JPH06501924A

JPH06501924A - シトケラチン２０又はシトケラチン２０の蛋白質分解による切断によりえられたそのα―ラセン状中央部片の免疫学的同定法

Info

Publication number: JPH06501924A
Application number: JP3512750A
Authority: JP
Inventors: モル，ローラント; フランケ，ヴェルナー　ヴィルヘルム
Original assignee: プローゲン　ビオテヒニク　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング
Priority date: 1990-07-27
Filing date: 1991-07-26
Publication date: 1994-03-03
Anticipated expiration: 2011-12-11
Also published as: EP0541645A1; WO1992002558A1; DE4023945A1; US5500347A; EP0541645B1; DE59108892D1; JP2562539B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】明　細　書シトケラチン２０の精製法及び抗体形成のためのその使用本発明はシトケラチン２ｏの精製法、標準蛋白質材料並びにその製法、並びにシトケラチン２ｏに対する抗体の製法及び組織切片上の、組織均質物及び抗体中のシトケラチン２０を検出するためのこの蛋白質に特異的である抗体の使用、並びに血液又は血清中のＣＫ２Ｏに対する自家抗体の検出用標準蛋白質材料の使用に関する。

シトケラチン類の中間フィラメント（ＩＦ）蛋白質が上皮細胞の種類及び分化の状態の分析に関して有効なマーカであることが確認された。少なくとも１９の異なるポリペプチドの類を包含する上皮シトケラチンは細胞分化の経過に依存して種々の異なる組合わせで発現される。シトケラチンの合成は悪性形質転換の間一般に保持され、かっこの事実は膀胱管の腫瘍も含む上皮細胞派生腫瘍の検出基準の１つとして使用することを可能にするであろう。特に、原発腫瘍に効果的に処置することができるように、転移組織の原発腫瘍の位置を確認するための容易に実施可能で、かつ確実な検出法に対する要求がある。従って、本願発明の課題は種々異なる腫瘍の種類を区別し、同様に種々異なる転移組織に関する由来の場所の検出を容易にかつできるだけ正確に行なうことへの可能性を提供することである。

一定の細胞中にのみ存在し、従って一定の細胞及び組織の識別のためのマーカーとして使用することのできる新規シトケラチンを確認した。これをシトケラチン２０と名付けた。

従って、本発明の課題は／トケラチン（ＣＫ）２０の精製法であり、この精製法において細胞骨格（Ｃｙｔ。

５ｋｅｌｅｔｔ）フラクションをＣＫ２Ｏを含有する組織又は細胞から製造し、この中に含有される蛋白質をゲル電気泳動法及び／又はクロマトグラフィーにより分離し、ゲル又はＣＫ２Ｏ含有クロマトグラフィーフラクションからＣＫ２Ｏを獲得する。

蛋白質ＣＫ２０は分子量約・４６．０００．９４５田０１尿素中の等電点〜６１を有し、かつこれはＣＫ８の非ホスホリル化変種としてわずかに酸性である。第１図はＣＫ２Ｏの部分アミノ酸配列を示す（図においてＩＴで示す　Ａ−ＤはＣＫ２ＯのフラグメントをスタフィロコッカスＶ８プロテアーゼで消化することにより得られた）。

本発明により、シトケラチン２０は例えば特異的抗体を製造することが可能であるように純粋な形で得ることが可能である。本発明の実施形の１つにおいては細胞骨格フラクションを特に人の組織の、十二指腸粘膜絨毛から製造する。本発明の他の実施例においては培養細胞から細胞骨格フラクションが得られ、この際大腸癌、膀胱癌又は胃癌から誘導された培養細胞が有利である。ゲル電気泳動の実施の際に、本発明の有利な実施形においては第１の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を高めた塩濃度を有する緩衝液系中で実施し、その後ＣＫ２Ｏを含有する帯域を切断し、そこから蛋白質を溶離し、第２のポリアクリルアミドゲル電気泳動を低い塩濃度の緩衝液系中で実施し、かつゲル中の相応する帯域から今や精製したＣＫ２Ｏを単離する。

本発明の更なる実施形において、すなわちクロマトグラフィー法での分離はまずアニオン変換クロマトグラフィー、次いで転相ＨＰＬＣ−クロマトグラフィーで実施する。このＤＥＡＥ−セルロース上のアニオン変換クロマトグラフィーを尿素の存在下に、かつ塩酸グアニジン０〜１００　ｍ＋ｓｏｌ／　ｌの線状傾斜溶液での溶離の使用下に実施すること、そして次でＣＫ２Ｏを含有するフラクションをＨＰＬＣにかけることが、ここでも有利である。この際、塩酸グアニジン３８〜５０＊ｍｏＬ／ｌを含有するフラクションをＨＰＬＣにかけるのが有利である。

本発明の更なる課題は標準蛋白質材料であり、この標準蛋白質材料はＣＫ２Ｏ及びシトケラチン１〜８の群から選択された塩基性シトケラチンを含有する再構成ノドケラチン複合体から、もしくは蛋白質加水分解により製造された相応する該蛋白質のα−ラセン状中央部片からなる。この際標準蛋白質材料がＣＫ２Ｏ及びＣＫ８を含有する複合体もしくはそのα−ラセン状中央部片からなるのが有利である。

この種の標準蛋白質材料は、例えば追い出し原理又はその他の競合免疫アッセイの適用下に実施すべき免疫テストに使用するために好適な材料である。

本発明の更なる課題はＣＫ　２．０及び塩基性シトケラチンを含有する標準蛋白質材料の製法でもあり、この方法においては精製したＣＫ２Ｏ及びシトケラチン１〜８の群からの精製した塩基性シトケラチンを等量比で一緒に尿素含有緩衝液に溶かし、かつこの混合物をはじめに尿素及びＤＤＴを含有する緩衝液に対して、次いで尿素を含有しない緩衝液に対して透析する。この方法により再構成フィラメント材料が得られ、これは尿素の除去の際に緩衝液から形成される。本発明の有利な実施形においては標準蛋白質材料の製造に続いて生じたシトケラチン複合体を蛋白質分解する。これにより再構成標準蛋白質材料のα−ラセン状中央部片が得られる。この蛋白質分解は有利にキモトリプシンを用いて、かつ酵素対基質比６　：　１０００〜１０．１０００及び消化時間３０〜６０分間で実施する。

本発明により、標準蛋白質材料の製造の際に塩基性シトケラチンとしてＣＫ８を使用することは特に有利である。本発明方法により精製した精製ＣＫ２Ｏを使用することは特に有利である。本発明の有利な実施形においては標準蛋白質材料の製造のために、蛋白質を８．５−１０ｍｏｌ／　ｌ　尿素及び１．５−３ｍ１＊ｏｌ／ｊ’　ＰＴＴを含有する緩衝液中に溶かし、第１の透析を３゜５〜４．５ｍｏ１／ｌ尿素及び１．５−３ｍ１ｏｌ／ｌ　ＤＴＴを含有する緩衝液に対して実施する。

本発明の更なる課題はＣＫ２Ｏに特異的な抗体の製法であり、この方法においては好適な動物の免疫のために精製したＣＫ２０を使用し、次いで、自体公知法によりポリクロナール又はモノクロナール抗体を形成する。ポリクロナール抗体の原則的な形成はモノクロナール抗体と同様専門家には公知であり、モノクロナール抗体の製造は例えば文献に記載されている（　Ｋｏｅｈｌｅｒ及び菖１１ｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ２５６　（１９７５）　４９５〜４９７）。ポリクロナール抗体を獲得するためには精製ＣＫでモルモットを免疫にするのが有利である。

