SE461616B - Foerfarande och testsats vid diagnos av iga nefropati med bestaemning av fibronektin-iga-komplex - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 461 616 IgA-nefropati och Renoch-Schönleins purpura (10).

Föreliggande uppfinning baserar sig pa den överraskande upp- täckten, att IgA-antikropparna är närvarande i cirkulerande immun- komplex i patienter med primär IgA-nefropati tillsamman: med fib- ronektin, och detta oväntade rön förklarar naturligtvis det fakt- um, att de IgA-haltiga komplexen har förmaga att binda till kolla- gen. Detta nya rön att det cirkulerande immunkomplexet förutom IgA innehåller även fibronektin möjliggör aetadkommandet av bade ett förfarande för diagnos av lgh-nefropati och är en diagnostisk kit för användning i eadan diagnos. ' 7 Ett ändamål med föreliggande uppfinning är följakt1igen_att åstadkomma ett förfarande för diagnos av Igà-nefropati under an- vändning av antigen-antikroppsinteraktion, och ett annat ändamål med uppfinningen är aatadkommande av en diagnostisk kit för an- vändning i sädan diagnos av IgA-nefropati.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning karakteriseras av följande steg: a) framställning av ett substrat med förmåga att binda fibro- nektin eller IgA, b) med ett prov av kroppsfluidum uttaget fran en patient föremal för bringande av eubetratet härrörande från steg a) i kontakt diagnos för bindning av eventuellt fibronektin-IgA-komplex som är närvarande i nämnda prov till substratet, och c) bestämning av närvaron av komplex bundet till eubstratet under användning av reaktionen mellan den exponerade delen av sa- dant bundet komplex och en motsvarande antikropp till detta.

Vid framställning av ett sådant eubetrat med förmåga att binda fibronektin är föredragna bindemedel kollagen, heparin, fib- rin eller anti-fibronektin. Enligt denna sida av uppfinningen framställes subetratet pa ett eadant sätt att fibronektin-IgA-kom- plexet bindes via dess fibronektinkomponent. Detta betyder i sin tur, att IgA-komponenten i komplexet är tillgänglig för bestämning av närvaron av komplex bundet till substratet.

A andra sidan kan bindningen av fibronektin-IgA-komplexet till subetratet riktas mot komplexets lgh-del. I ett sadant fall kan som bindemedel endera användas anti-IgA eller ett lektin, vil- ka bada kan binda lgh. I detta fall är komplexets fibronektindel 10 15 20 25 30 35 3 461 616 tillgänglig för bestämning av närvaron av komplex bundet till sub- stratet.

Bestämningen under steg c) enligt förfarandet enligt uppfin- ningen kan vara av kvantitativ karaktär och kan baseras pa ett konventionellt detekteringssystem. Bland sadana detekteringssystem kan nämnas sadana baserade pà enzymatisk aktivitet eller system baserade på strålning utsänd av en radioaktiv isotop eller baserat pa fluorescens.

Det substrat som användes vid bindning av fibronektin-IgA- komplexet närvarande i ett prov föremal för diagnos kan utgöras av olika föremal, såsom mikrotiterplattor, laboratorieteströr, nitro- cellulosapapper, plastsfärer eller nagot annat föremal lämpligt för ändamålet.

Prover av kroppsfluidum uttagna fran en patient föremål för det diagnostiska förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan utgöras av exempelvis humanblod, serum, plasma eller saliv.

Genom uppfinningen åstadkommas även ett diagnostiskt kit för användning vid diagnos av IgA-nefropati, och ett sådant kit inne- fattar: a) en bärare med förmåga att binda IgA, vilken pá sin yta uppbär anti-IgA eller IgA-bindande lektin; samt b) reagens innefattande heparin, kollagen, fibrin eller anti- fíbronektin med förmåga att binda fibronektin och en detekteringskomponent som möjliggör bestämning av fibronektin- -IgA-komplexet som är bundet till nämnda bärare. _ E I denna kit, vari IgA-delen sålunda utgör exponerad del av komplexet uppbär föremalet heparin, kollagen, fibrin eller anti- -fibronektin bundet till dess yta. I detta fall innefattar rea- genset företrädesvis lektin eller antikropp riktad mot Igà.

