JPH04501002A - コラーゲン分解をモニターする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「コラーゲン　をモニターする　′ 本発明は、特に、オステオポローシスおよびリウマチ関節炎に関する診断補助と しての、コラーゲン分解をモニターする方法に関する。

コラーゲンは、全ての組織の中に、様々な形で存在する。

コラーゲンは、ピリジノリンにより架橋されたアミノ酸鎖の形を有するというこ とが明かにされている　（Ｆｕｊｉ＋ｎｏｔｏら。

（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｃｏｍ＋ａｕｎｉｃａｔｉｏｎｖｏ１．８４．５２−５７）。ピリジニウ ム架橋は、３つのヒドロキシリジン残基から形成される。２つは反応前に酵素に よりアルデヒドに転換されるコラーゲン分子の末端（非らせん構造の）ペプチド に由来し、３っめは、隣接するコラーゲン分子のらせん部分に存在するヒドロキ シリジンに由来する。Ｒｏｂｉｎｓら（Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｈｅｕ ｍａｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１９８６．４５．９６９−９７３）は、ピリジ ノリンに特異的な抗体を使用することにより尿中のピリジノリンを測定する技術 について記載しており、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬ　ｌ５Ａ）により検出し た。しかしながら、この技術では、試料中のヒドロキシリシルピリジノリンを測 定し得るだけであり、リシルデオキシピリジノリンは検出できない。前者は骨お よび組織中に存在し、後者は骨のみの中に存在する。したがって、この技術を用 いれば、コラーゲン分解の発生を知ることができる関与する組織の種類まではわ からないが、成人病の存在を示す。

本発明は、リシルピリジノリンおよびヒドロキシリシルピリジノリンが、尿のよ うな生体液中に、アミノ酸原鎖の断片あるいは糖質に結合して存在するという認 識に基づいている。

しかしながら、原鎖がどこで切れるかについては不確定である。しかし、実質的 には、全ての場合に、特定のコラーゲンが由来する組織の種類を同定するために 充分なアミノ酸が存在する。

したがって１本発明は、リシルピリジノリンまたヒドロキシリシルピリジノリン あるいはそれらの置換体を含むコラーゲン断片を含有する生体液試料を分析する ことを包含する。

コラーゲン分解をモニターする方法を提供する。

さらに１本発明によれば、生体液試料を分析し１分解コラーゲンの組織起源に特 異的な少な（とも１つの置換基を含むリシルピリジノリンあるいはヒドロキシリ シルピリジノリンの量を測定することを包含する１分解コラーゲンの組織起源を 決定する方法が提供される。

他の局面では１本発明は、少なくとも１つの結合アミノ酸を有するリシルピリジ ノリンあるいはヒドロキシリシルピリジノリンを含むコラーゲン断片に特異的な 抗体、好ましくはりシルピリジノリンを含むコラーゲン断片に特異的な抗体。

好ましくは、モノクローナル抗体に関する。

好ましくは、上記ピリジノリン、はアミノ酸原鎖の一部で置換されている。

好ましくは、上記アミノ酸鎖の短い部分は、それぞれ１〜５個のアミノ酸を有す る。

好ましく−は、上記糖質は、ガラクトースとの糖鎖形成により、あるいはグルコ ースおよびガラクトースとの糖鎖形成により、ピリジノリンに結合している。

コラーゲンは、骨あるいは軟骨と好適に結合し得る。

本発明の実施態様を、実施例により、さらに詳細に説明する。

コラーゲンは１次の一般的な構造を有する：ＡＩ　−Ａ２−　Ａ３−　Ａ４−　 ＝　−ＡｎＰ　−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−−・−−−−−ＣｎＡ、　Ｂ、およ びＣは、アミノ酸であり、Ｐは、リシルピリジノリンまたはヒドロキシリシルピ リジノリンあるいはグリコジル化ヒドロキシリシルピリジノリンである。例えば 、尿のような生体液中に存在する場合には、Ａ鎖、Ｂ鎖、およびＣ鎖は。

