FI88341B - Foerfarande foer diagnostisering av ledgaongsinflammationer - Google Patents

Foerfarande foer diagnostisering av ledgaongsinflammationer Download PDF

Info

Publication number
FI88341B
FI88341B FI860284A FI860284A FI88341B FI 88341 B FI88341 B FI 88341B FI 860284 A FI860284 A FI 860284A FI 860284 A FI860284 A FI 860284A FI 88341 B FI88341 B FI 88341B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
igg
fragment
galactose
oligosaccharides
rheumatoid arthritis
Prior art date
Application number
FI860284A
Other languages
English (en)
Other versions
FI860284A0 (fi
FI860284A (fi
FI88341C (fi
Inventor
Raymond A Dwek
Thomas W Rademacher
Original Assignee
Monsanto Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Co filed Critical Monsanto Co
Publication of FI860284A0 publication Critical patent/FI860284A0/fi
Publication of FI860284A publication Critical patent/FI860284A/fi
Publication of FI88341B publication Critical patent/FI88341B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI88341C publication Critical patent/FI88341C/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/827—Lectins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Vessels, Lead-In Wires, Accessory Apparatuses For Cathode-Ray Tubes (AREA)
  • Control Of El Displays (AREA)

Description

88341
Menetelmä niveltulehdussairauksien diagnosoimiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää niveltulehdussairauksien diagnosoimiseksi. Erityiesti keksintö koskee me-5 netelmää nivelreuman tai luu-niveltulehduksen diagnosoimiseksi joko ainoana oireyhtymänä tai muiden reumaattisten sairauksien komponenttina määrittämällä galaktoosln vajaus niveltulehduspotllaan IgGtssä.
Nivelreuma on paljon esiintyvä krooninen systeeml-10 nen tauti, johon arvellaan liittyvän autolmmuunlkomponent-tl [katso esim. Kunkel ja Tan, Adv. Immunol. 4 (1964) 351-395]. Sitä, Indusoiko tämä Immuunivaste taudin, tekee sen pysyväksi vai on taudin seurausta, el tällä hetkellä tiedetä. Sekä humoraallsten että sellulaaristen mekanismien 15 on tähän asti oletettu kuuluvan taudin niveleen kohdistuviin ja nivelten ulkopuolisiin ilmenemisiin. Luu-niveltulehdus on niveltauti, jonka uskotaan olevan erilainen kuin nivelreuma, jolloin luuvaurio on seurausta ruston degeneroitumisesta. Tämän degeneraation on ajateltu olevan joko 20 ruston pääasiallinen sairaus tai sekundaarivaste ruston-alaisen luun stressin indusoimme mikromurtumille. Molempien tautien erotusdiagnoosi tehdään yleisesti kliinisen kertomuksen ja radiologisten kriteerien perusteella.
Nivelreumassa esintyy immunoglobuliini (Ig)-kom-·; 25 plekseja, jotka muistuttavat klassisia antigeenillä indusoituja immuunikomplekseja kykynsä suhteen aktivoida klassinen komplementtitie, stimuloida makrofagien opsonoiva aktiivisuus, herättää välitön yliherkkyys ihonalaisesti injisoitaessa ja vastaavien vaikutustensa osalta. Nämä 30 kompleksit sisältävät yksinomaan lmmunoglobuliineja, mikä merkitsee, että immunoglobuliini on sekä "vasta-aine" (reumaattinen tekijä) että "antigeeni”. Kuitenkin nämä kompleksit eroavat normaaleista lmmuunikomplekseista siinä, että sitomlskohdalla (reumaattisten tekijöiden Fab-: 35 alue) on alhainen affiniteetti kyseessä olevaan determl- 2 88341 nanttiin, homologinen assosiaatio on etusijalla (IgG-reu-maattiset tekijät) ja erityisesti siinä että valtaosa reumaattisista tekijöistä (IgM, IgA, igG) sitoutuvat ^-luokan lmmunoglobuliineihin. Sen vuoksi on väitetty, että nivel-5 reumapotilailla on rakenteellinen muutos luokan immuno-globuliineissa (IgG), mistä seuraa antigeenisesti ja oletettavasti immunologisesti aktiivinen alapopulaatio (katso Kunkel ja Tan, supra). Se, että tämä antigeeninen determinantti todella on olemassa ja sijaitsee muuttuneen 10 IgG:n C^2 -alueella, on osoitettu reumaattisen tekijän Fab-ryhmien kapasiteetilla sitoutua ainoastaan Fc:hen (vakio-osaan), joka kantaa yhden tai molemmat sen Cj^-alueis-ta. Tämä ja useat muut todisteet ovat johtaneet näkökantaan, että nivelreumapotilailla kompleksit käsittävät 15 Fab-Fc (IgG)-vuorovaikutuksia. On myös väitetty, että suuri osa immuunikomplekseista nivelreumapotilaan seerumissa sisältää vallitsevasti, ellei poikkeuksetta, itseassosioi-dun, muuttuneen IgG:n. Näin ollen että ne IgG-molekyylit, joiden Fab-alueella on anti-IgG-aktiivisuutta, sisältävät 20 myös rakenteellista epänormaalisuutta Fc-alueellaan. Se näkökanta, että tämä anti-IgG-aktiivisuus on seurausta epänormaalia IgG-alapopulaatiota vastaan kehittyneestä auto-vasta-aineesta on kiistetty toisten tutkijoiden taholta, joiden esittämät tiedot osoittivat, että IgG:n it-25 seassosiaatio ei ollut seurausta todellisista vasta-aine-antigeeni-vuorovaikutuksista (ei autoimmuuni-ilmiö).
Fc-alueen molekylaariset muutokset, jotka ovat aiheuttaneet näitä ilmiöitä, on tutkittu lähinnä käyttäen reumaattisia tekijöitä eniten spesifisinä saatavilla ole-30 vina koettimina. Kuitenkin IgG:n ja IgM:n reumaattisilla tekijöillä on kaksi arvoituksellista ominaisuutta. Ensinnäkin, ne eivät reagoi pelkästään saman (sairaan) yksilön IgG:n kanssa, vaan suuressa määrin myös normaalien yksiköiden IgG:n kanssa ja vieläpä muiden lajien IgG:n kanssa 35 (esim. jänis, rhesus-apina). Tämä merkitsee sitä, että Fc- 3 88341 sidoskohta joka on osassa nivelreumapotilaiden IgGrtä, esiintyy myös IgG:ssä, joka on saatu potilailta, joilla tauti ei ole aktiivisessa vaiheessa, mutta oletettavasti latentissa muodossa. Toiseksi, joillakin potilailla anti-5 IgG-aktiivisuus on assosioitunut suuren osan (25 %) kanssa kokonais-IgG määrää ja muodostuneet kompleksit muodostavat yli 50 %. Kolmanneksi, reumaattinen tekijä-IgG-vuorovaikutukset ovat poikkeuksetta monovalenttisia huolimatta tavallisesta käsityksestä, että IgG on rakenteellisesti sym-10 metrinen molekyyli ja sillä tulisi siten aina olla parillinen luku determinantteja. Vaikkakin eteeriset pakotteet reumaattisen tekijän ja kohde-IgG:n välisessä vuorovaikutuksessa saattaisivat olla vastuussa tästä monovalenssis-ta, on mahdollista, että IgG:n glykosylaatio itse asiassa 15 tekee monet molekyylit rakenteellisesti asymmetrisiksi (vaikka ne yhä tosiasiassa ovat symmetrisiä polypeptidien suhteen). Jos jälkimmäinen olisi totta, voisi Fc:n antigeeniseen determinanttiin liittyä oligosakkaridi jollain tavalla.
20 Ei ole olemassa todisteita, jotka osoittaisivat aminohappomuutoksia IgG:n Fc-alueella niveltulehduspoti-lailla. Useat raportit ovat kuitenkin esittäneet, että seerumin kokonais-IgG tai IgG-reumaattinen tekijä potilailla, joilla on immuunikompleksisairaus (reumaattinen 25 niveltulehdus, systeeminen punahukka), on epänormaali mitä tulee sen hiilihydraattisisältöön [katso Pope et ai., J. Immunol. 115, (1975) 363-373; Hymes et ai., J. Biol. Chem. 254, (1979) 3148-3151; ja Duo Dodon et ai., Immunol. 42, (1981) 401-407]. Näistä julkaisuista ei käy selville, ; 30 kuinka immuunikompleksin epänormaalisuutta voidaan käyt tää, jos yleensä voidaan, nivelreuman diagnosoitiin. Yleisesti käytetyt menetelmät nivelreuman diagnosoimiseksi perustuvat serologisiin reaktioihin, joissa kaikissa on gammaglobuliinia jossain muodossa tai plasmasta tai seeru-: 35 mistä saatava Cohn Fraction II-komponenttia, joka suurelta 4 88341 osin on gammaglobuliinia. Jos potilaan seerumi on positiivinen taudin suhteen, aiheuttaa niin kutsutun reumaattisen tekijän läsnäolo agglutinaation tai immuunisaostuksen, joita voidaan verrata kontrollinäytteisiin. Sellaiset 5 reaktiot voidaan määrittää erilaisilla hyvin tunnetuilla varmistavilla testeillä, joihin kuuluvat esimerkiksi elektroforeesi, Coombs'in (antiglobuliini) hemagglutinaa-tion inhibitiotesti, presipitlinireaktio, geelidiffuusio, immunoelektroforeesi, nefelometria, radioimmunomääritys ja 10 virtaussytometria.
