DK164417B - Diagnosemetode til paavisning af rheumatoid arthritis eller osteoarthritis - Google Patents

Description

DK 164417 B

Den foreliggende opfindelse angår en diagnosemetode til påvisning af rheumatoid arthritis eller osteoarthritis som det eneste syndrom eller som en komponent i andre rheumatiske sygdomme.

5

Rheumatoid arthritis er en vidt udbredt, kronisk, systemisk sygdom, som formodes at have en auto-immun komponent. Se f.eks. Kunkel and Tan, Adv. Immunol. 4, 351-395 (1964). Hvorvidt dette immunrespons initierer, fortsætter 10 eller er en konsekvens af sygdommen er ikke fuldt forstået indtil nu. Man har hidtil foreslået såvel humorale som cellulære mekanismer som værende involveret i sygdommens artikulære og ekstra-artikulære manifestationer. Osteoarthritis er en artikulær sygdom, som formodes at ad-15 skille sig fra rheumatoid arthritis ved at knoglebeskadigelse er sekundært syndrom efter degenerering af brusk.

Denne degenerering formodes at være enten en primær sygdom i bruskdelen eller et sekundært respons over for stress-fremkaldte mikrofrakturer i subchondral knogle.

20 for begge sygdommes vedkommende gennemføres for tiden differential-diagnosen på baggrund af klinisk historie og radiologiske kriterier.

Ved rheumatoid arthritis, foreligger der immunoglobulin 25 (Ig) komplekser, og de ligner klassik antigen-fremkaldte immun-komplekser ved deres evne til at aktivere den klassiske komplement udviklingsvej, ved at stimulere den op-soniserende aktivitet hos makrofager, ved at fremkalde den umiddelbart forekommende type hypersensitivitet efter 30 subcutan injektion, og ved lignende virkninger. Disse komplekser består udelukkende af immunoglobuliner, hvilket antyder, at immunoglobulin er såvel "antistof" (rheumatoid faktor) som "antigen". Disse komplekser adskiller sig imidlertid fra normale immun-komplekser ved den lave 35 affinitet til bindingsstedet (Fab regionen af rheumatoid faktorer) for den formodede determinant, ved preferencen for homolog associering (IgG rheumatoid faktorer) samt, 2

DK 164417 B

Λ især, ved den kendsgerning, at størstedelen af rheumatoid-faktorerne (IgM, IgA, IgG) bindes til r-klassen af immunoglobulin. Man har derfor fremført, at der i patienter med rheumatoid arthritis foreligger en strukturel æn-5 dring af r-klasse immunoglobuliner (IgG), som skaber en antigenisk og formodentlig immunogenisk aktiv sub-popu-lation. Se Kunkel og Tan, som ovenfor. At denne antigene determinant faktisk foreligger og er lokaliseret til Cr2 domænerne af ændret IgG, er blevet fastslået ved, den ev-10 ne rheumatoid faktor Fab delene har til kun at binde til Fc med et eller begge sin 02 områder. Dette og adskillige andre beviskæder har ført til det synspunkt, at komplekserne i rheumatoid arthritis patienter involverer in-teraktioner Fab-Fc (IgG). Man har ligeledes foreslået, at 15 et stort antal immun-komplekser i rheumatoid arthritis serum overvejende hvis ikke udelukkende består af selvassocieret, ændrede IgG. Dvs. at sådanne IgG molekyler, som i deres Fab område indeholder anti-IgG aktivitet, også bærer den strukturelle unormalitet i deres Fc område.

20 Det synspunkt, at denne anti-IgG aktivitet er resultatet af et fremkaldt auto-antistof over for en unormal IgG sub-population, er imidlertid blevet bestridt af andre forskere, som har fremlagt data, der antyder, at selv-associeringen af IgG ikke var en konsekvens af egentlige 25 antistof-antigen interaktioner (ikke et auto-immunt fæno men) .

Forsøg på udforskning af de molekylære ændringer i Fc området, som er årsag til disse fænomener, har i stort om-30 fang involveret anvendelsen af rheumatoid faktorer som de mest specifikke prober, der er tilgængelige. IgG og IgM rheumatoid faktorer udviser imidlertid to overraskende egenskaber. For det første reagerer de i stort omfang ikke alene med IgG fra det samme (syge) individ; men lige-35 ledes med IgG fra normale individer ja selv fra andre arter (f.eks. kanin, rhesusabe). Dette indikerer at Fc bindingsstedet på noget af IgG fra patienter med rheumatoid 3

DK 164417 B

'·% arthritis ligeledes eksisterer på IgG opnået fra patienter uden sygdom, men formodentlig i en latent form. For det andet er hos nogle patienter anti-IgG aktiviteten associeret med en stor andel (25 %) af det totale forråd af 5 IgG, og de derved opnåede komplekser udgør over 50 %. For det tredie er rheumatoid faktor-IgG interaktioner uden undtagelse monovalente, til trods for det almindelige an-tagne synspunkt, at IgG er et strukturelt symmetrisk molekyle, og derfor altid skulle besidde et lige antal de-10 terminanter. Selv om steriske hindringer efter interak-tionen mellem rheumatoid faktor og mål-IgG kan forklare denne monovalens, er det muligt, at glycosylering af IgG faktisk gør mange molekyler strukturelt asymmetriske (selv om de faktisk er symmetriske når det gælder poly-15 peptider). Dersom dette sidstnævnte er sandt, kunne antigendeterminanten på Fc involvere oligosaccharid på en eller anden måde.

Der er ikke noget bevis i retning af aminosyreændringer i 20 Fc regionen af IgG fra arthritis-patienter. Adskillige rapporter har imidlertid omtalt, at total serum IgG eller IgG-rheumatoid faktor fra patienter med immun-kompleks sygdomme (rheumatoid arthritis, systemisk lupus erythematosus) er unormale med hensyn til deres kulhydratindhold.

25 Se Pope et al., J- Immunol. 115, 365-373 (1975); Hymes et al., J. Biol. Chem. 254, 3148-3151 (1979); og Duc Dodon et al., Immunol, 42, 401-406 (1981).

