PT843821E - Processo para a caracterizacao da glicosilacao de glicoproteinas bem como para a determinacao in vitro da biodisponibilidade de glicoproteinas - Google Patents

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A CARACTERIZAÇÃO DA GLICOSILAÇÃO DE GLICOPROTEÍNAS BEM COMO PARA A DETERMINAÇÃO IN VITRO DA BIODISPONIBILIDADE DE GLICOPROTEÍNAS'' O objectivo da presente invenção é um processo para a caracterização da glicosilação de glicoproteinas bem como um processo in vitro para a determinação da biodisponibilidade de glicoproteinas, que se baseia no "número de carga hipotético" (a seguir designado por "Z") e que se pode aplicar tanto a glicoproteinas endógenas como a glicoproteinas exógenas.

Glicoproteinas exógenas são, neste contexto, por exemplo glicoproteinas terapêuticas recombinantes de células de mamíferos (por exemplo interleuquina 2, eritropoietina, activador de plasminogénio de tecidos ou antitrombina III) .

Estas substâncias têm despertado nos últimos anos um interesse considerável por parte de instituições científicas, farmacêuticas e governamentais.

Glicoproteinas endógenas são, neste contexto glicoproteinas de soro humanas ou não humanas (por exemplo bovinas) (como por exemplo glicoproteína ácida ai humana, transferrina humana ou fetuina bovina) e ainda glicoproteinas de outras espécies, como por exemplo ovomucoide de galinha ou tiroglobulina de porco. A investigação, desenvolvimento e produção de glicoproteinas terapêuticas bem como a sua autorização oficial ou clínica exige uma analítica dispendiosa do ponto de vista do tempo de meia 1 r vida in vivo, da segurança biológica, da definição do produto e da consistência de carga.

Neste contexto, desempenha até agora um papel importante como parâmetro principalmente o teor em ácido sialinico (ácido N-acetilneuramínico, Neu5Ac), uma vez que se parte do principio de que a presença ou ausência de Neu5Ac codetermina decisivamente o tempo de meia vida de circulação de uma glicoproteina no sangue ou a sua clearance. A investigação exacta das cadeias laterais de hidratos de carbono de uma glicoproteina exige aliás uma análise muito dispendiosa e complexa, que necessita de uma grande escala de "expertise" e de infraestruturas instrumentais (como por exemplo GC-MS, FAB-MS e espectroscopia de 1H-NMR de alta resolução).

Principalmente as entidades responsáveis pela autorização de glicoproteinas terapêuticas (por exemplo EPO) continuam a exigir, por razões de segurança, a determinação extremamente difícil, morosa, cara e imprecisa da eficácia terapêutica da glicoproteina em experiências com animais (testes in vivo). Seria vantajoso contudo dispor de um teste in vitro, que por um lado fosse simples e fiável na sua execução e por outro lado satisfizesse as elevadas exigências legais dos agentes da autoridade.

Em relação à execução de determinações complementares consegue-se já em determinada escala substituir os demorados e dispendiosos métodos da glico-analítica por métodos cromatográficos padronizáveis (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 203, 281-289; idem, ibid., (1992) 206, 419-429). Contudo, não houve até agora nenhum parâmetro que satisfizesse as exigências das autoridades competentes como substituto de um teste in vivo para a biodisponibilidade de uma glicoproteina. 2

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f\ Ο problema técnico que estava na base da presente invenção era por isso o de disponibilizar um processo in vitro que seja .adequado para determinar__. _o. __grau_ de___.glieo.silação de. uma- glicoproteína de modo tão simples e fiável, que o processo seja apropriado para substituir os processos in vivo conhecidos por exemplo para a determinação de biodisponibilidade e de consistência de carga. A solução deste problema técnico consegue-se com a disponibilização das formas de concretização caracterizadas nas reivindicações da patente.

Verificou-se surpreendentemente que Z se correlaciona extraordinariamente e de forma muito reprodutível com a biodisponibilidade / actividade biológica de uma glicoproteína determinadas pelo processo in vivo.

Devido à boa reprodutibilidade e à precisão analítica pode utilizar-se Z vantajosamente também num processo para a determinação da consistência de carga.

As presentes investigações permitem concluir que através de Z se pode caracterizar o "estado de glicosilação". Por isso, por meio da determinação de Z pode comparar-se a glicosilação de uma forma simples.

Por "estado de glicosilação" de uma glicoproteína entende-se no âmbito da presente invenção a composição do total de glicanos em glicanos bi-, tri- e tetra-antenários e respectivo grau de sialiliação (teor em ácido N-acetilneuramínico ligado) bem como o teor em grupos sulfato ou fosfato.

Por biodisponibilidade de uma glicoproteína terapêutica entende-se a capacidade do terapêutico desenvolver in vivo a sua 3 actividade biológica ou eficácia terapêutica. Em consequência disto, determinam-se quantitativamente a biodisponibilidade e a -ae-t-i-vidade -bi-o-lóg-ica-a—partir do comportamento—de—clearance_ in vivo, ou seja da libertação do terapêutico a partir da circulação sanguínea. Por exemplo, é conhecido para o EPO que, no caso de um erro do ácido N-acetilneuramínico situado no extremo da cadeia de açúcar N-glicosídica, ele é rapidamente libertado da circulação sanguínea através dos chamados "receptores assialo" no fígado, não podendo assim exercer a sua acção biológica. O Z de uma glicoproteína terapêutica correlaciona-se de uma maneira surpreendente com o tempo de meia vida in vivo da glicoproteína e representa por isso um parâmetro de medida completamente novo, que permite avaliar com antecedência o comportamento de clearance expectável da glicoproteína terapêutica de carga para carga, de um modo muito simples. Em consequência disso Z possibilita também fazer uma previsão sobre a segurança biológica expectável para a glicoproteína de carga para carga e a sua eficácia terapêutica. Por isso, através da determinação de Z de uma glicoproteína terapêutica de carga para carga, pode prescindir-se por exemplo da determinação difícil, morosa, cara e imprecisa da eficácia terapêutica da glicoproteína em experiências com animais (testes in vivo). Isto permite além disso uma nova e considerável contribuição para a redução de experiências com animais e deste modo para uma melhor protecção dos animais. Ao mesmo tempo, Z representa uma medida particularmente adequada para a consistência de carga.

