JPH01305356A - Ｏ―結合オリゴ糖を有するＩｇＡ↓１の検出方法およびそれを検出するためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生物学的流体中に存在する炭水化物残基の変
化した免疫グロブリンＩ　ｇ　Ａ　＋の検出′方法に関
する。さらに詳しくは、固定化抗１ｇＡ抗体と反応させ
ることにより体液中から全１ｇＡを抽出し、ついでβ１
−３−Ｎ−アセチルガラクトサミン−タンパク質を含む
ＩｇＡ、ｌを標識レクチンを用いて検出する、ことを特
徴とする免疫グロブリンＩｇＡ、の検出のためのイムノ
アッセイ法に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）腫瘍
マーカーは、当該技術分野においてよく知られているよ
うに、癌のモニタリングおよび癌のインビトロ診断の両
方で役立つようにしきりに探求されている。たとえば、
癌胎児性抗原（ＣＥΔ）イムノアッセイおよびα−フェ
トプロティンイムノアッセイを、生物学的流体中に存在
するある種の腫瘍マーカーを検出するために利用するこ
とができる。

血清分泌型１ｇＡ（Ｓ　ＩｇＡ）は、種々の癌の腫瘍マ
ーカーとして文献中に報告されている。ある研究者は、
全ＳＩｇＡのアッセイは癌に対して余りにも非特異的で
あるので癌の検出には無価値であると報告している［ロ
ゲルフォ（ＬｏＧｅｒｆｏ、　Ｐ、）らの（］　９７６
）Ｊ、Ｓｕｒｇ、Ｒｅｓ、、２−α：４８１］。池の研
究者は、全ＳＩｇＡの測定は、癌および慢性肝臓疾患の
あるケースにおいては臨床的な価値を有することを示し
ている［ホンバーガー（Ｈｏｍｂｕｒｇｅｒ、Ｈ，Δ、
）らの（１９８４）Ａ、　Ｊ、Ｃ，ｐ、ｆｌｉ：！５６
９；クバル（Ｋ　ｖａｌ、ｅ、　Ｄ、　）らの（１９８
７）Ｃａｎｃｅｒ５９：２０３＋ワタナベ（Ｗａｔａｎ
ａｂｅ、　Ｔ、）らの（１９８３）Ｏｔｏｌａｒｙｎｇ
ｏｌ　Ｈｅａｄ　Ｎｅｃｋ　Ｓ　ｕｒｇ　′９１　：　
１３６コ。その結果、癌および他の疾患、とりわけ慢性
肝臓疾患に関連すると思われる免疫グロブリンまたは他
の糖タンパク質が診断アッセイに使用する目的で探求さ
れている。

現在、癌を試験するために利用されている腫瘍マーカー
のいずれも、すべての癌または潜在的癌の前癌状態を検
出することはできない。従って、診断を正確なものにす
るために、多数のアッセイを用いてこれらの疾患を診断
しモニターしなければならない。１つの問題点は、現在
のアッセイは感度が悪いため、あるいは検出するのに充
分な特異性を有していないために幾つかの腫瘍マーカー
は検出することができず、重要な診断情報を得ることが
できないことである。

特異的または感度のあるイムノアッセイを確へγするの
に関連した他の問題点は、種々の特異的抗原に対する抗
体の開発を目指した度々の試みが失敗に終わり、そのた
め特異的抗原に対するイムノアッセイを確立することが
できないことである。

また、抗体の産生は、それが可能であるときも手間がか
かり高価な手順である。アッセイ中の抗体の代わりに天
然に存在する物質を使用することができれば有利であろ
う。

アッセイ中に部分的かまたは全体的に抗体を使用するこ
とを回避するために、また抗体はある種の結合親和性を
有しているので、レクチンが種々のアッセイに用いられ
ている。レクチンは、糖タンパク質のオリゴ部上の特定
の炭水化物構造を認識し、これに結合することができる
。たとえば、アタチ（Ａｄａｃｈｉ）の米国特許下４，
３８９，３９２号および同第４，５７１，３８２号各明
細書には、呻瘍関連糖結合金有物質を検出するために、
末端ガラクトース（β１−３またはβ１−４）−Ｎ−ア
セチルグル？サミンまたは末端ガラクトース（β１−３
またはβ１−４　）−Ｎ−アセチルガラクトサミンを有
する糖タンパク質に結合するレクチンを用いた方法が記
載されている。しかしながら、これらの伎許に記載され
た方法は、まず、どの分子をアッセイするかを特定する
ための免疫学的手段を使用しておらず、そのため殆ど特
異性を有していない。

ＰＣＴ特許出願第ｗ０８７１００２８９号明細書には、
レクチンを用いて可溶性の脱シアル酸糖タンパク質と複
合体を生成させ、ついでこれを検出しようとする抗体と
接触させることによる方法が開示されている。この試験
方法の変法として、脱シアル酸糖タンパク質を特異的抗
体と複合体を生成させ、ついで標識レクチンを該複合体
と接触させる方法が開示されている。両方の場合とも、
抗体が脱シアル酸糖タンパク質に選択的に結合するため
には、抗体は脱シアル酸糖タンパク質に特異的でなけれ
ばならない。レクチンは脱シアル酸糖タンパク質のオリ
ゴ糖残基上の特定の結合部位に対して特異的であるけれ
ども、試験の実質的な特異性は、抗体が正しい抗原に結
合する能力に存する。