Det fremgår ikke umiddelbart af disse publicerede skrif-30 ter, hvorledes immun-kompleks unormalitet kan anvendes, hvis den overhovedet kan anvendes, ved diagnostisk metodik ved rheumatoid arthritis. Almindelig anvendte fremgangsmåder til diagnose af rheumatoid arthritis er baseret på serologiske reaktioner. Ved disse prøver lader man 35 patientens serum reagere med et udvalg af serologiske systemer, som alle indeholder garama-globulin i en eller anden form eller en komponent af Cohn Fraktion II opnået 4

DK 164417 B

f'l fra plasma eller serum, som for en stor del består af gamraa-globulin. Dersom patientens serum er positivt for sygdommen, vil tilstedeværelsen af såkaldt rheumatoid-faktor forårsage en agglutinering eller immunoudfæld-5 ningsreaktion, som kan sammenlignes med kontrolprøver. Sådanne reaktioner kan bestemmes ved forskellige velkendte definitive målemetoder, som f.eks. inkluderer elektro-phorese, Coombs's (antiglobulin), hemagglutineringsinhi-beringstest, præcipitin reaktion, geldiffusion, immuno-10 elektrophorese, nephelometri, radioimmunoassay og flow cytometri.

En typisk komponent ved agglutineringsprøven for rheuma-toidfaktor involverer anvendelsen af inerte bærerpartik-15 ler, såsom f.eks. latexpartikler. Denne prøve blev først beskrevet af Singer and Plotz, Amer. J. Med. 21, 888-892 (1956). Modifikationer af latextesten er omtalt i US patentskrift nr. 3 088 875 og i talrige andre patentskrifter og publikationer. Kommercielle eksempler på disse la-20 textest for rheumatoid faktor er "Rapi-tex" fra Behring Diagnostics, "RA-TEST" fra Hyland Diagnostics og "Rheumanosticon" fra Organon Diagnostics.

Man vil kunne finde yderligere baggrundsinformation med 25 hensyn til disse konventionelle diagnostiske testmetoder for rheumatoid arthritis blandt andet i: Rose and Friedman, Manual of Clinical Immunology, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 2den udgave 1980. Se især Horan og Schenk, "Flow Cytometric Analysis of Serum 30 Autoantibodies Applied to the Detection of Rheumatoid Factor", kapitel 9, side 56-59; Agnello, "Method of Detection of Immune Complexes Utilixing Clq or Rheumatoid Factors", kapitel 21, side 178-185; og Froelich og Williams, "Tests for Detection of Rheumatoid Factors", 35 kapitel 117, side 871-873. Se ligeledes Schur, "Immune-complex assays; The state of the art", New England Journal of Med. 298, (3) 161-162 (1978).

5

DK 164417B

Λ

Det fremgår klart, at der til trods for den store mængde videnskabelige undersøgelser, som er blevet udført inden for dette område, ikke foreligger en diagnostisk test for rheumatoid arthritis, som er fuldt pålidelig. En signifi-5 kant procentdel af klassiske patienter med sygdommen mangler den rheumatoide faktor. En forbedret diagnosemetode for rheumatoide sygdomme og beslægtede tilstand ville derfor være af meget stor nytte.

10 I Arthritism and Rheumatism, bind 19 (1976) side 813, 2. abstract anføres at IgG galactosemanglen hos patienter med rheumatoid arthritis eller systemisk lupus erythematosus kan være ansvarlig for anormaliteter ved IgG-funk-tionen i disse sygdomme. De udførte undersøgelser fast-15 lægger de steder i IgG molekylet, der er involveret i galactosemanglen og antyder, at der er en enzymatisk årsag til manglen.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes en diagnosemetode til 20 sikker og entydig påvisning af rheumatoid arthritis og osteoarthritis som det eneste syndrom eller som en komponent ved andre rheumatiske sygdomme. Diagnosemetoden er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

En reduktion i ydrearms-galactosylering i en IgG-kompo- 2 nent eller et fragment deraf på 34-59 % i en patients 3 blodserum eller plasma eller ledvæske fastlægges ved at 4 analysere for forekomsten af ikke-reducerende, terminale 5 yderarms-N-acetylglucosaminrester i IgG-komponenten eller 6 fragmentet ved direkte kemiske, enzymatiske eller lectin- 7 baserede prøver på eksponeret N-acetylglucosamin eller 8 indirekte ved bestemmelse af f.eks. ændring i molekylvægt 9 eller hydrodynamisk volumen og sammenligne med tilsvaren 10 de normale kontrolværdier. Undersøgelserne udføres på hel 11

Ig som f.eks. IgG eller et fragment deraf. Fragmenterne kan f.eks. være H-kæde, Fc eller glycopeptider eller intakte Ig-oligosaccharider eller oligosaccharidfragmenter

DK 164417 B

6 afledt af Ig.

Eksempler til belysning af måder til gennemførelse af ovennævnte bestemmelse ved direkte kemisk, enzymatisk el-5 ler lectin-baserede analyser på eksponeret N-acetyl-glu-cosamin er: (i) direkte enzymatiske analyser på Ø-N-acetyl-glucos-amin under anvendelse af exo-Æ-N-acetyl-hexominida- 10 ser og (ii) direkte lectinanalyser på β-N-acetyl-hexosamin, der involverer agglutinin fra hvedekim.

15 Diagnosemetoden ifølge fremgangsmåden kan ligeledes gennemføres ved indirekte metoder, såsom f.eks. ved at bestemme ændringer i molekylvægt eller i hydrodynamisk volumen. Det vil sige, at analysen kan bestå i en fuldstændig sekvensbestemmelse af alle komplekse oligosaccharider 20 i ΙΟ eller ethvert af dets ovennævnte fragmenter, analyse af profilerne af den sialsyre-frie eller den neutrale oligosaccharidfraktion af Ig, eller ændringer i molekylvægten af glycopeptider fra Ig og dettes fragmenter.

25 Man har nu ved metoden ifølge opfindelsen fundet: 1. at omfanget af ydre arm galactose ¢(1-4) på serum IgG formindskes til 50 % (p = 0,001) i den "sialsyre-frie" oligosaccharidfraktion ved rheumatoid arthritis og til 41 30 % (p = 0,001) i den neutrale oligosaccharidfraktion ved rheumatoid arthritis. Der foreligger en reciprok forhøjelse i indholdet af ikke-reducerende terminal ydre arm . ¢(1-2) bundet N-acetyl-glucosamin. 1 2. Omfanget af ydre aim galactose formindskes til 66 % (p = 0,002) i den sialsyre-frie del ved osteoarthritis og til 59 % (p = 0,002) i den neutrale oligosaccharidfrak- tion ved osteoarthritis. Der foreligger en reciprok for højelse i ikke-reducerende terminal ¢(1-2) bundet ydre arm N-acetyl-glucosamin.