Surpreendente e de valor especial é também o facto de, no caso de glicoproteínas endógenas, por exemplo no caso de uma glicoproteína de soro humana, na qual a glicosilação varia com uma doença, se poder definir Z como um parâmetro de medida \ \7 diagnóstico que se correlaciona com a doença e que permite por isso fazer uma previsão sobre a gravidade da doença. Tal é válido para doenças--inflamatórias-,- por exemplo—para a "glicoproteína de fase aguda", como por exemplo a glicoproteina ácida ai, da qual se sabe que a glicosilação se modifica com o aparecimento de uma inflamação (De Graaf et al. (1993) J. Exp. Med. 177, 657-666) . Isto é também o que acontece em doenças tumorais, nas quais o teor em ácido sialinico ligado a proteínas (e com ele a glicosilação) varia com o progresso da doença tumoral (Shahangian et al. (1991) Clin. Chem. 37, 200-204).

Por exemplo, determinando o Z de uma glicoproteína associada ao tumor de um paciente sofrendo de tumor, pode fazer-se uma previsão sobre o estado da doença tumoral, partindo da observação de que a sialiliação se modifica durante o crescimento do tumor (Shahangian et al., ibid, pag. 200).

Num volume especial do Glycokonjugate J. (Vol. 12, N° 3, Junho 1995) publicou-se uma série de artigos que confirmam que a glicosilação de determinadas glicoproteínas se modifica com uma doença. Assim, por exemplo a α-fetoproteína é apropriada para o reconhecimento precoce do hepatocarcinoma (Aoyagi, ibid., pag. 194-199), o antigene de hidratos de carbono circulante relacionado com os grupos sanguíneos como marcador tumoral (0rnot e Bech, ibid., pag. 200-205), o inibidor de proteinase ai e a hepatoglobina para o diagnóstico do carcinoma do ovário (Turner et al., ibid., pag. 211-218), a transferrina para a caracterização do líquido cérebro-espinal para o diagnóstico de perturbações alcoólicas hereditárias e do "carbohydrate deficient glycoproteine syndrome" (De Jong et al., ibid., pag. 219-226), bem como glicoformas da glicoproteína ácida ai para o 5

diagnóstico de inflamações e do cancro (Mackiewicz & Mackiewicz, ibid., pag. 241-247).

Em todos estes e outros diagnósticos pode empregar-se vantajosamente Z para a determinação de estados patológicos de um paciente.

Essencial para a invenção é o conhecimento de que a distribuição dos grupos glicano unitários quanto à carga, em especial os de diferente grau de sialiliação (assialo a pentassialo), é um indicador decisivo para a biodisponibilidade de uma glicoproteina e para a consistência de carga. É por isso essencial para a invenção que os grupos glicano unitários quanto à carga sejam ponderados de acordo com a sua carga, em especial de acordo com o seu grau de sialiliação. Em resumo, estes componentes são ponderados através do valor Z. 0 Z de uma glicoproteina pode determinar-se muito bem e com precisão, por exemplo por meio de um processo cromatográfico optimizado e padronizado, como foi brevemente descrito (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem., 203, 281-289). 0 Z de uma glicoproteina determina-se a) libertando e isolando a totalidade de glicanos da glicoproteina de modo em si conhecido, quer por via química (por exemplo por meio de hidrazinólise) quer por via enzimática (por exemplo de PNGase F), b) separando primariamente estes, de modo em si conhecido, por meio de cromatografia de permuta iónica (de preferência por meio de HPEA-PAD), segundo a carga, 6 \

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c) determinando as áreas percentuais dos picos ou grupos glicano separados segundo a carga, de modo em si ---- cenhee-ido-,----- - — ------------------------- d) multiplicando as áreas percentuais dos picos ou grupos glicano em zonas neutra (assialo, as), monossialo (MS) , dissialo (DiS), trissialo (TriS), tetrassialo (TetraS) e pentassialo (PentaS) por zero (assialo), 1 (MS), 2 (DiS), 3 (TriS), 4 (TetraS) ou 5 (PentaS), e e) somando cada um dos produtos obtidos.

Com vista à determinação de Z, podem libertar-se as cadeias de açúcar ligadas a Asn das glicoproteínas, de modo em si conhecido, em principio de dois modos - quer por via química (por exemplo por meio de hidrazinólise) quer por via enzimática (por exemplo por meio de N-Glicanase ou PNGase F) . 0 processo enzimático exige de caso para caso condições reaccionais optimizadas, como uma digestão tripla prévia da glicoproteína ou a adição de um detergente apropriado. Também a hidrazinólise necessita de um "know-how" especial quando se deseja minimizar as reacções secundárias. Pode efectuar-se contudo hoje em dia com um aparelho da firma Oxford GlycoSystems (o GlycoPrep 1000) de uma maneira completamente automática.

No HPAEC separam-se primariamente os N-glicanos segundo a carga, isto é, segundo o número de grupos ácido sialínico (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 203, 281-298), razão pela qual este método é preferencialmente adequado para a determinação de Z de glicoproteínas.

Verificou-se assim que, fazendo o "mapping" do total de N-glicanos de glicoproteínas por meio de HPAE-PAD se podem agrupar os glicanos de igual carga - isto é, em geral glicanos com o mesmo número de grupos Neu5Ac - na maior parte dos casos em grupos de picos separados uns dos outros. Isto encontra-se 7

representado exemplificativamente no exemplo do total de glicanos de rhu IL (CHO) (Figura 1) . Revelou-se nesse caso va-liosa a utilização de-do-i-s—padrões—internos-,-dos quais-um—(-S1__ = por exemplo LNnT ou LNFP-V, Oxford GlycoSystems) elui antes dos picos individuais do total de glicanos e o outro [S2 = (Neu5Ac)3] elui depois dos picos individuais do total de glicanos, de modo que os glicanos detectados se encontram já na gama de TR entre os dois padrões e se pode determinar facilmente a respectiva área total de picos, que corresponde a 100%, por meio do software de tratamento dos dados de cromatografia. A área total dos picos obtém-se assim por integração e soma dos picos que se encontram entre os tempos de retenção dos dois padrões SI e S2. Do mesmo modo se podem agrupar de modo integrado os grupos de picos separados segundo a carga com 0, 1, 2, 3, 4 e 5 cargas negativas e calcular a respectiva área de grupos de picos "F" como parte percentual da área total de picos da totalidade de glicanos. Para tal, considera-se para todos os glicanos o mesmo factor de resposta. O cálculo do número de carga hipotético Z efectua-se de acordo com a equação I: Z = F (as) * 0 + F(MS)*1 + F(Dis)*2 + F(TriS)* 3 + F (TetraS) * 4 + F(PentaS)*5 (I) em que F(as), F(ms), F(Dís)í F(Tris) r F(Tetras) e F(pentas> representam respectivamente as partes percentuais das áreas de grupos de picos na gama assialo, monossialo, dissialo, trissialo, tetrassialo e pentassialo, em relação à área de picos = 100%.

