、ａ）ヒト腫瘍細胞に附帯した細胞表面糖蛋白抗原と反応性を有するモノクローナル抗体を、腫瘍細胞のサンプルと混合すること、ここで、前記抗原はポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したときに分子量が約６６，０００ダルトンであり、かつ、以下のアミノ末端アミノ酸配列を有することによって特徴付けられる抗原であり、また、前記抗体は検出を可能にするために標識されている ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘは未確認アミノ酸を表す）；及びｂ）前記抗原が附帯した腫瘍細胞に結合した前記標識されたモノクローナル抗体を測定すること、を含む方法。
１８．前記モノクローナル抗体が、ハイプリドーマセルラインＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９８０３によって産生する抗体である請求項１７記載の免疫学的検定法。
１９．前記抗体が、放射性核種、酵素、蛍光剤及び発色基からなる群から選ばれた標識で標識化されている請求項１７記載の免疫学的検定法。
２０．腫瘍を検出する方法であって、請求項１、６、８または１２記載のモノクローナル抗体をヒト組織または分泌物サンプルと接触させ、次いで、前記抗体と前記サンプル中の全ての抗原的に相当する腫瘍細胞またはその抗原決定基との相互作用を検出する方法。
２１．前記腫瘍細胞が肺癌腫細胞であり、ヒト組織が肺組織である請求項２０記載の方法。
２２．前記腫瘍細胞が結腸癌腫細胞であり、ヒト組織が結腸組織である請求項２０記載の方法。
２３．前記モノクローナル抗体と前記腫瘍細胞との相互作用が、免疫組織学的発色法によって検出される請求項２０記載の方法。
２４．生体内においてヒトの腫瘍を位置確認する方法であって、ａ）請求項１、６、８または１２のモノクローナル抗体を精製すること：ｂ）前記抗体を放射線標識化すること；ｃ）適当なキャリアーでヒトの患者に前記抗体を投与すること；及びｄ）該モノクローナル抗体を、外部シンチグラフィー、Ｘ線断層撮影法または放射性核スキャン法によって位置確認すること、を含む方法。
２５．腫瘍の治療のための免疫療法であって、ａ）請求項１、６、８または１２のモノクローナル抗体を精製すること；ｂ）前記モノクローナル抗体を細胞毒、毒素、または放射性薬品と結合させること；及びｃ）適当なキャリアーでヒトの腫瘍患者に前記結合モノクローナル抗体を投与すること、を含む方法。
２６．前記モノクローナル抗体が、抗−イディオタイプ抗体である請求項２５記載の方法。
２７．モノクローナル抗体を産生する連続セルラインであって、前記モノクローナル抗体が、ヒト癌腫細胞の細胞表面糖蛋白抗原上の決定基と結合する能力によって特徴付けられるモノクローナル抗体であり、癌腫細胞またはその免疫原決定基で免疫されたマウス及びマウスミエローマ細胞から誘導されたリンパ球のハイプリドーマを含む連続セルライン。
２８．モノクローナル抗体を産生する連続セルラインであって、前記モノクローナル抗体が、ヒト癌腫細胞の細胞表面糖蛋白抗原上の決定基と結合する能力によって特徴付けられるモノクローナル抗体であり、癌腫細胞を有するヒト及びミエローマ細胞から誘導されたリンパ球のハイプリドーマを含む連続セルライン。
２９．ヒト癌腫細胞の細胞表面糖蛋白抗原上の決定基と結合することのできる、ハイプリドーマセルラインＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９８０３モノクローナル抗体。
３０．ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウスミエローマ細胞に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したときに約６６，０００ダルトンの分子量を有しかつ以下のアミノ末端アミノ酸配列を有するヒト腫瘍細胞の細胞表面糖蛋白抗原に結合するモノクローナル抗体を産生する結腸腺癌腫Ｈ３０５９細胞で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスから得られたマウス脾臓細胞を、融合させることによって生成したハイプリドーマセルラインＡＴＣＣＮｏ，ＨＢ９８０３。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘは未確認アミノ酸を表す）
３１．腫瘍細胞に附帯した細胞表面糖蛋白抗原上の決定基と結合する能力によって特徴付けられるモノクローナル抗体を産生する連続セルラインであって、前記抗原が約６６，０００ダルトンの分子量を有し、かつ、以下のアミノ末端アミノ酸配列を有する抗原であり、前記抗原に対する抗体を産生することのできるリンパ球のハイプリドーマ及びミエローマ細胞を含む連続セルライン。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘは未確認アミノ酸を表す）
３２．実質的に精製された形の糖蛋白抗原であって、前記抗原がヒト腫瘍細胞から誘導された抗原であり、かつ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したときに約６６，０００ダルトンの分子量を有し、かつ、以下のアミノ末端アミノ酸配列を有する抗原及びこの抗原の免疫複合体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｘは未確認アミノ酸を表す）
３３．請求項３２記載の抗原をコードするＤＮＡを含有する組み換えウィルスを含む、腫瘍に対する免疫化に使用するワクチン。
３４．前記ウィルスがワクシニアウイルスである請求項３３記載のワクチン。
３５．請求項３３記載のワクチンを治療学的に有効量で投与することを含む腫瘍に対して免疫化する方法。