KR100296198B1 - 시이엔피-비(cenp-b)에피토프 - Google Patents

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에프.지.엠. 헤르만스 ; 이.에이치. 리링크
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Abstract

본 발명은 항 동원체 자가 항체(anticentromere autoantiboky : ACA)와 면역 화학적으로 반응성인 펩티드 또는 그 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 시험액중의 항 동원체 자가 항체의 검출 또는 동원체 항원 검출 방법과, 상기 방법이 적용되는 경우에 사용되는 면역화학적 시약 및 시험 키트에 관한 것이다.

Description

시이엔피-비(CENP-B) 에피토프
제1도는 항동원체 자가항체(anticentromere autoantibody : ACA)와 면역 화학적으로 반응성이 있는 본발명에 따른 60 아미노산 펩티드를 나타내는 1문자 암호로 도시된 아미노산 서열도이다.
본 발명은 항동원체 자가 항체(ACA)와 면역 화학적으로 반응성이 있는 펩티드 또는 그 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 시험액 중의 항동원체 자가 항체의 검출 또는 동원체 항원의 검출 방법, 및 상기 검출 방법을 수행하기 위한 면역 화학적 시약 및 시험 키트에 관한 것이다.
동원체(centromere) 성분은 류마티스성 질환을 앓고 있는 특정 환자들에서 고도로 선택적인 자가 면역 반응의 표적 중 하나이다. 비록 항동원체 자가 항체(ACA)가 주로 제한된 경화증 또는 CREST(석회침착증(Calcinosis), 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 식도의 운동성 이상(Esophageal dysmotility), 수지 경화증(Sclerodactyly), 모세관 확장증(Telangiectasia)) 증후군에서 관찰되었지만, 이들 항체는 몇몇 다른 류마티스성 질환 및 맥관염을 앓고 있는 환자에서도 또한 검출되어 왔다.
언샤우 등(Earnshaw et al.)은 ACA 양성 환자의 혈청이 세 종류의 면역학적으로 관련된 동원체 항원인 CENP-A (17kDa), CENP-B(80kDa) 및 CENP-C (140kDa)를 인식한다는 사실을 1985년에 보였다. CENP-A와 CENP-C에 대한 항체 역가는 종종 더 낮지만, CENP-B에 대한 항체는 모든 ACA 양성 환자의 혈청 중에서 높은 역가로 존재한다는 사실이 발견되었기 때문에, CENP-B가 주요 동원체 항원으로 간주되었다. ACA와 항-토포이소머라제 I(anti-topoisomerase I)항체가 전신성 경화증에 있어서의 유용한 임상 표지라는 사실이 제시되었다. 1987년에 언샤우 등은 CENP-B를 암호화하는 mRNA의 95%의 cDNA를 클로닝하는데 성공하였다. 그들은 또한 환자 혈청 중에서 자가 항체를 검출하기 위해 효소-결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA) 시스템에서 단백질, 즉 CENP-B를 처음 사용하였음을 보고하였다. 이들의 실험에 사용된 단백질은 113kDa의 β-갈락토시다제에 융합된 CENP-B의 카르복실-말단 영역으로부터의 147 아미노산 잔기를 암호화한 것이다. 그러나, 신뢰성있는 진단을 가능하게 하는 특이적이고 민감한 방법의 개발을 위해서는, 상기 단백질에서 면역 우성 에피토프(immuno-dominant epitopes)를 결정하는 것이 대단히 중요하다. CENP-B의 마지막 60개의 C-말단 아미노산 잔기들은 놀랍게도 예기치 못했던 중요한 자가항원 도메인을 구성한다. ACA가 면역 형광법 및 면역 블로팅(immunoblotting)에 의해 검출될 수 있는 환자의 혈청 모두가 이러한 C-말단 CENP-B 단편에 대한 항체들을 포함하고 있음을 상기 데이터는 나타낸다. 더욱이, 대장균에서 융합 단백질로서 CENP-B의 이러한 특정 부분의 발현 정도는 CENP-B의 마지막 157개의 C-말단 아미노산 잔기의 발현 정도보다 훨씬 더 높은 반면에, 놀랍게도 그것의 항원성은 적어도 이보다 더 긴 CENP-B 단편의 항원성만큼 높은 것으로 나타났다. 더욱이, 이 물질은 항-CENP-B 항체들에 대해 환자 혈청을 검색하기 위한 ELISA 시스템에서 항원공급원으로서 매우 적합하다.
본 발명은 항동원체 자가항체(ACA)와 면역 화학적으로 반응성이 있는 제1도에 도시된 바와 같이 1문자 암호로 도시된 아미노산 서열 및 60개의 아미노산을 갖는 펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명의 여전히 ACA와 면역 화학적으로 반응성이 있는 상기 펩티드의 단편들과, 또한 상기 펩티드 또는 그것의 단편을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.
제1도에 다른 펩티드의 유사체 또는 유도체도 또한 본 발명에 포함된다. 용어 "유사체(analogues)"란 예컨대 발현 후 변형된 펩티드를 나타내며, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등으로 변형된 펩티드를 나타낸다.