Deste modo, obtém-se para uma glicoproteina que apresenta maioritariamente estruturas tetraantenéras tetrassialo (C4-4*), como por exemplo a eritropoietina recombinante, um Z de cerca de 400. Do mesmo modo, obtém-se para uma glicoproteina que 8 \

Γ\ 1 > \ apresenta maioritariamente estruturas triantenéras trissialo (C3-3*), como por exemplo a fetuina bovina, um Z de cerca de 300 e pa-ra----uma— glicoproteina que---apresenta - -maioritariamente estruturas biantenéras dissialo (C2-2*), como por exemplo a antitrombina humana III, um Z de cerca de 200. Para uma glicoproteina que por exemplo apresenta apenas estruturas assialo, como por exemplo a ribonuclease B de pâncreas de vaca, ou que apresenta as chamadas "trunkated forms" (estruturas tronco), como por exemplo a ovomucoide de galinha, obtém-se um Z de cerca de 0.

Do ponto de vista analítico é desejável separar primeiro por via cromatográfica o total de glicanos isolado a partir de uma glicoproteina, segundo o grau de sialiliação, antes de, conforme a necessidade, empregar outros métodos de separação. Tal pode efectuar-se por meio de colunas de permuta aniónica, como por exemplo Glycopac™ DEAE (Waters), Mono Q™ (Pharmacia), Gen-Pak™ FAX (Waters) ou por meio de HPEAC (high-pH anion-exchange chromatography) em resinas de permuta aniónica peliculares (CarboPak PA-l™ ou CarboPak PA-100™, Dionex) (Lee e Rice (1994) em: "Glycobiology - A Practical Approach", Cap. 3C, pag. 127-163, IRL Press, Editor: Fukuda e Kobata).

Demonstrou-se brevemente que a "high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection" (HPAE-PAD) preenche os critérios de um método cromatográfico rápido, económico e principalmente reprodutível para o ordenamento estrutural de cadeias de oligossacáridos de glicoproteina? de modo preferencial (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 203, 281-289; Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 206, 419-429). Segundo este processo efectua-se a separação dos oligossacáridos em condições alcalinas numa coluna de permuta aniónica (CarboPac PA-1 ou CarboPac PA-100 da firma Dionex). Este processo separa 9

'S os N-glicanos isolados a partir da glicoproteína primeiro segundo a sua carga e possibilita assim uma previsão sobre a composição -do --tota-1—de- -N--gli canos de estruturas—neutras---- (assialo) bem como de estruturas mono-, di-, tri- e tetra-sialo (ou seja N-glicanos com zero a quatro grupos ácido neuraminico carregados negativamente). A determinação dos açúcares efectua-se de modo muito selectivo e sensitivo, e sem derivatização dos glicanos, por detecção amperométrica pulsada num eléctrodo de ouro. A determinação de Z validou-se como exemplo em numerosas experiências com rhu I1-4R (uma glicoproteína terapêutica da firma Behringwerke AG). Pôde assim demonstrar-se que o número de carga hipotético pode ser considerado como um novo parâmetro eficaz de previsão, fiável e característico para a glicosilação de proteínas.

Em seguida encontram-se vários exemplos para a determinação de Z a partir dos cromatogramas de HPAE-PAD obtidos. Para tal, libertaram-se e isolaram-se os glicanos de várias glicoproteínas, de modo em si conhecido, quer por meio de hidrazinólise automática (utilizando o GlycoPrep 1000™, Oxford GlycoSysyems, OGS), quer por via enzimática (por meio de PNGase F) ou compraram-se à firma Oxford GlycoSystems directamente como "pools" de glicanos e quantificaram-se por meio de HPAE-PAD em gradientes padrão "S" (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 203, 281-289). A determinação de Z apresenta-se exemplificativamente no exemplo do cromatograma de rhu IL-4R (Figura 1); o cálculo correspondente encontra-se na Tabela 1. Em todos os restantes exemplos a determinação de Z efectua-se de modo análogo. 10

A determinação de Z para a glicoproteína ácida ai (AGP) distancia-se um pouco da determinação para as restantes glicoproteínas mencionadas, porque—a--AGP--apresenta -nos seus N-glicanos grupos fucose antenáreos (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 206, 419-429). Tais N-glicanos eluem no HPAEC em gradientes padrão "S", em comparação como os N-glicanos correspondentes não fucosilados, cerca de 4 minutos mais tarde. Por isso, no caso do total de N-glicanos da AGP não ocorre a separação nítida, observada nos outros exemplos, em grupos de picos unitários segundo a carga, mas sim uma sobreposição destes grupos de picos (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 206, 419-429). A determinação do número de carga hipotético efectuou- se no caso da AGP por analogia com o ordenamento de picos segundo a carga de acordo com Hermentin et al. (1992) (Anal. Biochem. 206, 419-429) . Deste modo se determinou o Z nos exemplos 9 e 10.

Nos casos em que os N-glicanos de uma glicoproteína para além de grupos ácido neuramínico contêm também por exemplo grupos sulfato, efectua-se a determinação de Z por exemplo de modo que os grupos de picos separados segundo a carga que se situam no cromatograma na gama de 6 ou 7, sejam multiplicados por 6 ou 7.

Os valores de Z determinados para uma série de glicoproteínas apresentam-se na Tabela 3.

Os exemplos a seguir apresentados não restringem a invenção. Exemplo 1:

Validação da determinação de Z com rhu IL-4R (CHO) (carga E4-930914) 11 a) Validação com 1,0 mg de rhu IL-4R por reactor de hidrazinólise A determinação de Z validou-se com rhu IL-4R (CHO) como glicoproteina de referência. Para tal libertou-se e isolou-se o "pool" de glicanos da amostra de I1-4R (carga E4-930914, Behringwerke AG) em 3 dias diferentes e em seis misturas reaccionais diferentes, por meio de hidrazinólise automática -na presença de LNPF-V como padrão interno SI - (Glycoprep 1000™, Oxford GlycoSystems; hidrazinólise simultânea em ambos os reactores; cada mistura reaccional com 1 mg de IL-4R por reactor). Cada um dos 6 pools de glicanos foi dessalinizado sobre Sephadex G-25 superfino (Pharmacia) (enchimento da coluna 21x1 cm) e quantificado três vezes (em três dias diferentes, sempre sob adição de S2 = (Neu5Ac)3, por HPAE-PAD, e a partir dos respectivos cromatogramas obtidos determinou-se o Z com base na equação 1. Na Tabela 1 apresentam-se detalhadamente as respectivas partes de áreas de picos integradas para cada um dos 18 varrimentos individuais de HPAE-PAD, bem como a respectiva soma efectuada de acordo com a equação 1. Como exemplo ilustrativo e varrimento de referência serve o cromatograma "maping" de HPAE-PAD da Figura 1.