本発明の有利な実施形においては本発明により精製したＣＫ２Ｏを使用する。

ポリクロナール抗体の製造の際にＣＫ２Ｏに対するモノ特異的抗体を得るために、この特異的抗体の単離のために免疫グロブリンフラクションに他のシトケラチンに対する抗体の免疫沈降及び分離及び／又はＣＫ２Ｏに特異的な抗体の免疫沈降及び分離を行なうことが本発明により有利である。この際、専門家に公知のすべての免疫沈降法が好適であり、かつ最終的にはＣＫ２Ｏとだけ免疫学的に反応する抗体が得られるっ本発明の有利な実施形においては、ＣＫ２Ｏに特異的な抗体の免疫沈降及び分離を実験動物から得られた免疫グロブリンフラクションとＣＫ２Ｏが結合した固相とを恒温保持することにより実施する。他のシトケラチンに対する抗体の免疫沈降及び分離の際には、有利に得られた免疫グロブリンフラクションと電気泳動で精製したシトケラチン８．１８及び１９又はこれらを含有する細胞からの全蛋白質が結合した固相との恒温保持を実施する。本発明により、免疫沈降工程を有利に複数回実施し、こうしてＣＫ２Ｏに反応しないすべての抗体を完全にモノ特異的抗体から分離する。本発明において、固相としてニトロセルローステープを使用するのが有利である。

本発明の更なる課題は組織切片上、組織均質物及び抗体中のＣＫ２Ｏ又は蛋白質分解により得られたα−ラセン状中央部片の免疫学的同定のための、ＣＫ２Ｏに対して反応する抗体の使用である。この際、組織試料から均質物を形成し、均質物中に含有される中間フィラメント蛋白質を蛋白質分解し、かつこれから遊離するα−ラセン状中央部片を可溶性相中で分離し、かつ抗体を用いて同定し、かつ定量的に測定することが有利である。

更に、本発明の有利な実施形によれば、体液、例えば血液、血清及び尿中て、その中に含有される可溶性中間−フィラメント蛋白質フラグメントを抗体を用いて免疫学的に同定し、定量的に測定することが可能である。

ＣＫ２Ｏに対する抗体の本発明による使用によりこの蛋白質が組織、組織均質物又は体液中に存在するかどうか確認可能である。この蛋白質の存在は一定の組織中のＣＫ２Ｏの由来に相応する細胞もしくは組織の区別を可能にする。こうして、例えば胃腸管の腺癌、膀胱の腺癌そして皮膚のメルケル細胞の腺癌を他の腺癌から区別することを可能にし、同様に転移の細胞に関する決定の証明を可能とするが、その際多分全く身体の位置と独立して見い出される転移をＣＫ２Ｏ蛋白質の検出により前記範囲の原発腫瘍に関係づけることができる。この際、原発腫瘍の確定により、しばしば従来公知の方法により見つけだすことが著しく困難であったか又は全く見つけだすことができなかった本当の腫瘍の発生源を治療することが可能となり、このことにより患者の生存率を著しく改善することが可能となる。従って、胃腸管の腺癌、膀胱の腺癌及びメルケル細胞の腺癌を他の腺癌から区別するためのこのような方法又はＣＫ２Ｏに特異的な本発明による抗体により検査すべき組織中でのＣＫ２Ｏの存在に関する検査による転移の細胞的決定の証明も本発明の更なる課題である。

本発明の更なる課題は本発明による標準蛋白質材料を血液又は血清中のＣＫ２Ｏに対する自家抗体の検出のために使用することである。ＣＫ２Ｏに対する自家抗体は例えば腫瘍の化学療法の際に生じ、治療の経過に関する判断基準として評価される。更に、そのような自家抗体は池の笑壷の際に、例えばクローン（Ｃｒｏｈｎ）病においても生じ、これにより標準蛋白質材料を用いて疾患に関する示唆を得ること、又は誤っていることを証明することが可能である。

更に、例えばイムノアッセイを希釈原理により実施する場合、すでに前記のように標準蛋白質材料を免疫学的テストにおいて本発明により抗体の使用下にＣＫ２Ｏの検出のために使用することができる。

本発明による抗体又は標準蛋白質材料で実施可能なイムノアッセイは専門家に公知であり、ここでは更に詳説する必要はない。もちろん、この検出は、抗体又は標準蛋白質のすべての種類の標識付けにより実施され、この際すべての公知の実際のテスト法がここでは可能と思われる。

例えばヨーロッパ特許公開第００５７０４３号公報に記載されているような細胞障害の検出も本発明による抗体を用いて相応する形で実施することができる。

同様にしてヨーロッパ特許公開第００５７０７６号公報に記載されているような方法を実施するために、本発明による抗体をントケラチン２０に関すると同様にして使用することもできる。この際、本発明による抗体を明らかに免疫学的に反応する抗体として使用する次に実施例を本発明の図面と関連させて更に説明する。

ここで第１図はＣＫ２Ｏ−フラグメントの部分アミノ酸配列を示し、これはスタフィロコッカス■８プロテアーゼでの消化及び転相−ＨＰＬＣによる分離により得られた。この配列を種々の人のタイプニーシトケラチンの相応する配列と比較する。同一のアミノ酸を大字にする。点は相関性をより良く示すためになされた省略を意味する。

例　１細胞骨格調製物の製造十二指腸粘膜絨毛から細胞骨格フラクションを大規模に調製した。凍結絨毛材料を氷解し、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）−ホモジナイザー（［［ｉｎｅｍａｔｉｃａ、　Ｌｕｚｅｒｎ。

スイス）により均質化し、緩衝液Ａ　（１，５■ｏ１／ｌＫＣｌ、０．５％トライトン−Ｘ−１００，５ｇａｏｌ／　ＩＥＤＴＡ、０．４謹ｍｏｌ／ｌ　フエニルメチルスルホニル−フフ化物（ＰＭＳＦ）、１０　＋＊ｍｏｌ／　ｌ　）リス −ＨＣｌ、ｐＨ７，２）５倍容量と２０分間水中で撹拌下に抽出する。遠心分離（１３０００９，４℃で１０分間）及び緩衝液Ｂ　（５１ｏｌ／１ＥＤＴＡ、０．４＋＋ｍｏｌ／Ａ’ＰＭＳ　Ｆ、１０ｍｍｏｌ／ｊ’　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，２）中での沈殿物の２回の洗浄（Ｄｏｕｎｃｅ−ホモジナイザーによる再墾濁及びあらたな遠心分離）により細胞骨格−ペレットが得られ、これは−８０℃ で保持された。同様にして、他の組織及び腫瘍からの細胞骨格も調製された：これらの場合組織をポリトロン均質化の前にはさみまたはスカルペルで小さな切片に刻んだ。

培養細胞の細胞骨格フラクションは類似の方法で得られた。プラスチック培養瓶の床に付着して成長した細胞を培養液を注ぎ出し、かつゴムスパーチルでかき取りながら、燐酸塩緩衝塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で２回洗浄し、緩衝液Ａ中に抽出し、更に緩衝液Ｂで洗浄する（＾ｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ等著、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ＋ｎｏ１．　１３４　（１９８６）３５５〜３７１）。

培養細胞次の確立した人癌から由来する細胞培養系列を実験において使用した１　膀胱癌細胞列ＲＴ−１１２、ＲＴ−４、Ｔ−２４及びＥＪ（Ｍａｉｌ等、ＡＩｌ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、１３２　（１９８８）１２３〜１４４参照）。

２　多くの米国寄託機関（ＡＴＣＣ）に関連させ、かつ報告された培養結腸癌細胞系列：ＨＴ−２９（ＡＴＣＣＨＴＢ３８：ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣＣＣＬ２２９；５Ｗ１１１６　（ＡＴＣＣＣＣＬ２３３）；ＬＤＬ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２２１）：ＣＯＬＯ３２０ＤＭ　（ＡＴＣＣＣＣＬ２２０）。

