IT8047743A1

IT8047743A1 - Procedimento e corredo per determinare il livello di glicolegami associati a tumore.

Info

Publication number: IT8047743A1
Application number: IT1980A47743A
Authority: IT
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1979-01-30
Filing date: 1980-01-29
Publication date: 1981-07-29
Also published as: FR2461256B1; IT1165552B; NL8000536A; US4389392A; GB2043890B; CH645728A5; DE3003301C2; DK36980A; FR2461256A1; SE8000705L; SE451508B; DE3003301A1; ES8102679A1; GB2043890A; IT8047743A0; ES488747A0

Description

DESCRIZIONE dell?invenzione industriale dal titolo: Procedimento e corredo per determinare il livello di gl?colegami associati a tumore

RIASSUNTO

Procedimento per determinare il livello di sostanza contenente glicolegarai associata a tumo re (TAG) in un campione di fluido corporeo compren dente l'operazione di fare reagire la TAG in un campione del fluido corporeo con una lectina per formare un complesso TAG-lectina e misurare la quan tita di complesso di TAG-lectina oppure di lectina che non ha reagito ed un corredo da impiegare in ta_ le procedimento; esso ? utile per la diagnosi di vari cancri o tumori.

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce alla determinazione del livello di sostanze contenenti gli col?gami associati a tumori, cio?, sostanze affi ni agli zuccheri comprendenti glicoproteine, glico peptidi, glicolipidi e zuccheri (qui in seguito TAG) in un campione di fluidi corporei di mammiferi, pi? particolarmente di TAG che aumentano a causa di proliferazione d? cellule indifferenziate, spe cialmente cellule di tumore o cancro,e a diagnosi di cancro basata su questa determinazione.

Finora ? stato impiegato un metodo per deter minare il livello di glicoproteine specifiche in un campione di fluidi corporei di pazienti affetti da cancro. Questo procedimento fa uso della antigenicit? principalmente della parte proteica delle glicoproteine. Per esempio, il livello di ?.1-protei na del f?to e gli antigeni carcinoembriogeni (qui in seguito CEA) vengono determinati per la diagno si di epatoma primario e di cancri di organi dello apparato digerente, particolarmente cancro rettale, ecc,(vedi Igaku no Ayuni, voi. 106, N. 5, Fifth Saturday Special Issue, pp. 235-230 (1978)). Tuttavia, que sti metodi non sono soddisfacenti poich? la loro applicabilit? ? limitata a talari tipi di cancri e tumori.

D?altro canto, non ? noto finora alcun meto do diagnostico che si serva della specificit? di legame del radicale zuccherino di TAG.

Esiste da lungo la necessit? di una metodolo gia quantitativa.non costosa , semplice, per d_e terminare livelli di TAG in fluidi corporei che abbia un'ampia applicabilit?.

Prestando attenzione al fatto che nei fluidi corporei di .Individui o o-ozienti affetti da cancro ? presente TAG prodotta da cellule indifferenziate (per lo pi? cellule cancei'ose) e messe in libert? nel fluido corporeo e che TAG ? drasticamente dif ferente da sostanze contenenti glicole-gami prodot te da cellule differenziate (per lo pi? cellule nor mali) e messe in libert? nei fluidi corporei nella struttura chimica della catena dello zucchero, la sua lunghezza e composizione dei radicali zucche rini, estese ricerche sono state fatte e hanno por tato alla scoperta che TAG?ha un terminale di galat toso~(Bl->3 oppure B1 > 4)n-acetilglucosantnina e, oppure N-acetilga?attosammina e

si lega specificamente con leetine e che il livello di TAG in un campione di fluido corporeo pu? venire determinato facendo reagire la TAG con una lectina. Il livello di TAG indicher? presenza od assenza d? cellule d? cancro, grado di proliferazione di esse ed aumento e caduta di esse e permette una diagnosi di successo di vari cancri o tumori. La presente in venzione ? basata sulla scoperta di cui sopra.

Pertanto, la presente invenzione fornisce un metodo per determinare il livello di TAG in un cam pione di fluido corporeo comprendente l'operazione di fare reagire la TAG in un campione del fluido corporeo con una lectina per formare un complesso di TAG-lectina e misurare la quantit? di complesso di TAG-lectina oppure di lectina che non ha reagito, e corredo da usare in questo metodo.

La figura 1 del disegno annesso ? un grafico rappresentante le quantit? di TAG determinate se, condo l'esempio 1 della presente invenzione e

la figura 2 ? una rappresentazione grafica delle quantit? di TAG determinate secondo l'esempio 2 della presente invenzione.

Vari fluidi corporei possono venire usati nel, la presente invenzione. Esempi di adatti fluidi cor porei comprendono sangue, fluidi di tessuti, linfa, idrotorace, ascite, fluido amniotico, succo gastrico, urina, succo pancreatico, fluido cerebrospinale, sa liva, ecc. Fra questi viene preferito sangue, spe cialmente sotto forma di siero o plasma.

La quantit? di fluido corporeo per i campioni ? usualmente circa 1 fino a circa 10 ml , prefer? bilmente 2 fino a 5 ml.

Nella presente invenzione, la determinazione del livello di TAG in un campione di fluido corpo reo pu? venire eseguita isolando o separando TAG dal fluido corporeo,con reazione con una lectina per formare un complesso di TAG-lectina e misurando la quantit? del complesso di TAG-lectina oppure di lectina che non ha reagito dopo la sua separazione, oppure mediante aggiunta di una lectina etichetta, ta al campione di fluido corporeo direttamente per formare un complesso di TAG-lectina etichettata, se parando il complesso di lectina etichettata con TAG oppure di lectina etichettata che non abbia re.a gito e misurando la loro quantit??

Per separare la frazione di TAG da un campione di fluido corporeo, possono venire usati metodi usua_ li per l?estrazione o separazione di sostanze conte, nenti glicolegami quali salatura, precipitazione, estrazione con solventi, centrifugazione, dialisi, vaglio molecolare, disattivazione enzimatica, ecc, oppure una combinazione di uno o pi? di essi. Per esempio , la frazione TAG pu? venire ottenuta aggiun gendo una quantit? precipitante o denaturante effi cace d? acido solfo-salicilico, acido tricloroaceti co o solfato di zinco a siero di sangue o plasma di sangue oppure riscaldando il siero o plasma di sangue per precipitare albumina, immunoglobulina e simili, eliminando le proteine precipitate mediante filtrazione dial?zzando il filtrato.

In casi in cui si impieghi una lectina etichet_ tata, i fluidi corporei raccolti diversi dal sangue, possono venire usati cos? come sono come campioni di prova (qui in seguito "campione") ? Si preferisce tuttavia, aggiungere una proteina avente un basso tenore in zucchero quale albumina di siero bovino

(BSA) , ecc come proteina protettiva per impedire cbe il campione si denaturi e contemporaneamente

per promuovere la reazione con lecitina Preferibile mente, una quantit? appropriata della proteina protettiva viene aggiunta a campioni dopo la eli_ minazione di albumine, immu noglobuline. ecc, dai campioni poich? ci? permette la determinazione in condizioni pi? regolate? Quando si impieghino cam pioni di sangue, il siero di sangue ottenuto median te metodo di raccolta di siero di sangue usuale, oppure plasma di sangue ottenuto impiegando un anti coagulante quale eparina, EDTA, acido citrico,ecc, pu? venire usato come campione?preferendo plasma di sangue raccolto usando eparina come agente coagulante

I campioni possono venire diluiti con acqua od

adatte soluzioni acquose di tampone, se necessario o desiderato, per esempio in casi in cui il livello

di TAG sia relativamente alto come in asciti, ecc.

Nella presente invenzione possono venire

usate le lectine che possono combinarsi specifica mente con galattosio~(B1- 3 oppure B1->4) N-acetil glucosammina e, oppure -N-acetilgalattosammina,

come descritto in B.C. 250, 8518-8523

(1975); Bioehem Biophys? Res Comm? 62 144 (1975);

Z Immonitaetsforche , 133, 423-4-53 (1969) Br J. Ex p Pathol, 27, 228-236 (1946): Proc* Nati. Acad. Sci

USA, 75, N? 5, 2215-2219 (1978); Biochemistry 13,

196=204 (19?4); Carbohydrate Research, Voi- 51,

pagg- 107118 (1976), ecc, per esempio lectina di arachidi, lectina di olio di ricino (Ricinus commnnis),ecc.

Sostanze che possono venire usate per etichet

tare lectine e in tal modo renderle rilevabili me_

diante mezzi radiometrici,fluorimetrici.colorimetri

ci, e s?mili sono enzimi, sostanze fluorescenti e sostanze radioattive. Esempi di adatti enzimi com prendono giuncami?asi, glucoso-ossidasi, perossida

si, fosfatasi alcalina, B-galattosidasi, emeoctapepti de, ecc, e loro frammenti attivi. Esempi di adatte sostanze fluorescenti comprendono fluoreaceina, fluorescein? isotiocianato, rodammina, dansilcloru

ro (cio? 5-dimetilammino-l~naftalin~solfonilcloruro) , ecc Esempi di adatte sostanze radioattive comprendono iodio radioattivo, tritio, ecc. Per etichettare lecti

ne con le sostanze etichettanti sopra descritte, pu? venire impiegato qualsiasi metodo usuale usato

per etichettare proteine note, quali antigeni ed anticorp? con enzimi, sostanze fluorescenti e s_o

stanze radioattive? Per esempio, lectine possono

venire etichettate con isotopi radioattivi secondo

il metodo descritto in Kazuo Shizunome and Yuichi Kumahara: "fiadioimmunoassay" pp.45-56 (1978) pubbli cato da Asakura Publishing CO?, Tokyo?