切断され、長さが不確定になる。本発明は、特定の体組織に由来するコラーゲン により１次の物質が生体液試料中に存在するという事実に基づいている： Ａ　−Ａｘ　−Ａｙ　・・・・・・ Ｐ　−Ｃ−Ｃｘ　−Ｃｙ　・・・・・・ここで、　Ａ、　Ｂ、およびＣは、１〜 ５個のアミノ酸から成る短い鎖であり、　Ａ、　Ｂ、およびＣは、必ず存在する 。Ａｘ、　ＡＦ、　Ｂｘ。

Ｂｙ、　Ｃｘ、　Ｃｙなどは、必ずしも存在するとは限らない原鎖の他の部分で ある。さらに、　Ａ、　Ｂ、およびＣは、特定の組織起源に特異的である。した がって１本発明のこの局面では１次のユニットが機能する。

本発明の他の局面では、Ｘは、必ずしも結合アミノ酸を有するとは限らないグリ フシル化ヒドロキシリシルピリジノリンであり得る。

ヘリックス中のヒドロキシリジン残基は、そのヒドロキシル基において、糖グル ープを付加することにより、グリコジル化される。ピリジノリン（Ｐｙｄ）架橋 の形成がグリコジル化ヒドロキシリジンを伴う場合には、グリコジル化架橋が生 成する。ヘリックス中のりジン残基との反応により形成されたりシルピリジノリ ンのような架橋類似物は、側鎖ヒドロキシル基を有さないので、いかなるグリコ ジル化誘導体をも形成し得ない。

グリコジル化には、ガラクトース（Ｇａｌ）のみ、あるいは二糖グルフシルガラ クトース（Ｇａ１．Ｇｌｃ）という２つのタイプがある。したがって、下記に示 すように、グリコジル化ヒドロキシリシルピリジノリンは、２つのＰｙｄ−Ｇａ ｌおよびＰｙｄ−Ｇａｌ。

Ｇｌｃ、という形を取り得る。

Ｐｙｄ−ＧａＬ　（１）　Ｐｙｄ−Ｇａ１．Ｇｌｃ　（ｉｌｌヒドロキシリジン の三糖誘導体に対するｊ１１糖誘導体の相対的な割合は１組織により異なる。重 要な主組織（すなわち。

ピリジノリンを含むもの）については、骨コラーゲンでは。

単糖誘導体が豊富であるのに対し、軟骨は、はとんど全てがＧａ１．Ｇｌｃを含 む。

ピリジノリンの単糖誘導体および三糖誘導体（構造■および■）の両方は、ヒト の尿から単離され、同定された。これらの成分は１通常、尿の中に存在するが、 様々な骨の疾患および関節炎では多量に存在することがわかった。

これらの知見の主な重要点は、以下のとおりである：１、上記の成分は、加水分 解処理を行わなくても、尿中に存在する。したがって１分析方法を直接、尿に適 用し得る。

２、上記の２成分を分析することにより、コラーゲン分解に関する組織特異的な 情報が得られる。Ｐｙｄ−Ｇａｌを測定することにより、骨のコラーゲン再吸収 の指標が提供される：尿中のＰｙｄ−Ｇａ１．　Ｇｌｃｊｌは、主として、骨あ るいは軟骨の分解の指標となる。そして、　Ｆ’ｙｄ−ＧａｌおよびＰｙｄ−Ｇ ａ１．Ｇｌｃの相対量は、骨および軟骨の相対的な分解度に関する情報を提供す る。

３、糖グループの存在により、上記成分の抗原性（それにより、良好な抗体を生 じさせることのできる容易さ）が増大する。各構造に特異的な抗体が産生される ように、糖質部分は、抗体認識部位の一部を形成する。