Tyypillisenä komponenttina reumaattisen tekijän agglutinaatiomäärityksessä tulee kysymykseen inerttlen kantajapartikkelien käyttö, esimerkiksi lateksipartikke-lien. Tämän määrityksen kuvasivat ensin Singer ja Plotz, 15 Amer. J. Med. 21 (1956) 888-892. Lateksitestin muunnoksia kuvataan US-patentissa 3 088 875 ja lukuisissa muissa patenteissa ja julkaisuissa. Kaupallisia esimerkkejä näistä lateksitesteistä reumaattiselle tekijälle ovat Behring Diagnostics'in "Rapi-tex", Hyland Diagnostics'in "RA-TEST" 20 ja Organon Diagnostics'in "Rheumanosticon".
Lisää taustatietoa näistä nivelreuman tavanomaisista diagnostisista testeistä voi saada teoksesta Rose ja Friedmani, Manual of Clinical Immunology, American Society for Microbiology, Washington, D.C., toinen painos, 25 1980. Katso erityisesti Horan ja Schenk, "Flow Cytometric
Analysis of Serum Autoantibodies Applied to the Detection of Rheumatoid Factor", luku 9, ss. 56-59; Agnello, "Method for Detection of Immune Complexes Utilizing Clq or Rheumatoid Factors", luku 21, ss. 178-185; ja Froelich ja 30 Williams, "Tests for Detection of Rheumatoid Factors", luku 117, ss. 871-873. Katso myös Schur, "Immune-complex assays: The state of the art", New England Journal of Med. 298 (1978) 161-162.
Huolimatta merkittävästä tieteellisestä tutkimus-: 35 työstä alalla, on ilmeistä, ettei mikään diagnostinen 5 88341 testi nivelreumalle ole täysin luotettava. Huomattavalta prosenttiosuudelta klassisia potilaita, joilla on tauti, puuttuu reumaattinen tekijä. Niin muodoin olisi parannetulla menetelmällä reumaattisten tautien ja vastaavien 5 tilojen diagnosoimiseksi huomattavaa käyttöä.
Tämän keksinnön mukaisesti esitetään menetelmä tautien diagnosoimiseksi, joihin liittyy niveltulehduskom-ponentti, kuten esimerkiksi reumaattinen niveltulehdus ja luu-niveltulehdus. Menetelmä käsittää galaktoosin vajaukio sen määrittämisen potilaan veren seerumista tai plasmasta tai nivelnesteestä tai Ig-komponentista tai sen fragmentista verrattuna vastaavaan galaktoosin normaaliin arvoon.
Galaktoosin vajaus johtaa ei-pelkistävien terminaalisten N-asetyyliglukosamlinitähtelden läsnäolon lisäänty-15 miseen. Näin ollen voidaan määrittää (a) Ig:n N-kytketty-jen oligosakkaridirakenteiden, joissa on uloimman sakaran galaktoosi, prosentuaalinen osuus tai (b) ei-pelkistävien terminaalisten uloimman sakaran N-asetyyliglukosamiini-tähteiden prosentuaalinen osuus. Nämä edulliset määrityk-20 set voidaan suorittaa kokonaisella Ig:llä, kuten esimerkiksi XgG, tai sen fragmentilla. Fragmentit voivat olla esimerkiksi H-ketju, Fc tai glykopeptidit tai intaktit Ig:n oligosakkaridit tai Ig:stä peräisin olevat oligosak-karidifragmentlt.
·;· 25 Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että määritetään IgG-komponentln tai sen fragmentin uloimman sakaran galaktosyloitumisen vajaus potilaan veren seerumista tai plasmasta tai nivelnesteestä analysoimalla mainitun IgG-komponentin tai -fragmentin ei-pelkistävien 30 terminaalisten uloimman sakaran N-asetyyliglukosamiini-tähteiden esiintyvyys ja verrataan normaaleihin kontrolli-arvoihin.
Kuvaavia esimerkkejä yllä olevan määrityksen (a) suorittamiseksi ovat: : 35 suorat entsymaattiset tai lektiinipohjaiset galak- toosimäärltykset, kuten esimerkiksi 88 341 6 (i) suorat entsymaattiset galaktoosimääritykset käyttäen ekso-B-galaktosidaaseja tai galaktoosioksidaasia ja (ii) suorat galaktoosin lektiinimääritykset käsit- 5 täen Ricin communis-agglutiniinin.
Kuvaavia esimerkkejä yllä olevan määrityksen (b) suorittamiseksi ovat: suorat kemialliset, entsymaattiset tai lektiini-pohjaiset vapaan N-asetyyli-glukosamiinin määritykset, 10 kuten esimerkiksi (i) suorat entsymaattiset B-N-asetyyli-glukosamii-nin määritykset käyttäen ekso-B-N-asetyyliheksoosiamini-daaseja ja (ii) suorat B-N-asetyyliheksosamiinin lektlinimää- 15 ritykset käyttäen vehnän alkion agglutiniinia.
Keksintö voidaan myös toteuttaa epäsuorilla menetelmillä, kuten esimerkiksi määrittämällä muutokset mole-kyylipainossa tai hydrodynaamisessa tilavuudessa. Se merkitsee, että määritykseen voi sisältyä lg:n tai minkä ta-20 hansa sen fragmentin kaikkien kompleksisten oligosakkari dien sekvensointi, lg:n ei siaalihappoa sisältävän tai neutraalin oligosakkaridifraktion profiilin analyysi tai muutokset Xg:n tai sen fragmenttien glykopeptidien mole-kyylipainossa.
25 Keksinnön mukaisesti on havaittu, että: 1. Seerumin IgG:n uloimman sakaran galaktoosin B (1-4)-määrä vähenee 50 %:iin (p = 0,001) reumaattisen nivelreumapotilaan ei siaalihappoa sisältävässä oligosak-karidifraktiossa ja 41 %:iin (p * 0,001) nivelreumapoti-30 laan neutraalissa oligosakkaridifraktiossa. Käänteisesti lisääntyy ei-pelkistävän terminaalisen uloimman sakaran B (1-2)-kytketyn N-asetyyliglukosamiinin määrä.
2. Uloimman sakaran galaktoosin määrä laskee 66 %:iin (p = 0,002) luu-niveltulehduspotilaiden ei siaa-35 lihappoa sisältävässä populaatiossa ja 59 %:iin luu-nivel-tulehduspotilaiden neutraalissa oligosakkaridipopulaatios- 7 88341 sa. Käänteisesti lisääntyy ei-pelkistävän terminaalisen β (1-2)-kytketyn uloimman sakaran N-asetyyliglukosamiinin määrä.
Vaikka keksintö on yksityiskohtaisesti kuvattu se-5 lityksessä ja patenttivaatimuksissa uskotaan, että keksintö voidaan helpommin ymmärtää seuraavan kuvauksen ja siihen liittyvien kuvioiden avulla, joissa lyhyesti:
Kuvio 1(a) esittää vasta-aine-(IgG)-molekyylin rakennetta kaavamaisessa muodossa.
10 Kuvio 1(b) esittää immunoglobuliinialueen ja täy sin ojentuneessa muodossa olevan N-kytketyn kompleksisen oligosakkaridin suhteellisen koon.
Kuvio 2 esittää kaaviomaisesti ihmisen IgG:n N-kytkettyjen oligosakkaridien sekvenssit. Kunkin rakenteen 15 (tai sen neutraalin johdannaisen sialyloiduissa tapauksissa) hydrodynaaminen tilavuus (mitattuna glukoosiyksikköi-nä - g.u.) on esitettynä. KaavamuotoiSten symbolien koodi on esitettynä alemmassa laatikossa. Komposiittirakenteen esittävät myös Rademacher et ai., Biochem. Soc. Trans. 11 20 (1983) 132-134.
Kuvio 3 esittää tyypillisiä (a) kontrollin, (b) nivelreuma- ja (c) luu-niveltulehduspotilaiden seerumin kokonais-IgG:n ei siaalihappoa sisältävien oligosakkaridien Bio-Gel P-4 (-400) geelipermeaatiokromatogrammeja.
25 Kuvio 4 esittää kahdessa tutkimussarjassa kontrol lien, nivelreuma- ja luu-niveltulehduspotllalden seerumin kokonals-IgG:n ei siaalihappoa sisältävien oligosakkaridien neljän ydinrakenteen suhteellisen esiintymisen.
Kuvio 5 esittää kontrollin, nivelreuma- ja luu-ni-30 veltulehduspotilaiden IgG:n oligosakkaridien tyypillisiä radioelektroforeesigrammej a.