Nesse caso determinou-se Z para a referida amostra de IL-4R, obtendo-se Z = 201+/-3 (VK = 1,4%) com uma reprodutibilidade muito elevada (Tabela 2). b) Validação com 0,50 mg de rhu IL-4R por reactor de hidrazinólise

Numa segunda experiência de validação efectuou-se e quantificou-se a hidrazinólise em seis misturas reaccionais diferentes de modo análogo ao do exemplo la) com 0,5 mg de rhu IL-4R por \ Γ\

I κ

I / reactor. Determinou-se ο valor de Ζ como Ζ = 194+/-5 (VK = 2,3%) (Tabela 2).

Tabela 1: Determinação de Z do perfil de mapping de rhu IL-4R (CHO) (carga E4-9300914) da Figura 1

File N° Grupo de picos N° Tempo de retenção do pico mais alto (min) Gama de integração (Grupo de picos) Parte percentual da área de grupos de picos (%) Multipli cador Parte de grupos de carga 0940964K.D42 1 12,57 Assialo/alto Manose 9,70 0 0 2 19,23 Monossialo (MS) 23.31 1 23,31 3 29, 69 Dissialo (DiS) 31, 81 2 63, 62 4 33, 73 Trissialo (TriS) 25, 38 3 76, 14 5 39, 44 Tetrassialo (TetraS) 9, 81 4 39, 24 Area total de picos 100,01 Número de carga 202

Exemplo 2:

Determinação do Z de rhu I1-4R (CHO) (carga E4-930914) após digestão com PNGase F, sem e com CHAPS

A libertação dos N-glicanos efectuou-se após redução da glicoproteina (500 μg) por meio de ditioeritrol (DTE; 25 μΐ de uma solução aquosa 0,3 M de DTE) durante 10 minutos a 70°C. O 13

excesso de DTE removeu-se por concentração num cartucho Centricon com limite de exclusão de 10.000 D (firma Amicon) e o concent-rado—lavou--se- três vezes -com—tampão -de -digestão_de glicanase em tubos Centricon. Transferiu-se depois o concentrado para células de Eppendorf e digeriu-se em tampão de digestão de glicanase (500 μΐ) a) com e b) sem a presença de 0,5% de CHAPS por meio de PNGase F (Boheringer Mannheim; 5 unidades) em tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,6 durante 48 horas a 37°C.

Após dessalinização de modo análogo ao do exemplo la, determinaram-se os seguintes valores de Z: a) (sem CHAPS): Z = 208; b) (com CHAPS): Z = 206 (Tabela 2). Pôde assim demonstrar-se que por adição do detergente CHAPS não se consegue obter qualquer melhoria da desglicosilação. c) Em alternativa, procedeu-se à carboxamidometilação da rhu IL-4R após redução com ditiotreitol (DDT) e digeriu-se com tripsina, como descrito por Hermentin et al. {Anal. Biochem. (1992), 206, 419). Em seguida, procedeu-se à libertação dos glicanos de modo análogo ao do exemplo 2b) na presença de 0,5% de CHAPS. O valor de Z determinado foi Z = 200 (Tabela 2). d) De modo análogo ao do exemplo 2c) efectuou-se a digestão de rhu IL-4R com o enzima Lys C em vez do enzima tripsina.

No restante, procedeu-se como no exemplo 2c) . O valor de Z determinado foi Z = 204 (Tabela 2). 14

O valor médios dos números de carga determinados de acordo com os exemplos 2a) a 2d) é de Z = 204,5±3,4 (VK = 1,7%) (Tabela 2).

Estes quatro números de carga estão em boa concordância com o número de carga médio determinado nos exemplos la e lb após hidrazinólise automática, Z = 201 (la; 1,0 mg de IL-4R por reactor) ou Z = 194 (lb, 0,5 mg de IL-4R por reactor) (Tabela 2).

Tabela 2

Validação da determinação de Z por meio de rhu IL-4R como glicoproteina modelo

Carga Preparação do pool de glicanos z Determin. individual Z Valor médio Desvio padrão VK N° de experiências N° de varr. HPAE-PAD Exemp. E4- 930914 GlycoPrep (1,0 mg/reactor) 201 + /-3 1, 4% 6 18 la E4- 930914 GlycoPrep (0,5 mg/reactor) 194 + /-5 2, 3% 6 18 ' lb E4- 930914 PNGase F (sem CHAPS) 208 2a E4- 930914 PNGase F (com 0,5% de CHAPS) 206 2b E4- 930914 PNGase F (tripsina/ com 0,5% de CHAPS) 200 204,5 +/-3,4 1,7% 4 4 2c E4- 930914 PNGase F (Lys/com 0,5% de CHAPS) 204 2d 15 <Γ"-

X

Bll- 930406 GlycoPrep (0,5 mg/reactor) 243 3 Bll- 930406 PNGase F (sem CHAPS) 241 4a Bll- 930406 PNGase F (com 0,5% de CHAPS) 246 243,5 +/-3,5 1,5% 2 2 4b

Exemplo 3:

Determinação de Z de rhu IL-4R (CHO) (carga Bll-930406) após hidrazinólise automática A hidrazinólise efectuou-se de modo análogo ao do exemplo lb com 0,5 mg de rhu IL-4R.

Para o valor de Z determinou-se Z =* 243.

Exemplo 4:

Determinação de Z de rhu IL-4R (CHO) (carga Bll-930406) após digestão com PNGase F, com e sem CHAPS A libertação dos N-glicanos efectuou-se de modo análogo ao dos exemplos 2a) ou 2b).

Determinaram-se os seguintes valores de Z: a) (sem CHAPS) Z = 241; b) (com 0,5% de CHAPS) Z = 246; valor médio Z = 243,5 ± 3,5 (1,5%) /Tabela 2).

Estes dois valores de Z estão em boa concordância com o número de carga Z = 243 determinado no exemplo 3a após hidrazinólise, de modo que para a carga Bll-930406 de rhu IL-4R se pode atribuir um valor Z = 243 (Tabela 2). 16

Verificou-se assim que o material do clono Bll-930406 (Z = 243) (exemplos 3 e 4) em relação ao material do clono E4-930914 (Z = 240,5) (exemplos 1 -e 2) em iguais condições-—de.__cuLtura.,____ colheita e purificação - apresentam uma maior percentagem em glicanos mais carregados ou mais antenéreos.