7

DK 164417 B

'*V

5 Skønt beskrivelsen konkluderer i krav, som i særlig grad udpeger og tydeligt beskriver indholdet med hensyn til opbygningen af den foreliggende opfindelse, vil denne bedre kunne forstås fra den i den følgende givne beskrivelse, som skal læses i forbindelse med de vedlagte teg-10 ninger, i hvilke kort beskrevet: fig. 1(a) i skematisk diagramform viser strukturen af antistof (IgG) molekylet.

15 Fig. 1(b) viser den relative størrelse af et imraunoglobu-linområde og et fuldt udviklet N-bundet kompleks oligo-saccharid.

Fig. 2 i diagramform viser de primære sekvenser af de N-20 bundne oligosaccharider som står i forbindelse med human IgG. Det hydrodynamiske volumen (som målt i glucoseenhe-der - g.u.) for hver struktur (eller på dettes neutrale derivat, når det drejer sig om sådanne, som er sialylere-de) er indikeret. Nøglen til de i diagrammet anvendte 25 symboler er vist i det nederste indstregede felt. Kompo-sitstrukturen er ligeledes vist af Rademacher et al., Biochem. Soc. Trans. 11, 132-134 (1983).

Fig. 3 viser repræsentative Bio-Gel P-4 (-400) gel per-30 meationskromatogrammer for de sialsyre-frie oligosaccharider i det totale serum IgG for henholdsvis (a) kontrolprøve, (b) rheumatoid arthritis og (c) osteoarthritiske patienter. 1

Fig. 4 viser den relative forekomst af de fire kernestrukturer i de sialsyre-frie oligosaccharider fra det totale serum IgG for henholdsvis kontrol, rheumatoid

DK 164417 B

8 arthritis og osteoarthritis-patienter i de to undersøgelses-serier.

Fig. 5 viser repræsentative radioelektrophoretogrammer af 5 oligosacchariderne frigivet fra IgG fra henholdsvis kontrol, rheumatoid arthritis og osteoarthritis patienter.

I eksemplerne er anvendt konventionelle forkortelser for kulhydrater og konventionel nomenklatur. Således anvendes 10 de i det følgende viste symboler til at angive monosac-charid-enheder og deres respektive rester i oligosaccha-rider:

Glucose - Glo 15 Galactose - Gal

Mannose - Man

Fucose - Fuc

Gluconsyre, glycuronsyre, 2-amino-2-deoxysaccharider og 20 disses N-acetyl-derivater er beskrevet ved modificerede symboler. F.eks.: N-acetylglucosamin - GlcNAc N-acetylneuraminic acid - NeuNAc 25

Placeringen og arten af bindingerne mellem enhederne er vist ved tal og ved de anomere symboler a og 0. Pile anvendes til at indikere retningen for glycosid-bindingen, idet pilen peger væk fra hemiacetal-carbonatomet i bin-30 dingen. En almindelig forgrenet kerne i oligosaccharider med N-glycosidisk protein-bindinger kan således f.eks. være gengivet på følgende måde:

Man α (l-*6) 35 \ ManØ (l-+4)GlcNAcØ(l-+4) GlcNAc /

Man a (1-+3)

Aminosyrer er ligeledes vist ved deres konventionelle symboler. F.eks.: 9

DK 164417 B

- n L-Asparagin - Asn 5 L-Serin - Ser L-Threonin - Thr På tilsvarende måde betegnes antistofstruktur under anvendelse af konventionel nomenklatur. Immunoglobulin (Ig) 10 molekylerne er sammensat af lette (L) og tunge (H) kæder.

Hver af de 5 klasser af Ig molekyler har til hinanden svarende sæt af lette kæder; men de har et antigent specielt sæt af tunge kæder, som bliver betegnet med de tilsvarende græske bogstaver (r kæder i IgG, u i igM, a i 15 IgA, 6 i IgD, e i IgE). Aminosyresekvensen i de N-terminale homologe enheder varierer i betydelig grad mellem molekylerne, og den er kendt som den variable (V) region til forskel fra den konstante (C) region i molekylerne.

De N-terminale homologe enheder af lette og tunge kæder 20 betegnes henholdsvis og V^. Fragmenter af antistofmo-lekylet opnået ved papainspaltning betegnes de antigenbindende fragmenter (Fab) og det krystalliserbare fragment (Fc), medens fragmenter, der er opnået ved pepsin-spaltning, og som kun udviser små forskelle, betegnes 25 Fab' (univalent fragment) og F(ab'(bivalent fragment).

For at belyse opfindelsen undersøgte man i detaljer gly-cosylerings-mønstret for totalt IgG, der var isoleret fra arthritiske patienter. Undersøgelsen blev påbegyndt af 30 opfinderne i Oxford, U.K., og derpå blev den gennemført i samarbejde samtidigt i Oxford, U.K., og i Tokyo, Japan, hvor man analyserede de N-bundne oligosaccharider fra total serum IgG fra forskellige individer. I begge undersøgelser sammenlignede man tre grupper individer: normale 35 kontrolpersoner, osteoarthritiske individer og rheumatoid arthritiske individer. De opnåede resultater, som krævede en bedømmelse af mere end 1200 primære oligosaccharidse- 10

DK 164417 B

f*v kvenser fra 42 IgG prøver, indikerer, at den rheumatoide arthritis sygdomstilstand er korreleret med en markant ændring i omfanget af galactosesyleringen af de oligosac-charid-sekvenser, som er karakteristiske for human IgG.

5 Derudover udviser totalt serum IgG fra patienter med osteoarthritis den samme type af mangeltilstand på et niveau, der ligger mellem niveauet for normal tilstand og for rheumatoid tilstand. Det er vigtigt, at i ingen af sygdommene fører denne mangel eller brist til hidtil 10 ukendte oligosaccharid-strukturer, men snarere til en ændring i de relative molære forhold mellem de normalt forekommende strukturer.

EKSEMPEL 1 15

Asparagin-bundne oligosaccharider af IgG

Human serum IgG er et glycoprotein indeholdende i gennemsnit 2,8 N-bundne oligosaccharider pr. molekyle. Se 20 Rademacher og Dwek, Prog. Immunology 5, 95-112 (1983).

Disse er fordelt på ikke-tilfældig måde mellem de to bevarede glycosyleringssteder i Fc-regionen (Asn 297), og de variable glycosyleringssteder i Fab regionen. Se Sox og Hood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56, 975-982 (1970) og 25 Spiegelberg et al., Biochemistry 9, 4217-4223 (1970).