３　人乳癌−細胞列ＭＣＦ−７の細胞をモル（Ｍａｌｌ）及び共同研究者、Ｃｅ１ｌ　３１　（１９８２０１〜２４）に記載されているように培養した。いくつかの実験において、培養細胞を１１５ｓ−メチオニンで代謝的に標識付けした（Ｆｒａｎｋｅ及び共同研究者、Ｉ！：ｎａｐｐ及びＦｒａｎｋｅ、Ｃｅ１ｌ　５９　（１９８９）　、６７〜７９　“５ｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｏｓｓｅｓ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｓｅｄＳｎｏｎ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌｓｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　１ｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ”）。

例　２純粋なＣＫ２Ｏの調製ＣＫ−２０蛋白質の獲得のためには２つの異なる蛋白質単離法が適用された。第１に分取ゲル電気泳動法を使用した（　Ａｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ及び共同研究者、１９８６、例１参照）、この際十二指腸粘膜絨毛から得られた細胞骨格蛋白質を一次元電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で分離し、かつ酢酸ナトリウム染色により可視とした。切断した帯状物からの蛋白質溶離は電気泳動によるか、または０．０５％５ＤＳ−水溶液中での微細に均質にしたゲル材料の恒温保持により行なわれた。

この溶離した蛋白質を真空透析により濃縮し、かつアセトンで沈殿させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥ−システムとしてはラエムリーシステム（Ｌａｅａｓｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、　、Ｎａｔｕｒｅ２２７　（１９７０）６８０−６８５）又は高めた塩濃度を有する緩衝液７ステム（Ａｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ及び共同研究者、１９８６　（前記））を適用し、多（の場合両方を順次適用した。

第２の方法としては同じ出発材料からＤＥＡＥ−セルロース−アニオン交換体クロマトグラフィー及び“転相”−ＨＰＬＣ−クロマトグラフィーの組合わせを使用した（　Ａｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ及び共同研究者、１９８６年前記）。蛋白質フラクションの純度は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより検査した。クロマトグラフ法は５ＤＳ−変性を回避し、従って試験管内複合体形成試験及び再構成試験に関して選ばれる方法であった。

例　３ＣＫ２０に対する特異的ポリクロナール抗体の製造分取ゲル電気泳動により精製したＣＫ２Ｏ−蛋白質はマウス及びモルモットの免疫のために使用された、この際フランテ及びその共同研究者（Ｆｒａｎｋｅ、　Ｄｅｎｋ。

Ｋａｌｔ及び３ｃ１１＠ｉｄ　（ｌ　９８１　）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｉＩｌｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　１ｉｖｅｒ−ｔｉｓｓｕｅｓ。

Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、ｌ　３１．２９９〜３１８）の免疫工程法を適用した。ＣＫ２Ｏ−蛋白質に対する抗体の高い滴定量を有し、しかしながらＣＫ１８に対する抗体も有する抗血清を単離することができた。この血清からＣＫ２Ｏ −蛋白質に対するモノ特異的抗体（ＣＫＩ８との反応性なし）を単離することができた、この際１％牛血清アルブミン及び０．１％ナトリウムアジドを有するＰＢＳ中に希釈した血清（又はそれから硫酸アンモニウム−沈殿により製造した免疫グロブリンフラクション）を複数回ニトロセルローステープに吸収した、このニトロセルローステープにはＭＣＦ−７−細胞又はＭＣＦ−７−細胞総蛋白質からの、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、かつ電子移動したシトケラチン８．１８及び１９が結合していた。この吸収はそのつど連続的に回転する袋状シート中で３０分間恒温保持することにより行なわれた。吸収工程と吸収工程との間、ニトロセルローステープをＰＢＳ中の３ｍｏｌ／１ＫＳＣＮ中で恒温保持し、かつ引き続きＰＢＳ中で洗浄することにより再生した。順次約４〜８回の吸収工程を実施した。多（の実験においてはこの逆吸収の前にニトロセルローステープへのプラスの親和性精製工程を５ＤＳ−ＰＡＧＥ−分離ＣＫ２Ｏ−蛋白質で実施した：この際このテープに結合した抗体をＰＢＳ中の３　ｍｏｌ／　ｌ　ＫＳＣＮにより溶離し、ＰＢＳに対して真空透析した（　Ｋｒｏｎｅ及び共同研究者（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、９４　（１９８２）７４９〜７５４）。精製した抗体調製品の特異性は免疫プロット分析により二次元電気泳動分離により確実なものとした。

例　４ヘテロ型シトケラチン複合体及び中間フィラメントの試験管内再構成十二指腸粘膜−絨毛の細胞骨格材料から得られた。

クロマトグラフィーにより精製した蛋白質（ＣＲ２，１８及び２０）を２．５＋＋ＩＩ＋ｏｌ／１ＤＴＴ及び９．５ｍｏｌ／ｌ尿素を含有するｌ　Ｑ　ｍｍｏｌ／　Ｉ　トリス−ＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ８，０）中に溶かし、かつ（不溶性の残分を１３０００９で遠心分離した後）単独又は一定のほぼ化学量論量の混合物（ＣＫ８＋ＣＫ１８　：ＣＫ８＋ＣＫ２０）をＤＴＴは含有するが、４１１Ｏ１／ｌ　尿素のみを含有する同じ緩衝液に対して透析した。これにより、Ｉ型及び■ 型−シトケラチン間のへテロ型複合体形成が可能となるべきであった。４Ｉ１０１／ｌ　尿素にした溶液の部分量を（遠心分離の後）直接電気泳動の試料として非解離条件下に４ｍｏｌ／ｌ　尿素中で使用し、第２の次元で５ＤＳ−ＰＡＧＥと組み合わせた。

中間−（シトケラチン）−フィラメントの試験管内再構成のためにはクロマトグラフィーにより精製したＣＲ２及びＣＫ２Ｏ蛋白質をそれぞれ１　ｍｑ／　ｍｌ　の濃変に（Ｂｒａｄｆｏｒｄによる蛋白質測定（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　Ｍ、　Ｍ、＾ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２　（１９７６）　、２４８〜２５４））溶かしく緩衝液前記）、かつ等モル比で混合する。この混合物（及びコントロールとして個々の蛋白質の溶液）を浮かんでいる膜フイルタ−（ｌ１ｉｌｌｉｐｏｒｅＶＳ　Ｏ，０２５）上で２．５ｗｍｏｌ／１ＤＴＴを含有するＩ　Ｑ　ｗｏｏｌ／　ｌ　）リス−ＨＣｌ中の４ｍｏｌ、／ｌ　尿素に対して１時間透析し、引き続き２時間２　、５　ｍｍｏｌ、／　１ＤＴＴを含有するが尿素は含有しない１０　＋＋ｍｏｌ／　（！　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）　に対して透析する。引き続き、マイナス染色及び電子顕微鏡検査を実施した（Ｑｕｉｎｌａｎ等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１７８　（１９８４）　、３６５〜３８８）。

例　５蛋白質分解による切断実験十二指腸粘膜絨毛からの天然細胞骨格材料に部分蛋白質分解（キモトリプシンによる）切断を行なう（ｔｌａｔｚｆｅｌｄ及び共同研究者、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１９７　（１９８７）２３７〜２５５）。この際、６．６：１０００又は９　：　１０００の酵素基質比及び３０分〜６０分の消化時間を適用した。切断生成物は５ＤＳ−ＰＡＧＥ、引き続き銀染色又は免疫プロット−分析により又は二次元ゲル電気泳動により、トリプシンペプチド地図に関連づけて分析した。

例　６免疫細胞化学、免疫蛍光のために使用した方法、低温槽組織切片及び培養細胞の免疫ベルオキシダーゼ及び免疫電子顕微鏡検査を記載されたように適用した（　Ｂａｄｅｒ等著、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、４７　（１９８８）　３００−３１９　；　Ｆｒａｎｋｅ等著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。＾ｃａｄＳｃｉ、ＵＳＡ　７５、（１９７８）５０３４〜５０３８；　Ｆｒａｎｋｅ等著、Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　１１６　（１９７８）４２９−４４５　：　Ｆｒａｎｋｅ等著、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ１９　（１９７９）２５５ −２６８　；Ｆｒａｎｋｅ等著、ＥｘｐＣｅｌｌ　Ｒｅｓ、１３１　（１９８１）　２９９〜３１８　：Ｆｒａｎｋｅ等著、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、９０　（１９８１）１１６−１２７　；　Ｆｒａｎｋｅ等著、Ｃｅ１ｌ　３０　（１９８２）　１０３〜１１３　；　Ｆｒａｎｋｅ等著、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ’ｓ　Ａｒｃｈｉｖ　ＡｌＰａｔｈｏｌ、Ａｎａｔ、４１　１　（１９８７）　１３７〜１４７　：Ｊａｈｎ等著、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　３６　（１９８７）　２３４〜２５４　：　Ｋｎａｐｐ及びＦｒａｎｋｅ、　Ｃｅ１ｌ　５９、（１９８９）６７〜７９、Ｍｏ１１等著、Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、１３２（１９８８）　１２３〜１４４）。

例　７標準品の獲得法適用した方法はシトケラチンの例で記載されている：しかしながら処理の種類はすべてのＩＦ＝蛋白質に転用することができる。

７．１　完全ポリペプチドの精製人ノドケラチン（例えば８）を主にアハトンユテッター等によって記載されたように（＾ｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ等：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ４ｏ１．１３４　：　３５５−３７１　（１９８６））、人培養細抱列ＭＣＦ７から得た。削り取った細胞層を均實にする（主にＡｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ等によって記載されている、前記）。個々の／トケラチンーポリペプチドをＤＥＡＥ−セルロース上のアニオン−交換体クロ’７トグラフイー　（Ｄ　Ｅ　５２　；　ｆｈａｌ＋ａｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｉｎｃ、、　Ｃ１１ｆｔｏｎ、　Ｎ　Ｊ　、　Ｕ　Ｓ　Ａ）　８ｍｏｌ／／（シトケラチン８用）もしくは９．５ｍｏｌ／Ａ！　（シトケラチン２０用）により尿素−緩衝液（８もしくは９．５ｍｏｌ／ｌ尿素、２　、５　■ｏｌ／　ｌジチオエリトリット、３Ｃ１＋＋ｍｏｌ／／　トリス−ＨＣ１（ｐＨ８，０））中でクロマトグラフィーにより精製したが、これは主に文献（［Ｉａｔｚｆｅｌｄ及びＦｒａｎｋｅ、Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、１０１　（１９８５）　１８２６〜１８４１　；　Ａｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ等、１９８６（前記）　；　Ｂａｄｅｒ等、ＥＭＢＯＪ、５　（１９８６）１８６５〜１８７５）　；　Ｑｕｉｎｌａｎ等、Ｊ、　Ｍａｔ、　Ｒｉａ１１９２　（１９８６）３３７〜３４９）に記載されている。短かく記載すると、細胞骨格材料を２時間９，５ｍｏｌ／／尿素（５ｍｍｏｌ／　ｌ　ジチオエリトリトール、１０ｍ５ｏｌ／ｌ’　トリス−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　）中で抽出し、１００．０００ｘｇ　（ｇ＝重力定数）で遠心分離することにより得られた上澄抽出液を８もしくは９，５ｍｏｌ／ｌ　尿素−緩衝液に対して透析し、かっこの緩衝液で平衡にしたＤＥＡＥ−セルロースカラム上に担持した。結合した蛋白質を０〜１００　ｇａｏｌ／　ｌグアニジン−ＨＣｌ傾斜液で溶離した。ポリペプチド−組成物をＳＤＳ／ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により検査した。合したフラクションを転相を有する高圧−液体クロマトグラフィーにかけ、この際０．０１％（Ｖ／Ｖ）ｌ−リフルオル酢酸（ＴＦＡ）（Ｆｌｕｋａ、　Ｂｕｃｈｓ、　スイス）を水性溶剤Ａとして、アセトニトリル（クロマトグラフィー用品質、メルク・グルムンユタット、西独）中の０．０７％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを有機相（溶剤Ｂ）として、かつ転相を有するＢｉｏＲａｄ−ＲＰ− ３０４−カラム（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ　、Ｕ　Ｓ　Ａ　）を使用した。ピークフラクションを集め、アセトニトリルを真空蒸発により除去し、かつフラクションを凍結乾燥した。

７２　精製したポリペプチドのプロトフィラメント及びＩＦ−蛋白質への再構成精製したシトケラチンを９　、５　ｍｏｌ／　ｌ尿素を含有する緩衝液中に溶かした。等モル量のＩ型及び■型シトケラチンを約０　、５　ｍｙ／　ｍｌの最終濃度で混合し、プロトフィラメント及びシトケラチンフィラメントが得られた、この際ポリペプチド溶液を低いイオン強度の緩衝液に対して透析した。（ｔｌａｔｚｆｅｌｄ、　Ｍ　及びＦｒａｎｋｅ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０１　：　１８２６〜１８４１　（１９８５）において記載されている緩衝液を使用した。）プロトフィラメント及びシトケラチンフィラメントの形成を試料のネガティブ・コントラストによる電子顕微鏡検査により検査した（　Ｈａｔｚｆｅｌｄ及びＦｒａｎｋｅに比較、前記）。

７３　制限蛋白質分解によるα−ラセン状シトケラチン中央部片の製造蛋白質分解を種々のプロテアーゼで実施した。典型的な調製法においてはキモトリプシン（牛膵臓からのＥＣ３，４，２１，１、例えばシグマ社、ミュンヘンのもの）をシトケラチン８：１８対の場合６．６　：　１０００、シトケラチン８：２０対の場合９・１０００の酵素対基質比（重量／重量）で使用した。各キモトリプシンチャージに関して消化時間を最適化しなければならなかった。蛋白質分解を分解生成物をゲル電気泳動分析によりコントロールし、棒状中央片（Ｍ　ｒ　＝　３８０００〜４００００）の最大部分量に関して最適化した。最適値は３０℃で約２０分にあった。相応する消化時間後、酵素活性を５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを添加することにより中断した。

７．４　α−ラセン状中央部片の精製蛋白質分解による中央部片及びその単フラグメントをセファロースＣＬ　６　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌ　Ｋ　Ｂ　、フライブルグ）カラム上でクロマトグラフィーにより、又は直接転相−高性能液体クロマトグラフィーを介して分離した、すなわち前記の項７．１に記載した溶剤系の使用下に転相を有するＢｉｏＲａｄ　ＲＰ　３０４−カラム上で分離した。更なる精製のために、メインフラクションをアセトニトリル濃縮物の約２０％（Ｖ　／　Ｖ　）への低下のために溶剤Ａで希釈し、次いで直接転相を有するマイ−ポンダパック（Ｍｙ−Ｂｏｎｄａｐａｋ）　Ｃ１８−カラム（ｌｌａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　１ｌｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ）上に担持した。すべてのメインフラクションを凍結乾燥し、かつ試料をラセン構造がそこで中断される短かい中央の切片に切断位があるので、単にそれぞれ２つの中央部片フラグメントに分離されているα−ラセン状中央部片の存在に関して１−及び２次元ゲル電気泳動により試料を参照材料もしくは標準材料として検出システムの較正のために、かつ免疫のために使用した。

例　８好適な抗体の選択及び製造独自の増殖によって得られるか、又は市販の中間フィラメント蛋白質に対する特異的抗体を例７により標準材料として得られたようなα−ラセン状中央部片フラグメントとの免疫活性に関して次の方法で調べた：８．１　免疫プロット法（ウェスタン−プロット：変性抗原との反応）精製したフラグメント蛋白質（例えばシトケラチン８：１８−、シトケラチン８：２〇−又はビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）−フラグメント）及びキモトリプシンで蛋白質分解的消化反応（例９参照）の前及び後の組織試料（例えばリンパ節又は肝臓）からの細胞骨格−調製物をゲル電気泳動（ナトリウム−ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動）により分離し、蛋白質をニトロセルロース上で電気泳動により移動し、問題になっている特異的抗体と恒温保持した。

免疫反応を標識蛋白質Ａ又は標識抗−マウスー抗体により検出した。α−ラセン状中央部片（塩基性ケラチンの場合Ｍｒ３８．０００〜４０，０００　；Ｍｒ２０．０００〜２２．０００）と免疫反応を示す抗体を選択した。

８２　ドツト−プロット法（天然もしくは再天然化抗原）精製したＣＫ２０＝蛋白質約２Ｘ１０−６９（５０ｍｍａ１／　ｌ　Ｎ　ａ２ＨＰ　Ｏ４−緩衝液、［）Ｈ７，４５０ｘｌＱ−６１中に溶かす）もしくはキモトリプシン消化により均質化した組織試料の上澄フラクションを直接ニトロセルロースに結合しく例えばＳＲＣ９６Ｍｉｎｉｆｏｌｄ　Ｉ　Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ−装置中、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕ１１．　Ｋａｓｓｅｌ、Ｂ　ＲＤ）　、かつ問題になっている特異的な抗体と恒温保持する。更なる作業行程は１に記載していると同様である。

８．３　エリザ法（天然もしくは再天然化抗原）精製したフラグメント蛋白質５００ｎｗ（１０−’ｇ）（５０＋ｍｏｌ／ｌ　ＮａＨＣＯｓ−緩衝液、ｐ　Ｈ９，６１００μｍ１Ｏ−６ｚ）中に溶かす）もしくはキモトリプシン消化により均質化した組織試料の上澄フラクションの蛋白質２μ９（１０−’　９）（１００ μｌ［１０−’ｌ］中）を９６穴マイクロ滴定プレートの窪み毎に恒温保持し、かつ結合した蛋白質を問題になっている特異的な抗体と共に恒温保持する。更なる作業行程は］−に記載したように行なう。

８．４　免疫蛍光−鏡検標準法、例えばＣ１ｏｃｃａ　Ｄ、Ｒ。

及びＢｊｅｒｃｋｅ　Ｒ，Ｊ　によりＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　ｌ　２１　。

５６２〜５７９　（１９８６）に詳しく記載されている前記方法によりプラスであった抗体及び抗血清はＫｓ　１９．２　：Ｋｓ　１８−９８１　；Ｋｓ　１８ −２７ｒＶ；Ｋｓ　８−１７．２：Ｋｓｐａｎ　１−８：ＶＩＭ　３Ｂ４：ＩＴ −モルモット抗血清（シトケラチン２０に対するモルモット抗血清の製造（例３参照、ＩＴ−マウス抗血清（製造例３参照）。

８５　α−ラセン状中央部片に対するモノクロナール抗体の製造特異的抗体の製造のためには、その都度精製したポリペプチドから構成された試験管中で再構成されたフィラメントだけを免疫化のために注射した。モノクロナール抗体を製造するためにはメスの生後６〜８週のＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化するが、この際このマウスに蛋白’！３０〜３００Ｘ１０−６９を含有する細胞骨格調製品又は再構成フィラメントを１回の注射あたり投与した。この抗原を燐酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中で墾濁し、かつ最初の注射のためにフロイントのアジュバンス（完全）で乳化した。すべての後続の注射においてはフロイントのアジュバンス（不完全）を使用した。動物に約３週間の間隔で３回皮下注射し、かつこの動物は細胞融合の前３日間、抗原３０〜８０×１０−６ｇの腹腔内反復 −注射を受けた。免疫マウスの膵臓細胞を系列Ｓ　ｐ　３　／　０　、Ａ　ｇ　１４、Ｘ　６３−　、Ａ　ｇ　８．６５３及びＮ　Ｓ　Ｏ／　Ｕ　（５ｃｈｕｌｉａｎｎ等著、Ｎａｔｕｒｅ　２７６　：　２６９−２７０　（１９７８）：Ｋｅａｒｎｅｙ等著、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２３　：１５４８〜１５５０　（１９７９）；　Ｃ１ａｒｋ及び１ｌｉｌｓｔｅｉｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７６５７〜６６６　（１９８１）　）のマウス骨髄腫細胞と１０：１の比で主にＫｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより　Ｎａｔｕｒｅ２５６・４９５〜４９７　（１９７５）に記載されたように、融合した。ハイブリッド上澄を人及び生組織の凍結切片上で（主に＾ｃｈｔｓｔａｅｔｔｅｒ等により、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　３１　：　２０６〜２２７　（１９８６）に記載）又は特別に被覆したスライドグラス又はカバーグラス上で培養された培養細胞上で試験したか、又は酵素と組み合わせた免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で試験したが、この際マイクロ滴定プレートの積層のためには精製した抗原を使用した。プラスのクローンを２回コントロールした希釈によりサブクローン化した。

Ｉｇ−サブクラスを０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ及びＮｉ１ｓｓｏｎ、　Ｌ　Ａ。

（１９７８、［１ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｆ＋＋ｕｎｏｌｏｇｙ；　ｆｅｉ著、第１巻、第１９節、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、オノクスフォード、第１〜１９頁中）により決められた。

８．６　ディテクター抗体のベルオキシダーゼへの結合ディテクター抗体と呼ばれるモノクロナール抗体及び特異的なモルモット抗血清をＢ、　Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｏｒｙｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、　Ｒ，Ｈ，Ｂｕｒｄｏｎ及び　Ｐ、１１ｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ＾ｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　０ｘｆｏｒｄ　；第２３８頁）により記載された方法によりペルオキシダーゼに結合した：ペルオキシダーゼ５■ｑを炭酸ナトリウム（１００ｍｓｏｌ／ＣｐＨ９，２）０．５ｍｌ中に溶かし、かっこの酵素を２時間室温で遮光下に１０ｍｍｏｌ／１Ｎａｌ　０４−溶液Ｑ　、　５　ｍｌで酸化することにより、結合の前準備をした。その後、所望の抗体（１０−ｖを１００　ｍ１ｌａｌ／　１炭酸ナトリウム、Ｉ）Ｈ９，２２ｍｌ中に溶かす）を溶かし、乾燥セファデックスＧ　−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）　０　、５　ｑを加え、更に３時間遮光下１：　恒！　保持する。この際生じた複合体をセファデックス材料から炭酸ナトリウム緩衝液で溶離し、０　、１　■ａｌ／　ｌＮａＯＨ中の５％Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈａ−溶液１／２０容量部と混合する。３０分後に、同じ溶液１／１０容量部を加え、４℃で１時間恒温保持する。複合体をＰＢＳに対して真空透析し、かつ約Ｑ　、　５　ｍｌに濃縮し、かつ引き続きセファデックス−Ｇ　−２００ＣＰｈａｒｍａｃｉａ社）カラム（１，ＯＸ　５０Ｃｍ）で分別する。このフラクション（約Ｑ　、　５　ｙｒｌ容量）を酵素活性及び抗体に関してその量を試験し、高いＩｇ−濃度と高い酵素活性を同時に示すフラクションをまとめる。

例　９リンパ組織中の転移の検出及び測定９．１　ＣＫ２Ｏ−蛋白質、有利にそのα−ラセン状中央部片の溶解化まずリンパ節組織の湿潤時重量を調べる。この組織を（湿潤時重量に対して）３倍容量の燐酸塩緩衝含塩溶液（ＰＢＳ）（１０ｍｍｏｌ／／燐酸ナトリウムｐＨ７，４，１５０１■ｏｌ／ｌ　塩化ナトリウム）中にナイフホモジナイザーを用いてかゆ状の粘調物になるまで微細に切断する（　Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社、Ｌｕｚｅｒｎ／　スイス１７）Ｐｏｌｙｔｒｏｎ−ホモジナイザーの使用が勧められる）。この均質物をキモトリプシンと共に恒温保持する。

この目的のためにあらかじめマトリックス（ＣＮ　Ｂ　ｒ−活性化セフ７０−ス４　Ｂ　１Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に結合されているキモトリプシンを使用する：ＣＮＢ　ｒ−活性化セフ７０−ス４Ｂ　１ｇをｌ　ｗａ＋ｏｌ／　ｌＨＣｌ中で１５分間膨潤させ（ゲル容量的３．５１１１／９）、かつ全部テ１ｍｍｏｌ／ｌＨＣＩ　２００ｍ１で洗浄する。塩酸溶液を吸引濾過し、かつマトリックス材料を結合緩衝液（０，５ｍｏｌ／１ＮａＣ１，０、１ｍｏｌ／　ＩＮａＨＣＯａ　、ｐＨ８，０）５ｍｌ　で洗浄する。キモトリプシン１０１１ｇを結合緩衝液５ｍｌ中に溶かし、がっマトリックス材料と共に常に動揺下に室温で２時間恒温保持する。その後残った、飽和していない結合位を。

、２ｍｏｌ／ｌグリシン溶液（ｐＨ８，０）を添加して遮断する。引き続き、ゲル材料を過剰の結合緩衝液（約５０ｍ１）及び酢酸塩緩衝液（０，５ｍｏｌ／ｌ　ＮａＣ１，０、１ｍｏｌ／　ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，０）Ｌｏｇ／で洗浄する。この条件下に使用したキモトリプシン約６０％を結合する、すなわちセファロース４Ｂ−ゲルは結合したキモトリプシン１　、７　＊ｑ／　ｍｌを含有する。より良好な取り扱かいやすさのためにこのゲルをＰＢＳ中で２倍に希釈する（キモトリプシン−濃縮物　Ｏ８５ｙｓｑ／　ｌｌ１）　、このかゆ状組織にキモトリプシン（ＥＣ３，４，２１，１、牛膵臓から例えばＳｉｇｍａ社、ミュンヒエン）を１・１０００　（組織の湿潤時重量に対して計算）の割合で添加する。次いで３０℃での恒温保持工程を行なう（有利に熱ブロック、場合により水浴中）。この均質物を５分間水中に入れることにより、消化反応は３０分後に止まる。この均質物を２Ｘ１０４９で３０分間遠心分離し、かつすぐに遠心分離上澄を取り出す：結合したキモトリプシンは沈殿物中に存在する。

この条件下になお、同定可能な状態でα−ラセン状中央部片の材料の８０〜９５重量％がＣＫ２Ｏ−蛋白質から上澄フラクション中に遊離し、いくらかの完全ＣＫ２０＝蛋白賃が蛋白性の段階で同様に存在する。

９．２　ビメンチン含量の検査及び測定遠心分離を行なった上澄中でビメンチンをサンドイッチ−エリザ法により免疫学的に測定する。このためには第１の抗血清、ＧＰ−８をα−ラセン状中央部片に対する捕獲−抗体として使用し、かつ第２のモノクロナール抗体ＶＴＭ−３８４を第１のエピトープから独立しかつ異なる他のα−ラセン状中央部片のエピトープに対するディテクター抗体として使用する。捕獲−抗体（ＧＰ８）を５０ｍｍｏｌ／１ＮａＨＣＯｓ　（ｐＨ９，６）中に溶かし濃度１０　Ｘ　１０−６９／菖ｌで、マイクロ滴定プレート上に積層する（窪みあたり１５０Ｘ１０−’ｌ）、標準曲線のためには精製したビメンチンーフラグメントを１０　ｎｇ／　ｍｌ　〜５００　ｒ＋ｇ／　ｍｌの濃度で（緩衝液：　１５０ｍｍｏｌ／１ＮａＣ１，１０ｓ＋ｍｏｌ／　ｌＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７，４，００５％ツウィーン２０中に溶かす）使用する。遠心分離した上澄液中のビメンチン濃度の測定のためには、これを最後にあげた緩衝液で１：１００〜１　＋　５００に希釈する。ペルオキシダーゼで標識したディテクター抗体ＶＩＭ３Ｂ４を−緩衝液（１５０ｉｍｏｌ／１ＮａＣ１，１０＋＊ｍｏｌ／　ＩＮ　ａ２　ＨＰ　Ｏ４、ｐ　Ｈ７，４，１％牛血清アルブミン、０．０５％ツウィーン２０）で希釈して濃度　０．５×１０−６９／思ｌとし、かつ窪みあたり１５０Ｘ１０−’９／ｍｌの濃度にする。基質としては○−フェニレンジアミン又はＡＢＴＳ　（２，２’−アジノージ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（６）］　’）を使用する。次いで、このようにして得られたビメンチン値を他の測定結果の定量評価のための基準値として使用する。

９３　シトケラチンの測定及びシトケラチン含量の調査遠心分離上澄液中で存在するシトケラチンを免疫学的にサンドウィッチ−エリザ法により測定する。このためにはシトケラチン１〜８に典型的な第１のエピトープに反応する第１のモノクロナール抗体Ｋｓｐａｎｌ−８、いわゆる捕獲−抗体を使用する。捕獲−抗体Ｋｓｐａｎｌ−８を５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９，６）中に溶かし、濃度２Ｘ　１０−’　ｇ／ｍｌでマイクロ滴定プレート上に積層する（窪みあたり１５０　Ｘ　１０−６１）。標準曲線に関しては例えば精製したシトケラチン−フラグメントをシトケラチン８．１８及び８２０の組合わせで濃度５　ｎａ／　ｍｌ−５００ｎ　９／　ｍＡ！（緩衝液、１５０ｍ５ｏｌ／ｊ！　ＮａＣ１，１０ｉｍｏｌ／／　Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７，４，０，０５％ツウィーン２０中に溶かす）で使用する。ペルオキシダーゼ結合ディテクター抗体としては、例えばＫｓ　１８−２７１Ｖ及びＫｓ１８−９８１（／トケラチン１８フラグメントに関して）及びｌＴ−モルモット抗血清（シトケラチン２０フラグメントに関して）を使用する。遠心分離上澄液中のシトケラチン濃度の測定のためにはこれを緩衝液（１５０ａｍｏｌ／ｌ　ＮａＣ１，１０ｍｍｏｌ／／　Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７゜４．０．０５％ツウィーン２０）で１　＋　１００希釈する。

標準化のためには例７により得られた既知量のシトケラチン標準品をサンドウィッチ−エリザ法に使用する。それぞれの標準化シトケラチンの濃度に相応する酵素活性を濃度に対して記載し、標準曲線を得、この標準曲線から各シトケラチンの未知量の濃度が補間法によってめられる。

癌転移の規模は組織試料中の一定のシトケラチンと測定したビメンチンの比によりはっきりと表示することができる。

例１０マイクロ滴定プレート上でのサンドウィッチ−エリザ法におけるシトケラチン８：２０の定量測定１０１　マイクロ滴定プレートの積層各課みに捕獲抗体Ｋｓｐａｎｌ−８０，２Ｘ１０−’ｇ　（５Ｑ　ｍｍｏｌ／　ｌ炭酸ナトリウム緩衝液ｐ　Ｈ９、６１００〜１５０Ｘ１０−”ｌ中に溶かす）をピペットで挿入する。このプレートをおおって、１夜４℃で恒温保持する。