Seuraavat yksityiskohtaiset esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä, vaikkakin tulee ymmärtää, etteivät nämä spesifiset kuvaavat esimerkit rajoita keksintöä.
• 35 Näissä esimerkeissä käytetään tavanomaisia hiili hydraattien lyhenteitä ja nimistöä. Näin ollen seuraavia 8 88341 symboleja käytetään kuvaamaan monosakkaridiyksikköjä ja niiden tähteitä oligosakkarideissa:
Glukoosi - Glc Galaktoosi - Gal 5 Mannoosi - Man
Fukoosi - Fuc
Glukonihapot, glukuronihapot, 2-amino-2-deoksisak-karidit ja niiden N-asetyylijohdannaiset on esitetty muunnetuilla symboleilla. Esimerkiksi: 10 N-asetyyliglukosamiini - GlcNAc N-asetyylineuramiinihappo - NeuNAc Yksikköjen välisten sidosten asemaa ja luonnetta esitetään numeroilla ja anomeerisilla symboleilla a ja B. Nuolia käytetään osoittamaan glykosidisidoksen suuntaa 15 nuolen osoittaessa poispäin sidoksen hemlasetaalihiilestä. N-glykosidisia proteiinisidoksia sisältävien oligosakkaridien tavallista haaroittunutta ydintä voidaan esimerkiksi esittää seuraavasti: 20 Man a( l->6)
ManB(l-*4)GlcNAcB(l-*4)GlcNAc
Man
Myös aminohapot esitetään niiden tavallisilla sym-25 boleilla. Esimerkiksi: L-asparagiini - Asn L-seriini - Ser L-treoniini - Thr
Samaten esitetään vasta-aineen rakennetta tavan-30 omaisella nimistöllä. Xmmunoglobuliini (IgG)-molekyylit koostuvat kevyistä (L) ja raskaista (H) ketjuista. Kullakin viidellä Ig-molekyyliluokalla on samanlaiset kevyt-ketjuryhmät, mutta antigeenisesti selvästi erottuva ras-kasketjuryhmä, Joka on nimetty vastaavin kreikkalaisin 35 kirjaimin (^-ketjut IgGrssä, μ IgM:ssä, a IgA:ssa, 6 IgDrssä, £lgE:ssä). N-terminaalisten homologiayksikkö- 9 88341 jen aminohapposekvenssi vaihtelee suuresti molekyylien välillä, ja se tunnetaan nimellä vaihteleva (V) alue erotuksena molekyylien muuttumattomasta (c, vakio) alueesta. Kevyt- ja raskasketjujen N-terminaaliset homologiayksiköt 5 on merkitty VL:llä ja VH:lla, vastaavasti. Papaiinilla hajotetun vasta-ainemolekyylin fragmentteja on nimetty antigeeniä sitovana fragmenttina (Fab) ja kiteytyvänä fragmenttina (Fc), kun taas pepsiinihajotuksessa saatuja fragmentteja, joilla on pieniä eroja, kutsutaan nimillä Fab' 10 (yksiarvoinen fragmentti) ja F(ab')2 (kaksiarvoinen fragmentti ).
Keksinnön havainnollistamiseksi tutkittiin artriit-tipotilaista eristetyn kokonais-IgG:n glykosylaatiomallia yksityiskohtaisesti. Tämän aloittivat tutkijat Oxfordissa 15 Englannissa, ja sitä suoritettiin sitten yhteisissä tutkimuksissa, joita johdettiin samanaikaisesti Oxfordissa Englannissa ja Tokiossa Japanissa, ja joissa tutkimuksissa analysoitiin eri yksilöiden seerumin kokonais-IgG:n N-kyt-kettyjä oligosakkarideja. Molemmissa tutkimuksissa verrat-20 tiin toisiinsa kolmea yksilöryhmää - normaalikontrolleja, luu-niveltulehdus- ja nivelreumapotilaita. Tulokset, joiden saamiseksi määritettiin yli 1200 primaarioligosakkari-disekvenssiä 42:sta IgG-näytteestä, osoittivat, että ni-velreumatautitila korreloi huomattavaan muutokseen ihmisen ..': ‘ 25 IgG:lle ominaisten oligosakkaridisekvenssien galaktosylaa-tion määrässä. Lisäksi luu-niveltulehduspotilaiden seerumin kokonais-IgG:ssä on samantyyppistä vajausta tasolla, joka on normaalien ja reumaattisten tilojen välissä. On tärkeätä, ettei kummassakaan taudissa vajaus johda uusiin 30 oligosakkaridirakenteisiin, vaan paremminkin muutokseen normaalisti esiintyvien rakenteiden suhteellisissa molaa-. . risissa osuuksissa.
Esimerkki 1
IgG:n asparagilnlkytketyt oligosakkaridit 35 Ihmisen seerumin IgG on glykoprotelini, jossa on keskimäärin 2,8 N-kytkettyä oligosakkaridia molekyyliä 10 88341 kohti. [Katso Rademacher ja Dwek, Prog. Immunology 5 (1983) 95-112]. Nämä ovat jakautuneet järjestelmällisesti Fc-alueen (Asn 297) kahden konservoidun glykosylaatiokoh-dan ja Fab-alueen vaihtelevien glykosylaatiokohtien välis-5 sä [katso Sox ja Hood, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 66 (1970) 975-982 ja Spiegelberg et ai., Biochemistry 9 (1970) 4217-4223]. Oligosakkaridien pariutuminen Cjfc-alueen välisessä tilassa käsittää usein oligosakkarideja, joilla on erilainen primaarisekvenssi [katso Sutton 10 ja Phillips, Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 130-132]. Niin muodoin IgG-populaatioon kuuluu kokonaisuutena erillisiä asymmetristen IgG-molekyylien alaryhmiä.
Edellä esitetty on kuvattu kuviossa 1(a) seuraavasti: 15 Kuvio 1(a)
Vasta-ainemolekyyliin kuuluu kaksi raskasta ketjua (H) ja kaksi kevyttä ketjua (L), jotka ovat sitoutuneet toisiinsa disulfidisiltojen avulla (kiinteät viivat), ja molekyyli on jakautunut homologisiin alueisiin, joilla on 20 järjestys (VH, CH1, CH2, CH3), joissa kussakin on ketjujen välinen disulfiäisiltä. Ketjujen välisen sillanmuodostuk-sen malli, joka tässä on esitetty, on luonteenomaista ihmisen alaluokka IgGl:lle. VK:ssa ja VL:ssä edustavat pilkulliset segmentit hypervariaabeleja alueita sekvenssissä, 25 jotka kolmiulotteisessa rakenteessa yhdessä muodostavat antigeenin sitomiskohdan. Konservoidut asparagiiniin sidotut kaksihaaraiset kompleksiset oligosakkaridiketjut ovat sitoutuneet Asn 297:ään C„2-alueella. (Katso Sutton ja Phillips, supra). Ei-konservoidut oligosakkaridin kiin-30 nittymiskohdat sijaitsevat Fab-alueella. Niiden esiintymistiheys ja sijainti on riippuvainen Asn-X-Ser-kohdista hypervariaabeleilla alueilla (katso Sox ja Hood, supra).
Immunoglobuliinialueen ja täysin ojennetun N-kytke-tyn kompleksisen oligosakkaridin suhteelliset koot ovat : 35 hyvin samanlaiset kuten on esitetty kuviossa 1(b) [katso myös Montreuil, Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 134-136].
n 88341
Konservoituneen oligosakkaridin sijainti CH2-alueella on osoitettu kuviossa 1(b) [katso myös Spiegelberg et ai., Biochemistry 9 (1970) 4217-4223]. Immunoglobuliiniperäis-ten N-kytkettyjen oligosakkaridien rakenne- ja konformaa-5 tioanalyysit on esitetty myös julkaisuissa Rademacher et ai., Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 132-134 ja Rademacher ja Dwek, Prog. Immunol. 5 (1983) 95-112.
Ainakin 30 erilaista kompleksityyppistä kaksihaaraista oligosakkaridia on eristetty ihmisen seerumin 10 IgG:stä. Nämä ovat kuvattuna kuviossa 2. Näiden jokaisen rakenteen molaaristen osuuksien vertailemiseksi, kukin seerumin kokonais-IgG-näyte alistettiin hydratsinolyysiin intaktien oligosakkarldiryhmien vapauttamiseksi Takasakin et ai.:n, menetelmän mukaisesti (Methods in Enzymology 83, 15 s. 263-268, Academic Press, 1982). Pelkistävien terminaalisten N-asetyyliglukosamiinitähteiden pelkistäminen NaB3H4:llä suoritettiin sitten kunkin hiilihydraattiketjun leimaamiseksi radioaktiivisesti. Kullekin leimatulle oli-gosakkaridiseokselle suoritettiin sitten perusteellinen 20 hajotusneuraminidaasilla neutraalien rakenteiden jakautu misen analysoimiseksi. Nämä ei siaalihappoa sisältävät oligosakkaridiseokset altistettiin sitten Bio-Gel® p-4 (-400 mesh) geelipermeaatiokromatografiaan, tekniikka, joka erottaa neutraalit oligosakkaridit ainoastaan niiden 25 efektiivisten hydrodynaamisten tilavuuksien perusteella kuten ovat kuvanneet Yamashita et ai. (Methods in Enzymology 83, s. 105-126, Academic Press, 1982). Bio-Gel® p-4 on kaupallisesti saatavissa oleva huokoinen polyakryyll-amidihelmihartsi korkean erotuskyvyn geelisuodatukseen, 30 joka hartsi on valmistettu kopolymeroimalla akryyliamidia ja N,N’-metyleenibis-akryyliamidia [katso Hjertem ja Mos-bach, Anal. Biochem. 3 (1962) 109. Muita sopivia geeliper-meaatiokromatografiaväliaineita oligosakkaridien erottamiseksi toisistaan niiden koon perusteella ovat esimerkik-V'· 35 si agaroosigeelit Ja Sephadex® (ristisidottu dekstraani)- geelit.