Parringen af oligosacchariderne i mellemrumsrummene mellem Cr2 domænerne involverer ofte oligosaccharider med forskellig primær sekvens. Se Sutton og Phillips, Biochem. Soc. Trans. 11, 130-132 (1983). Som følge heraf 30 er der tydelige adskilte undergrupper af asymmetrisk IgG molekyler inden for IgG populationen som en helhed. Det ovenfor omtalte er belyst på fig. 1(a) på følgende måde:

Fig. 1(a)

Antistofraolekylet består af to tunge (H) og to lette (L) kæder, som er forbundet med disulfid-broer (fuldt optruk- 35

DK 164417B

11 ne linier), og som er opdelt i homologe regioner af sekvenser (Vjj, Cjjl, Cjj2, 0^3), idet hver af disse har en disulfid-bro inden for kæden. (Det her viste mønster af disulfid-brodannelsen inden for kæden er karakteristisk 5 for human undergruppe igGl). I og repræsenterer de med pletter forsynede segmenter de hypervariable regioner af sekvenser, som i den tredimensionale struktur tilsammen udgør antigenbindingsstedet- De bevarede asparagin-bundne, biantenneformede komplekse oligosaccharidkæder er 10 forbundet til Asn 297 i CH2 domænerne. Se Sutton og

Phillips, som ovenfor citeret. Xkke-bevarede oligosaccha-ridtilknytningssteder findes i Fab regionen. Deres hyppighed og placering afhænger af tilstedeværelsen af Asn-X-Ser steder i de hypervariable regioner. Se Sox og Hood 15 som ovenfor citeret.

De relative størrelser af et immunoglobulinområde og et fuldt udviklet N-bundet komplekst oligosaccharid er meget lig hinanden, således som det er vist på fig. 1(b). Se 20 ligeledes Montreuil, Biochem. Soc. Trans. 11, 134-136 (1983). Placeringen af det bevarede oligosaccharid i CH2 området er indikeret på fig. 1(b). Se ligeledes

Spiegelberg et al., Biochemistry 9, 4217-4223 (1970). Med hensyn til strukturel og konform analyse af immunoglobu-25 lin-afledte N-bundne oligosaccharider se ligeledes

Rademacher et al., Biochem. Soc. Trans. 11, 132-134 (1983), og Rademacher og Dwek, Prog. Immunol. 5, 95-112 (1983). 1 2 3 4 5 6

Man har fra humant serum IgG isoleret mindst 30 forskel 2 lige kompleks-typer biantenneformede oligosaccharider.

3

Disse er vist på fig. 2. For at sammenligne de molære an 4 dele af hver af disse strukturer underkastede man en prø 5 ve af hver total serum IgG hydrazinolyse for intakt at 6 frigive oligosaccharid-delene i overensstemmelse med metoden beskrevet af Takasaki et al., Methods in Enzymology 83, 263-268, Academic Press, 1982. Reduktion af de redu-

DK 164417 B

12 3 ærende terminale N-acetylglucosamin-rester med NaB blev derpå gennemført for radioaktivt at mærke hver kulhydratkæde. Hver af de mærkede oligosaccharid-blandinger blev derpå underkastet en udtømmende neuraminidasespalt-5 ning for at analysere fordelingen af de neutrale strukturer. Disse asialo (sialsyre-frie) oligosaccharid-blandinger blev derpå underkastet gelpermeationskromatografi over Bio-Gel® P-4 (-400 mesh), en teknik ved hvilken man alene separerer neutrale oligosaccharider på basis af 10 deres effektive hydrodynamiske voluminer som beskrevet af Yamashita et al., Methods in Enzymology 83, 105-126. Bio-Gel P-4 er en kommerciel tilgængelig porøs polyacrylamid-harpiks i form af hule korn til brug ved gelfiltrering med høj opløsningsevne, og som er fremstillet ved copoly-15 merisering af acrylamid og N,N'-methylen-bis-acrylamid.

Se Hjertem og Mosbach, Anal. Biochem. 3, 109 (1962).

Andre egnede gelpermeationskromatografiske medier til separering af oligosaccharid efter deres størrelse er f.eks. agarosegeler og Sephadex® (tværbundet dextran) ge-20 ler.

Den detaljerede fremgangsmåde til udførelsen af den foran beskrevne hydrazinolyse og gelpermeationskromatografi var som følger: man isolerede IgG fra serum fra hver af 42 25 individuelle personer ved udfældning ved 4 °C med ammoniumsulfat (33 %) og DE-52 ionbytningskromatografi (4 °C) i 0,01 M H2HP0^, pH 7,2. DE-52 er en kommercielt tilgængelig diethylaminoethylderivatiseret ionbytningscellulose på mikrogranulær form. Hver renset IgG (5 mg) blev dialy-30 seret udtømmende over for destilleret vand (4 °C) og cryogent tørret over aktiveret trækul ved -196 °C (<10-^ torr). Prøver af protein blev bragt i suspension i frisk destilleret vandfrit hydrazin i 8 timer ved 100 °C under en vandfri atmosfære af argon. Hydrazinen blev fjernet 35 ved gentagne (5 x) flash-inddampninger udfra vandfrit toluen. Hydrazinolysaterne blev N-acetyleret ved tilsætning af et overskud af eddikesyreanhydrid i mættet NaHCOg ved

DK 164417B

13 4 °C. Efter passage gennem en søjle af kommercielt til-gængeligt "Dowex®" Ag 50 x 12 (H formen) ionbytterhar-piks til fjernelse af Na+, blev prøverne inddampet til tørhed (27 °C), genopløst i vand og anbragt på "Whatman 3 5 MM kromatografipapir. Derpå gennemførte man nedadstigende papirkromatografi (27 °C) under anvendelse af n-butanol: ethanol:vand (4:1:1 v/v) solvent I. Efter 48 timers forløb blev de første 5 cm elueret med H20. De således isolerede oligosaccharider blev flashinddampet til tørhed 3 10 (27 *C) og reduceret med et 5 fold overskud af NaB H.