特に重要な２タイプの組織は骨および軟骨である。骨および軟骨の両方における コラーゲン分解の存在が関節の障害あるいは疾病の指標であるのに対し、骨コラ ーゲンのみの分解の存在はオステオポローシスおよび他の骨障害の指標である。

一般に８本発明は、以下の工程により、実施され得る：１、生体液中の重要な特 定のＸを同定する。

２、Ｘを単離する。

３、Ｘを適当なタンパクに結合させる。

４．３の生成物を宿主動物に注入し、抗体を生じさせる。

５、　この抗体をＥＬＩＳＡあるいは他の適当な分析法において使用する。

本発明のより具体的な実施例を示す。

スキーム１および２は、尿から架橋を含む断片を単離するための手順を要約した ものであり、単離される成分の詳細が与えられている。これらスキームの変形に ついては、以下テ詳述する。

１皿匹上 工法 ａ、高濃度の全ピリジニウム架橋を含む尿試料を、骨折の転換が増進する（副甲 状腺機能亢進症）か、あるいは軟骨および骨の分解が増進する（リウマチ様関節 炎）ような症状のどちらかを伴う疾患を持つ患者より採取した。

ｂ、　全部で、１．０〜１．ＳＩＬの尿を、凍結乾燥し、０．２Ｍ酢酸中に再溶 解させ、　Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ２の２．６ｘ１４０ｃ＋ｓカラムを用いて、バッチ 方式で、ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。

Ｃ１ピリジニウム架橋誘導体を含む選択画分を、ｃ１８支持体を用い、アセトニ トリルを含む移動相で溶出する逆相ＨＰＬＣにより、再度、クロマトグラフィー にかけた。これら、ペプチドをＤＥＡＥカラムおよび５Ｐ−５ＰＷカラムを用い たイオン交換ＨＰＬＣにより、さらに精製した。

ｄ、単離した成分を高速原子衝撃マススペクトロメトリーおよびアミノ酸配列分 析により特性付けた；グリコジル化部位は、これらペプチドのアルカリ加水分解 産物のガス液体クロマトグラフィーにより、同定された。

ｅ、　骨および軟骨の中の架橋部位の周辺のアミノ酸配列を知ることにより、尿 より単離したペプチドの組織起源を確定した。様々な組織の代表的なコア配列を 含む、多種類の多くのペプチドを、抗体を生成させるために選んだ。

ｆ、各々の精製されたペプチド（１μ＋＊ｏｌ）は、　Ｎ−エチル−Ｎ’−（３ −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライドを用いて卵白ア ルブミン（０，２５μｍ０１）に共有結合させた。

ｇ、Ｂａ１ｂ／ｃマウスを卵白アルブミン複合体で免疫し、Ａｇ８、６５３骨髄 腫細胞を用いて、融合を行った後、モノクローナル抗体を生成させた。陽性のク ローンを、別のカルボジイミド試薬Ｎ−シクロへキシル−Ｎ’−２−（４’−メ チルモルホリニウム）エチルカルボジイミド−ｐ−）ルエンスルフオネートとの 反応によりゼラチンに結合させたペプチドで被覆されたマイクロチューブプレー トを用いたＥＬＩＳＡにより、検出した。

このようにして生成したモノクローナル抗体を、様々な種類の骨障害および変性 関節疾患の診断およびモニターのための免疫検定試験において使用した。

及皿五主 方法 工程１　元の量の１０分の１にまで濃縮した尿（３００ｍｌ）を。

０．２Ｍ酢酸を溶離液として、セファデックスＧ２５Ｍのカラム　（３、Ｏｘｌ ＯＯｃｍ）によるクロマトグラフィーにかけた。約６０％の特徴的なピリジニウ ム架橋蛍光を含む、　５４０ｍ１と６３０＋ａｌとの間（Ｖ、／Ｖ０＝１．６〜 １．９）の画分をプールし、凍結乾燥させた。