12 88341
Yksityiskohtainen menettely edellä mainitun hydrat-sinolyysin ja geelipermeaatiokromatografiän suorittamiseksi oli seuraava:
Kunkin 42 yksilön seerumin IgG eristettiin saosta-5 maila 4 °C:ssa ammoniumsulfaatilla (33 %) ja DE-52-ionin-vaihtokromatografiällä (4 °C) 0,01 M H2P04:ssa, pH 7,2. DE-52 on kaupallisesti saatavissa oleva dietyyliaminoetyy-liderivoitu ioninvaihtoselluloosa mikrohiukkasmuodossa. Jokainen puhdistettu IgG (5 mg) dialysoitiin perusteelli-10 sesti tislattua vettä vastaan (4 °C) ja kylmäkuivattiin aktivoidun hiilen päällä -196 °C:ssa (<10*6 torria). Pro-teiininäytteet suspendoitiin tuoreeseen tislattuun vedettömään hydratsiiniin 8 tunniksi 100 °C:ssa vedettömässä argon-atmosfäärissä. Hydratsiini poistettiin toistuvalla 15 (5x) flash-haihdutuksella vedettömästä tolueenista. Hyd- ratsinolysaatit N-asetyloitiin lisäämällä ylimäärin aset-anhydridiä kyllästetyssä NaHC03:ssa 4 °C:ssa. Läpäistyään pylvään, jossa oli kaupallisesti saatavaa Dowex® Ag 50x12 (H+-muoto)-ioninvaihtohartsia Na*:n poistamiseksi, näytteet 20 haihdutettiin kuiviksi (27 °C), liuotettiin veteen ja levitettiin Whatman 3 MM-kromatografiapaperille. Laskeva pape-rikromatografia (27 °C) suoritettiin myöhemmin käyttäen n-butanoli:etanoli:vesi-seosta (4:1:1 v/v) (liuotin I). 48 tunnin kuluttua eluoitiin ensimmäiset 5 cm vedellä. Näin 25 eristetyt oligosakkaridit flash-haihdutettiin kuiviksi (27 °C) ja pelkistettiin viisinkertaisella ylimäärällä NaB3H4:llä (7,6 C* mmoolia'1, New England Nuclear) 50 mM NaOHrssa, pH 12,0, 30 °C, 4 tunnin ajan. Ekvivalenttitila-vuus IM NaB^iä 5 mM Na0H:ssa, pH 12,0, lisättiin sitten 30 ja inkubointia jatkettiin 2 tunnin ajan. Seos tehtiin sitten happameksi (pH 5-6) IM etikkahapolla ja vietiin Dowex 50x12 (H*)-pylvään läpi, haihdutettiin kuivaksi (27 °C) ja flash-haihdutettiin (5x) (27 °C) metanolista. Näytteet levitettiin sitten Whatman 3 MM-paperille ja suoritettiin 35 kaksi päivää kestävä laskeva paperikromatografia liuotti-messa I. Radiokromatogrammipyyhkäisy suoritettiin Berthol- 13 88 341 din radioautogrammiskannerilla LB 280. Alkukohdan radioaktiivisuus eluoitiin myöhemmin vedellä. Pelkistettyjen [3H]-oligosakkaridien näytteelle, joka näin oli eristetty, suoritettiin sitten perusteellinen hajotus neuraminidaasilla 5 (Arthrobacter ureafaciens, Nakrai Chemical Co. Kyoto, Ja pani); radioaktiivinen sokeri (lxlO7 cpm) 50 pl:ssa 0,1 M natriumasetaattia pH 5,0, jossa oli 0,1 yksikköä entsyymiä. Inkubointi suoritettiin 37 °C:ssa 18 tunnin ajan to-lueeniatmosfäärissä. Näytteille suoritettiin sitten kor-10 keajännite-paperielektroforeesi 80 V/cm:ssä pyridiini/- etikkahappo/vesi-seoksessa 3:1:387 v/v (pH 5,4). Kaikki radioaktiivisuus jäi alkukohtaan, mikä näin osoitti, että siaalihappo oli pilkkoutunut täydellisesti. Näytteet otettiin talteen paperista vedellä eluoimalla, niistä poistet-15 tiin suola käyttäen kaksoispylvästä, joissa oli Dowex^G 50x12 (H*)- ja AG 3x4A (OH')-täyte vedessä, haihdutettiin kuiviksi, suspendoitiin 175 pl:aan osittain happohydroly-soitua dekstraania 20 mg ml*1 ja laitettiin Bio-Gel P-4 (-400 mesh) geelipermeaatiokromatografiapylvääseen 20 (1,5 cm x 200 cm). Pylvästä pidettiin 55 °C:ssa ja vettä käytettiin (200 μΐ/mln) eluenttina. Eluentin radioaktiivisuutta seurattiin käyttäen Bertholdin HPLC-radioaktiivi-suusmonitoria (malli LB 503), ja taitekerrointa seurattiin käyttäen Perkin Elmerin malli LC 25 refraktometriä. Moni-25 torien analogisignaalit muutettiin digitaalisiksi käyttäen Nelsonin analyyttisiä ADC-rajapintoja. Digitaaliarvot kerättiin ja analysoitiin käyttäen Hewlett Packardin 9836 C-tietokoneita. Kuvio 3 esittää radioaktiivisuuden (pystyakseli) esitettynä graafisesti retentioajan suhteen stokas-30 tisen taustakohinan poiston jälkeen käyttäen Fournierin muuntotekniikkaa. Piikin päälle kirjoitetut numeeriset merkit viittaavat glukoosioligomeerien eluoitumisasemaan glukooslyksikköinä (g.u.) havaittuna samanaikaisesti tai-tekerroinmonitorin avulla. V0 on "tyhjä"-asema. Näytteen : 35 eluoitumisasemat (g.u.:lna) laskettiin "cubic spline"-in- ____ terpoloimalla sisäisten standardiglukoosioligomeeriasemien 14 88341 välillä. Si joletusarvot ovat erotuskykyä lisäävistä profiileista piirrettynä retentioaika-akseli muuttumattomana ja radloaktiivisuusakseli redusoituna 0,5:llä. Erotuskyvyn lisäys saatiin aikaan rivimuodon muuntamisena Fourierin 5 domeenissa.
Saatujen yksittäisten profiilien vertailu paljastaa useita mielenkiintoisia seikkoja.
Ensinnäkin, kaikkien ei siaalihappoa sisältävien kontrolliyksilöiden P-4-kromatogrammit (kuvio 3a) olivat 10 olennaisesti identtiset. Se merkitsee, että vaikka mikä tahansa tietty IgG-molekyyli voi sisältää vain hyvin pienen määrän selvästi erotettavia oligosakkaridirakenteita (so. 2 Fe- ja Fab-lisäsokeria kohti), on jokaisen noin 30 rakenteen suhteellinen molaarinen kokonaisosuus polyklo-15 naalisessa IgGrssä huomattavan vakio. Tämä suuri ollgosak- karidisekvenssien lukumäärä ei ole seurausta polyklonaali-sen lgG:n analyysin suoritustavasta, koska sama rakenne-ryhmä havaitaan sekä ihmisen myeloomaproteiineissa että hiiren monoklonaalisissa vasta-aineissa. Toiseksi, nivel-20 reumapotilaiden ei siaalihappoa sisältävien näytteiden P-4-kromatogrammit ovat olennaisesti samat potilaasta toi seen mutta eroavat merkittävästi ja dlagnostisesti kon-trolliprofiileista (kuvio 3b). Kolmanneksi luu-niveltuleh-duspotilaiden ei siaalihappoa sisältävien oligosakkaridien 25 P-4-kromatogrammit ovat myös luonteenomaisia kaikille sellaisille potilaille ja ovat selvästi erottuvia sekä kon-trolliprofiileista että nivelreumaprofiileista (kuvio 3c). Neljänneksi ja kaikkein tärkeimpänä, luonteenomaisten kontrolli- ja artriitti-(osteoartriittisten ja reumaattisten) 30 ei siaalihappoa sisältävien näytteiden P-4-profiilien väliset erot voidaan selittää järkevästi populaatiomuutok-sina oligosakkaridirakenteiden suuntaan, joilla on alempi hydrodynaaminen tilavuus. Tämän siirtymän molekylaarisen perustan varmistamiseksi analysoitiin kunkin potilaan ei : 35 siaalihappoa sisältävä oligosakkaridit joko (1) niiden eri 15 88341 ydinyksikköjen suhteen tai (2) niiden uloimman sakaran substituutioiden asteen ja luonteen suhteen.
