JP2018538551A - 癌幹細胞を単離する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する方法、研究目的の結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する方法並びに結腸直腸癌の治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度のインビトロ診断法を行うための、第１の標識手段としての、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、任意付加的な、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段、特にＴ抗原を認識するレクチンとの使用、及びフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンとＴ抗原を認識するレクチンとを含むキットとに関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌幹細胞の単離の分野に関する。
結腸直腸癌(ＣＲＣ)は、世界で３番目に頻度の高い疾患である。他の癌と同様に、それは、腫瘍塊の出現を引き起こす、健常組織(この場合は結腸粘膜)における異常な細胞増殖として要約することができる。腫瘍の発生、耐性機序及び再発を説明するために提唱される理論の１つは癌幹細胞の存在にある。放射線療法及び化学療法による治療からの腫瘍の治療エスケープは、腫瘍内でのこの細胞の存在に依存する。結果として、腫瘍組織内におけるこの細胞の検出が、腫瘍の悪性度レベルを定義する手段を構成する。したがって、癌幹細胞の特異的バイオマーカーの特徴付けは、癌の治療において診断的及び予後的に非常に重要である。しかしながら、他の腫瘍細胞から確実に癌幹細胞(ＣＳＣ)を区別することができる特異的マーカーは、現在のところ存在しない。
数が少ないこと、及び特異的マーカーが存在しないことから、ＣＳＣを研究する上での大きな困難は、それらの単離及びそれらの特徴付けにある。グリコシル化タンパク質の修飾は、しばしば腫瘍進行と関連しており、よって、表面マーカーの探索において非常に価値があると考えられる。
したがって、結腸直腸癌幹細胞を検出及び/又は単離する方法の必要性が存在する。
本発明は、この必要性を満たす。
本発明は、結腸直腸癌幹細胞の表面上に発現するフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを使用すると、この単位によってそれらの細胞の検出及び任意付加的に単離が可能になるという本発明者による実証に基づいている。
抗ＣＤ１３３抗体(Ｔ−ＡＣ１３３)がグラフトされた磁気ビーズ；グリコシル化マーカーＣＤ１３３(プロミニン−１)を利用するＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから市販されているキット(ＣＤ１３３ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ)；ストレプトアビジン及びビオチン化ＵＥＡ−１(レクチンＵＥＡ−１)がグラフトされた磁気ビーズ；ＵＥＡ−１/ジャカリン/ＡＢＡ混合物(混合物１)；及び、ＵＥＡ−１/ジャカリン/ＡＣＡ混合物(混合物２)を用いた、ＨＴ２９細胞株の試料に関する癌幹細胞の分離の結果を示す。 ＵＥＡ−１単独、２つのレクチン、又は等モル比の３つのレクチンＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡ混合物(混合物２)、又は６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＣＡ混合物を用いて細胞選別した後のＥｐｃａｍ Ｈｉｇｈ＋/Ｅｐｃａｍ ｈｉｇｈ−の比を示す。 ＵＥＡ−１/ジャカリン/ＡＢＡ混合物(混合物１Ｓ)及びＵＥＡ−１/ジャカリン/ＡＣＡ混合物(混合物２Ｓ)と共に磁気ビーズを用いた、種々の結腸直腸癌細胞株に関する細胞選別の結果を示す。 Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＡＣ１３３キット(Ｔ−ＡＣ１３３)、ＵＥＡ−１/ジャカリン/ＡＢＡ混合物(混合物１)又はＵＥＡ−１/ジャカリン/ＡＣＡ混合物(混合物２)を用いて選別した細胞の、非選別細胞(Ｔ−)を基準としたクローン原性の試験結果を示す。Ｙ軸はピクセルで表される2。 ヌードマウスにおけるインビボでの、非選別細胞(Ｔ−、菱形)、ＵＥＡ−１/ジャカリン/ＡＣＡを用いて単離した細胞(四角)及び選別後の「陰性」画分の細胞(癌非幹細胞、三角)のグラフト後の腫瘍増殖の結果を示す。結果は、時間(日数)に対する体積(Ｙ軸)で表される。
第１の態様において、本発明は、結腸直腸癌幹細胞の検出及び任意付加的に単離のための標識手段としてのレクチンの使用に関する。
第２の態様において、本発明は、レクチンを用いた結腸直腸癌幹細胞の標識を含む、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する方法に関する。有利には、本発明は、レクチンと、結腸直腸癌幹細胞を標識する少なくとも１つの第２の手段、特にＴ抗原を認識する少なくとも１つの第２のレクチン、特にＴ抗原を認識する２つのレクチンとの使用に関する。
第３の態様において、本発明は、レクチンと、結腸直腸癌細胞を検出及び任意付加的に単離する第２の手段とを含むキットに関する。
第４の態様において、本発明は、結腸直腸癌細胞の検出ステップ及び任意付加的の単離ステップを含む、結腸直腸癌の治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の悪性度及び/又は再発リスクを診断する方法に関する。
本発明の第１の態様は、結腸直腸癌幹細胞の検出及び任意付加的に単離の方法を行うための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵｌｅｘ Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ凝集素１(ＵＥＡ−１)又はＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ Ｊａｐｏｎｉｃａ凝集素ＩＩ(ＴＪＡ−ＩＩ)の、第１の標識手段としての使用に関する。
本発明は、特に結腸直腸生体試料中で、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するインビトロ法を行うための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵｌｅｘ Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ凝集素１(ＵＥＡ−１)又はＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ Ｊａｐｏｎｉｃａ凝集素ＩＩ(ＴＪＡ−ＩＩ)の、第１の標識手段としての使用に関する。
本発明はまた、特に腫瘍の動物モデル又はヒトモデルに対して、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するインビボ法を行うための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵｌｅｘ Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ凝集素１(ＵＥＡ−１)又はＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ Ｊａｐｏｎｉｃａ凝集素ＩＩ(ＴＪＡ−ＩＩ)の、第１の標識手段としての使用に関する。
本発明に関して、「結腸直腸癌幹細胞を標識する手段」は、結腸直腸癌幹細胞の表面上に発現するマーカーに特異的に結合することができる物質であると理解されたい。標識手段は、具体的には、糖タンパク質、タンパク質又はグリカン等の抗原決定基に対する抗体であってもよい。
結腸直腸生体試料は、具体的には、結腸直腸癌に罹患した患者から採取した腫瘍生検、又はそのような癌を有する疑いのある患者から採取した生検であってもよい。
腫瘍生体試料は同様に、癌細胞株の注射によって動物、例えばマウス又はラットに誘導される結腸直腸癌細胞株又は腫瘍であってもよい。細胞株は、好ましくは結腸直腸癌細胞株である。この実施形態によれば、誘導された腫瘍は、結腸直腸癌幹細胞を含有し、有利には、結腸直腸癌幹細胞は、調査のために腫瘍の他の細胞から単離されている。
本発明に関して、「検出」は、結腸直腸組織内の結腸直腸癌幹細胞の存在を分光学的方法によって同定する行為であると理解されたい。
本発明に関して、「単離」は、結腸直腸腫瘍から、結腸直腸癌幹細胞が富化された細胞集団を得る行為であると理解されたい。本発明に関して、「富化」という用語は、癌幹細胞数/総細胞数の比が、フローサイトメトリーによるＥｐｃａｍ ｈｉｇｈ＋細胞/Ｅｐｃａｍ ｈｉｇｈ−細胞の比によって予め決定されるように、少なくとも４、有利には少なくとも６、好ましくは少なくとも８、特に好ましくは少なくとも９である細胞集団を示す。
現在、結腸直腸癌幹細胞の単離のための基準製品は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから市販されている抗ＣＤ１３３抗体がグラフトされた磁気ビーズからなる。本発明の発明者は、結腸直腸癌幹細胞を単離するためには、このシステムよりもフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンがより効果的であることを実証した。
また、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段とを組み合わせることによって、細胞を特に効果的に富化することができることも本発明者によって実証された。
本発明は、したがって、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段との使用にも関する。
本発明に関して、「結腸直腸癌幹細胞を標識する手段」は、結腸直腸癌幹細胞の表面上に発現するマーカーに特異的に結合することができる物質である。それは、具体的には抗体であってもよい。
結腸直腸癌幹細胞のマーカーの例として、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ１６６(ＡＬＣＡＭ)、ＣＤ２４、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＥｐＣＡＭ、Ｏｃｔ−４及びＳｏｘ−２を挙げることができる。