Exemplo 5:

Uma comparação de Z com parâmetros glico-analiticos em si conhecidos, bem como o comportamento de clearance in vivo de uma glicoproteina no modelo do ratinho

Separou-se uma preparação de receptor de interleuquina-4 murino, solúvel em água, obtido a partir de células BHK (rmur IL-4R, Behringewreke AG), de modo em si conhecido, através de uma resina de permuta aniónica /Q-Sepharose, Pharmacia) em 5 fracções Q1-Q5 (Figura 2). A analítica de cada uma das fracções (focagem isoelectrica, determinação de ácido sialínico, teor em componentes monossacárido) efectuou-se de modo em si conhecido. 0 padrão de bandas IEF analisou-se de modo em si conhecido por meio de um software de tratamento de gel. Os conjuntos de bandas obtidos encontram-se apresentados na Figura 3. Os dados analíticos obtidos de modo em si conhecido encontram-se apresentados na Tabela 3. A determinação do teor em ácido N-acetilneuraminico (Neu5Ac; ácido sialínico) efectuou-se de acordo com Hermentin e Seidat (em: GFB Mongraphs, Vol. 15, pag. 185-188, H. S. Conradt, ed., VCH, Weinheim / New York / Cambridge). A determinação de monossacáridos efectuou-se de modo em si conhecido de acordo com Hardy et al. (Anal. Biochem. (1988) 170, 17

54-62). A partir do resultado da análise de monossacáridos determinou-se o quociente Neu5Ac/Gal (mol/mol).

Observação:

Uma vez que o Neu5Ac em N-glicanos normais se encontra já ligado a grupos galactose antenéreos, o quociente Neu5Ac/Gal (mol/mol) possibilita uma determinação do teor em galactose terminal. A galactose terminal dos N-glicanos influencia por sua vez o comportamento de clearance de uma glicoproteína, uma vez que as glicoproteinas com galactose terminal nos N-glicanos são eliminadas a partir do sangue através do chamado receptor assialo no fígado. 0 grau de sialiliação (Neu5Ac/Gal; mol/mol) permite assim fazer uma previsão sobre a clearance expectável de uma glicoproteína no fígado. A determinação do grau de sialiliação revela-se contudo relativamente imprecisa, uma vez que no grau de sialiliação as variâncias de ambos os testes (determinação de Neu5Ac e de Gal) se adicionam. Por isso, é necessário um parâmetro mais preciso, que descreva o comportamento de clearance de uma glicoproteína numa aplicação in vivo. A partir do resultado da análise de monossacáridos calculou-se ainda o quociente entre a composição molar em manose e galactose (Man/Gal; mol/mol), que dá uma indicação sobre a composição dos N-glicanos de estruturas "high-mannose" e "complex-type".

Observação: A razão Man/Gal permite também fazer uma previsão sobre o comportamento de clearance expectável de uma glicoproteína, uma vez que as glicoproteinas com estruturas "high mannose" também são eliminadas da circulação sanguínea através de um receptor no fígado (o chamado receptor "high mannose"). Uma vez que o teor em estruturas "high mannose" está envolvido no cálculo do número 18

de carga hipotético de acordo com a equação 1, o valor de Z reflecte também o teor em estruturas "high mannose" e permite ---assim- fazer—também -uma previsão sobre—a—clearan.ce-através do receptor "high-Man". 0 valor de Z determinou-se para cada uma das fracções de modo análogo ao do exemplo 1.

Tabela 3:

Neu5Ac (ug/mg) NeuAc/Ga (mol/mol) Man/Gal (mol/mol) AUD (ug/ml*min) CL (ml/min) Z Inicio: 78,5 0,54 1,28 42,7 0,23 Não det. Fracção Q1 13, 6 0,20 3,02 0,8 10,0 147 Fracção Q2 38,2 0,42 1,99 5,3 2,00 191 Fracção Q3 82,9 0,62 1,24 33,6 0,29 238 Fracção Q4 109,5 0, 67 1,04 63,7 0,16 . 248 Fracção Q5 108, 6 0,63 0,98 85,9 0,12 247

Além disso, testaram-se as fracções individuais, de modo em si conhecido, em relação ao seu comportamento de clearance no modelo do ratinho (AUD) (Tabela 3).

Para tal, injectaram-se aliquotas das fracções individuais em ratinhos e seguiu-se a clearance de mur IL-4R a partir do sangue dos ratinhos pelo método ELISA. 19

A taxa de clearance de IL-R4 determinou-se como se segue:

Ratinhos fêmea BALB/C receberam na veia da cauda uma injecção Bolus de IL-4R- (10 -μς> 0,2 μq/kq). Ginco, 10 e 30-minutos- após-a aplicação retiraram-se, por meio de punção do complexo venoso retroorbital, amostras de sangue para recuperação do soro. A concentração de IL-4R em cada amostra de soro determinou-se pelo método ELISA. A curva da concentração de IL-4R determinada no soro em função do tempo (AUD5_30) traçou-se utilizando a chamada regra do trapézio (Koch (1985), Apoth. Ztg-, 29, Série 17, Abril 1975) . A partir desta calculou-se a clearance inicial (Cl5-3o) de acordo com a equação CI5-30 = Dose/AUD5-3o.

Resultado:

Como se verifica pelos "scans" das bandas de IEF apresentados na Figura 3, observam-se no IEF diferenças de variação continua no padrão das bandas das glicoformas para as fracções Q1 a Q4, enquanto que as fracções Q4 e Q5 no IEF não se revelam distinguíveis. A focagem isoelectrica oferece contudo a desvantagem de quantitativamente não ser ou ser apenas muito pouco esclarecedora e por isso, numa primeira aproximação, constitui apenas um parâmetro de medida qualitativo. O teor em ácido sialínico aumenta continuamente da fracção Q1 (13,6 μg/mg) para a fracção Q4 (109,5 μg/mg) , enquanto que se mantém praticamente idêntico nas fracções Q4 e Q5 (Tabela 3). Os resultados da determinação de ácido sialínico correlacionam-se por isso bem com os resultados da focagem isoelectrica.

De modo análogo ao teor em ácido sialínico, embora de modo não tão pronunciado, aumenta também o grau de sialiliação (quociente Neu5Ac/Gal) da fracção Q1 (0,20 grupos Neu5Ac por grupo galactose) até à fracção Q4 (0,67 grupos Neu5Ac por grupo 20

galactose), mas diminui contudo na fracção Q5 (0,63 grupos Neu5Ac por grupo galactose) até ao valor da fracção Q3 (0,62 grupos - Neu5Ac por grupo- galactose-)--. (Tabela--3). . Esta queda do. -valor da análise da fracção para o valor da fracção Q3 não se observou quer na determinação do ácido sialinico quer na focagem isoelectrica. É assim de admitir que o grau de sialiliação (Neu5Ac/Gal; mol/mol) representa um parâmetro menos fiável do que a determinação de Neu5Ac ou que a focagem isoelectrica, porque no quociente do grau de sialiliação as imprecisões dos dois testes isolados (isto é, a determinação do ácido neuramínico e a análise dos componentes monossacáridos) se adicionam.