１０．２　洗浄及び遮蔽各窪みから過剰の抗体溶液を吸引により除去する。

各窪みに３同順次洗浄緩衝ｆ＆（ＰＢＳ−ツウィーン：１５０　ｍｗａｌ／　／　ＮａＣ１，１０ｇＩＩｏｌ／　ｌ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４，００５％ツウィーン２０）２００ｘｌＯ−”ｚをピペットで入れ、プレートを回転することにより除去する。残った湿り気を多層のティッシュペーパー上でプレートを軽くたた（ことにより除く。

各々の窪みを遮蔽緩衝液（１５０ＩＩｍｏｌ／１ＮａＣ１，１０ｍｓ＋ｏｌ／　ｌ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４，０゜０５％ツウィーン２０．１％牛血清アルブミン、５％蔗糖、長い保存時間の場合、更に００１％　チメロサールを添加する）２００ｘｌＯ−’　ｌで満たし、少なくとも１時間室温で恒温保持する。

１０．３　抗原もしくは血清試料との恒温保持例７により濃度５ｎｇ／ｍｌと５００　ｎｇ／　ｍｌの間（その都度のディテクター抗体に依存する）で得られたントケラチン８・２０の標準蛋白質を対照血清（ｆＩｅｒｚ＆Ｄａｄｅからの１ｌｏｎｉｔｒｏｌ又はＢｅｈｒｉｎｇからのＫｏｎｔｒｏｌｌｏｇｅｎＬ及びＬＵ）中に取り込む。この対照血清を１・１０及び１　：　１００希釈する。それぞれの窪みに標準蛋白質溶液又は血清試料（１：１０及び１・１００希釈）１００ＸＩＯ−６／をピペットで挿入し、９０分間室温で恒温保持する。その後、洗浄緩衝液（ＰＢＳ−ツウィーン、前記）２００Ｘ１０°６１で４回洗浄する。

１０４　ディテクター抗体との恒温保持ペルオキシダーゼと結合したディテクター抗体（ＣＫ２０−モルモット血清）を緩衝液（１５０ｍ＋ｍｏｌ／　ｌＮａＣ１、ｌ　Ｑ　ａｍｏｌ／　ｌ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７４，１％牛血清アルブミン）中で希釈しく最適濃度は０２〜０．５Ｕ／ｍｌ）、そこからミクロ滴定プレートの各窪みに１００ＸＩＯ−６１をピペットで入れ、９０分間室温で恒温保持する。その後洗浄緩衝液（ＰＢＳ　−ツ’）　イー　ン、前記）２００ｘｌＯ −’Ｉで２回、及び蒸留水２００μｌで４回洗浄する。

１０．５　基質反応マイクロ滴定プレートのために基質錠剤１０寓ｇ）。

−フエニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社）１つ及び３０％Ｈ２Ｏ２１０Ｘ１０−６／を０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）１０Ｍｌ中又はクエン酸塩−燐酸塩−緩衝液（０，０３４７ｍｏｌ／　ｌ　クエン酸、０．０６６７ｍｏｌ／Ａ ’燐酸水素二ナトリウム；ｐＨ５，０）中に溶かす（クエン酸塩−燐酸塩緩衝液の使用の際により高い吸着が得られる）。各々の窪み中に基質溶液１００×１０ −’Ｚ（室温に温度調節済）をピペットで入れる。

マイクロ滴定プレートをカバーして先住用による反応を保護しくアルミニウムシート等で）、かつ相応する色強度が生じるまで恒温保持する（１５〜３０分）。

１０．６　酵素反応の中断１２．５％Ｈ２ＳＯ４−溶液５０ｘｌＯ−６１！の添加により、ペルオキシダーゼの反応を中断する。定量測定の場合には、標準蛋白質とテスト血清に関して同じ時間の経過後に中断するように注意するべきである。

１０．７　評価マイクロ滴定プレートをエリザ−光度計中で４９２ｎｓで測定する。

例１１９６穴マイクロ滴定プレート（例えば、Ｍ１２９Ａ、ＤｙｎａｔｅｃｈＳＰｌｏｃｈｉｎｇｅｎ）の各々の窪み中で標準蛋白質（４ｍｏｌ／　ｌ　尿素、１０　ｍｍｏｌ／　ｌ　トリス−ＨＣｌｐＨ７，６，２ｍｍｏｌ／　ｌ　ジチオエリトリ　ソト、５　ｍｍｏ１７ｉ　ＥＤＴＡ中の原液０　、５　ｍｇ／　ｍｅからフィラメントに再構成されたシトケラチン２０及びシトケラチン８）１０μａを燐酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ　；　１５０ｍｍｏｌ／／ＮａＣ１，１０ｍｍｏｌ／　ｌ燐酸ナトリウムｐＨ７，４）１００μ！中に溶かしてピペットで入れ、室温（ＲＴ）で１６時間恒温保持する。その後窪みを空にし、それぞれＰＢ３２００ μｌで１回洗浄し、かつ飽和していない結合位を１％ＢＳＡ−溶液（牛血清アルブミン、ＰＢＳ中に溶解）１００μｌで室温で１時間恒温保持することにより遮蔽する。引き続き窪みを３回それぞれ洗浄液（０，０５％　ツウィーン２０、ＰＢＳ中に溶解）２００μｌで洗浄し、患者血清（ＰＢＳ中で１：５００に希釈）１００μｌと共にＲＴで１時間恒温保持し、洗浄溶液それぞれ２００μｌで３回洗浄し、特異的なＩｇＭ−抗体の検出のためにベルオキシダーゼ結合抗−人−ＩｇＭ抗血清（兎抗−人１ｇ、μ−鎖特異的；　Ｄａｋｏ　Ｐ　３２２　）と共に並びに特異的なＩｇＧ−抗体の検出のためにベルオキシダーゼ結合抗−人ＩｇＧ抗血清（兎抗−人１ｇ、ｃｙ−鎖特異的、Ｄａｋ。

Ｐ２１４）と共に１　：　１０００で０１％ＢＳＡ−溶液（ＰＢＳ中）中室温で１時間恒温保持する。それぞれ洗浄溶液２００μｌで３回及び蒸留水２００μｌで２回洗浄した後、各々の窪みに基質溶液（０−フェニレンジアミン１０菖９．３０％Ｈ２Ｏ２１０μ！、　クエン酸塩−燐酸塩緩衝液１０ｉ／中＋　０．０３４７ｍｏｌ／Ａ’クエン酸、０．０６６７■ｏｌ／ｌ燐酸水素二ナトリウム；ｐＨ５，０）１００μｌをピペットで入れる。遮光下に１０〜３０分（それぞれ色強度により）展開させ、酵素反応を１２．５％Ｈ２Ｓ０４−溶液５０μｌの添加により中断し、反応した基質を波長４９２ｎｍでエリザ−光度計により測定する。標準化のためにはシトケラチン２０自家抗体に関して低い、中程度の及び高い力価を有する比較血清を同時に平行測定する。