ＥＰＯ特許出願第００４３３５９号明細書には、分析し
ようとする糖タンパク質に特異的な抗体をコーティング
した固相を試料と接触させて複合体を生成させ、これに
標識レクチンを加えることによる試験方法が記載されて
いる。この場合も抗体は糖タンパク質に特異的でなけれ
ばならない。同様のアッセイ手順がビーキールヘアリン
グ（Ｐ　ｅｋｅＩｈａｒｉｎｇ、　Ｊ　、　Ｍ、　）ら
によって記載されている［（１９８７）Ａｎａ、Ｂｉｏ
、上６５：３２０］。

糖タンパク質のオリゴ糖残基は、０−グリコシド結合ま
たはＮ−グリコシド結合によりタンパク質残基に付着し
ている。腫瘍細胞により合成される糖タンパク質オリゴ
糖の炭水化物の構造は、正常な細胞における炭水化物の
構造とはしばしば異なっており、そのため、そのような
糖タンパク質は腫瘍マーカーとなる可能性を有している
。これら腫瘍マーカーの多くはムチン糖タンパク質とし
て同定されている。ムチンは、高分子量の糖タンパク質
であり、通常高い炭水化物含量を有し、炭水化物側鎖が
Ｏ−グリコシド結合によりタンパク質鎖に結合している
ことを特徴とする。ＩｇＡ、はそうではな、いが、Ｉｇ
Ａ＋もまた、Ｏ−グリコシド結合によりタンパク質鎖に
結合した炭水化物側鎖を含んでいる。この〇−結合は、
ポリペプチドのセリンまたはトレオニンの水酸基とオリ
ゴ糖のＮ−アセチルガラクトサミンの還元末端との間で
形成される。ある種のレクチンは、ＩｇＡ＋およびムチ
ンのポリペプチド鎖に〇−結合したＤガラクトースβ（
１−３）−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＤＧａｌβ（
１−３）ＤＧａｌＮＡｃ）オリゴ糖構造を認識し、これ
に結合する。

ムチンおよびＩｇＡ、は、この〇−結合を有する血清お
よび体液中での主要な糖タンパク質である。

血清糖タンパク質の大多数はＮ−グリコシド結合を有し
ている。これらのＮ−結合は、アス六うギンのアミド窒
素原子とＮ−アセチルグルコサミンの還元末端との間に
形成される。

癌患者においては、〇−結合糖タンパク質のオリゴ糖残
基は、腫瘍細胞の壊死および腫瘍近傍で放出されるグリ
コジルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼのため
変化を蒙る。糖タンパク質のＩｇＡ＋およびムチンは〇
−結合オリゴ糖を含むため、放出されたグリコジルトラ
ンスフェラーゼおよびグリコシダーゼの基質として働く
ことができる。グリコシダーゼおよびグリフジルトラン
スフェラーゼが呻瘍から放出されると、ｒ　ｇ　Ａ　１
分子の〇−結合炭水化物構造は変化を蒙る。

変化を蒙っていないＩｇＡ、はレクチン結合を受けやす
いＤＣ；ａｌβ（１−３）ＤＧａｌＮＡｃ構造を含んで
おらず、その結果、これらの〇−結合炭水化物側鎖は低
レベルまたはバックグラウンドの正常レベルとなる。し
かしながら、グリコシダーゼによりＩｇへ４分子が変化
を蒙ったときには、レクチン結合を受けやすいこれらＤ
Ｇａｌβ（１−３）ＤＧａ　ｌ　Ｎ　Ａ　ｃ構造は、そ
の数が増加する。

これらの癌により変化を蒙ったＩｇＡ＋免疫グロブリン
を検出すること、またはＩｇＡ、のｒｇＡ！に対する比
率９変化を検出することが、ＩｇＡＩ分子上の〇−結合
炭水化物側鎖を測定することによって高い特異性レベル
で行うことができれば有利であろう。特に有利なのは、
これらの側鎖を検出するのに抗体ではなくレクチンを用
いたイムノアッセイ法である。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記状況に鑑み鋭意研究を重ねた結果、
本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、流体試料中の〇−結合オリゴ糖を
有するＩｇＡ、の存在または量を決定するための方法で
あって、 （ａ）該試料を抗１ｇＡ抗体と接触させて抗！ｇＡ／Ｉ
ｇΔ複合体を生成させ、 （ｂ）該抗１　ｇＡ／　Ｉ　ｇＡ複合体を該１ｇＡ＋に
対して特異性を有する標識レクチンと接触させて、該試
料中にＩｇＡ、が存在するときに抗１ｇＡ／ＩｇＡ／Ｉ
ｇＡ１／レクチン複合体を生成させ、ついで（ｃ）該流
体試料中の該１ｇＡ＋の存在または量を示す指標として
、該抗１ｇＡ／ＩｇΔ１／レクチンＭｆ合体に結合した
、または結合していない標識の存在または量を決定する ことを特徴とする方法； 流体試料中の〇−結合オリゴ糖を有するＩｇＡ＋の存在
または量を決定するための方法であって、（ａ）該試料
を固相に結合した抗１ｇＡ抗体と接触させて抗ＩｇＡ／
ＩｇＡ固相複合体を生成させ、（ｂ）該抗１ｇＡ／Ｉｇ
Ａ固相複合体を該ＩｇＡ１に対して特異性を有する標識
レクチンと接触させて、該試料中にＩｇＡ、が存在する
ときに抗Ｉ　ｇＡ／　Ｉ　ｇＡ／ＩｇＡ１／レクチン固
相複合体を生成させ、ついで（ｃ）該流体試料中の該Ｉ
ｇＡ１の存在または量を示す指標として、該抗１　ｇＡ
／　Ｉ　ｇＡ　／ＩｇＡ１／レクチン固相複合体に結合
した、または結合していない標識の存在または量を決定
することを特徴とする方法； 流体試料中の〇−結合オリゴ糖を有するＩｇＡ。