Nel procedimento della presente invenzione, lectine etichettate o non etichettate vengono US?? te preferibilmente in miscuglio con solventi adatti? Pu? venire impiegato qualsiasi solvente che non de_ naturi lectine etichettate o non etichettate ad esempio soluzione di sale fisiologica, acqua, solu zione tampone tris-HCl, 0, 1 molare (pH circa 7,5), soluzione di tampone al fosfato 0,1 molare (pH cir ca 7,4), ecc. La quantit? di lectina contenuta nel solvente o diluente pud venire scelta a seconde del valore di agglutinamento (che ? definito in termini di una diluizione massima o finale di campioni di luiti in serie per due volte), tipo di etichetta oppure sostanze da determinare, ecc, ed usualmente ? circa 0,01 fino a circa 100 ?g/ml, preferibilmen te 0,03 fino a 40 ?g/ml . Le soluzioni di lectine etichettate o non etichettate di cui sopra possono venire ulteriormente diluite

Per realizzare il metodo della presente in venzione, una quantit? predeterminata di frazio ne di TAG o fluido corporeo, di per s? viene mesco lata con una data quantit? di lectina o lectine etichettata, rispettivamente ed il miscuglio risul tante viene lasciato riposare per reagire a circa 45?Co meno, preferibilmente a circa 4 fino a 40?C, ancora preferibilmente circe 20 fino a 40?C. Il complesso di lectina non etichettata od etichetta ta e TAG oppure di lectina etichettata o non eti chettata che non ha reagito pu? venire separato dal miscuglio di reazione mediante qualsiasi procedimeli to d? separazione usuale, per esempio cromatografia elettroforesi, salatura, frazionamento, dialisi., filtrazione di gel, adsorbimento od una combinazio ne di essi oppure mediante un metodo di separazione impiegando gel di agar, gel di agerose oppure gel di poliacrilammide ?

In maggior dettaglio, per separare, la lectj. na etichettata o non etichettata che non ha reagito dal miscuglio di reazione, una quantit? adatta d? un precipitante per il complesso T?G-lectina pu? venire aggiunta al miscuglio di reazione di cui so pra ed il complesso risultante pu? venire esportato per esempio, mediante centrifugazione per ottenere in tal modo la frazione lectina etichettata o non etichettata che non ha reagito come surnatante. Pre cipitanti rappresentativi sono polietilenglicole, solfato di ammonio (fino a saturazione) fiivanol (acrinol), ecc. Le condizioni di centrifugazione pos. sono venire scelte in maniera appropriata secondo i precipitanti usati. Per esempio, quando come pre. capitante si impieghi polietilenglicole, si prefer? sce effettuare la centrifugazione a circa 1000 giri per circa fino a 60 minuti.

In casi in cui il complesso di lectina eti. chettata o non eticnettata ? TAG venga isolato dal. la lectina che non ha reagito, il complesso pu? venire separato con facilit? dalla lectina che non ha reagito sfruttando la differenza nella velocit? di diffusione fra il complesso e la lectina che non ha reagito su gel di agar,gel di agarose oppure gel di poliacrilammide. Pi? particolarmente, quan do il miscuglio di reazione venga p?sto su gel in un recipiente, lectina che non ha reagito si diffon de entro il gel mentre il complesso TAG-lectina ri. mane su gel cio?, fuori dal gel senza diffondersi, fertanto essi possono venire separati uno dall?al. tro con facilit? in maniera usuale. non vi ? limi tazione alla preparazione dei geli e per questo scopo possono venire impiegati m?todi impiegati con venzionalmente. Per esempio, una certa quantit? di agar, agaros? o poliacrilammide viene aggiun ta ad un diluente che non s?a capace di provocare denaturazione di proteine, quale acqua distillata, citrato o soluzione tampone tris-HCl (pH: oiroa 7,5), ecc, seguita da riscaldamento a 60 fino ad 60?C con blando agitamento per dieoioglierlo e la so luzione viene versata in on recipiente adatto qua le una prov?tta e lasciata raffreddare per congelar si in maniera simile a gelatina? La concentrazione del gel viene scelte a seconda della dimensione (per esempio peso molecolare, etereoatruttura, ecc) della sostanza di etichetta e complesso di TAG-lecti na etichettata? Usualmente vengono usati nella pre sente invenzione geli di circa 0,4 fino a 2,0% in peso, preferibilmente 0,7 fino ad 1,0% in peso? Il gel risultante pu? contenere un conservante, se ne cessario desiderato. La superficie del gel cos? preparata pu? essere piana o concava, quest'ulti ma forma venendo preferita poich? complessi da for mare non aderiranno alla parete del recipiente.

La quantit? di complesso di TAG-lectima etichetta ta o non etichettata oppure di lectina etichettata o non etichettata che non ha reagito viene misura ta mediante il metodo usuale ed il livello di TAG nel fluido corporeo pu? venire calcolato dal vaio, re ottenuto

Per la misura della quantit? di lectina non etichettata residua, possono venire usati vari meto di- Si preferisce, tuttavia, aggiungere a campioni una sostanza capace di reagire con la lectina spe cificamente per agglutinarla o precipitarla ed osser vare ad occhio il cambiamento oppure effettuando mi sure impiegando una analisi ottica, per esempio den sit? ottica. Esempi di adatte sostanze che aggluti nano lectine comprendono glicolproteine aventi un galattoso-( B1- 3 oppure Bl ?> 4)-N-acetilglucosam mina, per esempio eritrociti di coniglio, eritrociti di ovini trattati con neuratnminidasi, ecc, e perle di vetro,Sephadex, ecc,ricoperte con le glicoprotei ne sopra descritte.

in pratica, questo metodo pu$ realizzarsi come SE gue- Il miscuglio di reazione sopra descritto viene diluito in successione per due volte con un diluen te, per esempio soluzione tampone al fosfato 0,15 mo_ lare, soluzione salina fisiologica, eco, ed aliquo te della diluizione vengono poste su lastre a forma di V oppure di U o lastrine di vetro oppure'in pic cole prov?tte o simili, e ciascuna viene mescolata con una sostanza capace di agglutinare la lectina specificamente, agitando, e le lastrine o simili por tanti il miscuglio vengono lasciate riposare a 45?C o meno, preferibilmente a 4 fino a 4G?C per 30 minati o pi?, preferibilmente per .60 fino a 90 minuti per osservare la diluizione finale o massima alla quale si verifica ancora agglutinamento. Questa di lu?zione massima viene definita come valore di agglu_ tinamento. Le lectine che possono venire usate nel la presente invenzione mostrano sostanzialmente il medesimo valore di agglutinamento-In casi in cui si impieghino lectine etichet, tate, la determinazione del livello di TAG pu? ve nire effettuata mediante un metodo adatto per misura re sostanze etichettate per lectine. Per esempio, dopo separazione del complesso TAG-lectina e di lecti na etichettata che non ha reagito uno dell'altro, la quantit? di complesso TAG-lectina etichettata oppure lectina etichettata che non ha reagito pu? venire determinata mediante scelta di un sostrato appropriato per un enzima il quale sostrato possa venire analizzato mediante analisi colorimetrica o XluDrimetrica e determinazione della attivit? dell?enzima quando la lectina venga etichettata con esso; mediante determinazione della intensit? di fluorescenza quando la lectine venga etichetta, ta con una sostanza fluorescente oppure mediante determinazione della radioattivit? quando la lecti^ na venga etichettata con una sostanza radioattiva.

Per esempio, quando per etichettare lectina venga impiegato un enzima (per esempio perossidas?), una quantit? predeterminata del miscuglio di reazione viene fatta gocciolare sulla superficie del gel in una provetta e lasciata riposare a circa la tem peratura ambiente, preferibilmente a 4 fino a 25?C per 1 fino a 48 ore. Poi, una data quantit? di

un sostrato adatto per l?enzima (per esempio acqua ossigenata) viene aggiunta al miscuglio di reazione co s? trattato per effettuare la reazione enzimatica seguita dal resto in un periodo appropriato di tem po e la densit? ottica del miscuglio risultante vie ne misurata, se necessario, impiegando un colorante o formatore di colore (per esempio o-feni?endiamtnina). In altra maniera, quando per etichettare lectina venga usata una sostanza fluorescente, una quantit? predeterminata di diluente quale una soluzione tam pone viene aggiunta al miscuglio di reazione sul gel dopo l'incubazione e viene misurata la intensi, t? di fluorescenza del miscuglio risultante?

Un procedimento particolarmente conveniente per effettuare il metodo qui descritto, consiste in un corredo per la determinazione di TAG in un flu?, do corporeo, quale plasma o siero. Un tale corredo pu? comprendere un reagente contenente una lectina di pianta come agente agglutinante specifico per TAG. Il reagente/lectina pu? anche contenere uno stabilizzante e oppure conservante per lectina, quale una proteina avente un basso tenore in zuc, chero, per esempio una albumina di siero bovino? In una esecuzione preferita, questo reagente lectina di pianta pu? venire utilizzato e nel corredo pu? venire incluso un reattivo/ ricostituzione con tenente un solvente a base acquosa o miscibile con acqua (pH circa 6 fino a 7,8, preferibilmente 7 fino a 7,2). I reagenti possono eventualmente contene re anche tamponi per mantenere il sistema reagente ricostituito ad un pH regolato e conservanti e, oppu. re stabilizzanti destinati a prevenire il deterio ramento del materiale prima dell'uso? Sebbene i tamponi non vengano considerati un componente cri tico dei reagenti del corredo, preferibilmente nell'effettuare il presente metodo dovrebbe venire impiegato un pH di circa 6 fino a 7,8, preferibil mente un pH di ? fino a 7,2). Il reagente di rico stituzione pu? contenere di preferenza acqua come solvente? Peresempio, come agente di ricostituzio ne pu? venire impiegata una soluzione di sale fi Biologica, una soluzione di tampone al fosfato, ecc, Inoltre, pu? venire aggiunto un solvente miscibile con acqua che non influisca sfavorevolmente sulla reazione.

Come detto qui sopra, il livello di TAG in un campione di fluido corporeo pu? venire determi nato vantaggiosamente secondo la presente invenzione. Inoltre questa invenzione che permette il riconosci mento di un glioolegame associato a tumore permette un'ampia applicabilit? a vari tipi di cancri o tu mor? in confronto con metodi o sistemi usuali che impiegano antigenicit? e riconoscono principalmente la parte proteina di glicoproteine quali CEA, a1 pro teina di feto, ecc, ed ? applicabile alla diagnosi di qualsiasi cancro o tumore quale cancro dello stomaco, cancro della mammella, cancro del colon, cancro del retto, cancro della ovata, cancro della cavit? orale, cancro della lingua, cancro della le ringe,cancro della prostata, liposercoma, melanoma maligno, linfoma maligno, sarcoma primario gastrico, epatoma , ecc, nei loro stadi precoci fino agli sta di tardivi con facilit? e pertanto la presente in venzione e molto utile per la scoperta di cancri nei loro stadi iniziali.

La presente invenzione verr? spiegata in mag gior dettaglio con riferimento ad esempi che debbono venire considerati non limitativi.

Se non viene indicato altrimenti tutte le par ti e percentuali qui usate non in peso.

Esempio 1 Determinazione impiegando una reazione di inibizione di agglutinamento di cellule del sangue

(i) Preparazione del campione di prova

Sangue viene raccolto da ciascuno di 7 pa

zienti con cancro dello stornato, 4 pazienti con can cro del polmone, 3 pazienti con cancro della mammella ed un paziente ognuno con cancro del colon, can

ero r?ttale, cancro delle ovaie, cancro della cavi

t? orale, cancro della lingua, cancro della laringe, cancro uterino, cancro della prostata, melanoma ma U gno, liposarcoma, linfoma maligno e sarcoma pri. mario gastrico e 7 persone sane e si preparano campioni di plasma .in modo usuale. Ai campioni di plasma viene aggiunta una soluzione acquosa al 6% di acido sol

fosalicilico, a dosi, agitando, finch? la proporzio ne dell'additivo rispetto al plasma ? 1:1 in volume.

Dopo avere agitato sufficientemente, il miscuglio viene centrifugato a 3000 fino a 3500 giri per mi

nuto p?r 10 minuti ed il surnatante viene dializza

to con acqua e soluzione di tampone al fosfato

0,15 molare per 24 ore per preparare il campione

di prova.

(ii) Determinazione

A ciascuno dei campioni di prova ottenuti in

(i) di cui sopra viene aggiunto un ugual volume di soluzione di tampone al fosfato a 0,15 molare contenen te disciolti in essa 0,8 ?g/ml di lectina di arachi di,(un prodotto di E.Y. LABORATORIES INC.) ed il mi scuglio viene fatto eagire con agitamento a 20 fi no a 57?C per 50 minuti. Il miscuglio di reazione vie ne diluito con soluzione di tamp?ne al fosfato 0.15 mo lare per ottenere una serie di doppia diluizione eie. scuna delle quali viene posta su ima piastra a forma di V in una quantit? di 50 ?l e mescolate con 50 ?l di eritrociti di coniglio (1 x 10 fino a 2 x 10 cellule/ml) agitando. Dopo aver lasciato la diluizio ne a 37?C per 1 ora si osserva il verificarsi di agglutinamento di eritrociti in ciascuna dilu?zio ne. Il valore massimo di diluizione al quale l?agglutiramento ai verifica ancora viene definito come valore di agglutinamento e la definizione viene effettuata impiegando questo valore. I risultati ottenuti sono mostrati nella tabella appresso.

(iii) Osservazione

Come sar? chiaro dai risultati riportati ne_l la tabella di cui sopra, tutte le persone sane mo strano un valore di agglutinamento di 128 o pi? mentre pazienti malati di cancro mostrano un vaio re di agglutinamento molto pi? basso che le persone sane* Sei dei 7 pazienti con cancro dello stomaco mostrano un valore di agglutinamento di 8 o meno ed il resto mostra il valore di 52. Tutti e quattro pazienti con cancro del polmone mostrano un valore di agglutinamento fli 1. Per quanto riguarda gli al tri tipi di cancro, quasi tutti i pazienti hanno valori di agglutinamento di 8 o meno le eccezioni essendo un valore di agglutinamento di 32 osserva., to per un paziente con cancro dell'utero e per un a.1 tro avente un sarcoma primario gastrico.

Come detto sopra, il valore di agglutinamento osservato in pazienti con tumori maligni o cancri ? sempre 32 o meno , mentre quello delle persone sane ? 128 o pi?.

Pertanto, questo metodo fornisce una maniera efficace di determinare il livello di TAG in un cam pione di fluido corporeo fuori dal corpo e pu? esse re utile nella diagnosi di vari tumori maligni o cancri

Determinazione impiegando lectina etichettata con enzima

Stadio di riferimento:

(1) Attivazione di perossidasi

Ad 1 mA di soluzione acquosa 0,3 molare di idrogeno carbonato di sodio contenente disciolti in casa 5 mg di perossidasi derivata da rapa grande viano aggiunto 0,1 ini di soluzione etanolica 0,1 mo lare di .fiucrodiaitro-bensolo ed il miseviglio vi? ne agitato blandamente per 1 ora a temperatura a? biente. Poi al miscuglio viene aggiunto 1 al di soluzione acquosa 0,06 molare di KaIO4 ed il miscu glio viene agitato blandamente a temperatura ambien te per 30 minuti. Il miscuglio risultante viene me, scolato ancora con 1 mi di soluzione acquosa 0,1 mo lare di etilenglicole ed agitato blandamente a tem peratura ambiente per 1 ora con successiva dialisi del miscuglio di reazione con soluzione tampone 0,01 molare di acido carbonico-idrogeno carbonato di sodio (pH 9,5) a 4-?C per 1 giorno per ottenere la preparazione di perossidasi attivata.

(li) Btichettamento di lectina con perossidasi

5 mg di lectina (lectina di arachide) vengono sciolti in 3 mi del preparato di perossidasi otte. nuto in (i) di cui sopra ed il miscuglio viene agi tato blandamente a temperatura ambiente per 2 fino a 3 ore per la reazione? Dopo l'aggiunta di 5 mg di NaBH4, il miscuglio di reazione viene lasciato ripo sare a 4?C per 3 ore e la soluzione risultante vie ne dializzata con soluzione di tampone 0,1 molare tris-HCl (pH 7,4) per 1 giorno seguito dal sottopor re a filtrazione di gel impiegando cromatografia in colonna di gel Sephadex G 150 (eluente: soluzione di tampone 0,1 molare tris-HCl, pH 7,4)? Vengono misurate le densit? ottiche (OD280 ed OD403) di Cia scuna frazione ottenuta e vengono raccolte le fra zioni i cui picchi di OD 280 ed OD403 si Sovrappongo no .

(iii) Preparazione di gel di agarose

Agarose (un prodotto di Iwa? Kagaku Co Ltd? )iene sospeso in soluzione di tampone tris-HCl, 0,01 molare (pH 7,5) in una quantit? di 1% in peso e la sospensione viene riscaldata a 70 fino ad 80?C per discioglierla? A questa soluzione vie ne aggiunto 0,01% in volume/voluo? di thimerosal e la soluzione risultante viene versata in prove;t te in una quantit? di 1 ml/provetta lasciando successivamente in riposo a temperatura ambiente per preparare gel di agsrose ad 1% peso/peso.

'Esempio 2-1 metodo al polietilenglicole

(i) Preparazione di campione di prova

5 mi di sangue vengono presi da ciascuno di 25 pazienti con cancro, 2 pazienti con malattie di verse .da cancro e 25 persone sane impiegando una siringa trattata con eparina (500 unit?)e centrifugan d? a 2G0G giri per minuto per 10 minuti? Il surna tante risultante (plasma) viene usato come campii) ne d? prova?

(ii) Determinazione

Il campione d? prova preparato in (i) viene posto in due provette in una quantit? di 200 ?l/pro vetta ai quali vengono aggiunti 50 ?? ciascuna del preparato di Isctina etichettata con perossidasi contenente 5,5 ?g/ml di lectina in soluzione di tam pone tris-HCI (pH : circa 7,5) preparato nello sta dio di riferimento deli'esempio 2 Dopo aver agita to ?eggerin?iite, il miscuglio viene lasciato riposai re a 20 fino a 30?C per 1 ora a scopo di reazione. Poi vengono aggiunti ad una delle provette 250 ?l di una soluzione di polietilenglicole ad8% peso/ volume. (peso molecolare : 6000) in soluzione di tam pone tris-HCI 0,1 molare ed il miscuglio viene agi tato blandamente per formare il campione A e ad un'altra provetta vengono aggiunti 250 ?litri di so lozione di tampone tris-HCl,0,1 molare ed il miscu glia viene agitato blandamente per formare il campio ne B* Entrambi i campioni A e B vengono centrifuga ti per 40 fino a 60 minuti impiegando un rotore del tipo oscillante a 1000 giri dopo aver lasciato ri posare campioni a 20 fino a 30?C per 30 fino a 60 mi nuti per la reazione* 50 ul del surnatante risultan te vengono raccolti ed aggiunti a 2 tal di soluzione di sale fisiologica preparata in precedenza* Dopo aver agitato sufficientemente, il miscuglio viene mescolato con 500 ?l di una soluzione di sostrato consistente in soluzione di tampone al citrato

0,1 molare, ortofenilen-diammina (concentrazione fi naie 6% in peso) e 0,1 % in peso di acqua ossigena ta e aver fatto reagire a 20 fino a 30?C per 30 mi nuti al buio La soluzione di sostrato viene pre parata in precedenza ed immagazzinata a 4?C, che ? la temperatura preferita- Poi, al miscuglio di reazione viene aggiunto 1 mi di acido cloridrico 2 normale per interrompere la reazione ed il colo, re del campione viene misurato spettrofot?metri cernente in termini di densit? ottica a 492 nm. La quantit? di complesso TAG-lectina che viene defin?, ta come differenza (e) ottenuta sottraendo la den sita ottica (a) del campione A dalla densit? otti.

ca (a) del campione A dalla densit? ottica (b) dei campione B viene riportata nella figura 1, in cui il simbolo 0 rappresenta persone in buona: salute ed i numeri (l)fino e (27 indicano i seguenti pazien ti: (1) e (18) cancro dello stomaco; (2), (6), (9), (16) e (17) cancro del polmone; (3), (5), (7), (8) e (13) cancro dello stomaco (primo stadio); (4) e (14) cancro dello stomaco progressivo; (10) cedi mento del cuore; (11) linfadenite; (12) cancro del colon con metastasi nel fegato; (15) cancro uteri, no con metastasi nel polmone; (19) mola da Idatide (20) cancro dei colon; (21) cancro dell?utero; (22), e (26) cancro delle ovaia; (23) cancro del retto; (24) cancro della prostata; (25) cancro dell'uretra; e (26) epatoma.

Dal risultati mostrati nella figura 1 si pu? vedere che campioni mostranti valori di (c) pi? elevati di quelli osservati nei campioni ottenuti da pers?ne sane contengono l'AG in quantit? pi? elevate che i campioni ottenuti da persone sane.

Da ci? viene fortemente suggerito che persone con un valore elevato di (c) hanno cellule di tornare o cancro.

Esempio 2-2 Metodo di filtrazione di gel (1) sangue viene raccolto da 14 pazienti ma.

lati di cancro ed 8 persone sane e campioni di pr? va vengono preparati da esso nella medesima manie ra che nell'esempio 2?

(ii) Determinazione

50 ?l di diluzione del campione in prova che ? stato preparato in (i) di cui sopra e diluito 10 volte con soluzione H che consiste in acqua distillata contenente disciolti in essa 8% di ci? ruro di sodio, 0,4 % di cloruro di potassio, 0,05% di idrogeno fosfato di sodio, 0,06% di diidrogeno fosfato di potassio, 0,05% di solfato di magnesio, 0,05% di cloruro di magnesio, 0,01% di cloruro di calcio ed 1% di glucosio vengono mescolati con 50 ?? del preparato di lectina etichettata con perossji desi che ? stato ottenuto secondo lo stadio di ri ferimento dell'esempio 2, diluiti di 100 volte con soluzione di tamp?ne al fosfato 0,1 molare (pH 7,4) ed incubati per 15 minuti in un bagnomaria a 23?C.

11 misucuglio risultante viene incubato per 15 mi nuti in un bagnomaria a 25?C e poi posto blandamen te.sulla superficie di gel agarose preparato me diante il metodo dello 3tadio di riferimento dello esempio 2. Dopo aver incubato la provetta contenen te il gel in un bagnomaria a 25?C per 1 ora al gel agarose che poi agitato , vengono aggiunti 2 mi di soluzione di tampone al fosfato 0,1 solare (pH cir ca 7,4) Il surnatante viene trasferito immediatamen te in una provetta pulita alla quale vengono poi ag

giunti 400 ml della soluzione di eostrato per perossi das? preparata nello stadio di riferimento de'il'esem pio 2. dopo aver agitato sufficientemente, il miscu glio viene lasciato riposare a temperatura ambiente per 15 minuti per la reazione. La reazione enzimati. ca viene interrotta con 1 mi di acido cloridrico 1 uor male; il miscuglio di reazione viene agitato saffi cienceaente impiegando un termomescolatore o dispo. sit ivo simile. La densit? ottica del miscuglio cos? trattato viene misurata impiegando uno Spettrofotometro a 492 nm. Un miscuglio di 400 mi della soluzio ne di sostrato ed 1 mi di acido cloridrico 1 normale viene usato c?me campione in bianco. I valori della densit? ottica ottenuti vengono trattati nella mede sima mani?ra che nell'esempio 2-1 e la quantit? di TAG-lectina calcolata viene riportata nella figura 2 in cui li simbolo 0 rappresenta persone sane ed i numeri (1) fino a (10) indicano i seguenti pazienti: (1) cancro dello stomaco; (2)mola da Idatide;

(3) cancro del colon; (4) cancro dell'utero, (3) can cro delle ovaia ; (6) cancro del retto; (7) cancro della prestata, (8) cancro dell?uretra} (9) epatoma

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Procedimento per determinare il livello di sostanza contenente glicolegame (TAG) associata a tumori in un campione di fluido corporeo comprenden te le operazioni di fare reagire il TAG in un campio ne del fluido corporeo con una lectina per formare un complesso TAG-lectina e misurare la quantit? del complesso di TAG-lectina oppure di lectina che non ha reagito.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, coniprendente inoltre le operazioni di -separare TAG dal campione di fluido corporeo e fare reagire la TAG se arata con detta lectina.