(7,6 Ci mmol , New England Nuclear) i 50. mmol NaOH, pH

12,0, 30 °C igennem 4 timer. Derpå tilsatte man et ækvivalent rumfang 1 M NaB^H^ i 50 mmol NaOH, pH 12,0, og inkuber ing blev fortsat i 2 timer. Blandingen blev derpå 15 gjort sur (pH 5-6) med 1 M eddikesyre og bragt til at passere gennem en søjle "Dowex" 50 x 12 (H+), inddampet til tørhed (27 °C) og flash-inddampet (5 x) (27 eC) fra methanol. Prøverne blev derpå anbragt på "Whatman" 3 MM papir og underkastet nedadstigende papirkromatografi i 2 20 dage i solvent I. Radiokromatogram scanning blev gennemført med et "Berthold" radiokromatogram scanningsapparat LB280. Radioaktiviteten ved startstedet blev derpå elueret med vand. En aliquot af de således isolerede reduce-rede [ H]-oligosaccharider blev derpå underkastet en ud-25 tømmende neuraminidasespaltning (Arthobacter ureafaciens,

Nakrai Chemical Co., Kyoro, Japan); radioaktiv sukker (1 7 x 10 cpm) i 50 #1 0,1 M natriumacetat pH 5,0, indeholdende 0,1 enhed af enzym. Inkubering blev gennemført ved 37 °C i 18 timer under en atmosfære af toluen. Prøverne 30 blev derpå underkastet højspændingspapirelektrophorese ved 80 V/cm i pyridin/eddikesyre/vand (3:1:387 v/v, pH 5,4). Al radioaktiviteten forblev ved startstedet, hvorved man bekræftede den fuldstændige spaltning af N-ace-tylneuraminsyre. Prøverne blev udtrukket fra papiret ved 35 eluering med vand, afsaltet under anvendelse af en dob-beltvirkende søjle af Dowex® AG 50 x 12 (H+) og AG 3 x 4A (OH) i vand, inddampet til tørhed, bragt i suspension i

DK 164417 B

14 175 ni af et 20 mg-ml ^ dextransyre partiel hydrolysat og påført en Bio-Gel® P-4 (-400 mesh) gelpermeationskro-matografisøjle (1,5 cm x 200 cm). Søjlen blev holdt ved 55 °C, og man anvendte som elueringsmiddel vand (med has-5 tighed 200 ul/min). Eluenten blev overvåget for radioaktivitet under anvendelse af en "Berthold" HPLC radioaktivitetmonitor (model LB503), og til brydningsindeks anvendte man et refraktometer af fabrikatet Perkin Elmer model LC25. Analogsignaler fra monitorerne blev digitili-10 seret under anvendelse af Nelson analytisk ADC interface. Digital-værdierne blev opsamlet og analyseret under anvendelse af Hewlett Packard 9836C computere. På fig. 3 er vist radioaktiviteten (den lodrette akse) afbildet over for retentionstiden efter fjernelse af stochastisk støj 15 under anvendelse af Fourier transformation-teknik. De nummeriske overskrifter oven over kurven refererer til elueringspositionen for glucoseoligomere i glucoseenheder (g.u.), således som de samtidig detekteredes med den monitor, der overvåger brydningsindeks. Vo er positionen 20 for den "tomme" tilstand. Elueringspositioneme for prøverne (udtrykt i g.u.) blev beregnet ved cubisk splejs-ning-interpolering mellem positionerne for de interne standardglucoseoligomere. De indføjede figurer viser profiler med forstærket opløsning, som er tegnet med reten-25 tionstidsaksen uændret og radioaktivitetsaksen reduceret med en faktor 0,5. Opløsnings forbedring blev opnået ved linieformet transformation inden for Fourier området.

En sammenligning mellem de således opnåede individuelle 30 profiler afslører adskillige interessante forhold. For det første var alle sialsyre-frie P-4 kromatograramer fra kontrolindividerne (fig. 3a) i det store hele identiske.

Dvs., at skønt et givet IgG molekyle kun kan indeholde et meget lille antal af særlige oligosaccharidstrukturer 35 (dvs. 2 pr. Fc og yderligere Fab sukkerarter), er det totale relative molbidrag fra hver af de ca. 30 strukturer ved analysen af polyklonal IgG bemærkelsesværdig kon-

DK 164417B

15 stant. Dette store antal oligosaccharidsekvenser er ikke resultatet af at gennemføre analysen på polyklonal IgG, eftersom man finder dette samme "sæt" af strukturer både på humane myelomaproteiner som på musens monoklonale an-5 tistoffer. For det andet er de sialsyre-frie P-4 kromato-grammer fra patienter med rheumatoid arthritis stort set de samme fra den ene patient til den anden; men de adskiller sig signifikant og diagnostisk fra profilerne for kontrolpersonerne (fig. 3b). For det tredie er de sialsy-10 re-frie oligosaccharid P-4 kromatogrammer fra osteo-arthritiske patienter ligeledes karakteristiske for alle sådanne patienter, og de er forskellige fra såvel profilerne fra kontrolgruppen som fra rheumatoid arthritis (fig. 3c). For det fjerde, og dette er det mest vigtige, 15 kan man forklare forskellene mellem de karakteristiske kontrol og arthritisk (osteoarthritisk og rheumatoid) sialsyre-frie P-4 profiler som udtryk for et polulations-skift over imod oligosaccharidstrukturer med lavere hy-drodynamiske voluminen. For at fastslå den molekylære ba-20 sis for dette skrift analyserede man de sialsyre-frie oligosaccharider fra hver patient med hensyn til enten (1) deres relative niveau af forskellige kærneenheder og (2) graden og arten af deres ydre arm substitutioner.

25 EKSEMPEL 2

Oligosaccharidkærner

Man kan i almindelighed klassificere kompleks-type N-30 bundne oligosaccharider som indeholdende en ud af fire forskellige kærnestrukturer, som er vist i diagramform på fig. 4. Se Mizuochi et al., J. Immunol. 129, 2016-2020 (1982). For de biantenneformede oligosaccharider af IgG kan man let bestemme de relative andele af disse fire 35 kærner ved at spalte den samlede mængde oligosaccharider med en blanding af Streptococcus pneumoniae a-galactosi-dase og a-N-acetyl-hexosaminidase, således som det er be-

DK 164417 B

16 skrevet af Mizuochi et al., som oven for citeret. De derved fremkomne spaltningsprodukter er diagnostiske for hver af de fire kærner og adskiller sig indbyrdes tilstrækkeligt meget med hensyn til hydrodynamisk volumen 5 til at kunne opløses på en P-4 søjle. De opnåede resultater, som er opsummeret på fig. 4, indikerer klart, at der ikke er nogen systematisk korrelation mellem sygdomstilstanden og forekomsten af en hvilken som helst speciel type kærnestruktur.