の存在または量を決定するための方法であって、（ａ）
ＩｇＡ免疫グロブリンに特異的な抗体を固相上に吸着さ
せ、 （ｂ）該試料を抗体コーティング固相に加えインキュベ
ートして抗！ｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を生成させ、（ｃ
）該抗１ｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を洗浄して未反応の試
料を除き、 （ｄ）該１ｇＡ３．に対して特異性を有する酵素標識レ
クチンを加えインキュベートして抗ＩｇＡ抗体ｇＡ１／
レクチン固相複合体を生成させ、 （ｅ）該抗１　ｇＡ／　Ｉ　ｇＡ　／ＩｇＡ１／レクチ
ン固相複合体を洗浄し、 （ｆ）酵素基質を加えてインキュベートし、（ｇ）酵素
反応を停止させ、ついで （ｈ）該流体試料中の該ＩｇＡ、の存在または逍を示す
指標として、標識を検出する ことを特徴とする方法： 流体試料中の〇−結合オリゴ糖を有するＩｇＡ。

の存在または量を決定するための方法であって、（ａ）
　Ｉ　ｇＡ免疫グロブリンに特異的な抗体を固相上に吸
着させ、 （ｂ）該試料を抗体コーティング固相に加えインキュベ
ートして抗１ｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を生成させ、（ｃ
）該抗１ｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を洗浄して未反応の試
料を除き、 （ｄ）該ｒｇＡ、に対して特異性を有する放射性標識レ
クチンを加え、 （ｅ）インキュベートして、ＩｇＡ、が存在するときに
抗ＩｇＡ／ＩｇＡ　ｌ／レクチン固固相会合体生成させ
、 （ｆ）該固相を洗浄し、 （ｇ）該流体試料中の該ＩｇＡ１の存在または量を示す
指標として、標識を検出する ことを特徴とする方法； 抗ヒト１ｇＡ抗体をコーティングしたポリスチレンビー
ズ、該１ｇＡに対して特異性を有する標識レクチン、試
料希釈バッファーおよび初乳１ｇＡ標準からなることを
特徴とする、流体試料中の〇−結合したオリゴ糖を有す
るＩｇＡ、の試験用キット；および 癌胎児性抗原陰性の生物学的流体試料中の０−結合オリ
ゴ糖を有するＩｇＡ、の存在または量を決定するための
方法であって、 （ａ）該試料を、抗ＩｇＡ抗体と接触させて抗１ｇＡ／
ＩｇＡ複合体を生成させ、 （ｂ）該抗ＩｇＡ抗体ｇＡ複合体を該ＩｇＡ１に対して
特異性を有する標識レクチンと接触させて、該試料中に
ＩｇＡＩが存在するときに抗１　ｇＡ／　Ｉ　ｇＡ　。

／レクチン複合体を生成させ、ついで （ｃ）該流体試料中の該１ｇＡｌの存在または量を示す
指標として、該抗１　ｇＡ／　Ｉ　ｇＡ　／ＩｇＡ１／
レクチン複合体に結合した、または結合していない標識
の存在または量を決定する ことを特徴とする方法、を提供するものである。

本発明は、血清、血漿、痰、尿および糞便などの種々の
体液中に存在する、変化を蒙ったＩｇＡ。

免疫グロブリンの存在または量を決定するためのイムノ
アッセイ法に関するものである。本明細書において［変
化を蒙ったＩｇＡ−なる語は、〇−結合オリゴ糖を有す
るすべてのＩｇＡ、を含み、正常な変化を蒙っていない
Ｉ　ｇＡ　、および疾患（腫瘍など）に冒されたＩｇＡ
、の両者を含む。本発明の方法は、試料を抗ＩｇＡ抗体
と接触させて抗１ｇＡ／ＩｇＡ複合体を生成させ、つい
でこの複合体を標識レクチンと接触させて抗ＩｇＡ抗体
ｇＡ／レクチン複合体を生成させる。上記標識レクチン
は、ＤＧａｌβ（１３）ＤＧａｌＮＡｃ　　［ｇＡ、と
は結合できるが、シアル酸化ｒｇＡ、または〇−結合オ
リゴ糖の欠如したＩｇＡｔ＆は結合できない。結合標識
または未結合標識の存在または量を測定することにより
、試料中の変化を蒙ったＩｇＡ、の存在または量を決定
することができる。標識としては、険出可能なシグナル
を生じるものであればいかなるものであってもよく、た
とえば、酵素、放射性標識または蛍光分子などを挙げる
ことができる。