結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段は、好ましくは、Ｔ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物である。
有利な様式において、Ｔ抗原を認識する前記レクチンは、Ａｇａｒｉｃｕｓ Ｂｉｓｐｏｒｕｓ凝集素(ＡＢＡ)、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ Ｃａｕｄａｔｕｓ 凝集素(ＡＣＡ)及びジャカリンからなる群から選択される。
また、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段は、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物、特には、ＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群から選択されるＴ抗原を認識するレクチンの混合物、有利にはジャカリンとＡＣＡの混合物であってもよい。
一実施形態において、本発明は、ＵＥＡ−１とＡＢＡの混合物、ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡの混合物、ＵＥＡ−１とＡＣＡの混合物、ＴＪＡ−ＩＩとＡＣＡの混合物、ＵＥＡ−１とジャカリンの混合物及びＴＪＡ−ＩＩとジャカリンの混合物からなる群から選択される２つのレクチンの混合物の使用に関する。
別の実施形態において、本発明は、結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する方法を行うための、ＵＥＡ−１とＡＢＡとＡＣＡ；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとＡＣＡ；ＵＥＡ−１とＡＢＡとジャカリン；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとジャカリン；ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡ；ＴＪＡ−ＩＩとジャカリンとＡＣＡからなる群(有利にはＵＥＡ−１とＡＢＡとジャカリン；及びＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡ)から選択される３つのレクチンの混合物(好ましくはＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物)の使用に関する。
有利には、３つのレクチンの混合物は、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比のフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡからなる。
特定の実施形態において、レクチンは、有利には６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、好ましくは６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡとである。
結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するために、レクチンを、前記細胞を検出及び任意付加的に単離する手段に直接的又は間接的に結合させる。
本発明に関して、「検出及び任意付加的に単離する手段」は、結腸直腸癌幹細胞に結合した標識手段の同定を可能にする物質又は物質の群であると理解されたい。前記検出手段は、例えば、フルオロフォア、発色団又は磁気ビーズである。結腸直腸癌幹細胞を単離することが望まれる場合、好ましくはフルオロフォア又は磁気ビーズが使用される。
前記検出及び任意付加的に単離する手段は、レクチンに直接的又は間接的に結合させてもよい。
本発明に関して、「直接的に結合した」は、検出及び任意付加的に単離する手段が標識手段に共有結合していることを意味するものと理解されたい。
本発明に関して、「間接的に結合した」は、検出手段が第２の物質に結合しており、第２の物質が標識手段を特異的に認識し該標識手段と十分に強い結合を形成して、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離することができることを意味するものと理解されたい。検出及び任意付加的に単離する手段は、具体的にはストレプトアビジン/ビオチン系であってもよい。
一実施形態において、検出及び任意付加的に単離する手段は、レクチンに共有結合したビオチン、及びストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズからなる。
本発明は、したがって、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する方法を行うための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンと、Ｔ抗原を認識する第１のビオチン化レクチンと、Ｔ抗原を認識する第２のビオチン化レクチンと、ストレプトアビジンがグラフトされた磁気ビーズとの使用に関する。有利には、前記レクチンは、好ましくは６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０の様々な比の、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０の比のＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡ又はＡＣＡとである。
別の実施形態において、検出及び任意付加的に単離する手段はフルオロフォアである。フルオロフォアは、レクチンに共有結合させることができるか、又はストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わせることができ、この場合、レクチンはビオチン化されている。
フルオロフォアは、フローサイトメトリーに使用することができる任意のフルオロフォアであり得る。そのようなフルオロフォアは市販されている。それらは、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８ｒ、７００、７５０又は７９０、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、ローダミン、アロフィコシアニン(ＡＰＣ)及びフィコエリトリン(ＰＥ)である。フルオロフォアは、有利には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３である。
したがって、本発明は、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する方法を行うための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンと、Ｔ抗原を認識する第１のビオチン化レクチンと、Ｔ抗原を認識する第２のビオチン化レクチンと、ストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体と結合させたフルオロフォアとの使用に関する。有利には、前記レクチンは、好ましくは６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０の様々な比の、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５の、特に６２５０：１６０：１０の比のＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡ又はＡＣＡとである。
したがって、本発明はまた、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する方法を行うための、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、Ｔ抗原を認識する第１のレクチンと、Ｔ抗原を認識する第２のレクチンとの使用にも関し、前記レクチンは、フルオロフォアと組み合わされる。有利には、前記レクチンは、好ましくは６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０の様々な比の、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５の、特に６２５０：１６０：１０の比のＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡ又はＡＣＡとである。
今日、特に、癌幹細胞に対して作用することが可能な新しい物質の証拠を提供するために、調査及び診断を目的としたこれらの細胞の研究は不可欠である。同様に、これらの細胞の研究は、個別化医療の領域においても特に有用である。
したがって、本発明は、有利には、結腸直腸癌幹細胞を単離するためのそれらの使用に関する。
結腸直腸癌幹細胞の検出、特にそれらの定量によっても、腫瘍の進行のリスクを評価することが可能になる。本発明は、したがって、結腸直腸癌の治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度をインビトロで診断するための、前述の条件での、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、任意付加的に、Ｔ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンとの使用にも関する。
本発明の第２の目的は、結腸直腸生体試料中の癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩで標識するステップを含む、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するインビトロ法(Ｉ)に関する。
本発明による方法は、主なステップとして、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを用いた結腸直腸癌幹細胞の標識、又はフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンとＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンとを用いた結腸直腸癌幹細胞の標識を含む。