I en diagnostisk kit enligt uppfinningen kan detekter- ingskomponentens funktion vara baserad pa enzymatisk aktivitet, stralning utsänd av en radioaktiv isotop eller fluorescens.

Uppfinningen kommer i det följande att ytterligare illust- reras genom icke inskränkande konkreta exempel. Denna illustration är förenad med hänvisning till bilagda ritning, vari: fibronektin (FN) och ett fig. 1 visar bindningen av IgA, komplex till en heparin-Sepharoskolonn; 10 15 20 25 30 35 461 616 fig. 2 visar ett diagram över elueringen av proteiner fran en ordinär jonbytare under användning av en ealtgradient; fig. 3 visar bindningen av IgA, fibronektin och ett komplex till en jacalin-Sepharoskolonn; och fig. 4 visar separationen av proteiner under användning av SDS-PAGE och immunoblotting. figiigggå, Patientsera härrörde fran patienter med primär IgA-nef- ropati (glomerulonefrit och dominerande meeangiala IgA-avsätt- ningar detekterade med immunofluorescensmikroekopi av renala_biop- siprover). tematoeus (SLE), Ingen av patienterna hade tecken pa systemisk lupusery- Henoch-Schönleine purpura eller cirrotiek lever- sjukdom. Sera fran friska bloddonatorer användes eom kontroller. 1gg1g;igg_a1_immgnLgmp1g3, Antieera (1 ml) dialyeeradee mot 0,05 M Tris, 0,05% natriumazid pH 7,4 före applikation på en 10 ml Hepa- rin-Sepharos-CL-SB-kolonn (Pharmacia, Uppsala, Sverige). Material eluerat fran kolonnen med 0,5 M NaCl i samma buffert dialyeeradee mot 0,1 M natriumfosfat, 0,05% natriumazid pH 7,5 före kromatogra- fering pa en 1 ml Mono Q-kolonn (Pharmacia). Kromatografi utfördes under användning av ett LKB (Bromma, Sverige) HPLC-system med lag- trycksblandning. Absorbans uppmättee vid 280 nm med en LKB_2l§l detektor med variabel våglängd. Fraktioner bindande till kollagen I och reagerande med anti-human-IgA (Dakopatts, Hägersten, Sveri- ge) pooladee och applicerades pá en jacalinagaroe (Pierce Chemi- cals, Rockford, melibios i buffert innehållande 0,05 M Tris, 0,15 H NaCl, Illinois). IgA-haltiga komplex eluerades med 0,2 M 0,05% natriumazid pH 7,5.

' Kellleen I frflflfiilldfls Genom Pentiu- extraktion fran bovint flexortendon sasom beskriven av Vogel et al (12). 510 15 20 25 'so 35 461 616 mmm Elektrofores, SDS-PAGE utfördes såsom beskrives av Laemmli (13) under användning av 3-16% lineära gradienta geler. Geler behandla~ des med silver enligt den metod som beskrivas av Morrisey (14) under uteelutning av glutaraldehyd. Reduktion utfördes genom till- sats av 2-merkaptoetanol till 0,21 vol/vol till prover före elek~ troforee och kokning i tva minuter. ßL1§fi. Antigen utströks på mikrotiterplattor av polystyren med 96 brunnar (NUNC immunoplatta I, NUNC, Roskilde, Danmark). Fraktioner fran kolonnerna överdrogs över natten under icke denaturerande betingelser under användning av 0,05 M natriumkarbonatbuffert vid pfl 9,6 innehållande 0,05% natriumazid. Detta atföljdes av inkuba- tion i en timme med samma buffert även den innehållande 2% bovint serumalbumin (blockeringsbuffert) för att förhindra icke specifik bindning. Kollagen I utströks under denatureringsbetingelser under användning av 6 M guanidin-HCI, 0,05 M Trie-HCl pH 7,4 över nat- I detta fall erfordrades ej inkubering med blockeringsbuf- 0,15 M NaCl, 0,05% ten. fert. Sera utspâddes i 0,01 M fosfat pH 7,5, Tween 20 och 0,25 M guanidin-HCl och inkuberades i 1 timme i de överdragne mikrotiterplattorna. IgAantikroppar detekteradee genom inkubering med affinitetsrenat anti-humant lgA alkaliskt fosfatas- konjugat &Dako> i 1 timme. Fibrcnektin detekterades under'anv§nd- ning av anti-humant fibronektinantiserum fran kanin (Dako) atföljt av anti-kanin-IgA alkaliskt fosfataskonjugat (Dako). Enzymaktivi- tet bestämdes under användning av p-nitrofenylfosfat som substret.