10

Den detaljerede fremgangsmåde til bestemmelse af den relative forekomst af de fire kæmestrukturer var som føl- 5 ger: man spalter en prøve (3-5 x 10 cpm) af de ikke-fraktionerede sialsyre-frie oligosaccharider med en blan-15 ding af Streptococcus pneumoniae 0-galactosidase (2 mil-lienheder) og Ø-N-acetylhexosaminidase (4 millienheder) i 25 μΐ 0,1 M citrat-phosphat, pH 6,0. Spaltningen blev gennemført ved 37 °C i 18 timer under en toluenatmosfære, og den blev afsluttet ved opvarmning til 100 °C i 2 mi-20 nutter. Efter af saltning [med Dowex® AG 50 x 12 (H+),

Ag3,4A (0H~)] blev spaltningsprodukterne separeret på en Bio-Gel P-4 (-400 mesh) søjle. Enzymerne blev renset ved en modifikation af den metode, der er beskrevet af Glasgow et al., J. Biol. Chem. 252, 8615-8623 (1977).

25 Strep, pneum. 0-galactosidase fjerner alle galactose- rester fra de sialsyre-frie oligosaccharider fra IgG uafhængigt af disses kærnestrukturer. Strep, pneum. 0-N-acetyl-hexosaminidase spalter de derved opnåede oligosaccharider på en måde, der er afhængig af tilstedeværelsen 30 af den (halverende) GlcNAc 0 - 4 rest. Mere specifikt frigives kun en N-acetylglucosamin-rest (GlcNAc 5 i fig.

2) fra den galactosyl-frie struktur GlcNAc 01 - 2 Man al - 6 (GlcNAc 01-2 Man al - 3) (GlcNAcØl - 4) Man 01-4 GlcNAcØ - 14 (+Fuc al - 6) GlcNAc som omdannes til 35 GlcNAcØl - 2 Man al - 6 (Man al - 3) (GlcNAc 01-4) Man 01 - 4 GlcNAc 01-4 (+Fuc al - 6) GlcNAc. Imidlertid frigives 2 N-acetylglucosamin-rester fra GlcNAc 01-2

DK 164417 B

17

Man al - 6 (GlcNAcØl - 2 Man al - 3) Man ¢1-4 GlcNAc ¢1 - 4 (+Fuc al - 6) GlcNAc, som omdannes til Man al - 6 (Man al - 3) Man ål - 4 GlcNAc ¢1-4 (+FUC al - 6) GlcNAc. De fire kærner har følgende strukturer: 5 A (jC^j)Manor 1-6 (Manal*3) (GlcNAcpi74) Manpi^4GlcNacpl-* _ 4GlcNAc(+B-F); B Manal-»6(Manal-*3 ) Manpi+4GlcNAcpi+4GlcNAc(-B-F); C ()Mana 1·?6(Mana 1-^3) (GlcNAc81+4) Manpi-4GlcNAc31+ 10 ' ^ 4(Fucalr6)GlcNAc(+B+F); D (i )Manal-r6(Manal*»3 ) Μβηβ l+4GlcNacpi-*4( Fuca 1+6)

GlcNAc(-B+F).

15 Procentdelen af hver kærne, således som det blev bestemt i Oxford Serierne, var: (+B-F)-kontrol (5,1 + 3,3), OA

(3,5 + 1,0), RA (4,1 + 1,4); (-B-F)-kontrol (19,1 + 6,7), OA (13,5 + 5,1), RA (16,9 + 5,9); (+B+F)-kontrol (10,7 + 6,0), OA (13,0 + 6,5), RA (10,2 + 3,1); (-B+F)-kontrol 20 (65,1 + 1,3), 0A (69,7 + 8,0), RA (70,5 + 5,8). De vær dier, som blev bestemt i Tokyo-serierne var: (+B-F)-kontrol (3,1 + 0,7), 0A (3,7 + 0,8), RA (4,6 + 1,4); (-B-F)-kontrol (9,9 + 3,0), OA (0,7 + 2,4), RA (8,8 + 2,1); (+B+F)-kontrol (15,4 + 0,9), 0A (16,6 + 4,0), RA (20,9 +

25 5,7); (-B+F)-kontrol (71,7 + 2,8), OA (70,1 + 5,1), RA

(65,7 + 6,7). Der er ingen statistisk signifikans (p større end 0,05) vedrørende den forskellige forekomst af en vilkårlig kærne inden for de tre grupper. 1 35 I det ovennævnte betyder: B = halverende GlcNAc; F = fucose.

DK 164417 B

18 EKSEMPEL 3

Ydrearm substitutioner 5 De ydrearm strukturer kan karakteriseres med hensyn til forekomsten, bindingen og placeringen af galactose, N-acetyl-glucosamin og N-acetyl-neuraminsyre. De sialsyre-frie oligosaccharidblandinger blev derpå først underkastet Ricinus communis agarose affinitetskromatografi for 10 at separere galactosylerede og ikke-galactosylerede strukturer. I efterfølgende tabel 1 er vist, at i kontrol IgG indeholder op til 75 % af alle oligosaccharidkæder mindst én galactoserest. I IgG isoleret fra rheumatoidpa-tienter og osteoarthritiske patienter indeholder hen-15 holdsvis kun 50 % (p = 0,001) og 66 % (p = 0,002) af kæderne galactose.

For yderligere at undersøge denne mangel på galactose bestemte man forholdet i hvert individuelt tilfælde mellem 20 digalactosyl og monogalactosylstrukturerne enten ved kromatografi af de galactosylerede oligosaccha'ridkæder på Ricinus communis agarose eller enzymatisk. I sidstnævnte tilfælde resulterede spaltning med såkaldte jackbønne 5-N-acetyl-hexosaminidase efterfulgt af P-4 gelpermeations-25 kromatografi i opløsning af fragmenter, som er diagnostiske for de digalactosylerede og monogalactosylerede strukturer. De indbyrdes forhold mellem digalactosyl og monogalactosyl strukturerne, som blev opnået ved begge metoderne, var indbyrdes overensstemmende og indikerede 30 en nedgang på 28 % (p mindre end 0,02) og 14 % (p mindre ned 0,15) henholdsvis for de rheumatoide og osteoarthritiske sialsyre-frie oligosaccharidblandinger.