Ao contrário, o quociente Man/Gal diminui continuamente da fracção Q1 (3,02 mol/mol) até à fracção Q4 (1,04 mol/mol) e mantém-se praticamente constante na fracção Q5 dentro da precisão da medida (0,98 mol/mol) (Tabela 3). O quociente Man/Gal, devido à sua variação continua da fracção Q1 à fracção Q5, parece mais uma vez ser um parâmetro fiável e com o qual se podem fazer previsões, analogamente à determinação de Neu5Ac e à focagem isoelectrica. 0 valor de Z determinado de acordo com a equação 1 ou com o exemplo 1, aumenta, como esperado, paralelamente ao teor em ácido sialinico, e varia continuamente de Z = 147 (fracção Ql) até Z = 248 (fracção Q4), enquanto se mantém constante da fracção Q4 (Z = 248) até à fracção Q5 (Z = 247) (Tabela 3). Assim, a determinação de Z reflecte muito bem tanto os resultados da determinação de ácido sialinico, como a variação qualitativa da focagem isoelectrica e parece (como a determinação de Neu5Ac e o IEF) ser superior à determinação do grau de sialiliação (Neu5Ac/Gal; mol/mol) . (No exemplo 6 que se 21 \ Γ\ ? S*"O‘ segue, mostra-se que a determinação de Z se revela também superior comparada com a determinação de Neu5Ac). 0 comportamento de clearance (AUD, "area under data"; pg/ml*min) das fracções Q1 a Q5 foi também determinado de modo em si conhecido. Neste caso, o tempo de meia vida de circulação da IL-4R no sangue do rato é tanto maior quanto maior a AUD. Como se pode concluir da Tabela 3, a AUD aumenta continuamente da fracção Q1 (AUD = 1) até à fracção Q5 (AUD = 86). Obtém-se assim uma boa correlação da AUD com o IEF, com o teor em ácido sialinico, com o quociente Man/Gal (mol/mol) e com Z, para as fracções Q1 a Q4. Apenas para a fracção Q5 se obtém um desvio da AUD em relação aos parâmetros de medida mencionados. Verificou-se assim que a clearance se correlaciona estreitamente com o número de carga e que Z - em comparação com um padrão adequado -permite fazer uma boa previsão sobre o comportamento de clearance expectável de uma glicoproteina em aplicação in vivo.

Observação:

Se este desvio da AUD em relação aos restantes parâmetros de medida analíticos se trata de um comportamento real ou de um artefacto (fuga), não pôde ser reproduzido por falta de material. Além disso, há que ter em conta que, por razões de protecção animal, a AUD se determinou sempre com apenas um rato por ponto de medida de AUD, o que torna relativa a fiabilidade do valor de AUD em comparação com os valores das medições analíticas.

Resultado: 0 valor de Z para a previsão do comportamento de clearance expectável de uma glicoproteina in vivo, tem a vantagem especial de Z de acordo com a equação 1, abranger tanto a clearance 22 expectável através do receptor assialo como também a clearance expectável através do receptor high-Man, permitindo assim uma —prev-i-são mais precisa—sobre.....o. comportamento de clearance expectável, do que qualquer outro dos métodos de análise mencionados.

Exemplo 6: Z e a estabilidade ao armazenamento de rhu IL-4R (CHO)

Para a determinação da capacidade de armazenamento de IL-4R em meio de colheita de fermentador, armazenaram-se aliquotas das colheitas a várias temperaturas (RT, +4°C, -20°C e -70°C). Ao tempo zero bem como após 1, 2 e 3 meses recolheram-se aliquotas. A partir destas aliquotas purificou-se a I1-4R, de modo em si conhecido, por meio de cromatografia de afinidade num anticorpo monoclonal anti-IL-4R imobilizado. Para cada uma das amostras de IL-4R purificadas determinou-se o teor em ácido neuraminico bem como o Z (de modo análogo ao do exemplo 1). Os resultados apresentam-se na Figura 4.

Como se verifica na Figura 4a, o Z para as amostras armazenadas a -70°C e -20°C revelou-se constante, mas diminui claramente com o aumento de tempo de armazenamento para as amostras armazenadas a +4°C e à RT de forma massiva.

Os resultados da determinação de ácido neuraminico (Figura 4b) são claramente de menor valor de previsão, embora se consiga reconhecer uma tendência análoga à do número de carga. Conclui-se assim que a determinação do número de carga é superior à do ácido neuraminico do ponto de vista analítico. A vantagem reside na maior precisão com que se consegue determinar o número de carga, com a vantagem especial de, para a determinação do número 23

de carga - ao contrário da determinação do ácido neuramínico -não ser necessário recorrer à concentração de (glico)proteína, pe-lo-que -a -incerteza da· determinação da - proteína—não_ interfere no resultado do teste. Pôde assim demonstrar-se que o Z é extraordinariamente adequado como parâmetro para testar a estabilidade ao armazenamento de uma glicoproteína.

Exemplo 7:

Determinação de Z de rhu EPO (BHK) A libertação dos N-glicanos efectuou-se a partir de rhu EPO (BHK) (Merckle AG) por meio de PNGase F, de modo em si conhecido (Nimtz et al., Eur. J. Biol. (1993) 213, 39-56). 0 Z determinou-se de modo análogo ao do exemplo 1, sendo Z = 323 (Tabela 4).

Observação:

Nimtz et al. {Eur. J. Biol. (1993) 213, 39-56) investigaram intensivamente a glicosilação de rhu EPO (BHK) (Merckle AG) num detalhado estudo analítico (por meio de GC-MS, FAB-MS e 1H-NMR). Segundo este estudo, o pool de N-glicanos do referido rhu EPO (BHK) contem 40,9% de N-glicanos tetra-sialiliados, 35,0% de tri-sialiliados e 21,1% de di-sialiliados. A partir destes dados, utilizando a equação 1, calcula-se para o pool de N-glicanos um valor de Z de Z = 40,9x4+35,0x3+21,1x2 = 311.