本発明はまた、流体試料中の変化を蒙ったＩｇＡｌの存
在または量を決定するためのインビトロ診断用キットに
も関するものである。本発明のキットは、抗ヒトＩｇＡ
抗体をコーティングしたポリスチレンビーズ、該変化を
蒙ったＩｇＡ＋に対しては特異性を有するかＩｇＡ、に
対しては特異性を有しない標識レクチン、試料希釈バッ
ファーおよびρ１乳１ｇＡ標準からなる。

本発明者らの研究によると、変化を蒙ったＩｇＡ１、と
りわけ血清または血漿中の変化を蒙ったＩｇＡ、レベル
は、正常な果団に比べて肺癌、結腸癌、頭頚部の癌、乳
癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌および膵臓癌、並びに潰
瘍性大腸炎、結腸ポリープおよび膵臓炎のような悪性で
ないある種の疾患を有する患者において上昇することが
示された。

本発明のアッセイ法の結果を、結腸直腸癌患者における
血清学的マーカーとして最も広く用いられている試験で
ある癌胎児性抗原（ＣＥＡ）イムノアッセイの結果と比
較すると、両方法を一緒に用いたときにｔ１乗効果が得
られることがわかる。従って、本発明の変化を蒙ったＩ
ｇＡ、アッセイをＣＥＡアッセイと組み合わせて用いれ
ば、ＣＥＡアッセイを単独で行った場合よりも優れた臨
床情報が得られる。

以下に本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、流体試料中の変化を蒙った〇−結合オリゴ糖
を有するＩｇＡ、の存在または量を決定するための方法
を提供するものであり、本発明の方法の１つの態様は、 （ａ）固相に結合した抗１ｇＡ抗体に流体試料を接触さ
せて抗Ｉ　ｇＡ／　ｌ　ｇＡ固相複合体を生成させ、（
ｂ）該抗ｒｇΔ／ＩｇＡ固柑複合体を該ＩｇＡ１に対し
て特異性を有する標識レクチンと接触させて、流体試料
中に変化を蒙ったＩｇＡ、が存在するときに抗［ｇＡ／
ＩｇＡ／ＩｇＡ１／レクチン固相複合体を生成させ、つ
いで （ｃ）流体試料中の該ＩｇＡ１の存在または量の指標と
して、該抗１　ｇＡ／　Ｉ　ｇＡ　／ＩｇＡ１／レクチ
ン固相複合体に結合した、または結合していない標識の
存在または量を決定する ことを特徴とする。

本発明の抗１ｇＡイムノアッセイの特異性は、抗体とレ
クチンの両方によるものである。

本発明のイムノアッセイでアッセイする流体試１１とし
てはいかなる流体試料であってもよいが、一般に、血液
、血清、血漿、痰、尿または糞便のような体液であり、
血液、血清または血漿が最も好ましい。

抗！ｇＡ−抗体は、ＩｇＡまたはＩｇＡ、に特異的なポ
リクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよ
く、固相に吸着させるかまたは共有結合的に結合させる
。固相としては、ポリスチレンビーズ、微細粒子、ウェ
ル、ストリップ、プレートまたは当業者によく知られた
池の適当な固体支持体か挙げられる。

本発明を実施するのに有用なレクチンには、ＩｇＡ、お
よびムチンのポリペプチド鎖に〇−結合したＤＧａｌβ
（１−３）ＤＧａｌＮＡｃオリゴ糖摺造を認識し、これ
に結合するレクチンが含まれる。この目的のために現在
のところ特に好ましいレクチンには、ピーナソツアグル
チニン（Ｐ　Ｎ　Ａ、　）およびハカマカズラ（Ｂａｕ
ｈｉｎｉａ　ｐｕｒｐｕｒｅａ　ａｌｂａ）アグルチニ
ン（ＢＰＡ）が含まれるか、適当な特異性を有する他の
レクチンを用いることもできる。

本発明に用いる標識としては、酵素、放射性同位体、蛍
光標識、または検出可能なシグナルを生成し当業者によ
く知られた他の化学的または生物学的標識が挙げられる
。標識として酵素を用いる場合には、基質が酵素の存在
下で色のついた生成物を生成する。たとえば、西洋ワサ
ビペルオキシターゼを用いる場合には、基質としてＯ−
フェニレンジアミンを加えて色のついた生成物を生成さ
せ、これを分光学的に測定することができる。

放射性標識を用いる場合には標識を活性化するために基
質を加える必要はなく、放射性標識レクチンおよび固相
を適当な量でインキュベートした後、未結合放射性標識
レクチンを洗浄により除き、固相に結合した放射性同位
体を測定することにより結合放射性標識レクチンを決定
する。

レクチン上の標識は、アルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシターゼおよびグルコースオキシダーゼのような
酵素であるのが好ましい。レクチンに用いるのに最も好
ましい標識は、西洋ワザビベルオキシダーゼ酵素である
。