本発明はまた、
(ａ)結腸直腸癌幹細胞が標識された生体試料を得るために、癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｂ)癌幹細胞が標識された生体試料を、細胞の検出及び任意付加的に単離する手段と接触させるステップと、
(ｃ)結腸直腸癌幹細胞を検出するステップと、
(ｄ)任意付加的に、結腸直腸癌幹細胞を単離するステップと、
を含む、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するインビトロ法(Ｉａ)にも関する。
一実施形態において、本発明による方法は、結腸直腸癌幹細胞を単離するために行われる。この単離ステップにより、例えば、再発及び転移の起源であることが多いこれらの癌幹細胞を排除することが可能な新たな治療を発見するために、特に結腸直腸腫瘍試料中に検出される結腸直腸癌幹細胞を調査することが可能になる。
したがって、本発明はまた、
(ａ)結腸直腸癌幹細胞が標識された生体試料を得るために、癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｂ)癌幹細胞が標識された生体試料を、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段と接触させるステップと、
(ｃ)結腸直腸癌幹細胞を検出するステップと、
(ｄ)結腸直腸癌幹細胞を単離するステップと、
を含む、結腸直腸癌幹細胞を検出及び単離するインビトロ法(Ｉｂ)にも関する。
結腸直腸生体試料は、具体的には結腸直腸癌に罹患した患者から事前に得られた腫瘍生検であってもよい。同様に、生体試料は、結腸直腸癌に罹患している疑いのある患者の結腸直腸組織の生検であってもよい。同様に、腫瘍生体試料は、癌細胞株、特にヒト細胞株の注射によって動物、例えばマウス又はラットに誘導される結腸直腸癌細胞株又は腫瘍であってもよい。
ステップ(ａ)における結腸直腸癌幹細胞の標識の前に、細胞は、有利には、互いに解離される。この細胞の解離は、従来の手順に従って、例えば、細胞の表面上に発現するグリカン、特にフコースα１−２ガラクトース単位及びＴ抗原を変化させることなく、細胞を互いに解離させることが可能な１つ以上の酵素を用いて、行うことができる。細胞の解離は、例えば、Ｒｏｃｋ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓから市販されている混合物Ｌｉｂｅｒａｓｅ(登録商標)を用いて実施することができる。
本発明は、したがって、ステップ(ａ)の標識の前に、細胞を互いに解離するステップを含む、方法(Ｉ)、(Ｉａ)又は(Ｉｂ)に関する。
一実施形態において、標識ステップ(ａ)は、第１の標識手段としてのフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段、有利にはＴ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物とを用いて行われる。Ｔ抗原を認識するレクチンは、有利には、ＡＢＡ、ジャカリン及びＡＣＡからなる群から選択される。
有利には、ステップ(ａ)の標識は、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物、特にはＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群から選択されるＴ抗原を認識するレクチンの混合物、有利には、ジャカリンとＡＣＡの混合物を用いて行われる。
本発明は、したがって、前述の方法(Ｉ)、(Ｉａ)又は(Ｉｂ)に関し、標識ステップ(ａ)は、ＵＥＡ−１とＡＢＡとＡＣＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとＡＣＡの混合物；ＵＥＡ−１とＡＢＡとジャカリンの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとジャカリンの混合物；ＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群、有利には、ＵＥＡ−１とＡＢＡとジャカリンの混合物；及びＵＥＡ−１とジャカリンと及びＡＣＡの混合物から選択されるレクチンの混合物、好ましくは、ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡとの混合物を用いて行われる。
標識ステップ(ａ)は、有利には、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０の様々なモル比の、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５の特に６２５０：１６０：１０のモル比のフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡの混合物を用いて行われる。レクチンの混合物は、好ましくは、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０の様々なモル比、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡからなり、特に、６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物である。
ステップ(ｂ)において、生体試料を、上記のような検出及び任意付加的に単離する手段、すなわち、ストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズ(レクチンはビオチン化されている)、レクチンと共有結合したフルオロフォア、又はストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォア(レクチンはビオチン化されている)と接触させる(ここで、フルオロフォアは上記のとおりである)。
細胞の検出ステップ(ｃ)及び任意付加的な単離ステップ(ｄ)は、有利には、フローサイトメトリー又は磁気的細胞選別等の、細胞を検出及び任意付加的に単離する従来技術を使用して行われる。
前述の方法において、ステップ(ａ)は、レクチンの混合物を用いて行われ、幹細胞は、有利には、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンとＴ抗原を認識するレクチンとによって同時に標識される。
別の実施形態において、生体試料中の結腸直腸癌幹細胞の標識は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、Ｔ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチン混合物とを用いて逐次的に行われる。
この実施形態において、本発明による方法は、したがって、
(ａ)結腸直腸癌幹細胞がフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された試料を得るために、結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｂ)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された細胞を検出及び単離するステップと、
(ｃ)単離された結腸直腸癌幹細胞を、標識のための第２の手段、好ましくはＴ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチン混合物で標識するステップと、
(ｄ)Ｔ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチン混合物による癌幹細胞を検出するステップと、
(ｅ)結腸直腸癌幹細胞を単離するステップと、
を含む。
この他の実施形態において、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された癌幹細胞の単離ステップ(ｂ)の後に、細胞増幅ステップが続いてもよい。よって、細胞の単離後、第２の標識手段、有利にはＴ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物を用いた標識に供される前に、結腸直腸癌幹細胞の量を増加させることが可能な培地で細胞を培養することができる。またステップ(ｃ)の後には、結腸直腸癌幹細胞の検出ステップ(ｄ)及び単離ステップ(ｅ)の前で、細胞増幅ステップが続いてもよい。
第２の標識手段がレクチンの混合物である場合、ステップ(ｃ)は、Ｔ抗原を認識する第１のレクチンを用いて行うことができ、単離された標識細胞を、任意付加的に、細胞増幅ステップに供することができ、次いで、単離された細胞をＴ抗原を認識する第２のレクチンで標識することができる。
発明者は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、特にＵＥＡ−１が、Ｔ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物の任意付加的な存在下で、結腸直腸癌幹細胞を検出するばかりでなく、それらを単離することも、特に効果的に可能にすることを実証した。
本発明は、研究目的の結腸直腸癌幹細胞の調査に、例えば、例えばマウス又はラットにおける癌細胞株(特にヒト)の注射によって動物に誘導される結腸直腸癌細胞株又は腫瘍におけるこれらの細胞の調査に特に適合されている。
本発明は、同様に、特に疾患及び/又は治療のモニタリングにおいて、結腸直腸癌に罹患した患者における診断用途に特に適合されている。
結腸直腸癌幹細胞は、実際、化学療法治療に対するそれらの抵抗性のために腫瘍の再形成及び腫瘍の再発をもたらす、特定の細胞の集団である。本発明は、したがって、結腸直腸癌幹細胞の検出を可能にすることにより、腸直腸癌の再発リスクを評価することを可能にする。
腫瘍組織内の結腸直腸癌幹細胞の検出及び定量によって、同様に、癌の悪性度及びそれを発生する可能性を決定することが可能になる。
結腸直腸癌幹細胞の検出及び定量は、個別化医療手技においても誘導される。生体試料中の結腸直腸癌幹細胞の検出により、特に、治療の予後値を評価すること、及び必要に応じて治療を適合させることが可能になる。
本発明の第４の目的は、したがって、結腸直腸生体試料中の癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩで標識するステップを含む、結腸直腸癌の治療調整のための予後値を定義するために結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度をインビトロで診断する方法、又は上記のようなフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを含むキットにも関する。
本発明は、より具体的には、
(ａ)癌幹細胞が標識された生体試料を得るために、癌幹細胞を、第１の標識手段としてのフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｂ)癌幹細胞が標識された生体試料を、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段と接触させるステップと、
(ｃ)結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に定量するステップと、
(ｄ)結腸直腸癌幹細胞の存在及び任意付加のその量から出発して、結腸直腸癌の治療調整を行うための予後値を定義するために結腸直腸癌の再発のリスク及び/又は結腸直腸癌の悪性度を推定するステップと、を含む、結腸直腸癌の治療調整を行うための予後値を定義するために結腸直腸癌の再発のリスク及び/又は結腸直腸癌の悪性度をインビトロで診断する方法に関する。
ステップ(ａ)は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを単独で、又は上記のような第２の結腸直腸癌幹細胞標識手段、有利には、ＡＢＡ、ジャカリン及びＡＣＡからなる群から特に選択されるＴ抗原を認識するレクチン若しくはＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群から特に選択されるＴ抗原を認識するレクチンの混合物(有利には、ジャカリンとＡＣＡの混合物)の存在下で用いて行うことができる。
本発明は、したがって、特に、結腸直腸癌の治療調整を行うための予後値を定義するために結腸直腸癌の再発のリスク及び/又は結腸直腸癌の悪性度をインビトロで診断する方法に関し、癌幹細胞を標識するステップは、ＵＥＡ−１とＡＢＡとＡＣＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとＡＣＡの混合物；ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとジャカリンとＡＢＡの混合物；ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群(有利には、ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡの混合物及びＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物)から選択されるレクチンの混合物(好ましくは、ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物)を用いて行われる。有利には、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡのモル比は、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０と様々であり、有利には５０００〜７０００；５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比である。
より有利には、レクチンは、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０のモル比の、有利には５０００〜７０００；５０〜２５０：５〜１５の、特に６２５０：１６０：１０のモル比の、ＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡである。
好ましい実施形態において、レクチンは、６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１、ジャカリン、及びＡＣＡである。
一実施形態において、レクチンが、上記のような結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する手段に結合している。
本発明は、特に、結腸直腸癌の治療調整を行うための予後値を定義するために結腸直腸癌の再発のリスク及び/又は結腸直腸癌の悪性度をインビトロで診断する方法に関し、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段は、ストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズ(レクチンはビオチン化されている)；レクチンと共有結合的に結合したフルオロフォア；又はストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォア(レクチンはビオチン化されている)からなる群から選択される。
本発明の診断方法は、特に、細胞の検出ステップ(ｃ)及び任意付加的な単離ステップ(ｄ)については、フローサイトメトリー、磁気的細胞選別又は免疫組織化学的検査を用いて行うことができる。細胞を検出及び任意付加的に単離する方法がフローサイトメトリーである場合、ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と組み合わせられるフルオロフォアは、有利にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３である。細胞を検出及び任意付加的に単離する方法が免疫組織化学的検査である場合、ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と組み合わせられるフルオロフォアは、有利にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４である。
本発明の第４の目的は、第１の標識手段としての、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩと、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段とを含むキット、特に結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離することを目的としたキットに関する。
結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段は、有利には、Ｔ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物、特にＡＢＡ、ジャカリン及びＡＣＡからなる群から選択されるＴ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物である。
一実施形態において、本発明によるキットは、第２の標識手段として、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物、特にＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群から選択される、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物、有利にはジャカリンとＡＣＡの混合物を含む。
本発明は、したがって、ＵＥＡ−１とＡＢＡとＡＣＡ；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとＡＣＡ；ＵＥＡ−１とＡＢＡとジャカリン；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとジャカリン；ＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡ；ＴＪＡ−ＩＩとジャカリンとＡＣＡから選択され、有利にはＵＥＡ−１とＡＢＡとジャカリン；及びＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡから選択されるレクチン、好ましくはＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡとを含むキットに関する。
本発明によるキットのレクチンは、それらを使用する時点で組み合わせるために独立した容器に存在していてもよく、又は直ぐに使用できる単一容器内で組み合わされていてもよい。
レクチンが直ぐに使用できる単一容器内で組み合わされている場合、レクチンの混合物は、有利には、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０のモル比、有利には５０００〜７００：５０〜２５０：５〜１５のモル比、特に６２５０：１６０：１０のモル比のフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡからなる。
直ぐに使用できる単一容器内で組み合わされているレクチンの混合物は、有利には、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０のモル比、有利には５０００〜７００：５０〜２５０：５〜１５のモル比、特に６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡからなる。
有利な実施形態において、本発明は、６２５０：１６０：１０のモル比で、直ぐに使用できる単一容器内で組み合わされているＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡの混合物を含むキットに関する。
本発明によるキットは、有利には、上記のような細胞を検出及び任意付加的に単離する手段を含むことができる。したがって、検出手段は、ストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズ(レクチンはビオチン化されている)；レクチンと共有結合したフルオロフォア；又はストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォア(レクチンはビオチン化されている)からなる。有利には、フルオロフォアは、フローサイトメトリーに使用することができる任意のフルオロフォアであり、有利にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３である。