Surpreendentemente, este valor de número de carga, calculado de acordo com os dados de Nimtz et al., de Z = 311, está em excelente concordância com o valor de número de carga calculado de acordo com o exemplo 1, de Z = 323. A diferença entre ambos 24 .-.--7- os números de carga é de 12, o que corresponde a uma diferença percentual inferior a 4%. A determinação do número de carga de acordo com- -o exemplo— 1—é—contudo—comparativamente- muito ma is económica, rápida e simples. Assim, Z revela-se como um novo e muito útil e vantajoso parâmetro de medida para a caracterização do estado de glicosilação de uma glicoproteína.

Exemplo 8:

Determinação de Z de rhu EPO (CHO) A libertação dos N-glicanos efectuou-se a partir de rhu EPO (CHO) (Boheringer Mannheim) por meio de PNGase F, de modo em si conhecido (Nimtz et al., ibid). 0 Z determinou-se de modo análogo ao do exemplo 1, sendo Z = 361 (Tabela 4).

Observação:

Watson et al. (Glycobiology (1994) 4, 227-237) investigaram a glicosilação de rhu EPO (CHO) também num estudo analítico detalhado. Segundo este estudo, os N-glicanos da referida rhu EPO (CHO) encontram-se sialiliados acima de 90%, o que em comparação com a BHK-EPO do exemplo 9, esclarece o elevado número de carga.

Watson et al. (ibid) separaram o pool de N-glicanos obtido após digestão com PNGase F, por meio de uma coluna de permuta aniónica Glycopak™ DEAE da firma Waters. 0 cromatograma apresentado na Figura 1 da publicação de Watson et al. (pag. 228) utilizou-se no âmbito da presente invenção para a determinação de Z de acordo com a equação 1. Aí, determinou-se para a CHO-EPO da Amgem Z = 367, o que está em muito boa 25

concordância com o número de carga Z = 361, determinado no exemplo 8 para a CHO-EPO da Boheringer Mannheim.

No trabalho de doutoramento de C.H. Hokke (Hokke et al. (1993), em Hokke, C.H. "Strucure determination of glycoprotein glycans" (doctoral thesis, pag. 51-90) está descrito o esclarecimento detalhado da estrutura de açúcares da rhu EPO (CHO) da firma Organon Technika. Ai demonstrou-se para esta EPO que em 18-20% dos N-glicanos faltava um grupo ácido neuraminico e em 3% dos N-glicanos faltavam dois grupos ácido neuraminico. Os dados apresentados por Hokke permitiram no âmbito da presente invenção o cálculo de Z como Z = 286. Este número de carga, em relação ao Z da CHO-EPO da Amgen Z= 367) e ao Z da CHO-EPO da Boheringer Mannheim (Z = 361) e ainda ao Z da BHK-EPO da Merckle (Z = 323), é claramente inferior. Por esta razão, pode atribuir-se à CHO-EPO da firma Organon Technika uma clearance claramente mais elevada e - com ela relacionada - uma eficácia biológica claramente menor.

Observação:

Como referido nos exemplos anteriores e no texto introdutório, a glicosilação (e com ela o número de carga) pode variar de carga para carga conforme o modo de obtenção da glicoproteina correspondente. Isto é confirmado mais uma vez nos exemplos 9 e 10.

Exemplo 9:

Z e a comparação de vários pools de N-glicanos de AGP

Hermentin.et al. (Anal. Biochem. (1992) 206, 419-429) efectuaram uma comparação de pools de N-glicanos de AGP preparados por vias diferentes (carga 281184, Behringwerke AG) e compararam-nos com 26 /

/) t V. uma "N-Glycan Library" de AGP obtida comercialmente (LB-001, OGS) . Os respectivos cromatogramas de HPAE-PAD-Mapping foram publicados—(Hermentin. et al-. , ibid).. Na--referi da—publicação demonstrou-se que os cromatogramas de mapping se distinguem entre si como consequência da perda de ácidos N- acetilneuramínicos ligados, o que foi documentado por uma sobreposição dos cromatogramas de mapping (Hermentin et al., ibid, Fig. 5).

No âmbito da presente invenção determinou-se retrospectivamente o número de carga de cada um dos cromatogramas de mapping de AGP publicados por Hermentin et al. (ibid, Fig. 5) (de modo análogo ao do exemplo 1) . Verificou-se assim o aumento do número de carga, como se segue • Run a: Z = 248 (LB-001, OGS; "hydrazinolysis- derived") Run b: Z = 262 ("large-scale hydrazinolysis", 50 mg AGP) Run c: Z = 276 ("large-scale hydrazinolysis", 1000 mg AGP) Run d: Z = 285 ("automated hydrazinolysis", 2 mg AGP) Run e: Z = 289 ("PNGase F-derived after previous tryptic AGP digest"). 0 valor de Z dos ensaios confirma, pelos seus diferentes valores numéricos, a natureza diferente dos pools de glicanos. Confirma também ainda a descoberta da semelhança dos cromatogramas dos ensaios d e e, feita por Hermentin et al. (ibid.) através da comparação dos cromatogramas de mapping. Isto reforça mais uma vez a capacidade de previsão, a utilidade e a enorme vantagem do número de carga Z. 27 Ç\

Exemplo 10: Z e-a digestão de AGP- com-JPNGase^ F_ ___________

Observação: É conhecido da AGP que os respectivos N-glicanos se conseguem cindir apenas incompletamente com PNGase F sem digestão tríptica prévia e/ou sem adição de detergentes especiais (Nuck et al. (1990), Glycoconjugate J. 7, 279-286). No exemplo 10 mostra-se que se pode verificar a obtenção incompleta do pool de N-glicanos da AGP (por meio de PNGase F) através do cálculo do número de carga (de modo análogo ao do exemplo 1):

Para tal isolaram-se os N-glicanos de AGP (como descrito nos exemplos 7 e 8) após 48 horas de incubação com PNGase F. Determinou-se o número de carga do pool de N-glicanos isolado, de modo análogo ao do exemplo 1, sendo Z = 248. Este valor situa-se claramente abaixo do valor determinado de acordo com o exemplo 9 de Z = 289 ("Run e"). Pode assim concluir-se claramente com base nos números de carga que, por incubação de AGP com PNGase F de acordo com o exemplo 10 (ou seja, sem a digestão tríptica prévia de AGP utilizada no exemplo 9), os N-glicanos mais altamente carregados são particularmente difíceis de cindir.