本発明のアッセイを酵素イムノアッセイ態様で行う場合
には、流体試料を抗［ｇＡ抗体に加え・インキュベート
する。ＩｇＡ、フラクションおよびＩｇＡ、ｔフラクシ
ョンの両方からなる全１ｇＡか、抗ＩｇＡ抗体に、結合
する。ついで、抗ＩｇＡ抗体に結合していないＩｇＡお
よび残留する試料成分をすべて洗浄により除く。ついで
、抽出１ｇＡ、上のＤＧａｌβ（１３）ＤＧａｌＮＡｃ
レセプターに特異的な酵素標識レクチンを洗浄ビーズに
加える。結合試料＋ｇＡおよび標識レクチンを含むビー
ズをインキュベートする。適当な時間の後、ビーズを再
び洗浄し、ついで反応管に移し、ここで基質を加える。

ついで反応管をインキュベートする。反応を停止させ、
試料中のＩｇＡ、に結合したレクチン結合部位の測定指
標として固相中の標識を検出する。

つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１ 本実施例では、酵素標識レクチンを用い、変化を蒙った
炭水化物残基を有するＩｇＡ、の血清中の存在または量
を決定するためのアッセイを行った。

（Ａ）ＩｇＡに対するポリクローナル抗体の調製：Ｉｇ
Ａを結合するのに用いたポリクローナル抗体は、［ＣＮ
イムノバイオロジカルズ（［ｍｍｕｎｏＢｉｏｉｏｇｉ
ｃａｌｓ）（カタログ＃６５−０６５）から入手した、
ヒトＩｇＡ（α鎖）に対するウサギ抗血清から調製した
。この抗体はつぎのようにして調製した。すなわち、通
常のプロティンＡアフィニティークロマトグラフィーに
より上記抗血清からＩｇＧフラクションを精製した。２
０ｍＭトリス−Ｉ（Ｃ１，０，２Ｍ　ＮａＣＬ　ｐＨ８
，３中で平衡化したプロティンＡアフィニティーカラム
に抗血清を加えた。カラムを同じバッファーで溶出し、
フラクションを集めた。溶出は、２８０ｎｍにおける吸
光度か基準線に戻るまで続けた。ついでカラムを０４１
Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３，０で溶出し、２８０ｎｍ
における吸光度が基準線に戻るまでフラクションを集め
た。２８Ｏｒ＋ｎ＋での吸光度によりタンパク質を含む
と決定されたフラクションをｐＨ３，０溶出工程からプ
ールし、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，５に対し
て透析した。この透析した抗体をポリスチレンビーズを
コーティングするのに用いた。得られた抗体はヒトＩｇ
Ａ（α鎖）に対してのみ特異的であり、ヒトＩｇＧのＨ
鎖およびＩｇＭのＩ］鎖に対しては特異的ではなかった
。

ＩｇＡのα鎖部分に対して特異性を有する抗体であれば
同ハに有効であると思われる。抗［ｇＡ−ＰＮＡ酵素イ
ムノアッセイには、ウサギ抗ヒトＩｇＡ抗体を用いた。

（Ｂ）ＰＮＡレクチン西洋ワサビペルオキシダーゼ結合
体の調製： ＰＮＡを調製するために、生のビーナツツ（２５０ｇ）
を蒸留水（２５Ｏｚ□中でウェアリング（Ｗａｒｉｎｇ
）ブレンダーを用い室温にて３分間粉砕し、ホモジネー
トを４°Ｃでアセトン（３Ｃ）とともに−夜撹拌し、つ
いで吸引濾過した。残渣を空気乾燥し、残渣（２００ｇ
）をＯ，ｌ　５Ｍ　ＮａＣＩ（１１５０１の中に懸濁し
、これを室温で１時間撹拌し、■０．４００Ｘｙで１時
間遠心分離した。上清を７５％飽和硫酸アンモニウムに
調節し、ｐＨを５．５に調節し、混合物を４°Ｃで一夜
撹拌した。ついで混合物を遠心分離にかけ、ペレットを
蒸留水中に溶解し、水に対して充分に透析し、ついでリ
ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。透析した
フラクションを、酸で処理しＰＢＳ中で平衡化しておい
たセファロース６Ｂカラムに加えた。吸光度が２８０ｎ
ｍの基準線に達するまでカラムを溶出した。Ｑ、４Ｍ　
Ｄ−ガラクトースを含むＰＢＳでカラムを溶出し、２８
０ｎｍの吸光度を示すフラクションをプールし、ＰＢＳ
に対して充分に透析した。

透析したプールは精’ＩＰＮＡであった。

西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）をシグマ・ケ
ミカル社から購入し、以下の方法によりＰＮＡに結合さ
せた。

ＨＲＰＯ（酢酸ナトリウムｉｏ＋Ｍ中に１５ａｇ／ｘ（
、ｐＨ４，５）にメタ過ヨウ素酸ナトリウムを最終濃度
が３３ｍＭとなるように加え、混合物を室温で１５分間
インキュベートした。この混合物を、酢酸バッファー中
で平衡化したセファロースＧ−２５カラム中に通した。

集めた茶色のバンドは活性化ＨＲＰＯであった。最終濃
度が１ｍｇ／Ｍ＆の活性化ＨＲＰ　ＯをＰＮＡ（５０ｍ
Ｍ重炭酸塩、ｐＨ９，５中に４ｉｇ／ｑ（Ｉｃ最終ａＦ
ｌ　）　）に加え、室温で４時間インキュベートした。