Mikrotiterplattor sköljdee mellan varje steg med 0,15 M NaCl inne- hållande 0,05% Tween 20. Alla prover analyserades som triplikat.

Abeorbans moniterades vid 405 nm under användning av en Titertek Hultiskan fotometer.

EX§§PEL 6 lmmungglottigg, Proteiner separerades under användning av SDS-PAGE och överfördes elektroforetiskt till nitrocellulosapapper (Schlei- cher och Schüll, Daesel, Västtyskland) vid 0,5 A i 4 timmar. Icke specifik bindning förhindrades genom inkubering med blockeringa- 10 15 20 25 30 35 461 616 buffert i 1 timme. Igà-antikroppar detekteradee under användning av peroxidaskonjugerat anti-human-IgA-antiserum (Dako), och fibro- nektin detekterades under användning av kaninanti-human fibronsk- tin atföljt av peroxidaekonjugerat anti-kaninantiserum. Enzymakti~ vitet bestämdes med HZO2/diaminobenzidin (0,5 mg/ml) (Fluka) i 0,05 M natriumfosfat pH 7,5 innehållande koboltklorid och ammoni- umnickslsulfat (15).

MP 7 11gLg;¿gg_§!_§§§;;1;gggggt¿ Eftersom vi tidigare funnit, att lgA- antikroppar frän patienter med IgA-nefropati binder till kollagen I, II och IV (1) gjordes ett försök att isolera den specifika epi- topen av bovint kollagen I ansvarigt för bindningen. Peptinextra- herat kollagen I fragmentsrades genom användning av CNBr, och fragmenten separerades genom katjonbytarkronatografi pa en Mono S kolonn åtföljt av gelkromatogrefi pa en TSK G3000SWkolonn. Bind- ning av antikroppar till kollagen I kunds fullständigt inhiberes genom att fragment identifierades som CB7-fragmentet av alfa1-ked- jan och CB3,5-fragmsntet av alfaz-kedjan.

Dessa fragment är kända för att innehalla den fibronektin- bindande domänen (16). Det förefaller därför som om fibronektin är involverat i bindningen av IQA-antikroppar till kollagen. Såsom vi funnit för patient-IgA-antikroppar har i själva verket Engvall et al (8) tidigare visat, att fibronektin binder till bade kollegan I och II och att bindningen förbättras när denaturerade kollagsner användes. Som vidare stöd kunde vi visa genom ELISA, att anti-fib- ronektinantikroppar överförda pa en mikrotiterplatta medförde bindning av såväl lgh-antikroppar som fibronektin vid inkubering med serum från patienter ned primär IgA-nefropati.

Vid användning av serum fran friska bloddonatorer som kont- roll bands inga IQA-antikroppar till antifibronektin-antikropps- förläggningen. Vi bestämde därför att rena Éomplexen i princip under användning av affinitetskolonner för fibronektin resp. IQA i följd. 10 15 20 25 30 35 461 616 Heparin-Sspharos (9) användes som första steg för rening av fibronektin-lgA-komplex Såsom visats med ELISA (fig. 1) under använd- fran humant serum. ning av fraktionerna som överdrag bibehölls easom förväntat de flesta av IgA-antikropparna ej pá heparinkolonnen. Fibronektinet band till heparinkolonnen och eluerades under användning av 0,5 M NaCl (fig. 1).

Det är känt, att fibronektin binder till kollagen genom dess kollagenbindande domän belägen i den N-terminala delen av molekyl- en (7,17>. De kollagenbindande egenskaperna hos fibronektin utnyt- tjades i en ELISA för att visa närvaron av fibronektin-IgA-immun- komplex i eluat från heparinkolonnen. Denaturerat kollagen I (17) användes som överdrag. Fraktioner fran heparin-Sepharoe-kolonnen inkuberades i kollagenöverdragna mikrotiterbrunnar. Bundna IgA-an- tíkroppar detekteradee under användning av ett specifikt anti- 1). Endast den fraktion som eluerades från kroppekonjugat (fig. heparinkolonnen genom användning av NaCl innehöll antikroppareak- tivitet i analysen uppenbarligen representerande fibronektin-lgA- -immunkomplex vari lgà-antikropparna är bundna till fibronektin och fibronektin medierar bindning till kollagen genom ein kolla- genbindande domän.