Isto confirma mais uma vez a capacidade de previsão, a utilidade e a enorme vantagem do número de carga Z e o seu significado como parâmetro diagnóstico para o estado de glicosilação de uma glicoproteína. Por exemplo, através da determinação do Z de AGP de dadores individuais, pode fazer-se uma previsão sobre o grau de uma inflamação (De Graf et al., J. Exp. Med. (1993), 177, 657-666) . 28

Exemplo 11: Z-de -várias—glicoproteínas ______ _______ ____________________

Uma vez que Z se revela como um novo e muito útil e conveniente parâmetro de medida para a caracterização do estado de glicosilação de uma glicoproteina, apresentam-se na Tabela 4 como exemplo os números de carga de várias glicoproteínas, determinados de modo análogo ao do exemplo 1. A origem de cada glicoproteina e a preparação ou origem de cada pool de N-glicanos (preparação por meio de hidrazinólise ou de PNGase F ou adquiridos à firma Oxford GlycoSystem (OGS), Abingdon,

Inglaterra) indicam-se também na Tabela 4.

Deste modo, Z é adequado de forma muito vantajosa para a caracterização do estado de glicosilação de uma glicoproteina.

Glicoproteina Origem da Glicoproteina Origem do Pool de glicanos Z rhu EPO (CHO) Boehringer Mannheim PNGase F 361 rhu EPO (BHK) Merckle PNGase F, 323 Fetuina de soro de vitela fetal Sigma "large scale"-hidrazinólise 256 Fetuina de vaca Sigma GlycoPrep 290 Ribonuclease B de pâncreas de vaca Oxford Glyco Systems (OGS) 15 Ovomucoide de galinha OGS 15 Tiroglobulina dé porco OGS 82 Glicoproteina ácida alfa-1 humana BWH AG (Behrinwerke AG) GlycoPrep 289 29 7

Transferrina de soro humana OGS 207 An t i t r ombima-111 humana BW AG ________ _ GlycoPrep______ 18-0. Fibrinogénio humano OGS 184 Glicoproteina alfa-l-T BW AG GlycoPrep 187 Antitripsina alfa-1 BW AG GlycoPrep 190 Antiquimotripsina alfa-1 BW AG GlycoPrep 236 Glicoproteina-I beta-2 BW AG GlycoPrep 185 Glicoproteina TB6 BW AG GlycoPrep 208 Glicoproteina alfa-l-B BW AG GlycoPrep 194 Glicoproteina alfa-2-HS BW AG GlycoPrep 158 Glicoproteina 8S-alfa-3 BW AG GlycoPrep 145 Haptoglobulina BW AG GlycoPrep 137

Descrição das Figuras Figura 1 A Figura 1 mostra o perfil de mapping de N-glicanos de rhu IL-4R (carga E4-930914) após separação por meio de HPAE-PAD em condições padrão, de acordo com Hermentin et al., Anal. Biochem. 203 (1992), pag. 281-289.

Observação:

Sl: padrão interno 1 S2: padrão interno 2 30

Os glicanos encontram-se no cromatcgrama entre Sl e S2. Os picos antes de Sl resultam da hidrazinólise; os picos depois de S2 são de nabureza-d.esconhecida. . .... ___________________ . .

Figura 2 A Figura 2 mostra o fraccionamento de mur IL-4R (carga 018PP) por meio de cromatografia de permuta aniónica em Q-Sepharose FF.

Figura 3 A Figura 3 mostra a focagem isoelectrica (IEE) das fracções de mur IL-4R, carga 018PP, obtidas em Q-Sepharose, de acordo com a Figura 2.

Os dados analíticos respectivos encontram-se na Tabela 3.

Figura 4 A Figura 4a mostra a diminuição de Z, a Figura 4b a diminuição do teor em NANA, de rhu IL-4R, no sobrenadante de cultura, por armazenamento à temperatura ambiente (RT), +4°C, -20°C e -70°C.

Lisboa, 7 de Dezembro de 2001

®*AGENTE OFICIAL DA PROPRJEDADE INDUSTRIAL 31

Claims (15)

1. , J > 7 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a caracterização da glicosilação de uma glicoproteina, através dum número de carga hipotético (Z), que se obtém a) isolando o pool (total) de glicanos, b) separando-o primariamente por meio de cromatografia de permuta iónica segundo a carga, c) determinando a parte de área percentual dos grupos de picos (dos glicanos) separados de acordo com a carga, d) multiplicando a parte de área percentual dos grupos de picos na zona neutra (assialo), monossialo (MS), dissialo (Dis(, trissialo (TriS), tetrassialo (TetraS) e pentassialo (PentaS), respectivamente por zero (assialo), 1 (MS), 2 (DiS), 3 (TriS), 4 (TetraS) ou 5 (PentaS) e e) somando os respectivos produtos obtidos.
2. 2. Processo para a determinação in vitro da biodisponibilidade de uma glicoproteina em que o número de carga para a glicoproteina, obtido segundo o processo de acordo com a reivindicação 1, se correlaciona com um valor padrão que se obteve numa determinação in vivo.
3. 3. Processo para a determinação in vitro da biodisponibilidade de uma glicoproteina em que o número de carga para a glicoproteina, obtido segundo o processo de acordo com a reivindicação 1, se correlaciona com um valor padrão que se obteve por cálculo. 1 r Γ· Ο-
4. 4. Processo para a determinação da consistência de carga de uma glicoproteina, em que o número de carga para a _ glicoproteina.,obtido. _seg.undo_o _pr.oces.so de acordo___c.om_ a.. reivindicação 1, se correlaciona com um valor padrão que se obteve pelo processo de acordo com a reivindicação 1 para uma preparação padrão.
5. 5. Processo para a determinação da consistência de carga de uma glicoproteina, em que o número de carga para a glicoproteina, obtido segundo o processo de acordo com a reivindicação 1, se correlaciona com um valor padrão que se obteve por cálculo.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a libertação do pool de N-glicanos a partir da glicoproteina se efectuar por hidrazinólise.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a libertação do pool de N-glicanos a partir da glicoproteina se efectuar por via enzimática.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cromatografia de permuta iónica ser uma HPAE-PAD (high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection).
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 1 para a caracterização do estado de glicosilação de uma glicoproteina.
10. 10. Processo de acordo com as reivindicações 2 ou 3 para testar a biodisponibilidade de uma glicoproteina. 2
11. 11. Processo de acordo com as reivindicações 4 ou 5 para testar a consistência de carga de uma glicoproteina produzida por ... _ tecnologia _c.e iular. . . .. ______________ _________ _ ____
12. 12. Utilização de um processo de acordo com a reivindicação 1 como meio auxiliar de diagnóstico ou como meio de diagnóstico.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 1 para testar o estado p>atológico de uma espécie através do estado de glicosilação de uma glicoproteina caracteristica da doença
14. • 14 . Processo de acordo com a reivindicação 1 para testar o estado patológico de um doente através do estado de glicosilação de uma glicoproteina caracteristica da doença.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a libertação se efectuar por meio de PNGase F. Lisboa, 7 de Dezembro de 2001 ENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL