CN102043046B - 一种检测糖链异常IgA肾病的蛋白芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白芯片领域，特别是涉及一种检测糖链异常IgA肾病的蛋白芯片，所述蛋白芯片是将凝集素固定在固相载体上，采用标记的二抗与检测样本中IgA结合，凝集素选自蜗牛凝集素或长柔毛野豌豆凝集素。本发明的蛋白芯片利用凝集素与特定糖链蛋白的特异性结合来诊断疾病，为疾病的诊断提供了新的途径。本方法简便易行，成本较低，简化了操作步骤，缩短了检测时间，是一种适宜推广的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白芯片领域，特别是一种检测糖链异常IgA肾病的蛋白芯片及糖链异常IgA肾病检测方法。
背景技术
蛋白芯片是通过平面微细加工与生物分子的自组装技术相结合，在微小载体上组装成数目众多的不同生物分子微阵列，以实现对目标分子信息的大规模检测。
糖生物学(glycobiology)是研究聚糖及其衍生物的结构、化学、生物合成及生物功能的科学。科学家把研究生物体内多糖的科学叫做“糖生物学”，也有人沿袭“基因组学”和“蛋白质组学”的概念把这们学科叫做“糖原组学”。蛋白质、核酸和多糖是构成生命的三类大分子，蛋白质和核酸的研究已经成为生命科学中的热点问题。随着蛋白质和核酸研究的深入，糖类的重要性也浮出水面，成为生命科学研究中的新热点。
1990年，有3家实验室几乎同时发现当组织受到损伤时，白血球和免疫细胞穿过血管壁，进入受损组织，以便杀灭入侵的微生物。然而，过多白血球的进入则可能导致炎症的产生。并且发现炎症过程与糖类和相关的糖结合蛋白参与有关。更进一步的研究表明，进入血液循环系统的癌细胞可能借助了糖链改变的机制穿过血管，导致癌症的转移。随后又出现了以这一基础研究成果为依据，开发抗炎和抗肿瘤药物的热潮。最近的研究结果表明，糖复合物表面糖链结构的改变和很多疾病的发生相伴随。
糖生物学之所以落后于基因和蛋白质的研究，在于糖分子本身的复杂性以及研究人员缺乏研究糖类分子的有效工具。近年来在糖类研究方面已取得不少进展。目前研究结果表明，糖类作为信息分子在受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要作用；炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和转换、病原体感染等生理和病理过程都与糖类的参与有关。
糖蛋白是一种结合蛋白质，由短的寡糖链与蛋白质共价连接构成。糖与蛋白质之间以蛋白质为主，其一定部位上以共价键与若干短的寡糖链相连，这些寡糖链常常是具分支的杂糖链，不呈现重复的双糖系列，一般由2～10个单体(少于15)组成，未端成员常常是唾液酸或L-岩藻糖。通常每个分子的含糖量较少(约4％)。一些糖蛋白只含一个或几个糖基，另一些含有多个线性或分支的寡糖侧链。糖蛋白包括酶、激素、载体、凝集素、抗体等。
糖蛋白的生物学功能有：
一、糖蛋白携带某些蛋白质代谢去向的信息。糖蛋白寡糖链末端的唾液酸残基，决定着某种蛋白质是否在血流中存在或被肝脏除去的信息。
二、寡糖链在细胞识别、信号传递中起关键作用。淋巴细胞正常情况应归巢到脾脏，而切去唾液酸后，结果竞归巢到了肝脏。在原核中表达的真核基因，无法糖基化。
糖蛋白可以是胞溶性的，也可以是膜结合型的，可以存在于细胞内在也可存在于细胞间质中。糖蛋白在动植物中较为典型，脊柱动物中糖蛋白尤为丰富，如金属转运蛋白(转铁蛋白)、血铜蓝蛋白，凝血因子、补体系统、一些激素，RNase、膜结合蛋白、主要组织相容性抗原(major histocompatibility antigen)。绝大多数糖蛋白的寡糖是糖蛋白的功能中心。有些糖蛋白的糖对于糖蛋白自身及机体起着保护作用或润滑作用，如牛的RNaseB(糖蛋白)对热的抗性大于RNaseA，大量的唾液酸能增强唾液粘蛋白的粘性从而增强唾液的润滑性。南极鱼抗冻蛋白的糖组分能与水形成氢键，阻止冰晶的形成从而提高了抗冻性。糖蛋白在细胞间信号传递方面起着更为复杂的作用。HIV的靶细胞结合蛋白GP120是一个糖蛋白，能与人类靶细胞表面的CD4受体结合从而附着在靶细胞表面，如果去掉GP120的糖部分则不能与CD4受体结合从而失去感染能力。细胞表面的糖蛋白形成细胞的糖萼(糖衣)、参与细胞的粘连，这在胚胎组织的生长、发育以及分化中起着关键性作用。
糖蛋白的异常对于很多疾病具有诊断意义，因此，可通过检测异常糖蛋白为疾病的检测提供新途径。
IgA肾病是一组多病因引起的具有相同免疫病理学特征的慢性肾小球疾病。临床上约40％～45％的患者表现为肉眼或显微镜下血尿，35％～40％的患者表现为显微镜下血尿伴蛋白尿，其余表现为肾病综合征和肾功能衰竭。IgA肾病是世界范围内一种常见的肾小球疾病，IgA肾病的流行在不同洲、不同国家或在一个国家不同地区的差异很大，如亚洲的日本、新加坡，IgA肾病肾病的发病率占原发性肾小球疾病的50％，而美国西部的印第安人低发区只占2％。一般而言，白人、黄种人明显高于黑人的发病率。我国IgA肾病的发病率占原发性肾小球疾病的26％～34％。男女之比大约是2∶1。
目前的诊断依据有：
1.发生于上呼吸道感染后的肉眼血尿或显微镜下血尿或无症状性蛋白尿(尤其男性青年)；
2.血尿为肾小球性(畸形红细胞为主)，蛋白尿为高、中分子或混合性蛋白尿，血清IgA可能升高；
3.肾活检免疫病理检查肾小球系膜区可见到颗粒状IgA为主的免疫荧光；
4.除外链球菌感染后急性肾小球肾炎、非IgA系膜增生性肾炎、薄基底膜肾病、狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、肝硬化及酒精性肝病的肾损害等。
目前关于IgA肾病的诊断，市场上已经出现了相关的试剂盒。例如专利申请号为200710107507.7的发明申请，公开了一种检测糖链异常IgA肾病的装置及应用此装置的试剂盒。但该发明的装置使用较为复杂，同时无法适应对高发人群进行大规模筛查的需要。
发明内容
本发明的发明目的在于提出一种检测糖链异常IgA肾病的蛋白芯片。
本发明的又一发明目的在于提出一种糖链异常IgA肾病的检测方法。
为了完成本发明的发明目的，本发明采的技术方案为：本发明涉及一种检测糖链异常IgA肾病的蛋白芯片，其中，所述蛋白芯片是将凝集素固定在固相载体上，采用标记的二抗与检测样本中IgA结合。
其中，本发明的第一优选方案为：所述的凝集素选自蜗牛凝集素或长柔毛野豌豆凝集素。
本发明的第二优选方案为：蜗牛凝集素的点样浓度为0.2～1.0mg/ml，优选为0.5～1.0mg/ml；长柔毛野豌豆凝集素的点样浓度为0.5～1.5mg/ml，优选为0.8～1.2mg/ml。
本发明的第三优选方案为：所述的固相载体包括玻璃硅片、尼龙膜、纤维素膜、金属或凝胶，优选玻璃硅片或硝酸纤维素膜。
本发明的第四优选方案为：本发明糖链异常IgA肾病的蛋白芯片上蜗牛凝集素或长柔毛野豌豆凝集素点样体积为1～50nl，优选10～40nl。
本发明的第五优选方案为：本发明糖链异常IgA肾病的蛋白芯片上蜗牛凝集素或长柔毛野豌豆凝集素点样直径为1～300微米，优选10～200微米。
本发明还涉及一种糖链异常IgA肾病的检测方法，包括以下步骤：
1)取本发明检测糖链异常IgA肾病的蛋白芯片加入参考品、阴性对照品、阳性对照品和待测样品，室温反应1～3小时，除去芯片孔中的液体，用清洗液清洗；
2)加入酶标记的二抗或抗体/抗原，室温反应1～3小时，除去芯片孔中的液体，清洗后加入发光底物液，利用蛋白芯片检测仪进行检测，自动分析，得到结果。
其中，参考品为糖链异常IgA标准物质，浓度为1～10ng/ml，反应时间优选为2小时，反应的缓冲液优选为pH为7.4 0.1M的PBS缓冲液。
本发明所具有的技术优势为：
(1)本发明的蛋白芯片利用凝集素与特定糖链蛋白特异性结合，对IgA肾病来进行诊断，为疾病的诊断提供新途径。
(2)本发明的蛋白芯片利用凝集素与糖蛋白的特异性结合，抗体/抗原特异结合，具有更高的特异性行和敏感性。
(3)本发明的蛋白芯片应用酶联免疫标记法进行检测，该方法简便易行，成本较低，简化了操作步骤，缩短了检测时间。
(4)本发明的蛋白芯片具有集成化、高通量、平行性好，以及微量化、系统化、自动化的特点，并且具有很高的升级潜力。
具体实施方式
本发明的具体实施方式目的在于对本发明进行进一步的解释和说明，并不对本发明的内容进行限制。
实施例1 利用蛋白芯片检测糖链异常IgA肾炎
1.蜗牛凝集素(HAA/HPA)与芯片固定
本芯片采用聚碳酸酯材料，蜗牛凝集素HAA溶解于晶芯芯片点样液，蜗牛凝集素的点样浓度为1.0mg/ml，用点样仪将凝集素点样于芯片上，点样体积为10nl，点样直径为50～100微米；点样完毕后，将芯片置于室温过夜。
2.处理样本
取糖链异常IgA肾炎患者血清400份，正常人血清600份，用pH7.4的0.1M的PBS缓冲液稀释；
3.采用YL-JCY2.0型蛋白芯片检测仪进行检测
1)取蛋白芯片加入100μl 0.1M Tris-HCl室温反应1.5小时进行封闭，并将芯片以0.1MTris-HCl-Tween20溶液清洗3次，加入参考品、阴性对照品、阳性对照品和待测样品，室温反应2小时，除去芯片孔中的液体，用0.1MTris-HCl-Tween20清洗3遍，每次5分钟；
其中，阳性对照品为IgA肾炎病人血清，过滤除菌后与无菌条件下分装，于4℃保存；阴性对照品为正常人血清，经鉴定为IgA肾炎阴性，过滤除菌后与无菌条件下分装，于4℃保存；参考品为糖链异常IgA标准物质，其中，糖链异常IgA标准物质的浓度为2ng/ml。
2)加入辣根过氧化物酶标记的羊或兔抗人IgG或IgM，室温反应2小时，除去芯片孔中的液体，0.1MTris-HCl-Tween20溶液清洗3次，每次5分钟；加入辣根过氧化物酶的发光底物液，利用蛋白芯片检测仪进行检测，自动分析，得到结果。
4.实验结果：
用本方法检测600例正常人的血清样品，检测结果589例为阴性，11例为假阳性，特异性为98.17％；用本方法检测400例糖链异常IgA肾炎患者血清，395例为阳性，5例为假阴性，与肾穿刺病理检测结果的符合率为98.75％。
实施例2 利用蛋白芯片检测糖链异常IgA肾炎
1.长柔毛野豌豆凝集素(VVL)与芯片固定
本芯片采用聚碳酸酯材料，蜗牛凝集素HAA溶解于晶芯芯片点样液，长柔毛野豌豆凝集素的点样浓度为1.5mg/ml；用点样仪将凝集素点样于芯片上，点样体积为40nl，点样直径为100～150微米；点样完毕后，将芯片室温过夜。
2.处理样本
取糖链异常IgA肾炎患者血清400份，正常人血清600份，用0.1M的PBS缓冲液稀释；
3.采用YL-JCY2.0型蛋白芯片检测仪进行检测
1)取蛋白芯片加入100μl 0.1M的Tris-HCl室温反应1.5小时进行封闭，并将芯片以0.1％TBS-Tween20溶液清洗3次，加入参考品、阴性对照品、阳性对照品和待测样品，室温反应2小时，除去芯片孔中的液体，并用0.1MTris-HCl-Tween20清洗3遍，每次5分钟；
其中，阳性对照品为IgA肾炎病人血清，过滤除菌后与无菌条件下分装，于4℃保存；阴性对照品为正常人血清，经鉴定为IgA肾炎阴性，过滤除菌后与无菌条件下分装，于4℃保存；参考品为糖链异常IgA标准物质，其中，糖链异常IgA标准物质的浓度为5ng/ml。
2)加入辣根过氧化物酶标记的羊或兔抗人IgG或IgM，室温反应2小时，除去芯片孔中的液体，0.1MTBS-Tween20溶液清洗3次，每次5分钟；加入辣根过氧化物酶的发光底物液，利用蛋白芯片检测仪进行检测，自动分析，得到结果。
4.实验结果：
用本方法检测600例正常人的血清样品，检测结果585例为阴性，15例为假阳性，特异性为97.5％；用本方法检测400例糖链异常IgA肾炎患者血清，392例为阳性，8例为假阴性，与肾穿刺病理检测结果的符合率为98。
Claims (2)
1.一种检测糖链异常IgA肾病的蛋白芯片，其特征在于，所述蛋白芯片是将蜗牛凝集素固定在聚碳酸酯材料上，采用标记的二抗与检测样本中IgA结合，所述的蜗牛凝集素的点样浓度为1.0mg/ml，点样体积为10nl，点样直径为50～100微米。
2.一种检测糖链异常IgA肾病的蛋白芯片，其特征在于，所述蛋白芯片是将长柔毛野豌豆凝集素固定在聚碳酸酯材料上，采用标记的二抗与检测样本中IgA结合，所述的长柔毛野豌豆凝集素的点样浓度为1.5mg/ml，点样体积为40nl，点样直径为100～150微米。
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