工程２　工程１の画分（２８０ｍｇ）を、セファデックスＧＩＯのカラム（１， ７Ｘ１４０Ｃ■）によるクロマトグラフィーに再びかけ。

０．２Ｍ酢酸で溶出させることにより、アミノ酸および他の低モル濃度の物質か ら架橋成分を分離した。これらの画分を、蛍光（Ｅｘ　２９５ｎ＋ｅ；　Ｅｍ＋ ＊　４００ｎｍ）によりモニターＬ、１０５＋ｉｌと１２１＋ａｌとの間（Ｖ、 ／Ｖｏ＝１．１〜１．３）で溶出した物質をプールし、蒸発乾固させた。

工程３　工程２の画分を、ジビニルベンゼン（Ｌｏｃａｒｔｅ　Ｃｏ。

Ｌｔｄ、　Ｌｏｎｄｏｎ；　Ｃａｔ　Ｎｏ　ＬＡ　４８１０８）で架橋した（８ ％）スルホン化ポリスチレン樹脂ピーズ（５μ）のカラム　（０，９ｘ１５ｃ＋ ａ）を用いて５６°Ｃで行う陽イオン交換クロマトグラフィーにかけ、　６７ｍ Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，８４）で溶出させた。

５ｍｌの画分を採取し、適当な画分をセファデックスＧＩＯのカラム（１，７ｘ ５０ｃ＋＋）で脱塩し、凍結乾燥させた。

このシステムでは、　Ｐｙｄ−Ｇａｌ　（Ｉ　）は９１分と１０５分との間で溶 出し、　ｐｙｄ−Ｇａ１．Ｇｌｅ　（Ｉｆ）は４１分と５０分との間で溶出した Ｉおよび■の最終精製は、　Ｒｏｓｉｌ　Ｃｚｓ充填剤（３μ）のカラム（０， ９ｘ２５ｃ＋ｓ）による逆相ＨＰＬＣで行い、０．１％へブタフルオロブチル酸 および１５％〜３０％の直線勾配濃度のアセトニトリルで、３０分間溶出させた 。（Ｉ）および（ｎ）は、それぞれ。

１７．３分と１６．９分との間で溶出した。

１住且埜 １、腹木立旌箪 穏やかな酸加水分解（０，１Ｍ　ＨＣｌ、　１０８℃、１２時間）により。

Ｐｙｄ−Ｇａ１．Ｇｌｃ　（Ｉｆ　）を、完全に、　Ｐｙｄ−Ｇａｌ　（１）お よびピリジノリン（Ｐｙｄ）の混合物に転換した。Ｐｙｄ−Ｇａｌ　（Ｉ　）を 、１０８℃の２ＭＨＣｌ中で８時間加水分解させることにより、この成分をＰｙ ｄに完全に転換させた。この挙動は、これらのタイプの成分に特徴的なものであ り、従来より、ヒドロキシリシングリコシドのヒドロキシリジンへの相互転換に ついて知られている。

２、　ＭｊｉＸ！！Ｌ 強い鉱酸を用いて加水分解を行うと、成分（Ｉ）および（ＩＩ）の両方ともが、 ｐｙａを生成し、加水分解産物中には他のアミノ酸が検出されなかった。この糖 質組成を、　２Ｍ硫酸中で加水分解させ、水素化ホウ素ナトリウムで還元した後 、メチル化誘導体のガス液体クロマトグラフィーにより決定した。これらの結果 およびＨＰＬＣによる架橋量の測定に基づくと１モル比は； 成分■　ピリジノリン（１，０）　；　ガラクトース（０，９）成分■　ピリジ ノリン（１，０）　；　ガラクトース（０，８）グルツース（０，９） したがって１．上記の結果により、成分■および■の構造は。

先に示された通りであることが確認された。

上記に加えて、工程３において、１８４分と１９５分との間で溶出したｒＸＪと 呼ぶ関連誘導体を単離した。この成分は、　ｐｙａを含んでおり、骨障害を持つ 患者において、その量が増加している。これら成分の免疫検定法は、アミノ基あ るいはカルボキシル基によって、卵白アルブミンに結合させることにより、ペプ チドについて述べたように、精度よ〈実施される。