Huvuddelen av IgA-antikropparna band ej till heparin-Sepha~ ros, och inga kollagenbindande IgA~antikroppar aterfanne i_denna obundna fraktion.

Kontrasterande resultat erhölls med ett eerumprov fran en frisk bloddonator. Inga immunkomplex detekterades, vare sig i fraktionen bunden till heparin-Sepharoe eller i den obundna frak- tionen (tig. 1).

Eftersom heparin binder ej endast fibronektin utan även plaemaproteiner (9) utval- des en jonbytarkolonn för nästa steg i reningeproceduren. Material eluerat fran heparinkolonnen applicerades pa en Hono Q anjonbytar- -HPLC-kolonn. Immunkomplex detekterade med ELISA med kollagen I-överdrag eluerades mellan 0,22-0,24 M NaCl (fiq. 2). 10 15 20 25 461 616 ° Närvaron av IgA-antikroppar (separerade fran immunkomplexen) visa- de att en liten andel av lgA binder till heparinkolonnen och/eller IgA friges genom dissociation av immunkomplex under reningesepro- ceduren.

EXEMPEL 10 s ti n av - nt e t'l ' ca 'n- a- gge. Fraktioner innehållande immunkomplex (fig. 2) pooladee och kromatograferades pa en jacalin-Sepharoskolonn. Jacalin är ett lektin som kan användas för bindning av Igàrantikroppar (18). Det- ta ger en möjlighet att separera komplexen från fibronektinet, eftersom denna struktur ej är närvarande pa fibronektinmolekylsn.

Ett förväntat fibronektin aterfinnes bade i det material som ej bundits till jacalinkolonnen och i den bundna fraktion som eluera- des med melibios, under det att IQA-antikroppar är närvarande en- dast i det bundna materialet (fig. 3). Fibronektínkomponenten av immunkomplexen var bunden till kollagen I i en ELISA och fibronek- tin och IgA-antikroppar identifieradee (fig. 3). Närvaron av kom- ponenter med mobiliteter motsvarande fibronektin och IgA i mate- rialet bundet till jacalinkolonnen visades ytterligare med SDS- -PAGE bade med och utan reduktion (fig. 4). Ytterligare bevis pa identiteten av komponenterna erhölls genom immunoblotting under användning av anti-IgA resp. anti-fibronektin (fig. 4). Huvudkom- ponenterna som visualiserats med SDS-PAGE visade sig sålunda re- presentera IgA resp. fibronektin.

Ovanstaende exempel viser, att patienter med IgA-nefropati har cirkulerande immunkomplex innehallande fibronektin och IgA-an- tikroppar. Detta star i överensstämmelse med en föreslagen immun- komplexmedierad karaktär av primär IgA-nefropati (11). (w

Claims (2)