3 Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui viene usata una lectina etichettata.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui la lectina etichettata ? una lectina etiche_t tata con un enzima, una sostanza fluorescente od una sostanza radioattiva.

5. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui al detto fluido corporeo viene aggiunta una pro teina protettiva.

6. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il fluido corporeo ? sangue, fluido d? tessu ti, linfa, idrotorace, ascite, fluido amniotico, succo gastrico, urina, succo pancreatico, fluido cerebrospinale o saliva.

7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui il fluido corporeo ? siero di sangue o plasma , di sangue.

8. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui la reazione viene effettuata a o meno per almeno 30 minuti.

9. proced?mento secondo la rivendicazione 8, in cui la reazione viene effettuata a 4-fino a 40?C.

10= Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui la reazione viene effettuata a 20 fino a 40?C?

11. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui la reazione viene effettuata per 60 fino a

90 minutia

12 . Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la lectina ? ima lectina che si lega specifi cernente con legame di galattosio-(B1? 3 oppure B1? >-4)-N-acetilglucosammira e, oppure -N-acetilgalattosammina.

15 Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui la lectina ? lectina di arachide o lectina di ricino?

14. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui la quantit? di lectina che non ha reagito

? determinata mediante agglutinamento di lectina

che non ha reagito?

15 Procedimento secondo la rivendicazione 14 in cui la lectina che non ha reagito viene aggluti nata con un terminale di galattosio (B1- 3 oppure ?- 4)?N-acetilglticosammina e, oppure -N-acetilgalat tosammina contenente glicoproteina o sephat?ex o per le di vetro ricoperte con essa?

16. Procedimento .secondo la rivendicazione 15, in cui la glicoproteina ? er?trocito di coniglio oppure eritrocito ovino trattato con neursmminidasi 17? Procedimento secondo le rivendicazione 4, in cui l'enzima ? glucoamilasi, glucosossid?si, perossidasi, fosfatasi alcalina od emeoctapeptide od un frammento attivo di essi?

18. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui la sostanza fluorescente ? fluoresceina,idro geno tioc?anato di fluoresceina oppure dansllcloruro.

19 Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui la sostanza radioattiva ? iodio o tritio radioattivo .

20 Procedimento secondo la rivendicazione 17, in cui 1 ?enzima ? perossidasi?

21?;Procedimento per la diagnosi di cancro comprendente le operazioni di determinare il livello di TAG in un campione di fluido corporeo secondo il procedimento della rivendicazione 1 e confrontare il livello di TAG ottenuto con quello osservato in per sone sane.

22. Corredo per determinare il livello di TAG in un fluido corporeo comprendente Pectina come agente agglutinante specifico pey TAG.

2J. Corredo secondo la rivendicazione 22, in cuila lectina ? stata liofilizzata ed il corre do contiene addizionalmente un reagente di ricosti tuzione contenente un solvente a base acquosa oppure miscibile con sequa .

24. Corredo secondo la rivendicazione 22, in cui la lectina ? lectina di arachide.

25- Procedimento secondo la rivendicazione 1, comprendente le Operazioni di separare una frazio ne di TAG dal fluido corporeo, fare reagire il flui do con lectina etichettata o non etichettata, sep? rare la lectina che non ha reagito dal miscuglio di reazione e misurare la quantit? di lectina che non ha reagito oppure di lectina che ha reagito con TAG*

26. Procedimento secondo la rivendicazione 1, comprendente l'operazione di fare reagire un fluido corporeo con lectina etichettata o non etichettata, separare la lectina che ha reagito dalla lectina che non ha reagito su un gel ? misurare la quantit? di lectina che ha reagito o non ha reagito,

10. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui la reazione viene effettuata a 20 fino a 40?C?

90 minuti.

12. Frocedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la lectina ? una lectine che si lega specificernente con legame di galattosio-(Bl ? P3 oppure (B1?>4)-N-acetilglucosammina.

15. Frocedimento secondo la rivendicazione 12 in cui la lectina ? lectina di arachide

di ricino.

? determinata mediante agglutinamento di lectina

che non ha reagito.

15 Procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui la Pectina che non ha reagito viene aggluti nata con un terminale di galattosio?(B1>3 oppure

B1? > 4)-N-acetilglucosammina ,contenente glicopro teina o sephadex o perle d? vetro ricoperta

essa ,

16. Procedimento secondo la rivendicazione 15, in cui la glicoproteina ? eritrocito di coniglio oppure eritrocito ovino trattato con neuramminid?si.