改変および改善は９本発明の範囲から逸脱することな〈実施され得る。

スキーム１ １０分の１の容量に濃縮 セファデックスＧＩＯでのゲル濾過 により、小さい成分を分画 イオン交換クロマトグラフィーおよび ＨＰＬＣによる分離および精製 グリコジル化誘導体の特性付け： Ｐｙｄ−Ｇａ１．Ｇｌｃ　（１）　、　Ｐｙｄ−Ｇａｌ　（ＩＩ）スキーム２ １Ｏ分の１の容量に濃縮 ３つの架橋されたペプチド成分（ｍ、ＴＶおよび■）の単離保持時間は、それぞ れ２７．２分間、　３１．７分間および３６．２分間ＨＦＢＡ／アセトニトリル を用いた ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムでのイオン交換クロマトグラフィーおよびさらに（工程 ４のような）　ＨＰＬＣにょる■の精製ｒ５際調査報告 １−１−−１’＠ｌＡ−紬□Ｉ””６ＰＣＴ／ＧＢ８９／［１０７１５国際調査 報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コラーゲン分解をモニターする方法であって，リシルピリジノリンあるいは ヒドロキシリシルピリジノリンあるいはそれらの置換体を有するコラーゲン断片 を含む生体液試料を分析することを包含する，モニター方法２．前記ピリジノリ ンがアミノ酸鎖の一部で置換されている，請求項１に記載の方法。 ３．前記コラーゲン断片がグリコシル化ヒドロキシリシルピリジノリンを含む， 請求項１に記載の方法。 ４．前記ヒドロキシリシルピリジノリンが，ガラクトースでグリコシル化されて いる，請求項３に記載の方法。 ５．ヒドロキシリシルピリジノリンがガラクトースおよびグルコースの組み合せ でグリコシル化されている，請求項３に記載の方法。 ６．前記生体液試料が尿である，前記請求項のいずれかに記載の方法。 ７．前記分析が，試料の精製を含む，前記請求項のいずれかに記載の方法。 ８．前記精製が，ゲル濾過クロマトグラフィー，逆相高圧液体クロマトグラフィ ーおよびイオン交換液体クロマトグラフィーから選択された少なくとも１つの技 術を含む，請求項７に記載の方法。 ９．前記精製物が定量化される，請求項８に記載の方法。 １０．前記精製物が，蛍光法，紫外線分光法，電気化学的検出法およびキャピラ リーゾーン電気泳動法から選択された技術により定量化される，請求項９に記載 の方法。 １１．前記試料を，リシルピリジノリンあるいはヒドロキシリシルピリジノリン あるいはそれらの置換体に特異的な抗体を用いて分析される，前記請求項のいず れかに記載の方法。 １２．前記抗体がモノクローナルである，請求項１１に記載の方法。 １３．分解コラーゲンの組織起源を決定する方法であって，生体液試料を分抗し ，分解コラーゲンの組織起源に特異的な少なくとも１つの置換基を有するリシル ピリジノリンあるいはヒドロキシリシルピリジノリンの量を測定することを包含 する，決定方法。 １４．前記置換基がペプチドである，請求項１３に記載の方法。 １５．前記置換基がグリコシドである，請求項１３に記載の方法。 １６．前記置換基がガラクトースである，請求項１５に記載の方法。 １７．前記置換基が，ガラクトースおよびグルコースの組み合せである，請求項 １５に記載の方法。 １８．コラーゲン断片に特異的な抗体であって，該断片が少なくとも１つの結合 アミノ酸を有するリシルピリジノリンあるいはヒドロキシリシルピリジノリンを 含む，抗体。 １９．コラーゲン断片に特異的な抗体であって，該断片が，結合糖残基を有する ヒドロキシリシルピリジノリンを含む，抗体。