Esimerkki 2 OIlgosakkaridiytimet 5 Yleisesti voidaan kompleksityyppiset N-kytketyt oligosakkaridit luokitella siten, että ne sisältävät yhden neljästä ydinrakenteesta, jotka on kuvattu kaaviomaisesti kuviossa 4 [katso Mizuochi et ai., J. Immunol. 129 (1982) 2016-2020]. IgG:n kaksihaaraisille oligosakkarideille voi-10 daan näiden neljän ydinrakenteen suhteelliset osuudet helposti määrittää hajottamalla oligosakkaridit seoksella, jossa on Streptococcus pneumoniae'n β-galaktosidaasia ja β-Ν-asetyyliheksosaminidaasia, kuten ovat kuvanneet Mizuochi et ai., supra. Syntyneet hajotustuotteet ovat di-15 agnostisia kullekin neljälle ytimelle Ja eroavat riittävästi hydrodynaamiselta tilavuudeltaan, jotta ne voidaan erotttaa P-4-pylväällä. Tulokset, joista on tehty yhteenveto kuviossa 4, osoittavat selvästi, ettei ole olemassa systemaattista korrelaatiota tautitilan ja minkä tahansa 20 erityisen tyyppisen ydinrakenteen esiintymistiheyden välillä.
Yksityiskohtainen menettely neljän ydinrakenteen suhteellisen esiintymisen määrittämiseksi oli seuraava: Fraktioimattomien ei siaalihappoa sisältävien oligosakka-25 ridien näyte (3-5 x 105 cpm) hajotettiin Str. pneumoniae'n B-galaktosidaasin (2 milliyksikköä) ja 8-N-asetyyliheksos-aminidaasin (4 milliyksikköä) seoksella 25 pl:ssa 0,1 M sitraattifosfaattia, pH 6,0. Hajotus suoritettiin 37 °C:ssa 18 tunnin ajan tolueeniatmosfäärissä ja lopetettiin kuu-. . . 30 mentamalla seos 100 °C:seen 2 minuutin ajaksi. Suolan poiston jälkeen [Dowex®kg 50x12 (H*), Ag 3. 4A (OH')] hajotus-tuotteet erotettiin Bio-Gel P-4 (-400 mesh)-pylväällä.
Entsyymit puhdistettiin Glasgowin et ai. menetelmän muunnelman avulla [J. Biol. Chem. 252 (1977) 8615-8623]. Str.
. 35 pneumoniae'n β-galaktosidaasi poistaa kaikki galaktoosi- 16 88341 tähteet IgG:n ei siaalihappoa sisältävistä oligosakkarideista, riippumatta niiden ydinrakenteista. Mikro-organismin β-Ν-asetyyliheksosaminidaasi hajottaa syntyvät oligosakkaridit tavalla, joka riippuu (kaksijakoisen) GlcNAc 5 Bl-*4-tähteen läsnäolosta. Erityisesti, vain yksi N-asetyy-liglukosamiinitähde (GlcNAc 5 kuvassa 2) vapautuu agalak-tosyylirakenteesta GlcNAc Bl-*2 Man al-+6 (GlcNAc fll-»2 Man al-»3) (GlcNAc Bl-»4) Man β1->4 GlcNAc Bl-»4 (± Fuc al-*6) GlcNAc, joka muuttuu rakenteeksi GlcNac Bl-»2 Man al-*6 (Man 10 al-*3) (GlcNAc Bl-*4) Man 81-4 GlcNAc B1-+4 (± Fuc al-*6)
GlcNAc. Kuitenkin kaksi N-asetyyliglukosamiinitähdettä vapautuu rakenteesta GlcNAc Bl-»2 Man al-*6 (GlcNAc 61-*2 Man al-*3) Man Bl->4 GlcNAc Bl-*4(± Fuc al-*6) GlcNAc, joka muuttuu rakenteeksi Man al-*6 (Man al-»3) Man fll-*4 GlcNAc β1-»4 15 (± Fuc al-*6) GlcNAc. Neljällä ytimellä on seuraavat raken teet : A (1¾¾) Manalle (Manal-*3) (GlcNAcfll-»4) ManBl-»4GlcNacBl-+ 4GlcNAc(+B-F); B (1¾^) Manal-6(Manal-»3) ManBl-»4GlcNAcBl-*4GlcNAc( -B-F); 20 C (£SjS3) Manal-*6 (Manal->3) (GlcNAcBl-4) ManBl-*4GlcNAcfll- 4( Fucal-*6 )GlcNAc( +B+F ); D (f ]) Manal-+6(Manal-»3) ManBl-»4GlcNacBl-»4(Fucal->6) GlcNAc(-B+F).
25 Kunkin ytimen prosentuaalinen määrä Oxford-sarjassa oli: (+B-F)-kontrolli (5,1±3,3), OA (3,5±1,0), RA (4,1± 1,4); (-B-F)-kontrolli (19,1±6,7), OA (13,5±5,1), RA (16,9±5,9); (+B+F)-kontrolli (10,7±6,0), OA (13,0±6,5), RA (10,2±3,1); (-B+F)-kontrolli (65,1±1,3), OA (69,7±8,0), RA 30 (70,5±5,8). Arvot Tokio-sarjassa olivat: (+B-F-)-kontrolli (3,1±0,7), OA (3,7±0,8), RA (4,6±1,4); (-B-F)-kontrolli (9,9±3,0), OA (9,7±2,4), RA (8,8±2,1); (+B+F)-kontrolli (15,4±0,9), OA (16,6±4,0), RA (20,9±5,7); (-B+F)-kontrolli (71,7±2,8), OA (70,1*5,1), RA (65,7±6,7).
35 Minkään kolmen ryhmän ytimen esiintymistiheyksillä ei ole tilastollista merkitsevyyttä (p > 0,05). Yllä olevassa: B - kaksiosainen GlcNAc; F - fukoosi.
17 88341
Esimerkki 3
Uloimman sakaran substituutiot
Uloimman sakaran rakenteita voidaan karakterisoida galaktoosin, N-asetyyliglukosamiinin ja N-asetyylineura-5 miinihapon esiintymistiheyden, sitomisen ja sijainnin suhteen. Ei siaalihappoa sisältävät oligosakkaridiseokset kromatografoitiin sen tähden ensin Ricinus communis-aga-roosiaffiniteettikromatografiällä galaktosyloitujen ja ei-galaktosyloitujen rakenteiden erottamiseksi. Taulukosta 1 10 ilmenee, että kontrolli-IgG:ssä -75 % kaikista oligosakka-ridiketjuista sisältää ainakin yhden galaktoositähteen. IgG:ssä, joka on eristetty reumaattisista ja osteoartriit-tisista potilaista, vain 50 %:lla (p - 0,001) ja vastaavasti 66 %:lla (p - 0,002) ketjuista sisälsi galaktoosia. 15 Tämän galaktoosivajauksen tutkimiseksi edelleen kunkin yksittäisen tapauksen suhteellinen osuus digalak-tosyylirakenteista monogalaktosyylirakenteisiin määritettiin joko galaktosyloitujen oligosakkaridiketjujen kroma-tografoinnilla Ricinus communis-agaroosilla, tai entsy-20 maattisesti. Jälkimmäisessä tapauksessa hajotus jack-pavun B-N-asetyyliheksosaminidaasilla, jota seurasi P-4-geeli-permeaatiokromatografointi, johti fragmenttien erottumiseen, jotka olivat diagnostisia digalaktosyloiduille ja monogalaktosylolduille rakenteille. Digalaktosyyliraken-25 teiden suhde monogalaktosyylirakenteisiin määritettyinä kummallakin menetelmällä olivat yhdenmukaiset ja osoittivat laskua 28 % (p < 0,02) ja vastaavasti 14 % reumaattisissa ja osteoartrilttisissa oligosakkaridiseoksissa.
Sen määrittämiseksi, oliko galaktoosia sisältävien 30 ketjujen alentunut lukumäärä seurausta uloimman sakaran β(1-2)-kytkettyjen N-asetyyli-glukosamiinitähteiden vähe-. . nemisestä, kunkin yksilön ei-galaktosyloidut rakenteet kromatografoitiin P-4-kromatografiällä. Kaikissa kolmessa ryhmässä havaittiin samanlaiset profiilit, mikä viittasi 35 siihen, että uloimman sakaran β( 1-2)-kytkettyjen N-asetyy-liglukosamiinitähteiden (GlcNAc 5 ja 5') vajausta ei esiintynyt. Tämä varmistettiin myöhemmin entsymaattisesti.
18 88341
Yksilöiden välillä ei sen vuoksi voi olla eroavaisuuksia tautitilasta riippumatta N-asetyyli-glukosaminylaation määrän suhteen.
Koska negatiivisesti varautuneet N-asetyylineura-5 miinihappotähteet liikkuvat sähkökentässä, altistettiin leimatun oligosakkaridipoolin näyte (ennen neuraminidaasi-hajotusta) korkeajännitepaperielektroforeesiin. Oligosakkaridit erottuivat täydellisesti neutraaleiksi, monosialy-loiduiksi ja disialyloiduiksi rakenteiksi (kuvio 5). Näi-10 den esiintymistä on esitetty taulukossa 2 ja kolmessa ryhmässä esiintyvät rakenteet on esitetty yksityiskohtaisesti kuvassa 2.
Yksityiskohtaiset menetelmät eri yksilöiden IgG:stä vapautettujen oligosakkaridien radioelektroforeesigrammien 15 saamiseksi, kuten on kuvattu kuviossa 5, olivat seuraavat: [3H]-oligosakkaridien näyte (5 x 106 cpm) vietiin korkea-jännitepaperielektroforeesiin (80 V/cm) pyridiini:etikka-happo: vesi-systeemissä (3:1:387 V/V), pH 5,4 (Camag HVE laite 61000). Skannauksen jälkeen Bertholdin LB 280 radio-20 kromatogrammiskannerilla alueet N (neutraali), A-l (mono-sialyloitu) ja Ά-2 (disialyloitu) eluoitiin ja kunkin dpm määritettiin, mikä mahdollistaa suhteellisten osuuksien laskemisen kussakin näytteessä. Skannerin analogiasignaa-lit muutettiin digitaalisiksi käyttäen Nelsonin analyyt-25 tistä ADS-rajapintaa ja digitaaliarvot kerättiin talteen ja analysoitiin käyttäen mikrotietokonetta. Laktoosi (L); (2-3 )-*sialyylilaktoosi (SL); bromifenolisininen (BPB).
Odotusten vastaisesti kussakin tutkimuksessa korreloivat kaksi tautitilaa yhteen tai kahteen N-asetyyli-30 neuramiinlhappotähteeseen päättyvien ketjujen lukumäärän vähenemiseen, huolimatta galaktosylaatiotason ei-identti-sistä muutoksista. Tämän vähenemisen määrässä on kuitenkin eroja kahden tutkimuksen välillä [36 % väheneminen 0xf:ssa (p - 0,001, OA ja RA) ja 12 % väheneminen Tok:ssa (p * 35 0,002, 0A, p = 0,3, RA)].