本発明は、したがって、
・フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、
・Ｔ抗原を認識する第１のレクチンと、
・Ｔ抗原を認識する第２のレクチンと、
・細胞を検出及び任意付加的に単離する手段と
を含むキットＡにも関し、
前記レクチンは、ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡ又はＡＣＡとであり、有利には、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０のモル比、有利には５０００〜７００：５０〜２５０：５〜１５のモル比、特に６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡ又はＡＣＡとである。
第１の特定の実施形態において、本発明は、
・フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンと、
・Ｔ抗原を認識する第１のビオチン化レクチンと、
・Ｔ抗原を認識する第２のビオチン化レクチンと、
・ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズからなる、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段と
を含むキットＡ１に関し、
前記レクチンは、ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡ又はＡＣＡとであり、有利には、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０のモル比、有利には５０００〜７００：５０〜２５０：５〜１５のモル比、特に６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡ又はＡＣＡとである。
キットは、有利には、
・ビオチン化ＵＥＡ−１と、
・ビオチン化ＡＢＡ又はビオチン化ＡＣＡ、有利にはビオチン化ＡＣＡと、
・ビオチン化ジャカリンと、
・ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズと
を含むキットＡ１−１である。
キットＡ１−１内の前記レクチンは、直ぐに使用できる単一容器内で組み合わされていてもよく、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０、有利には５０００〜７０００；５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のビオチン化ＵＥＡ−１：ビオチン化ジャカリン：ビオチン化ＡＢＡ又はビオチン化ＡＣＡのモル比で、直ぐに使用できる単一容器内で組み合わされていてもよい。
第２の特定の実施形態において、本発明は、
・フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンと、
・Ｔ抗原を認識する第１のビオチン化レクチンと、
・Ｔ抗原を認識する第２のビオチン化レクチンと、
・ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォアからなる、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段と、
を含むキットＡ２にも関する。
フルオロフォアは、フローサイトメトリーに使用することができる任意のフルオロフォアであり得る。そのようなフルオロフォアは市販されている。それらは、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８ｒ、７００、７５０又は７９０、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、ローダミン、アロフィコシアニン(ＡＰＣ)及びフィコエリトリン(ＰＥ)である。フルオロフォアは、有利には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３である。
キットは、有利には、
・ビオチン化ＵＥＡ−１と、
・ビオチン化ジャカリンと、
・ビオチン化ＡＢＡ又はビオチン化ＡＣＡ、有利にはビオチン化ＡＣＡと、
・ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォアと、
を含むキットＡ２−１である。
前記レクチンは、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０のモル比の、有利には５０００〜７０００；５０〜２５０：５〜１５の、特に６２５０：１６０：１０のビオチン化ＵＥＡ−１：ビオチン化ジャカリン：ビオチン化ＡＢＡ又はビオチン化ＡＣＡのモル比で、直ぐに使用できる単一容器内で組み合わされていてもよい。
キットはまた、
・フルオロフォアと、特に上記のようなフルオロフォアと組み合わせたフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、
・フルオロフォアと、特に上記のようなフルオロフォアと組み合わせたＴ抗原を認識する第１のレクチンと、
・フルオロフォアと、特に上記のようなフルオロフォアと組み合わせたＴ抗原を認識する第２のレクチンと、
を含むキットＡ３であってもよい。
キットは、有利には、
・フルオロフォアと、特に上記のようなフルオロフォアと組み合わせたＵＥＡ−１と、
・フルオロフォアと、特に上記のようなフルオロフォアと組み合わせたジャカリンと、
・フルオロフォアと、特に上記のようなフルオロフォアと組み合わせたＡＢＡ又はＡＣＡと、
を含むキットＡ３−１である。
前記レクチンは、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０、有利には５０００〜７０００；５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のフルオロフォアと組み合わせたＵＥＡ−１：フルオロフォアと組み合わせたジャカリン：フルオロフォアと組み合わせたＡＢＡ又はフルオロフォアと組み合わせたＡＣＡのモル比で、直ぐに使用できる単一容器内で組み合わされていてもよい。
本発明はまた、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する方法を行うための、上記のようなキットの使用にも関する。
本発明はまた、結腸直腸癌の治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度をインビトロで診断するための、上記のようなキットの使用にも関する。
本発明の第５の目的は、結腸直腸生体試料中の癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩで標識するステップを含む、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するインビトロ法(Ｉ)に関する。
本発明による方法は、主要なステップとして、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを用いた結腸直腸癌幹細胞の標識、又はフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンとＴ抗原を認識する少なくとも１つのレクチンとを用いた結腸直腸癌幹細胞の標識を含む。
本発明はまた、
(ｅ)結腸直腸癌幹細胞が標識された生体試料を得るために、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｆ)癌幹細胞が標識された生体試料を、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段と接触させるステップと、
(ｇ)結腸直腸癌幹細胞を検出するステップと、
(ｈ)任意付加的に、結腸直腸癌幹細胞を単離するステップと、
を含む、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するインビトロ法(Ｉａ)にも関する。
一実施形態において、本発明による方法は、結腸直腸癌幹細胞を単離するために行われる。この単離ステップにより、例えば、再発及び転移の起源であることが多い癌幹細胞を排除することが可能な新たな治療を発見するために、特に結腸直腸腫瘍試料中に検出される結腸直腸癌幹細胞を調査することが可能になる。
本発明は、したがって、
(ｅ)結腸直腸癌幹細胞が標識された生体試料を得るために、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｆ)癌幹細胞が標識された生体試料を、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段と接触させるステップと、
(ｇ)結腸直腸癌幹細胞を検出するステップと、
(ｈ)結腸直腸癌幹細胞を単離するステップと、
を含む、結腸直腸癌幹細胞を検出及び単離するインビトロ法(Ｉｂ)にも関する。
結腸直腸生体試料は、具体的には、結腸直腸癌に罹患した患者から事前に得られた腫瘍生検であってもよい。同様に、生体試料は、結腸直腸癌に罹患している疑いのある患者の結腸直腸組織の生検であってもよい。同様に、腫瘍生体試料は、癌細胞株、特にヒト細胞株の注射によって動物、例えばマウス又はラットに誘導される結腸直腸癌細胞株又は腫瘍であってもよい。
ステップ(ａ)における結腸直腸癌幹細胞の標識の前に、細胞は、有利には、互いに解離される。この細胞の解離は、従来の手順に従って、例えば、細胞の表面上に発現するグリカン、特にフコースα１−２ガラクトース単位及びＴ抗原を変化させることなく、細胞を互いに解離させることが可能な１つ以上の酵素を用いることによって、達成することができる。細胞の解離は、例えば、Ｒｏｃｋ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓから市販されている混合物Ｌｉｂｅｒａｓｅ(登録商標)を用いて実施することができる。
本発明は、したがって、標識ステップ(ａ)の前に、細胞を互いに解離するステップを含む、方法(Ｉ)、(Ｉａ)又は(Ｉｂ)である。