例１２人の正常組織及び腫瘍組織中のＣＫ２Ｏ（蛋白質ＩＴ）の免疫組織化学的局在限定試験法は例えば例６に記載されているような公知方法に相応して実施した。

１、正常組織上皮：胃粘膜（小高上皮）＋＋＋薄層腸粘膜　＋＋＋厚層腸粘膜　＋＋＋泌尿器系上皮　＋＋＋メルケル細胞　＋＋＋胆嚢粘膜　十胸腺細網　十前立腺　十肝臓　− 皮脂腺　− 乳腺　− 口内唾液腺　− 口内粘膜　− 食道−粘膜　− 甲状腺　− 精巣上体　− 非上皮組織　すべてマイナス２　Ｆ４瘍癌結嚇の腺癌　＋＋＋冑の腺癌　＋＋膵臓の腺癌　＋＋胆嚢のｖａ癌　＋＋泌尿器系上皮癌　＋＋＋メルケル細抱瘍　よ十士肺の腺癌　−＊乳癌　− 子宮内膜の腺癌　−＊卵巣の腺癌　−零本腎臓の腺癌　− 甲状腺の癌　− 口腔の扁平上皮癌　−＊肺の扁平上皮癌　−＊頚の扁平上皮癌　− 肺の小細胞癌　−木すべての非上皮腫瘍はマイナスである　−＋＋＋＝非常に強（プラス −＝マイナス一京　＝マイナスだが、個々の細胞は場合により免疫組繊化学をＣＫ２Ｏに対する特異的抗体（モルモット又はマウスから）及びペルオキシダーゼ結合第２吹拭体（羊からの抗−マウス−もしくは抗−モルモット−１ｇ）又はベルオキシダーゼ結合蛋白質Ａを用いて低温槽−組織切片で実施した。

原則的にはこの方法はマウス−抗体を使用する際にパラフィン切片上でも適用可能である。

明細書中で例として挙げた細胞列ＡＴＣＣＨＴＢ３８、ＡＴＣＣＣＣＣ２２９、ＡＴＣＣＣＣＣ２３３、ＡＴＣＣＣＣＣ２２１及びＡＴＣＣＣＣＣ２２０は米国寄託機関（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）　、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　１ｌａｒｙｌａｎｄ　１Ｕ　Ｓ　Ａ　（７）細胞列収集中にすべての人に使用可能に提供されており、かつＡＴＣＣ−カタログに記載されている。

手続補正書平成５年１月２６日

Claims

【特許請求の範囲】

１．シトケラチン２０（ＣＫ２０）からなる細胞骨格フラクションを含有する細胞を製造し、この中に含有される蛋白質をゲル電気泳動法により又は／及びクロマトグラフィー法により分離し、かつこのＣＫ２０をゲルから、もしくはＣＫ２０を含有するクロマトグラフィーフラクションから獲得することを特徴とするシトケラチン２０の精製法。
２．細胞骨格フラクションを十二指腸粘膜絨毛から製造する請求項１記載の方法。
３．細胞骨格フラクションを特に結腸癌、膀胱癌又は胃癌から由来する培養細胞から製造する請求項１記載の方法。
４．第１のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を高めた塩濃度を有する緩衝液系中で実施し、ＣＫ２０を含有する帯域を切断して取出し、蛋白質を溶離し、第２のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を低い塩濃度を有する緩衝液系中で実施し、ゲル中の相応する帯域から精製したＣＫ２０を単離する請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
５．クロマトグラフィー分離のためにまずアニオン交換クロマトグラフィー、次いで転相ＨＰＬＣを実施する請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
６．ＤＥＡＥ−セルロースでのアニオン交換クロマトグラフィーを尿素の存在において、かつ塩酸グアニジン０〜１００ｍｍｏｌ／ｌの線状傾斜溶離液を用いて実施し、次いでＣＫ２０含有フラクションにＨＰＬＣを実施する請求項５記載の方法。
７．塩酸グアニジン３８〜５０ｍｍｏｌ／ｌを含有するフラクションにＨＰＬＣを実施する請求項６記載の方法。
８．ＣＫ２０とシトケラチン１〜８の群から選択された塩基性シトケラチンとを含有する再構成シトケラチン複合体から、又は該蛋白質の蛋白質分解により製造した相応するα−ラセン状中央部片からなることを特徴とする標準蛋白質材料。
９．ＣＫ２０及びＣＫ８を含有する複合体、もしくはそのα−ラセン状中央部片からなる請求項８記載の標準蛋白質材料。
１０．ＣＫ２０及び塩基性シトケラチンを含有する標準蛋白質材料を製造する方法において、精製したＣＫ２０とシトケラチン１〜８の群から選択された精製した１種の塩基性シトケラチンとを等モル比で一緒に尿素含有緩衝液中に溶かし、かつこの混合物をまず尿素及びＤＴＴを含有する緩衝液に対して、次いで尿素不含の緩衝液に対して透析することを特徴とするＣＫ２０及び塩基性シトケラチンを含有する標準蛋白質材料の製法。
１１．形成されたシトケラチン複合体を蛋白質分解により切断する請求項１０記載の方法。
１２．蛋白質分解による切断をキモトリプシンを用いて、酵素対基質の比６：１０００〜１０：１０００で、かつ消化時間３０〜６０分で実施する請求項１１記載の方法。
１３．塩基性シトケラチンとしてＣＫ８を使用する請求項１０から１２までのいずれか１項記載の方法。
１４．請求項１から７項のいずれか１項により精製したＣＫ２０を使用する請求項１０から１３までのいずれか１項記載の方法。
１５．該蛋白質を８．５〜１０ｍｏｌ／ｌ尿素及び１．５〜３ｍｍｏｌ／ｌＤＴＴを含有する緩衝液中に溶かし、かつ３．５〜４．５ｍｏｌ／ｌ尿素及び１．５〜３ｍｍｏｌ／ｌＤＴＴを含有する緩衝液に対して第１の透析を実施する請求項１０から１４までのいずれか１項記載の方法。
１６．ＣＫ２０に特異的な抗体を製造する方法において、免疫化のために精製したＣＫ２０を使用し、次いで自体公知法によりポリクロナール又はモノクロナール抗体を形成することを特徴とするＣＫ２０に特異的な抗体の製法。
１７．請求項１から７までのいずれか１項により精製したＣＫ２０を使用する請求項１６記載の方法。
１８．ポリクロナール抗体を製造する際にモノ特異的抗体の単離のために、免疫グロブリンフラクションに他のシトケラチンに反応する抗体の免疫沈降及び分離、又は／及びＣＫ２０に特異的な抗体の免疫沈降及び分離を実施する請求項１６又は１７記載の方法。
１９．ＣＫ２０に特異的な抗体の免疫沈降及び分離を得られた免疫グロブリンフラクションと、ＣＫ２０が結合した固相との恒温保持により行なう請求項１８記載の方法。
２０．他のシトケラチンに反応する抗体の免疫沈降及び分離を得られた免疫グロブリンフラクションと電気泳動により精製したシトケラチン８．１８及び１９又はこれらを含有する細胞からの全蛋白質が結合した固相との恒温保持により行なう請求項１８記載の方法。
２１．複数回免疫沈降行程を実施する請求項１８から２０までのいずれか１項記載の方法。
２２．固相としてニトロセルローステープを使用する請求項１９又は２０記載の方法。
２３．組織切片上、組織均質物中及び体液中のＣＫ２０又は蛋白質分解による切断により得られたそのα−ラセン状中央部片の免疫学的同定のために請求項１６から２０までのいずれか１項により製造された抗体の使用。
２４．組織試料から均質物を製造し、この均質物中に含有される中間フィラメント蛋白質を蛋白質分解的に切断し、かつこれから遊離するα−ラセン状中央部片を可溶性の相中で分離し、抗体を用いて同定し、かつ定量的に測定する請求項２３記載の使用。
２５．血液、血液血清及び尿のような体液中で、この中に含有される可溶性中間フィラメント蛋白質フラグメントを抗体を用いて免疫学的に同定し、かつ定量的に測定する請求項２３記載の使用。
２６．血液又は血清中のＣＫ２０に対する自家抗体を検出するための、請求項８又は９によるか、又は請求項１０から１５までのいずれか１項により製造した標準蛋白質材料の使用。
２７．胃腸管、膀胱及びメルケル細胞の癌を他の腫瘍、特に他の癌から区別するための方法又はＣＫ２０に特異的な抗体を用いて検査すべき組織中のＣＫ２０の存在を調べることにより転移の細胞に関する由来の証明。