19 «8341
Taulukko 1
Prosentuaalinen osuus oligosakkaridiketjuja, joista puuttuu galaktoosi seerumin IgG:ssä* 5 Yksittäiset Kontrolli Luu-nivel- Nivelreuma potilaat tulehdus
Oxford-sarja Oxfl 26,6 0xf7 38,9 0xfl3 51,5 0xf2 23,9 0xf8 36,0 0xfl4 54,7 10 Oxf3 23,9 0xf9 26,5 0xfl5 41,9 0xf4 23,4 OxflO 35,2 0xfl6 43,6
Oxf5 16,2 Oxfll 31,4 0xfl7 54,9
Oxf 6 19,3 Oxf12 33,0 Oxf18 55,0 15 Tokio-sarja Toki 31,4 Tok6 32,2 Tokl2 44,3
Tok2 26,8 Tok7 32,7 Tokl3 53,8
Tok3 38,9 Tok8 32,7 Tokl4 52,4
Tok4 25,4 Tok9 47,4 Tokl5 48,4
Tok5 23,3 ToklO 43,2 Toki6 43,9 20 Tokll 32,4 Tokl7 47,9
Tokl8 74,5 Toki9 56,2
Tok20 55,6 Tok21 51,8 25 Tok22 44,3
Tok23 38,7
Aritmeettinen keskiarvo Oxf 22,9 ±3,7 33,5 ± 4,3 50,1 ±5,9 . . 30 ± s.d. Tok 29,2 ± 6,2 36,7 ± 6,1 50,1 ± 9,1 kerätty Bern-1 24,0 . . kontrolli- seerumi 35 * Verinäytteet Oxford-sarjassa saatiin potilailta St.
John's Highfield Hospital:ista, Droitwich, Englanti ja the 20 8 8 341
Queen Elizabeth Medical Centre:stä, Birmingham, Englanti Potilaat Oxf 13 - Oxf 18 ja Tok 12 - Tok 23 täyttivät the American Rheumatism Association'in kriteerit määrätylle tai klassiselle nivelreumalle Oxf-potilaiden ikäjakauma 5 oli 50-75 vuotta (keskiarvo RA 64 ± 8 SD, OA 68 ± 9 SD). Analyysit suoritettiin kaksoissokkotesteinä, ja sairaskertomukset saatiin oligosakkaridianalyysin päättämisen jälkeen. Oxford-sarjassa potilaat Oxf 7, 13 ja 14 olivat Ro-se-Waaler-positiivisia. Rose-Waaler-testi on erityinen 10 antiglobuliinitesti, jossa käytetään lampaan punasoluja, jotka on herkistetty jäniksen anti-lammas-punasolun IgG:n subagglutinoivalla annoksella. Reumaattinen tekijä liittyy membraaniin sidottuun IgG:hen, jolloin muodostuu aggluti-naatio [katso Rose et ai., Proc. Soc. Exper. Biol. £ Med. 15 68 (1948) 1]. Potilailla 0xf7 ja 0xf8 oli (krooninen pit käaikainen) luu-niveltulehdus ja ne olivat aivan äskettäin näyttäneet merkkejä tulehduksellisesta komponentista (6 kuukautta ja vastaavasti 9 kuukautta). Bem-1 viittaa lgG:hen, joka on peräisin usean tuhannen yksilön yhteenke-20 rätystä seerumista ja oli lahja Dr. U. Nydeggeriltä Sveitsin Punaisen ristin verensiirtokeskuksesta, Bern, Sveitsi. Ei-galaktosyloidut oligosakkaridit eristettiin seuraavasti. Kunkin yksilön lgG:n ei siaalihappoa sisältävät oligosakkaridit (1 x 107 cpm) laitettiin Ricin CA-120 agaroosi-25 pylvääseen (Miles-Yeda Ltd., Israel, erä n:o AR 26), jonka mitat olivat 6 mm x 20 cm. Pylväs kehitettiin 5 mM nat-riumasetaatissa (pH 5,6). Ei-galaktosyloidut rakenteet eluoituivat alkukohdan tilavuudessa, kun taas digalaktosy-loidut ja monogalaktosyloidut rakenteet eluoituivat myö-30 hemmin ja määrättyinä tilavuuksina. Galaktoosien määrä kussakin piikissä varmistettiin joko viemällä piikki uudelleen samalle Ricinus communis-agaroosipylväälle tai seuraamalla muutosta hydrodynaamisessa tilavuudessa hajotuksen jälkeen jack-pavun B-N-asetyyliheksosaminidaasilla 35 (14 μΜ substraatti, 150 yksikköä ml-1 entsyymiä 0,1 M sit- raattifosfaatissa, pH 4,5). Digalaktosyloitujen rakenteiden hydrodynaaminen tilavuus ei muutu, monogalaktosyloitu- 21 88341 jen laskee 2:11a g.u.:11a ja niiltä rakenteilta, joilla puuttuu galaktoosi 1 4:llä g.u.:11a. Oxford-sarjassa erot aritmeettisissa keskiarvoissa olivat merkittävät p - 0,002 (C vs 0A) ja p 1 0,001 (C vs RA) ja p - 0,002 (OA vs RA).
5 Tokio-sarjassa merkitsevyys oli p - 0,05 (C vs 0A), p = 0,0007 (C vs RA) ja p < 0,0008 (0A vs RA). Mitään eroa aritmeettisissa keskiarvoissa kahden sarjan välillä ei pidetty tilastollisesti merkitsevänä. Digalaktosyloitujen rakenteiden suhteelliset osuudet monogalaktosyloituihin 10 rakenteisiin nähden, jotka oli saatu yllä kuvatun mukaisesti, olivat seuraavat: C - 0,87 ± 0,10; OA - 0,75 ± 0,14; RA - 0,63 ± 0,12. Näiden tilastollinen merkitsevyys on C vs OA (p « 0,15), C vs RA (p < 0,02), 0A vs RA (p 0,1). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen ei-pa-15 rametrista yhdistetyn luokan tilastollista testiä (Wilco-xon-Mann-Whitney-testi, kuten Lloyd on kuvannut, "Handbook of Application Mathematics", 6 Statistics, osa B, John Wiley and Sons, 1984). Todennäköisyydet esitetään kaksipäisen testin nollahypoteesilla H„ : μ1 - μ2 testattuna 20 vaihtoehtoista hypoteesia vastaan H2 : μ2 1 μ2.
Taulukko 2
Prosentuaalinen osuus oligosakkaridiketjuja, joissa on terminaalinen o(2-6)-kytketty N-asetyylineura-miinihappo1 25 Neutraali Monosialyloitu Dislalyloitu
Oxford-sarj a
Kontrollit 75,7 ± 5,0 20,5 ± 5,0 3,8 ± 1,6
Luu-niveltu- 84,7 ± 1,8 13,7 ± 1,5 1,7 ± 0,7 lehdus : . 30 Nivelreuma 85,2 ±1,1 12,6 ±1,2 2,2 ± 0,6
Tokio-sarja
Kontrollit 75,6 ±0,8 17,8 ± 2,1 6,6 ± 1,6
Luu-niveltu- 78,6 ± 2,1 16,5 ± 1,8 5,0 ± 0,9 lehdus 35 Nivelreuma 78,4 ±4,4 15,2 ±3,2 6,5 ± 1,5
Katso kuvion 5 kuvaus.
22 88341
Sen varmistamiseksi, että kaikki rakenteet, jotka olivat läsnä kuvion 5 A-l- ja A-2-asemissa, sisälsivät vain yhden tai kaksi siaalihappotähdettä, vastaavasti, laitettiin eluoitujen A-l- ja A-2-oligosakkaridifraktioi-5 den näyte QAE-A25 Sephadex®-pyivääseen (6 mm x 10 cm). Näytteet olivat 2 mM ammoniumasetaatissa (pH 5,3) ja pylväs kehitettiin lineaarisella 2 mM-*350 mM ammonlumasetaat-tigradientilla. Sekä A-l- että A-2-fraktiot antoivat pape-rielektroforeesissa yksinkertaiset eluointipiikit, jotka 10 vastasivat monosialyloitujen ja disialyloitujen oligosakkaridien standardi-eluutioasemia, vastaavasti. Sephadex® QAE-A25 on ristisidottu dekstraani-ioninvaihtohartsi, jossa on toiminnallisena ryhmänä dietyyli(2-hydroksipropyy-li)aminoetyyli.
15 Edellä olevat tulokset osoittavat, että luu-nivel tulehdukseen ja erityisesti nivelreumaan liittyy selviä muutoksia seerumin kokonais-igG:n kompleksisten N-kytket-tyjen oligosakkaridien uloimman sakaran galaktosylaatlon määrässä. Galaktosylaatlon absoluuttisen tason havaittiin 20 olevan tautispesifinen. Havaitut muutokset galaktosylaa-tiossa korreloivat suuresti molempien tautitilojen kanssa (p « 0,002 OA vs C, p * 0,001 RA vs C) ja tautitilojen välillä (p » 0,002 0A vs RA). Merkityksellistä oli, ettei kummankaan artriitin IgG:hen liittynyt uudentyyppisiä pri-25 maarisia oligosakkaridisekvenssejä. Merkityksellisempää kuin galaktoosin vajaus (-33 % nivelreumassa) on N-asetyy-liglukosamilnin ei-pelkistävän pään lisääntynyt altistuminen (-100 %). Ottaen huomioon oligosakkaridin pariutumis-ilmiö Fc:ssä ja sen rajoitukset yksinkertaiset laskelmat 30 osoittavat, että saadaan selvä kohoaminen Fc-molekyylien esiintymistiheydessä, joista molekyyleistä puuttuu kokonaan galaktoosi (-300 % nivelreumassa ja -60 % luu-niveltulehduksessa). Näin ollen hierarkiset muutokset, jotka alkavat muuttuneella galaktosylaatlon tasolla ja jatkuvat 35 oligosakkaridirakenteiden vakiojoukon suhteellisten popu- 23 88341 laatioiden muutoksella, johtavat pariutumlsilmiön kautta dramaattisiin muutoksiin yksittäisten Fc-alapopulaatioiden esiintymistiheyksissä.
Lukuisat toiset esimerkit ovat selviä alan ammatti-5 miehelle tämän julkaisun lukemisen jälkeen poikkeamatta keksinnön hengestä ja piiristä ja tarkoitus on, että kaikki sellaiset esimerkit sisällytetään patenttivaatimuksen suojapiiriin.