1. 0 15 20 25 30 35 461 616 namram 1. Förfarande för diagnos av lgA-nefropati under användning av en antigen-antikroppsinteraktion, linnetecknat av stegen: a) framställning av en bärare med förmåga att binda fibronektin eller IgA, _ b) bringande av bäraren härrörande fran steg a) i kontakt med ett prov av kroppsfluidum uttaget från en patient föremal för diagnos för bindning av eventuellt fibronektin-IgA-komplex som är närvarande i nämnda prov till bäraren, och c) bestämning av närvaron av komplex bundet till bäraren under användning av reaktionen mellan den exponerade delen av sadant bundet komplex och en motsvarande antikropp till detta. att 2. Förfarande enligt patentkravet 1, linnetecknat därav, man framställer en bärare med förmåga att binda via kollagen, fibrin eller heparin till fibronektindelen av komplexet. 3. Förfarande enligt patentkravet 1, kínnetecknat därav, att man framställer en bärare med förmaga att binda via anti-fibro- nektin till fibronektindelen av komplexet. att 4. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknar därav, man framställer en bärare med förmåga att binda via anti-IgA eller IgA-bindande lektin till IgA-delen av komplexet. 5. Förfarande enligt nagot av de föregående patentkraven, vari kroppsfluidet utgöres av humanblod, serum, plasma eller saliv. 6. Förfarande enligt nagot av de föregaende patentkraven, kännetecknat därav, att i steg c) närvaron av bundet komplex upp- mätas kvantitativt under användning av ett detekteringssystem ba- serat pà enzymatisk aktivitet, strålning utsänd av en radioaktiv isotop eller fluorescens. 7. Förfarande enligt patentkravet 2 eller 3, kännotecknat därav, att man under steg c) använder reaktionen mellan IgA-delen av komplexet och ett anti-lgA- eller lektin-onzymkomplex. 8. Förfarande enligt patentkravet 4, linnetecknat därav, att man under steg c) använder reaktionen mellan fibronektindelen av komplexet och ett anti-fibronektin-, heparin-, fibrin- eller kol- lagen-enzymkomplex. 9. Förfarande enligt nagot av de föregående patsntkraven, 10 461 616 w vari bäraren utgöres av en mikrotiterplatta. 10. Diagnoetiek kit för användning vid diagnos av IgA-nefropati innefattande a) en bärare med förmåga att binda IgA, vilken pa ein yta uppbär anti-IQA eller IgA-bindande lektin; samt b) reagens innefattande heparin, kollagen, Eibrin eller anti- fibronektin med förmåga att binda fibronektin och en detekteringekomponent eom möjliggör bestämning av fibronektin- -IgA-komplexet eom är bundet till nämnda bärare. 11. Diagnoetiek kit enligt patentkravet 10, vari funktionen hos detekteringekomponenten baserar eig på enzymatiek aktivitet, etrålning uteând av en radioaktiv ieotop eller fluoreecens. Roíornnsnr". 1.

2. JO 5. 9. 10. 11. 12. I). 1/ 461 616 Cederholm, 8., fliaeiander, J. and Meineqård, D. (1986) Proc. Matl. Acad. Soi. USA BJ, Glßl-álåå. Muatonen, J., Paatarnack, A., Helin, M. and Nikkill, M. (1905) Im. J. Nepnrui. s, 110-111. Boart De La Feiiia-Kuyper, E., Ketar, L., Kuijten, R., Kooiker, C.,' Magenaar, S., Van Der Zoonen, P. and Meaa, E. (1916) xlmy m. s, aza-azø. Nomoto, Y., Sakai, M. and Arimori, S. (1979) Am. J. Clin. Paéhol. 71, läfl-IGO. . _ ' - sam, n., 11mm, Y. .nu Arnfmi, s. (1979) cun. up. inn.- ml. Ja. 2111-2911. _ _ Sakai, H., Endoh, M. end ïomino, Y. (1982) Clin. Exp. lmmunoi. so, 71-112. _ ' naumri, s., round., M., smgušru. K. .nu Carter, u. (men) in: Extreceiiuiar Matrix Biüocemietry. Elsevier Science Publis- hing Co, New York, USA, 229475. Engvall, E., Rouaiahti, E. and Miller, E. (1978) J. Exp. Med. lä7:2, 1586-1595. _ Yamada, K (1982) lmnmochemietry of' tne Extracellular Matrix 1, 111-121. ' Pettersson, E. and Colvin, R. (1978) Clin. lmnunoi. imunopot- hol. ll, 4125-436. ' Cnppo, R., Baaolo, B., Piccoii, G., Mezzucco, G., Bulzomi, M., Roceatelio, O., De Marchl, M., Carbonara, A. and Di Belgiojoeo, e. (19:11) C11... cup. 1mm1. 57, 591-590. _' Vogel, K., owman, n. .nu nunegard, n. (19:11) .amnm J. 223, 507-597. Laemmli, U. (1970) Natura (London) 227, 680-685. 461 616 /2 lb: Horriaey, ,1. (_1981) Anal. Bióctæmflfl. 307-310. 15. nanm, A. .nu cmmmu, u. (m1) Anu. 91mm. w, 210-219. 16. fly..ada,'ka,',. (nas) Am. nu. agøcm. sz, 761-799. 17. Engvall, E. and Rouchhti, E. (_1977) Int. J. Cancer 20, 1-5. 18. Roqzxe-Benrein, H. and Campus-Nato, A. (1985) J. Innunol. Uh, 1740-1763 .' I!