For at bestemme, om det reducerede antal kæder, der inde-35 holdt galatose, var sekundært i forhold til en nedgang i ydrearm 5(1-2) bundet N-acetyl-glucosamin-rester, blev de ikke-galactosylerede strukturer fra hvert enkelt individ

DK 164417 B

19 underkastet P-4 kromatografi. I alle tre grupper fandt man indbyrdes tilsvarende profiler, hvilke viste, at der ikke var underskud med hensyn til ydrearm ¢(1-2) bundet N-acetyl-glucosaminrester (GlcNAc 5 og 5'). Dette blev 5 senere bekræftet enzymatisk. Der kan derfor ikke være nogen forskelle mellem individer uafhængig af deres sygdomstilstand med hensyn til omfanget af N-acetyl-glucos-aminylering.

10 Eftersom de negativt ladede N-acetyl-neuraminsyre-rester bibringer mobilitet i et elektrisk felt, underkastede man en prøve af den mærkede oligosaccharidblanding (forud for spaltning med neuraminidase) for papirelektrophorese med høj spænding. Oligosacchariderne blev fuldstændig separe-15 ret i neutrale, monosialylerede og disialylerede strukturer (fig. 5). Forekomsten af disse er anført i efterfølgende tabel 2, og de i disse tre grupper tilstedeværende strukturer er detaljeret vist på fig. 2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

De detaljerede fremgangsmåder til opnåelse af radioelek- 2 trophoretogrammerne af oligosacchariderne frigivet fra IgG fra forskellige individer, således som det er vist på 3 fig. 5, var som følger: man underkastede en prøve (5 x 4 6 3 5 10 cpm) af [ H]-oligosaccharider papirelektrophorese med 6 høj spænding (80 V/cm):pyridin:eddikesyre:vand (3:1:387 7 v/v), pH 5,4 (Camag HVE celle 61000). Efter undersøgelse 8 ved scanning med et "Berthold" LB280 radiokromatogram- 9 scannings-apparat eluerede man regionerne N (neutral), A- 10 1 (monosialylerede), A-2 (disialylerede), og man bestemte 11 værdien dpm i hver, hvilket gjorde det muligt for at be 12 regne mængdeforholdene i hver prøve. Analogsignalerne fra 13 scanneren blev digitaliseret under anvendelse af en 14

Nelson analytisk ADC interface, og de digitale værdier 15 blev opsamlet og analyseret under anvendelse af en mikro- 16 computer. Lactose (L); (2-3)-sialyllactose (SL); bromphe-nolblåt (BPB).

DK 164417 B

20

Inden for hver af undersøgelserne korrelerer uventet de to sygdomstilstande med en identisk nedgang i antallet af kæder, som er afsluttet med en eller to N-acetyl-neur-aminsyre-rester, på trods af de ikke-identiske ændringer 5 i niveauet for galactosyleringen. Omfanget af denne sænkning er imidlertid forskellig mellem de to undersøgelser [36 % nedgang i Oxf. (P = 0,001, OA og RA) og 12 % nedgang i Tok. (p = 0,002, 0A, p = 0,3 RA)].

10 15 20 25 1 35

DK 164417B

21

Tabel 1 % o 1 igosaccharidkæder manglende galactose i serum IgG*

Individuelle Osteo- Rheumatoid patienter Kontrol arthritis arthritis

Oxford Oxf1 26,6 0xf7 38,9 0xfl3 51,5 senerne 0xf2 23,9 0xf8 36j0 0xfl4 54j7

Oxf3 23,9 0xf9 26,5 0xfl5 41,9 0xf4 23,4 OxflO 35,2 Oxfl6 43,6

Oxf5 16,2 Oxfil 31,4 0xfl7 54,9

Oxf6 19,3 0xfl2 33,0 0xfl8 55,0

Tokyo Tokl 31,4 Tok6 32,2 Tokl2 44,3 ^eneme Tok2 26,8 Tok7 32,7 Tokl3 53,8

Tok3 38,9 Tok8 32,7 Tokl4 52,4

Tok4 25,4 Tok9 47,4 Tokl5 48,4

Tok5 23,3 ToklO 43,2 Tokl6 43,9

Tokll 32,4 Tokl7 47,9

Tokl8 74,5 Tokl9 56,2 Tok20 55,6 Tok21 51,8 Tok22 44,3 Tok23 38,7

Arithmetisk gennemsnit Oxf 22,09 - 3,7 33,5 - 4,3 50,1 - 5,9 - standard- Tok 2g 2 + 6 2 36,7 - 6,1 50,1 - 9,9

Samlet kontrol Bern-1 24,0 serum

DK 164417B

22 *Blodprøver i Oxford serierne blev opnået fra patienter på St. John's Highfield Hospital, Droitwich, U.K. og fra Queen Elizabeth Medical Centre, Birmingham, U.K. Patienterne 0xfl3 til og med 0xfl8 og Tokl2 til og med 5 Tok23 opfyldte de af American Rheumatism Association opstillede kriterier for defineret og klassisk rheumatoid arthritis. Oxf patienterne varierede i alder fra 50-75 år (gennemsnit RA 64 + 8 SD, OA 68 + 9 SD). Analyserne blev udført som dobbeltblind-analyser, idet de kliniske histo-10 rier først blev optaget efter afslutningen af oligosac-charidanalysen. I Oxford serierne var patienterne Oxf7, 13 og 14 positiv med hensyn til Rose-Waaler titer. Rose-Waaler testen er en specialiseret antiglobulin test, hvorved man anvender erythrocyter fra får, som er sen-15 sitiviceret med en subagglutinerende dosis af kaninens anti-fåre erythrocyt IgG. Rheumatoid faktor kombinerer med membranbundet IgG til fremstilling af agglutinin. Se Rose et al., Proc. Soc. Exper. Biol. & Med. 68, 1 (1948). Patienterne 0xf7 og 0xf8 havde haft osteoarthritis igen-20 nem lang tid, og havde fornylig vist tegn på en inflammatorisk komponent (henholdsvis 6 måneder og 9 måneder).