Claims (2)

  1. 24 88 341 Patenttivaatimus Menetelmä nivelreuman tai luu-niveltulehduksen diagnosoimiseksi joko ainoana oireyhtymänä tai muiden reu-5 maattisten sairauksien komponenttina määrittämällä galak-toosin vajaus niveltulehduspotilaan IgG:ssä, tunnet-t u siitä, että määritetään IgG-komponentin tai sen fragmentin uloimman sakaran galaktosyloitumisen vajaus potilaan veren seerumista tai plasmasta tai nivelnesteestä 10 analysoimalla mainitun IgG-komponentin tai -fragmentin ei-pelkistävien terminaalisten uloimman sakaran N-asetyyli-glukosamiinitähteiden esiintyvyys ja verrataan normaaleihin kontrolliarvoihin.
  2. 15 Patentkrav Förfarande för diagnosticering av ledgängsreumatism eller osteoartrit som enda syndrom eller som en komponent av andra reumatiska sjukdomar genom att bestämma galaktos-20 underskottet i artritpatienters IgG, känneteck- n a t därav, att man bestämmer underskottet av ytterarm-galaktosylering i en IgG-komponent eller ett fragment därav i patientens blodserum, plasma eller ledvätska genom att analysera förekomsten av icke reducerande terminals 25 ytterarms-N-acetylglukosaminrester i nämnda IgG-komponent eller fragment därav och jämföra med motsvarande normala kontrollvärden.
FI860284A 1985-01-22 1986-01-21 Foerfarande foer diagnostisering av ledgaongsinflammationer FI88341C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/693,075 US4659659A (en) 1985-01-22 1985-01-22 Diagnostic method for diseases having an arthritic component
US69307585 1985-01-22