一実施形態において、標識ステップ(ａ)は、第１の標識手段としての、検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段、有利には、検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、Ｔ抗原を認識するレクチン、又は検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物とを用いて行われる。Ｔ抗原を認識するレクチンは、有利には、ＡＢＡ、ジャカリン及びＡＣＡからなる群から選択される。
有利には、標識ステップ(ａ)は、検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物、特にはＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群から選択される、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物、有利にはジャカリンとＡＣＡの混合物を用いて行われる。
本発明は、したがって、前述の方法(Ｉ)、(Ｉａ)又は(Ｉｂ)に関し、標識ステップ(ａ)は、ＵＥＡ−１とＡＢＡとＡＣＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとＡＣＡの混合物；ＵＥＡ−１とＡＢＡとジャカリンの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとジャカリンの混合物；ＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群、有利にはＵＥＡ−１とＡＢＡとジャカリンの混合物；及びＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物から選択されるレクチンの混合物、好ましくはＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物を用いて行われる。
標識ステップ(ａ)は、有利には、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０の様々なモル比、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比のフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡの混合物を用いて行われる。レクチンの混合物は、好ましくは、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０の様々なモル比、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡからなり、特に、６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物である。
ステップ(ｂ)において、生体試料を、上記のような検出及び任意付加的に単離する手段、すなわち、ストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズ(レクチンはビオチン化されている)、レクチンと共有結合したフルオロフォア、又はストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォア(レクチンはビオチン化されている)と接触させる(ここで、フルオロフォアは上記のとおりである)。
細胞の検出ステップ(ｃ)及び任意付加的な単離ステップ(ｄ)は、有利には、フローサイトメトリー又は磁気的細胞選別等の、細胞を検出及び任意付加的に単離する従来技術を使用して行われる。
前述の方法において、ステップ(ａ)は、レクチンの混合物を用いて行われ、幹細胞は、有利には、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンとＴ抗原を認識するレクチンとによって同時に標識される。
別の実施形態において、生体試料中の結腸直腸癌幹細胞の標識は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンとＴ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物とを用いて逐次的に行われる。
この実施形態において、本発明による方法は、したがって、
(ｆ)結腸直腸癌幹細胞がフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された試料を得るために、結腸直腸癌幹細胞を、検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｇ)フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された細胞を検出及び単離するステップと、
(ｈ)単離された結腸直腸癌幹細胞を、第２の標識手段、好ましくは検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、Ｔ抗原を認識するレクチン又は検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物で標識するステップと、
(ｉ)Ｔ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物により癌幹細胞を検出するステップと、
(ｊ)結腸直腸癌幹細胞を単離するステップと、
を含む。
この別の実施形態において、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンによって標識された癌幹細胞の単離ステップ(ｂ)の後に、細胞増幅ステップが続いてもよい。よって、細胞の単離後、第２の標識手段、有利にはＴ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物を用いた標識に供される前に、結腸直腸癌幹細胞の量を増加させることが可能な培地で細胞を培養することができる。またステップ(ｃ)の後には、結腸直腸癌幹細胞の検出ステップ(ｄ)及び単離ステップ(ｅ)の前で、細胞増幅ステップが続いてもよい。
第２の標識手段がレクチンの混合物である場合、ステップ(ｃ)は、Ｔ抗原を認識する第１のレクチンを用いて行うことができ、単離された標識細胞を、任意付加的に、細胞増幅ステップに供することができ、次いで、単離された細胞をＴ抗原を認識する第２のレクチンで標識することができる。
発明者は、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、特にＵＥＡ−１が、Ｔ抗原を認識するレクチン又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物の任意付加的な存在下で、結腸直腸癌幹細胞を検出するばかりでなく、それらを単離することも、特に効果的に可能にすることを実証した。
本発明は、研究目的の結腸直腸癌幹細胞の調査に、例えば、癌細胞株、特にヒト癌細胞株の注射によって動物、例えばマウス又はラットに誘導される結腸直腸癌細胞株又は腫瘍におけるこれらの細胞の調査に、特に適合されている。
本発明は、同様に、特に疾患及び/又は治療のモニタリングにおいて、結腸直腸癌に罹患した患者における診断用途に特に適合されている。
結腸直腸癌幹細胞は、実際、化学療法治療に対する抵抗性のために腫瘍の再形成及び再発をもたらす、特定の細胞集団である。本発明は、したがって、結腸直腸癌幹細胞の検出を可能にすることにより、結腸直腸癌の再発リスクを評価することを可能にする。
腫瘍組織内の結腸直腸癌幹細胞の検出及び定量によって、同様に、癌の悪性度及び進行可能性を決定することが可能になる。
結腸直腸癌幹細胞の検出及び定量は、個別化医療手順にも含まれる。生体試料中の結腸直腸癌幹細胞の検出により、特に、治療の予後予測値を評価すること、及び必要に応じて治療を適合させることが可能になる。
本発明の第４の目的は、したがって、結腸直腸生体試料中の癌幹細胞を、検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩで標識するステップを含む、結腸直腸癌の治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度をインビトロで診断する方法、又は上記のような検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを含むキットにも関する。
本発明は、より具体的には、
(ｅ)癌幹細胞が標識された生体試料を得るために、結腸直腸癌幹細胞を、検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、第１の標識手段としての、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
(ｆ)癌幹細胞が標識された生体試料を、細胞の検出及び任意付加的に単離する手段と接触させるステップと、
(ｇ)結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に定量するステップと、
(ｈ)結腸直腸癌幹細胞の存在及び任意付加的なその量から出発して、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度を推定するステップと、
を含む、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度をインビトロで診断する方法に関する。
ステップ(ａ)は、検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンを単独で、又は上記のような結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段、有利には、検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、Ｔ抗原を認識するレクチン、特にはＡＢＡ、ジャカリン及びＡＣＡからなる群から選択されるＴ抗原を認識するレクチン、若しくは検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、Ｔ抗原を認識するレクチンの混合物、特にはＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群からに選択されるＴ抗原を認識するレクチンの混合物、有利には、ジャカリンとＡＣＡの混合物の存在下で行うことができる。
本発明は、したがって、特に、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度をインビトロで診断する方法に関し、癌幹細胞を標識するステップは、ＵＥＡ−１とＡＢＡとＡＣＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとＡＢＡとＡＣＡの混合物；ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとジャカリンとＡＢＡの混合物；ＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物；ＴＪＡ−ＩＩとジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群から、有利にはＵＥＡ−１とジャカリンとＡＢＡの混合物；及びＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物から選択される、検出及び任意付加的に単離する手段で修飾された、レクチンの混合物、好ましくはＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡの混合物を用いて行われる。有利には、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡのモル比は、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０と様々であり、有利には５０００〜７０００；５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比である。
より有利には、レクチンは、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０のモル比、有利には５０００〜７０００；５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１：ジャカリン：ＡＢＡ又はＡＣＡである。
好ましい実施形態において、レクチンは、６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１とジャカリンとＡＣＡとである。
本発明は、特に、結腸直腸癌治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度をインビトロで診断する方法に関し、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段は、ストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズ(レクチンはビオチン化されている)；レクチンと共有結合したフルオロフォア；又はストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォア(レクチンはビオチン化されている)からなる群から選択される。
本発明の診断方法は、特に、細胞の検出ステップ(ｃ)及び任意付加的な単離ステップ(ｄ)については、フローサイトメトリー、磁気的細胞選別又は免疫組織化学的検査を用いて行うことができる。細胞を検出及び任意付加的に単離する方法がフローサイトメトリーである場合、ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と組み合わせられるフルオロフォアは、有利にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３である。細胞を検出及び任意付加的に単離する方法が免疫組織化学的検査である場合、ストレプトアビジン、アビジン又は抗ビオチン抗体と組み合わせられるフルオロフォアは、有利にはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４である。
実施例１：結腸直腸癌幹細胞の単離プロトコル
Ｉ．必要な器具
試薬及び機器
−結腸直腸癌の癌幹細胞を特異的に標識するビオチン化混合物(Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の個々のレクチンから調製)
−ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｉｎ Ｂｉｎｄｅｒキット(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)
−磁石

緩衝液
−Ｖｅｒｓｅｎｅ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)
−緩衝液１：０．１％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)を含むＰＢＳ(Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まないリン酸緩衝食塩水)、ｐＨ７．４
−緩衝液２：０．１％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)及び０．６％クエン酸ナトリウムを含むＰＢＳ(Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まないリン酸緩衝食塩水)
−緩衝液３：１％のＦＣＳ(ウシ胎仔血清)、１ｍＭ ＣａＣｌ2及び５ｍＭのＭｇＣｌ2を含むＲＰＭＩ １６４０、ｐＨ７．０〜７．４
ＩＩ．実験期間
−細胞を調製するために２０分
−細胞を標識するために２０分
−標識された細胞をビーズとともにインキュベートするために２０分
−ＣＳＣで富化されていない懸濁液を回収するために１０分
−ＣＳＣ/ビーズの結合を破壊するために１５分
−目的のＣＳＣで富化された懸濁液を回収するために５分
−合計：１時間３０分
ＩＩＩ．磁気選別による操作モード
１．細胞の調製。１０分間３７℃でＶｅｒｓｅｎｅを用いて細胞を支持体から剥離する。
２．細胞を数え、細胞数を１．１０7に調節する。
３．細胞懸濁液を３００ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除去する。
４．非特異的部位のブロッキング。１ｍＬの緩衝液２を加える。
５．細胞の標識。８０μｌの混合物を加え、混合物を１０分間４℃でインキュベートする。
６．５００μＬの緩衝液２を加えて細胞を洗浄し、懸濁液を３００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去する。
７．ビーズ。細胞を１ｍＬの緩衝液２に再懸濁した後、２５μＬの予め洗浄したビーズを加え、緩衝液１で再懸濁する。混合物を緩やかに撹拌しながら２０分間４℃でインキュベートする。
８．ＣＳＣで富化されていない懸濁液の回収。その後、試験管を磁石上に２分間配置し、次いで上清を取り出し、上清を「ｆａｌｃｏｎ」試験管に保存する。その間、試験管は依然として磁石上に維持する。
９．試験管を磁石から外し、１ｍＬの緩衝液１を加え、ボルテックスにより試験管を撹拌し、再び磁石上に２分間配置した後、再度、ステップ８と同じ「ｆａｌｃｏｎ」試験管に上清を保存する。このステップを２回繰り返す。
１０．依然としてビーズに結合している細胞を３７℃に予熱した２００μｌの緩衝液３で再懸濁する。ＤＮａｓｅＩからなる細胞/ビーズ結合を破壊する緩衝液を４μＬ加える。緩やかに撹拌しながら、周囲温度で１５分間混合物をインキュベートする。
１１．ピペットで５〜１０回懸濁液を激しく撹拌して、細胞の遊離を促進する。
１２．ＣＳＣで富化された懸濁液の回収。試験管を磁石上に２分間配置し、目的の細胞を含有する上清を、３７℃に予熱した２００μＬの緩衝液３を含む試験管に移す。収率を高めるためにステップ１１及び１２を繰り返してもよい。
この実験を、ＵＥＡ−１単独、２つのレクチンの混合物又はＭｉｌｔｅｎｙｉ社のキットを用いて、結腸直腸癌細胞の他の４つの株に対して同様の条件下で行った。
これらの異なる試験の結果を図１〜３に提示する。
試験結果が示すように、ＵＥＡ−１の単独又はＴ抗原を認識する１つ若しくは２つのレクチンとの混合での使用は、標準的方法(ＡＣ１３３)と比較して非常に明らかに向上した効率で結腸直腸癌幹細胞の単離を可能にする。
実施例２：クローン原性試験
クローン原性試験は、５０単位/ｍＬのペニシリン、５０単位/ｍＬのストレプトマイシン(Ｇｉｂｃｏ)、及び２．４ｇ/ｌの重炭酸ナトリウム、１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液(Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ−Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ)、１×プロゲステロン(Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ)、１×プトレシン(Ｓｉｇｍａ)、０．０２５ｇ/ｍＬヘパリン(Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ)、３０％(ｍ/ｖ)グルコース(Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，)、１×増殖添加剤Ｂ２７(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ)、２０ｎｇ/ｍＬ ＥＧＦ(Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ)、２０ｎｇ/ｍＬ塩基性ヒトＦＧＦ(Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ)、１×インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム添加剤(Ｒｏｃｋ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ)を添加したＭＥＭ(Ｇｉｂｃｏ)から構成される培地中で、６ウェルプレート中５００細胞/ｃｍ2の密度で行った。
ＣＯ2雰囲気下３７℃でのインキュベーション後、コロノスフェアの発生を観察し、ＩｍａｇｅＪ(登録商標)ソフトウェアを用いて定量した。
結果を図４のグラフに示す。
本発明に記載される方法に従って単離した癌幹細胞は、マーカーＣＤ１３３の認識に基づくキットを用いて単離した細胞よりも大きな直径のスフェアの形成をもたらす。
本発明による方法は、したがって、現在利用可能であり、標準であると見なされている方法と比べて、はるかにより効果的に腫瘍を再形成することができる幹細胞を得ることを可能にする。
実施例３：インビボ腫瘍発生試験
Ｖａｒｎａｔ Ｆら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ ％ Ｍｅｄ．２００９；１(６−７)：３３８−３５１に記載される方法から適合させたインビボ試験を行った
このために、ＵＥＡ−１/ジャカリン/ＡＣＡを用いて、又は該混合物により単離した陰性画分を用いて単離した３×１０6の細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。
対照マウスは、予め選別されていない細胞(ＨＴ−２９株に由来する非選別細胞)の注射によって得た。
腫瘍が法規制値に達する前に、動物を屠殺し、腫瘍を調べる。
腫瘍寸法の増大の結果を図５に示す。
実施例４のインビトロ実験と同様に、結腸直腸癌幹細胞は非単離細胞よりも大きな体積を有する腫瘍の形成をもたらす。したがって、単離された細胞は、腫瘍イニシエーターである結腸直腸幹細胞で効果的に富化されている。

Claims (18)

  1. 結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するための、第１の標識手段としての、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩの使用。
  2. フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌幹細胞の第２の標識手段、有利には、Ｔ抗原を認識するレクチン、特にＡＢＡ、ジャカリン及びＡＣＡ、又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物、特にＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群から特に選択される混合物、有利にはジャカリンとＡＣＡの混合物から選択される第２の標識手段との請求項１に記載の使用。
  3. 前記レクチンが、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する前記手段、有利には、レクチンがビオチン化されている場合のストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズ；レクチンと共有結合的に結合したフルオロフォア；又はレクチンがビオチン化されている場合のストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォアからなる該手段に結合している、請求項１又は２のいずれか一項に記載の使用。
  4. ・フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンがビオチン化され、
    ・Ｔ抗原を認識する第１のレクチンがビオチン化され、
    ・Ｔ抗原を認識する第２のレクチンがビオチン化され、
    ・前記細胞を検出及び任意付加的に単離する手段が、ストレプトアビジンがグラフトされた磁気ビーズからなり、
    前記レクチンが、有利には、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１、ジャカリン、及びＡＢＡ又はＡＣＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
  5. 第１の標識手段として、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチン、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩと、
    ＡＢＡ及びＡＣＡ；ＡＢＡ及びジャカリン；並びにジャカリン及びＡＣＡからなる群から有利に選択されるＴ抗原を認識するレクチン、有利にはジャカリン及びＡＣＡと、
    を含むキット。
  6. ６２５０：１６０：１０の比でＵＥＡ−１、ジャカリン及びＡＣＡを含む請求項５に記載のキット。
  7. 前記細胞を検出及び任意付加的に単離する手段、有利には、レクチンがビオチン化されている場合のストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズ、レクチンと共有結合的に結合したフルオロフォア、又はレクチンがビオチン化されている場合のストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォアからなる手段を更に含む、請求項５〜６のいずれか一項に記載のキット。
  8. ・フコースα１−２ガラクトース単位を認識するビオチン化レクチンと、
    ・Ｔ抗原を認識する第１のビオチン化レクチンと、
    ・Ｔ抗原を認識する第２のビオチン化レクチンと、
    ・細胞を検出及び任意付加的に単離する手段、有利にはストレプトアビジンがグラフトされた磁気ビーズと、
    を含み、前記レクチンが、有利には、６２５〜１２５００：１６〜３２０：１〜２０、有利には５０００〜７０００：５０〜２５０：５〜１５、特に６２５０：６０：１０のモル比のＵＥＡ−１、ジャカリン、及びＡＢＡ又はＡＣＡである、請求項５〜７のいずれか一項に記載のキット。
  9. 結腸直腸生体試料中の結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩで標識するステップを含む、結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離するインビトロ法。
  10. (ａ)結腸直腸癌幹細胞が標識された生体試料を得るために、前記結腸直腸癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
    (ｂ)前記癌幹細胞が標識された前記生体試料を、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段と接触させるステップと、
    (ｃ)前記結腸直腸癌幹細胞を検出するステップと、
    (ｄ)任意付加的に、前記結腸直腸癌幹細胞を単離するステップと、
    を含む請求項９に記載の方法。
  11. 前記ステップ(ａ)が、第１の標識手段としてのフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段、有利には、ＡＢＡ、ジャカリン及びＡＣＡ、又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物、特にＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物及びジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群から選択される混合物、有利にはジャカリンとＡＣＡの混合物からなる群から選択される第２の標識手段とを用いて行われる、請求項９又は１０のいずれか一項による方法。
  12. 前記レクチンが、６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１、ジャカリン及びＡＣＡである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記レクチンが、前記結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に単離する手段、有利には、レクチンがビオチン化されている場合のストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズ、レクチンと共有結合的に結合したフルオロフォア、又はレクチンがビオチン化されている場合のストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォアからなる手段に結合している、請求項１２に記載の方法。
  14. 結腸直腸生体試料中の癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで、有利にはＵＥＡ−１又はＴＪＡ−ＩＩで標識するステップを含む、結腸直腸癌の治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発リスク及び/又は悪性度をインビトロで診断する方法。
  15. (ａ)癌幹細胞が標識された生体試料を得るために、前記癌幹細胞を、フコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンで標識するステップと、
    (ｂ)前記癌幹細胞が標識された前記生体試料を、細胞を検出及び任意付加的に単離する手段と接触させるステップと、
    (ｃ)前記結腸直腸癌幹細胞を検出及び任意付加的に定量するステップと、
    (ｄ)前記結腸直腸癌幹細胞の存在及び任意付加的のその量から、結腸直腸癌の治療を適合させるための予後値を定義する結腸直腸癌の再発のリスク及び/又は悪性度を推定するステップと、
    を含む請求項１４に記載の診断方法。
  16. 前記ステップ(ａ)が、第１の標識手段としてのフコースα１−２ガラクトース単位を認識するレクチンと、結腸直腸癌幹細胞を標識する第２の手段、有利には、Ｔ抗原を認識するレクチン、特にＡＢＡ、ジャカリン若しくはＡＣＡ、又はＴ抗原を認識するレクチンの混合物、特に、ＡＢＡとＡＣＡの混合物、ＡＢＡとジャカリンの混合物又はジャカリンとＡＣＡの混合物、有利にはジャカリンとＡＣＡの混合物から選択される第２の標識手段とを用いて行われる、請求項１４又は１５に記載の診断方法。
  17. 前記レクチンが、６２５０：１６０：１０のモル比のＵＥＡ−１、ジャカリン及びＡＣＡである、請求項１６に記載の診断方法。
  18. 細胞を検出及び任意付加的に単離する前記手段が、レクチンがビオチン化されている場合のストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体がグラフトされた磁気ビーズ、レクチンと共有結合的に結合したフルオロフォア、又はレクチンがビオチン化されている場合のストレプトアビジン、アビジン若しくは抗ビオチン抗体と組み合わされたフルオロフォアからなる、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の診断方法。
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