Bern-1 refererer til IgG fra en samling af serum fra adskillige tusinde individer, som blev doneret fra Dr. U. Nydegger fra Blood Transfusion Center of the Swiss Red 25 Cross, Bern, Schweitz. Ikke-galactosylerede oligosaccha-rider blev isoleret på følgende måde. Sialsyre-frie oli- 7 gosaccharider (1 x 10 cpm) fra IgG fra hvert individ blev overført til en Ricin CA-120 agarosesøjle (Miles-Yeda Ltd., Israel, fabrikationsnummer AR26) med dimensio-30 nerne 6 mm x 20 cm. Søjlen blev fremkaldt i 5 mmol natriumacetat (pH 5,6). Ikke-galactosylerede strukturer eluerede i det tomme afsnit, medens digalactosylerede og monogalactosylerede strukturer eluerede senere og i adskilte volumina. Antallet af galactoseenheder i hver top 35 blev fastlagt enten ved, at man lod toppen passere igen over den samme Ricin comminis agarosesøjle, eller ved at følge ændringen i hydrodynamisk volumen efter spaltning

DK 164417B

23 med såkaldt j ackbønne /5-N-ace tyl-hexosaminidase (14 μΜ substrat, 150 enheder ml ^ enzym i 0,1 M citrat phosphat, pH 4,5). Det hydrodynamiske volumen af digalactosyleret strukturer ændres ikke, medens volumen af mono-galactosy-5 lerede strukturer formindskes med 2 g.u., og volumen af strukturer uden galactose med ^ 4 g.u. For Oxford serierne var forskellene i de aritmetiske gennemsnit signifikante med p = 0,002 (C over for OA) og med p = 0,001 (C over for RA) og p = 0,002 (OA over for RA). For Tokyo-se-10 rierne var signifikansen p = 0,05 (C over for OA), p = 0,0007 (C over for RA) og p mindre end 0,0008 (OA over for RA). En forskel i de aritmetiske gennemsnit mellem de to serier blev ikke bedømt som værende statistisk signifikant. Forholdene mellem de digalactosylerede og monoga-15 lactosylerede strukturer, der blev opnået som ovenfor beskrevet, var som følger: C - 0,87 + 0,10; 0A - 0,75 + 0,14; RA - 0,63 + 0,12. Den statistiske signifikans af disse var C over for OA (p = 0,15), C over for RA (p mindre end 0,02), 0A over for RA (p = 0,1). Man gennem-20 førte en statistisk analyse under anvendelse af den ikke-parametriske statistiske prøve af sammensat orden (Wilcoxon - Mann - Whitney test som beskrevet af Lloyd, "Handbook of Application Mathematics", 6 Statistics, Del B, John Wiley and Sons, 1984. Sandsynlighederne er cite-25 ret for en to-delt test med en nul hypotese H^: = testet over for en alternativ hypotese Η^: μ^ = μ£· 1 35

DK 164417 B

24 TABEL 2 % oligosaccharid kæder indeholdende termi nal a(2-6) bundet N-acetyl-neuraminsyre * g Neutral Monosialyleret Disialyleret

Oxford Serierne

Kontroller 75,7 - 5,0 20,5 - 5,0 3,8 - 1,6

Osteoarthritis 84,7-1,8 13,7-1,5 1,7-0,7

Rheumatoid + arthritis · 85,2 - 1,1 12,6 - 1,2 2,2 - +0,6

Tokyp Serierne

Kontroller 75,6 - 0,8 17,8 - 2,1 6,6 - 1,6

Osteoarthritis 78,6 - 2,1 16,5-1,8 5,0-0,9 ic Rheumatoid + arthritis 78,4 - 4,4 15,2 - 3,2 6,5 - 1,5 20 *Se den ovenfor anførte beskrivelse til fig. 5. For at bekræfte, at alle strukturer til stede i A-l og A-2 stillingerne i fig. 5 indeholdt henholdsvis kun en og to 25 sialsyre-rester, anbragte man en prøve af de eluerede A-l og A-2 oligosaccharidfraktioner på en QAE - A25 Sephadex® søjle (6 nun x 10 cm). Prøverne blev tilført i 2 mmol ammoniumacetat (pH 5,3) og søjlen blev fremkaldt med en 2 mmol til 350 mmol lineær gradient af ammoniumacetat. Så-30 vel A-l som A-2 fraktionerne fra papirelektrophoresen førte til enkelte elueringstoppe svarende til standard-elueringsplaceringerne af henholdsvis monosialylerede og disialylerede oligosaccharider. QAE-A25 Sephadex® er en tværbunden dextran ionbytterharpiks med den funktionelle 3 5 gruppe diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethyl.

DK 164417 B

25

De ovenfor viste resultater viser, at osteoarthritis og især rheumatoid arthritis er forbundet med udprægede ændringer i niveauet for ydre arm galactosylering af kompleks N-bundne oligosaccharider i det totale serum igG.

5 Den absolutte grad af galactosylering blev fundet at være specifik for sygdomstilstande. Iagttagne ændringer i ga-lactosyleringen korrelerer i høj grad med begge sygdomstilstande (p = 0,002 OA over for C, p = 0,001 RA over for C) og mellem sygdomstilstandene (p = 0,002 0A over for 10 RA). Hvad der er vigtigt er, at man ikke fandt nogen hidtil ukendte oligosaccharidsekvenser som værende sammenknyttet med IgG fra nogen af de to arthritissygdomme. Mere signifikant end tabet af galactose (-33 % ved rheumatoid arthritis) er den forøgede blottelse ved den ikke-15 reducerende terminus af N-acetylglucosamin (-100 %). Idet man går ud fra fænomenet parring af oligosaccharider i Fc og dets restriktioner, afslører simple kalkulationer, at der ville være en konsekvent og udpræget forhøjelse i forekomsten af Fc molekyler, som fuldstændig mangler galac-20 tose (-300 % i rheumatoid arthritis og -60 % i osteoarthritis ). Således fører det hierachiske sæt af forandringer, som begynder med et ændret niveau af galactosylering, og som fortsætter gennem en ændring i de relative populationer af et konstant sæt af oligosaccharid-struk-25 turer, gennem parringsfænomenet til dramatiske ændringer i forekomsten af individuelle Fc sub-populationer. 1 35

Claims (1)

1. DK 164417 B *n Fremgangsmåde til diagnosticering af rheumatoid arthritis 5 eller osteoarthritis som eneste syndrom eller som en komponent i andre rheumatiske sygdomme, kendetegnet ved, at en reduktion i ydrearmsgalactosylering i en IgG-komponent eller fragment deraf på 34-59 % i en patients blodserum eller plasma eller ledvæske bestemmes 10 ved, at man analyserer for forekomsten af ikke-reduceren-de, terminale ydrearms-N-acetylglucosaminrester i IgG-komponenten eller fragmentet ved direkte kemiske, enzymatiske eller lectinbaserede undersøgelser på eksponeret N-acetylglucosamin eller indirekte ved bestemmelse af 15 f.eks. ændringer i molekylvægt eller hydrodynamisk volumen og sammenligner med tilsvarende normale kontrolværdier. 20 25 1 35