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI860284A0 FI860284A0 (fi) 1986-01-21
FI860284A FI860284A (fi) 1986-07-23
FI88341B true FI88341B (fi) 1993-01-15
FI88341C FI88341C (fi) 1993-04-26

Family

ID=24783210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI860284A FI88341C (fi) 1985-01-22 1986-01-21 Foerfarande foer diagnostisering av ledgaongsinflammationer

Country Status (14)

Country Link
US (1) US4659659A (fi)
EP (1) EP0189388B1 (fi)
JP (1) JP2515289B2 (fi)
AT (1) ATE78518T1 (fi)
AU (1) AU586662B2 (fi)
CA (1) CA1272670C (fi)
DE (1) DE3686061T2 (fi)
DK (1) DK164417C (fi)
FI (1) FI88341C (fi)
GR (1) GR860167B (fi)
IE (1) IE58727B1 (fi)
IL (1) IL77666A (fi)
NO (1) NO166302C (fi)
ZA (1) ZA86442B (fi)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4659659A (en) * 1985-01-22 1987-04-21 Monsanto Company Diagnostic method for diseases having an arthritic component
GB8618443D0 (en) * 1986-07-29 1986-09-03 Univ London Monoclonal antibodies
GB8714270D0 (en) * 1987-06-18 1987-07-22 Williams G R Analysis of carbohydrates
US4791067A (en) * 1987-06-25 1988-12-13 Fisher Scientific Co. Agglutination immunoassay for hapten involving monoclonal antibody of IgA class reagent
CA2016125A1 (en) * 1989-05-19 1990-11-19 Eisai Co., Ltd. Diagnostic drug for rheumatoid arthritis
US5089409A (en) * 1989-09-28 1992-02-18 Monsanto Company Method of increasing specific activity of t-pa
US5100778A (en) * 1989-10-03 1992-03-31 Monsanto Company Oligosaccharide sequencing
US5164374A (en) * 1990-12-17 1992-11-17 Monsanto Company Use of oligosaccharides for treatment of arthritis
JP3537535B2 (ja) * 1994-07-14 2004-06-14 株式会社中埜酢店 免疫グロブリンｇ結合糖鎖構造に基づく臨床検査方法
US6159748A (en) * 1995-03-13 2000-12-12 Affinitech, Ltd Evaluation of autoimmune diseases using a multiple parameter latex bead suspension and flow cytometry
US5846758A (en) * 1995-11-30 1998-12-08 His Excellency Ghassan I. Shaker Method for diagnosing autoimmune diseases
IL129835A (en) * 1999-05-06 2008-03-20 Ofer Markman Polysaccharide sequencing and structure determination
US7407773B2 (en) * 2000-11-03 2008-08-05 Procognia, Ltd. Method for characterizing a carbohydrate polymer
US20040132131A1 (en) * 2001-11-05 2004-07-08 Ofer Markman Methods for comparitive analysis of carbohydrate polymers and carbohydrate polymers identified using same
EP1583968B1 (en) * 2003-01-14 2015-04-22 VIB, vzw A serum marker for measuring liver fibrosis
CA2527916A1 (en) * 2003-03-14 2004-09-30 Aaron B. Kantor Biological markers for diagnosing rheumatoid arthritis
WO2005015200A1 (ja) * 2003-08-11 2005-02-17 Shionogi Co., Ltd. 血清を用いた簡易疾患診断およびテーラーメイド治療
EP1709443A2 (en) * 2003-12-18 2006-10-11 Procognia, Ltd. Method for analyzing a glycomolecule
WO2006007664A1 (en) * 2004-07-22 2006-01-26 Genomics Research Partners Pty Ltd Agents and methods for diagnosing osteoarthritis
US20060269979A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-30 Dwek Raymond A High throughput glycan analysis for diagnosing and monitoring rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases
US7892752B2 (en) * 2005-04-26 2011-02-22 Dwek Raymond A Glycosylation markers for cancer diagnosing and monitoring
US8039208B2 (en) * 2005-04-26 2011-10-18 National Institute For Bioprocessing Research And Training Limited (Nibrt) Automated strategy for identifying physiological glycosylation markers(s)
US8173437B2 (en) * 2005-06-10 2012-05-08 Mannatech, Incorporated Rapid serum sugar biomarker assay of rheumatoid arthritis
PT2486938T (pt) 2006-09-26 2018-06-12 Infectious Disease Res Inst Composição para vacina contendo adjuvante sintético
US20090181078A1 (en) * 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
US20100266558A1 (en) * 2007-12-18 2010-10-21 Dov Zipori Method and assay for glycosylation pattern detection related to cell state of stem cells
TWI494125B (zh) * 2009-06-05 2015-08-01 Infectious Disease Res Inst 合成的葡萄吡喃糖基脂質佐劑
AU2012243039B2 (en) 2011-04-08 2017-07-13 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
PL2811981T3 (pl) 2012-02-07 2019-09-30 Infectious Disease Research Institute Ulepszone formulacje adiuwantowe zawierające agonistę TLR4 oraz sposoby ich zastosowania
EA034351B1 (ru) 2012-05-16 2020-01-30 Иммьюн Дизайн Корп. Трехкомпонентная вакцина против впг-2 и способы ее применения
BR112015025709A2 (pt) 2013-04-18 2017-07-18 Immune Design Corp monoterapia com gla para uso em tratamento de câncer
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
PT3089754T (pt) 2013-12-31 2021-07-23 Infectious Disease Res Inst Formulações de vacina de dose única
AU2017273650B2 (en) 2016-06-01 2022-08-18 Access To Advanced Health Institute Nanoalum particles containing a sizing agent
MX2021014363A (es) 2019-05-25 2022-02-21 Infectious Disease Res Inst Composicion y metodo para secar por pulverizacion una emulsion de vacuna adyuvante.

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3088875A (en) * 1959-10-27 1963-05-07 Hyland Lab Immunological diagnostics utilizing polystyrene latex particles of 0.15 to 0.25 micron
US4189466A (en) * 1975-09-19 1980-02-19 Technical Research Affiliates, Inc. Detection of rheumatoid factor by antibody sensitized microbial particles
US4213764A (en) * 1978-08-09 1980-07-22 Akzona Incorporated Method for determining immunochemical substances
US4282002A (en) * 1979-09-06 1981-08-04 Akzona Incorporated Sensitized sheep stroma immunoassay for rheumatoid factor
SE447028B (sv) * 1980-06-30 1986-10-20 Erik Audunn Cerven Bestemning av endstaende sackaridgrupper i glykoprotein
US4457865A (en) * 1982-03-08 1984-07-03 Research Corporation Sialic acid specific slug lectin
US4420461A (en) * 1982-05-26 1983-12-13 Ortho Diagnostic Systems Inc. Agglutination-inhibition test kit for detecting immune complexes
US4659659A (en) * 1985-01-22 1987-04-21 Monsanto Company Diagnostic method for diseases having an arthritic component

Also Published As

Publication number Publication date
CA1272670A (en) 1990-08-14
DK29086D0 (da) 1986-01-21
FI860284A0 (fi) 1986-01-21
EP0189388A3 (en) 1988-11-30
DE3686061D1 (de) 1992-08-27
IE860176L (en) 1986-07-22
EP0189388B1 (en) 1992-07-22
NO166302C (no) 1991-06-26
ATE78518T1 (de) 1992-08-15
NO860191L (no) 1986-07-23
ZA86442B (en) 1986-10-29
NO166302B (no) 1991-03-18
AU586662B2 (en) 1989-07-20
AU5253886A (en) 1986-07-31
DE3686061T2 (de) 1993-03-11
IE58727B1 (en) 1993-11-03
FI860284A (fi) 1986-07-23
JPS61170657A (ja) 1986-08-01
DK29086A (da) 1986-07-23
JP2515289B2 (ja) 1996-07-10
EP0189388A2 (en) 1986-07-30
FI88341C (fi) 1993-04-26
GR860167B (en) 1986-05-22
DK164417B (da) 1992-06-22
DK164417C (da) 1992-11-16
CA1272670C (en) 1990-08-14
IL77666A (en) 1990-12-23
US4659659A (en) 1987-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI88341B (fi) Foerfarande foer diagnostisering av ledgaongsinflammationer
Moore et al. Reactivities of N-acetylgalactosamine-specific lectins with human IgA1 proteins
Franzen et al. Characterization of proteoglycans from the calcified matrix of bovine bone
EP0145681B1 (en) A method for determining changes occurring in cartilage
EP2431391B1 (en) Monoclonal antibody for analyzing high-molecular weight adiponectin and utilization of same
US4621048A (en) Reagents containing an anti-ligand bound to an anti-enzyme and methods for employing said reagents in an immunoassy
Raouf et al. Ion exchange chromatography of purified colonic mucus glycoproteins in inflammatory bowel disease: absence of a selective subclass defect.
PT843821E (pt) Processo para a caracterizacao da glicosilacao de glicoproteinas bem como para a determinacao in vitro da biodisponibilidade de glicoproteinas
AU7065991A (en) Method to detect bone and other connective tissue disorders in humans and animals
Monica et al. Characterization of the glycosylation of a human IgM produced by a human-mouse hybridoma
CN117092344B (zh) 一种检测金黄色葡萄球菌蛋白a的试剂盒及其应用
Geyer et al. Core structures of polysialylated glycans present in neural cell adhesion molecule from newborn mouse brain
EP0271461B1 (en) Method for determining hyaluronic acid
EP0704458A2 (en) Anti-human type IV collagen antibodies and use thereof
Keusch et al. Analysis of different glycosylation states in IgG subclasses
CN101871940B (zh) IgG型类风湿因子酶免疫检测方法
EP0928201B1 (en) Novel glycolipid complexes and their uses
EP0274847B1 (en) A-associated h-antigens, monoclonal antibodies specific thereto and methods for employing the same in blood typing
JPH01305356A (ja) Ｏ―結合オリゴ糖を有するＩｇＡ↓１の検出方法およびそれを検出するためのキット
Jaskiewicz et al. The role of carbohydrate in the blood group N-related epitopes recognised by three new monoclonal antibodies
Nakamura et al. Detection of gender difference and epitope specificity of IgG antibody activity against IgA1 hinge portion in IgA nephropathy patients by using synthetic hinge peptide and glycopeptide probes
Lines High-performance liquid chromatographic mapping of the oligosaccharides released from the humanised immunoglobulin, CAMPATH™ 1H
US5891642A (en) Method of detecting PHB in human blood serum
Doinel et al. Anti‐I (A+ B): an autoantibody detecting an antigenic determinant of I and a common part to A and B
Hartmann et al. Development of a radioimmunoassay for ‘Tamm-Horsfall-like’glycoprotein in serum and cerebrospinal fluid

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: MONSANTO COMPANY

MA Patent expired