水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度２．６ｍＭで加える
ことにより反応を静め、これを４°Ｃで３０分間反応さ
せた。アセトンを最終濃度０．２％（ｖ／ｖ）で加えて
水素化ホウ素ナトリウム反応を停止させた。

（Ｃ）抗１ｇＡ　ＰＮＡ酵素イムノアッセイ手順ポリス
チレンビーズ（直径０．２５インチ）を室温で受動吸着
によりウサギ抗ヒトＩｇＡ（１０μ２／＋１２）で−夜
コーティングした。血清試料（２５μａ）または初乳１
ｇＡｆｍ準（シグマ・ケミカル社、カタログ＃Ｉ　　０
６３３０２５μの、アッセイ希釈液（１０ｍＭリン酸ナ
トリウム、１５０ｍＭ　ＮａＣ１゜ｐＨ７，２中に０．
１％ＢＳＡおよび０．０２％ツイーン２０Ｘ２００μＱ
）およびコーティングビーズをプラスチック反応トレイ
（アボット・ラボラトリーズ、リスト＃４０４６−１６
）のウェルに加えた。

正常ヒト血清プール中に希釈した初乳１ｇＡ３．２０．
６０および１５０μｇ／ｍ（ｌとして標準を調製した。

この正常ヒト血清プールもまた参照コントロールとして
試験した。８４５血清試料のパネルが試験試料であった
。

トレイを３７°Ｃで１時間インキュベートした。

ヒースを蒸留水で洗浄し、ついでアッセイＳｆ液中に希
釈したＨＲＰＯ結合ＰＮＡ（２００μのとともに室温で
再び２時間インキュベートした。このインキュベーショ
ンの後にビーズを蒸留水で洗浄し、ついで反応管に移し
た。各反応管にＯ−フェニレンジアミン基質（アボット
・ラボラトリーズ○ＰＤ試薬キット、リスト＃６１７２
−３０より入手）のアリコート（０，３ｉσ）を加え、
ついでこれを室温で３０分間インキュベートした。ペル
オキシダーゼ反応を停止させるために各反応管にＩＮ硫
酸（１，０ｉのを加え、分光光度計を用いて４９２μｍ
における吸光度を測定した。各標準および試料ニついて
の最終結果（Ｒ値）を、参照コントロールアッセイ値に
関する比率として報告した。

第１図に８４５血清試料パネルから得られた結果を示す
。正常試料の平均Ｒ値は０．９８±０．４７３、Ｄ、で
あり、これを３つのカットオフ値、すなわち１．９１（
平均プラス２８．Ｄ、）、２．３８（平均プラス３３．
Ｄ、）および３，０を確立するために用いた。Ｒ値が１
．９１および２．３８では、それぞれ正常奨料の５．１
％および１．２％がＲ値よりも大きく、３．０のＲ値で
は正常試料の０％がそれより上昇した。

第１表に示すように、８４５のすべての血清試料からの
Ｒ値をこれらのＲ値に関して分析した。

最も高い特異性は３．０のＲ値で得られ、この場合はす
べての正常試料が陰性であり、良性疾患試料の１３％が
Ｒ値よりも大きく、異なる４つのタイプの癌の試料の４
０％以上がＲ値より上昇した。

カットオフＲ値が低くなると癌試料を検出するアッセイ
の感度は高くなるが、カットオフＲ値を越える良性疾患
試料の数が増加するため特異性は悪くなる。

第１表（悪性疾患およびコントロールを用いた抗１ｇＡ
第２表には、良性疾患についてのアッセイの結果を示す
。１．９１のＲ値では９つのすべての肺試料がカットオ
フ値よりも上昇しているが、３゜０のカットオフ値では
２つの試料のみがこのカットオフ値よりも上昇した。８
つの腹部良性試料のうち７つが１．９１カツトオフ値よ
りも上昇したが、わずかに１つのみが３．０カツトオフ
値よりも上昇した。糖尿病を有する患者の試料では、試
料の３０％が３．０カツトオフ値よりも上昇した。

これらの結果は、ＩｇＡ、に〇−結合したオリゴ糖鎖に
関して、癌患者およびある種の良性疾患における血清１
ｇＡは正常者における血清１ｇＡとはしばしば異なるこ
とを示している。

上記のすべての試料はまた、癌患者をモニターするため
に最も普通に用いられるアッセイである癌胎児性抗原（
ＣＥＡ）イムノアッセイでも試験した。血清ＣＥＡと変
化を蒙ったＩｇＡ、の血清レベルとの間に何等の相関関
係も見られなかった。ｒ＝Ｏ，１２４の相関が認められ
た。ＣＥＡ値と抗ＩｇＡ−ＰＮＡＩＩ素イムノアッセイ
からのＲ値とを組み合わすたときに、第２図に示すよう
に、卵巣癌を除いてすべてのタイプの癌において、ＣＥ
Ａ単独の場合に比べて診断感度が増加した。このことは
、ヒト癌患者からの幾つかの試料が陰性であったが、本
発明のアッセイで陽性と試験された場合に起こった。従
って、本発明のアッセイ法は、ＣＥＡアッセイの補足的
な試験として臨床的有用性を有する。

笈樵珂２ 第３図は、試料希釈液の組成を０．１％ウシ血清アルブ
ミン、０．０２％ツイーン２０．５亀ＭＥＤＴＡ、１０
ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣ１，ｐＨ７，
２に変え、実施例１記載の方法を用いて試験した結果を
示す。

本アッセイで試験した血清試料は、２９の正常試料、癌
胎児性抗原アッセイ（ＣＥＡ）値が５　ｎｇ／ｘＱ未満
の３６の結腸癌試料、同アッセイ値が５ｎ９７ＲＱより
も大きい２７の結腸癌試料、結腸ポリープを有する患者
からの２８の試料、憩室症患者からの１５の試料、潰瘍
性大腸炎患者からの１５の試料、硬変症患者からの１５
の試料および肺臓炎患者からの１５の試料であった。

正常平均プラス２標準偏差のカットオフＲ値を用いた。

正常試料の０％、ＣＥＡアッセイ値が５ｎ９／１（１未
満の結腸癌試料の３６％、ＣＥＡア、、セイ値が５　ｎ
９／　＊Ｑよりも大きい結腸癌試料の５９％、結腸ポリ
ープ試料の２５％、憩室症試料の１３％、潰瘍性大腸炎
試料の７３％、硬変症試料の８７％、および肝臓炎試料
の６７％が、この力ｌトオフ値を越えて上昇した。

第３図の結果もまた、本発明のレクチンアッセイが、癌
のアッセイに広（用いられているＣＥΔアッセイの補足
的アッセイとして使用できることを示している。結腸ポ
リープおよび潰瘍性大腸炎の前癌状態並びにＣＥＡ陰性
の結腸癌試料（ＣＥ八へベルが５　ｎ９／　ｘＱ未満の
もの）の３６％においてカットオフＲ値を越えて値が上
昇した。

ＣＥＡアッセイおよび本発明のアッセイは、相乗的また
は補足的な仕方で一緒に用いて、−層多数の前癌状態お
よび癌状態を検出し、疾患の再発について結腸癌患者を
モニターするために用いることができる。

検出された良性の状態は、硬変症および肝臓炎であった
。これらの結果はまた、本発明のアクセイ本発明がこれ
らのタイプの疾患の診断に有用であることを示唆してい
る。

実施例３ 本実施例では、放射性標識レクチンを用いたほかは実質
的に実施例１と同様にしてアッセイを行った。

抗１ｇＡ、−ＰＮＡラジオイムノアッセイポリスチレン
ビーズ（直径０．２５インチ）をウサギ抗ヒトＩｇＡで
コーティングし、実施例１と同様に血清（２５μａ）ま
たは標準（２５μの、アッセイ希釈液（２００μのとと
もに反応トレイのウェルに加えた。アッセイブランクは
、試験試料の代わりにアッセイ希釈液（２５μのを用い
て測定した。トレイを３７°Ｃで１時間インキュベート
し、蒸留水で洗浄し、ついて＋２５１で標識したＰ　Ｎ
　Ａとともに室温で２時間インキュベートした。ビーズ
を標識レクチンとともにインキュベートし、蒸留水で再
び洗浄し、ついで結合した１２５Ｉをカウントするため
に管に移した。

抗１ｇＡ−ＰＮＡ酵素・イムノアッセイは、インビトロ
診断試験キットとして製造し配給することができる。こ
のキットは、抗ヒトＩｇＡ抗体をコーティングした０、
２５インチポリスチレンビーズ、ＩｇＡ、上の〇−結合
オリゴ糖に対して特異性を有する標識レクチン、試料希
釈バッファーお上び初乳１ｇＡ標準からなっている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗１ｇＡ−ＰＮＡ酵素イムノアッセイを用い
て試験を行った場合の８４５の血清試料のパネルから得
られた結果を示すグラフ、第２図は、ＣＥＡアッセイ陰
性の患者試料を本発明のアッセイにより試験した結果を
示すグラフ、第３図は、本発明の別態様の抗ＩｇＡ−Ｐ
ＮＡ酵素イムノアッセイを用いて正常者、非癌患者およ
び癌患者からの１８０の血清試料を試験した結果を示す
グラフである。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）流体試料中のＯ−結合オリゴ糖を有するＩｇＡ＿
   １の存在または量を決定するための方法であって、 （ａ）該試料を抗ＩｇＡ抗体と接触させて抗ＩｇＡ／Ｉ
   ｇＡ複合体を生成させ、 （ｂ）該抗ＩｇＡ／ＩｇＡ複合体を該ＩｇＡ＿１に対し
   て特異性を有する標識レクチンと接触させて、該試料中
   にＩｇＡ＿１が存在するときに抗ＩｇＡ／ＩｇＡ＿１／
   レクチン複合体を生成させ、ついで （ｃ）該流体試料中の該ＩｇＡ＿１の存在または量を示
   す指標として、該抗ＩｇＡ／ＩｇＡ＿１／レクチン複合
   体に結合した、または結合していない標識の存在または
   量を決定する ことを特徴とする方法。
2. （２）流体試料中のＯ−結合オリゴ糖を有するＩｇＡ＿
   １の存在または量を決定するための方法であって、 （ａ）該試料を固相に結合した抗ＩｇＡ抗体と接触させ
   て抗ＩｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を生成させ、（ｂ）該抗
   ＩｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を該ＩｇＡ＿１に対して特異
   性を有する標識レクチンと接触させて、該試料中にＩｇ
   Ａ＿１が存在するときに抗ＩｇＡ／ＩｇＡ＿１／レクチ
   ン固相複合体を生成させ、ついで（ｃ）該流体試料中の
   該ＩｇＡ＿１の存在または量を示す指標として、該抗１
   ｇＡ／ＩｇＡ＿１／レクチン固相複合体に結合した、ま
   たは結合していない標識の存在または量を決定する ことを特徴とする方法。
3. （３）標識が、酵素、放射性同位体および蛍光分子より
   なる群から選ばれたものである請求項（１）または（２
   ）記載の方法。
4. （４）流体試料中のＯ−結合オリゴ糖を有するＩｇＡ＿
   １の存在または量を決定するための方法であって、 （ａ）ＩｇＡ免疫グロブリンに特異的な抗体を固相上に
   吸着させ、 （ｂ）該試料を抗体コーティング固相に加えインキュベ
   ートして抗ＩｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を生成させ、（ｃ
   ）該抗ＩｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を洗浄して未反応の試
   料を除き、 （ｄ）該ＩｇＡ＿１に対して特異性を有する酵素標識レ
   クチンを加えインキュベートして抗ＩｇＡ／ＩｇＡ＿１
   ／レクチン固相複合体を生成させ、 （ｅ）該抗ＩｇＡ／ＩｇＡ＿１／レクチン固相複合体を
   洗浄し、 （ｆ）酵素基質を加えてインキュベートし、（ｇ）酵素
   反応を停止させ、ついで （ｈ）該流体試料中の該ＩｇＡ＿１の存在または量を示
   す指標として、標識を検出する ことを特徴とする方法。
5. （５）酵素標識が、アルカリホスファターゼ、β−ガラ
   クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよび西洋ワサ
   ビペルオキシダーゼよりなる群から選ばれたものである
   請求項（４）記載の方法。
6. （６）流体試料中のＯ−結合オリゴ糖を有するＩｇＡ＿
   １の存在または量を決定するための方法であって、 （ａ）ＩｇＡ免疫グロブリンに特異的な抗体を固相上に
   吸着させ、 （ｂ）該試料を抗体コーティング固相に加えインキュベ
   ートして抗ＩｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を生成させ、（ｃ
   ）該抗ＩｇＡ／ＩｇＡ固相複合体を洗浄して未反応の試
   料を除き、 （ｄ）該ＩｇＡ＿１に対して特異性を有する放射性標識
   レクチンを加え、 （ｅ）インキュベートして、ＩｇＡ＿１が存在するとき
   に抗ＩｇＡ／ＩｇＡ＿１／レクチン固相複合体を生成さ
   せ、 （ｆ）該固相を洗浄し、 （ｇ）該流体試料中の該ＩｇＡ＿１の存在または量を示
   す指標として、標識を検出する ことを特徴とする方法。
7. （７）流体試料が、血液、血清および血漿よりなる群か
   ら選ばれた物である請求項（１）、（２）、（４）また
   は（６）記載の方法。
8. （８）レクチンが、ピーナッツアグルチニンおよびハカ
   マカズラアグルチニンよりなる群から選ばれたものであ
   る請求項（１）、（２）、（４）または（６）記載の方
   法。
9. （９）ＩｇＡ＿１が、該ＩｇＡ＿１のポリペプチド鎖に
   Ｏ−結合したマスクされていないまたは露出したＤＧａ
   ｌβ（１−３）ＤＧａｌＮａｃオリゴ糖構造を含む請求
   項（１）、（２）、（４）または（６）記載の方法。
10. （１０）抗ヒトＩｇＡ抗体をコーティングしたポリスチ
    レンビーズ、該ＩｇＡ＿１に対して特異性を有する標識
    レクチン、試料希釈バッファーおよび初乳ＩｇＡ標準か
    らなることを特徴とする、流体試料中のＯ−結合したオ
    リゴ糖を有するＩｇＡ＿１の試験用キット。
11. （１１）癌胎児性抗原アッセイ陰性の生物学的流体試料
    中のＯ−結合オリゴ糖を有するＩｇＡ＿１の存在または
    量を決定するための方法であって、 （ａ）該試料を抗ＩｇＡ抗体と接触させて抗ＩｇＡ／Ｉ
    ｇＡ複合体を生成させ、 （ｂ）該抗ＩｇＡ／ＩｇＡ複合体を該ＩｇＡ＿１に対し
    て特異性を有する標識レクチンと接触させて、該試料中
    にＩｇＡ＿１が存在するときに抗ＩｇＡ／ＩｇＡ＿１／
    レクチン複合体を生成させ、ついで （ｃ）該流体試料中の該ＩｇＡ＿１の存在または量を示
    す指標として、該抗ＩｇＡ／ＩｇＡ＿１／レクチン複合
    体に結合した、または結合していない標識の存在または
    量を決定する ことを特徴とする方法。