본 발명은 또한 적어도 한 종류의 본 발명에 다른 펩티드를 포함하는 면역화학적 시약에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 한 종류의 본 발명에 따른 펩티드사 사용하는 방법으로서, 시험액에서 ACA를 검출하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 적어도 한 종류의 본 발명에 따른 펩티드사 사용하는 방법으로서, 시험액에서 동원체 항원을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 한 종류의 본 발명에 따른 면역화학적 시약을 포함하며, 면역 분석법에 사용되는 시험 키트에 관한 것이다.
핵산 증폭 기술, 예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 핵산 서열 기초 증폭(nucleic acid sequence based amplification)(NASBA)에 의해 CENP-B DNA 또는 RNA를 검출하는 시험의 기초로서 제1도에 따른 아미노산들을 암호화 하는 새로운 뉴클레오티드 서열을 사용하는 것도 본 발명의 영역에 포함된다.
위에서 언급한 펩티드는 시험액 중에서 CENP-B 또는 ACA의 존재를 검출하기 위한 진단 방법에 사용하는데 특히 적합한 것으로 판명되었다.
본 발명에 따른 펩티드의 제조는 펩티드 합성을 위한 공지의 유기 화학적 방법 중 어느 하나에 의해서 수행되거나, 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 수행된다. 후자의 방법은 숙주로서 적절한 미생물 중에서 하나 또는 그 이상의 문제의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현 시키는 것에 의하여 원하는 펩티드를 제조하는 것을 포함한다.
펩티드 합성을 위한 유기 화학적 방법은 균질상(homogeneous phase) 중에서 또는 고체상의 도움으로 축합 반응에 의해 필요한 아미노산들을 커플링시키는 것을 포함하도록 고려된다.
이미 앞에서 지적한 바와 같이, 본 발명에 따른 펩티드는 재조합 DNA 기술의 도움으로 유사하게 제조될 수 있다. 펩티드가 반복 서열("탠덤(in tandem)")중에 통합되거나 또는 펩티드가 (훨씬 더 큰) 단백질이나 폴리펩티드의 구성 성분으로 제조되는 경우에 이러한 가능성은 특히 중요하다. 따라서, 이러한 유형의 펩티드의 제조도 본 발명이 영역내에 포함된다.
본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 이러한 유형의 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드가 통합된 재조합 DNA도 본 발명의 영역내에 포함된다.
특허 청구 범위 중에 특별히 포함시키지 않아도, 본 발명에 따른 펩티드 중의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 문제의 펩티드의 면역 화학적 활성에 영향을 미치지 않고 다른 아미노산이나 아미노산 유사체 또는 유도체로 대체할 수 있다는 것을 자명한 것이다.
상기 펩티드들의 작용성 유도체들, 즉:
(a) 상기 펩티드들의 산 부가 염;
(b) 상기 펩티드들의 아미드류, 특히 C-말단 아미드류;
(c) 에스테르류, 특히 C-말단 에스테르류; 그리고,
(d) N-아실 유도체, 특히 N-말단 아실 유도체류와 특히 N-아세틸 유도체류도 또한 본 발명에 따른 펩티드로서 고려된다.
"면역 화학적 시약(immunochemical reagent)"이라는 용어는 본 발명에 따른 펩티드가 적절한 지지체에 결합되거나 또는 표지화 물질이 구비된 것을 의미한다.
사용될 수 있는 지지체로는, 예컨대 마이크로테스트 웰 또는 큐벳의 내벽, 관 또는 모세관, 막, 필터, 테스트 스트립 또는 예컨대, 라텍스 입자, 적혈구, 염료졸, 금속 졸 또는 졸 입자로서 금속 화합물과 같은 입자의 표면을 들수 있다.
사용될 수 있는 표지화 물질은 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소, 염료졸, 금속 졸 또는 졸 입자로서 금속 화합물이다.
시험액 중의 동원체 항원에 대한 항체의 검출 방법에 있어서, 본 발명에 따른 면역 화학적 시약을 시험액과 접촉시키게 된다. 그 후, 시험액중의 항체와 펩티드 사이에 형성된 면역 복합체의 존재는 시험액중의 상기 항체의 존재에 대한 지표가 된다.
이들 검출 방법을 사용할 때 발생하는 면역 화학적 반응은 바람직하게는 샌드위치 반응, 응집 반응, 경쟁 반응 또는 저해 반응이다.
시험액중의 동원체 항원, 예컨대 CENP-B의 검출을 위해서는, 본 발명에 따른 면역 화학적 시약을 시험액과 ACA에 접촉시킨 후, 형성된 면역 복합체의 존재를 검출하고, 이로부터 시험액중의 CENP-B 항원의 존재를 결정할 수 있다.
시험액중의 CENP-B 항원을 검출하기 위한 특히 적합한 방법은, 표지 물질이 제공되어 있는 본 발명에 따른 펩티드와 CENP-B 항원(시험액중에 존재) 사이의 경쟁 반응으로서, 고체 지지체에 결합되어 있는 CENP-B에 대한 항체상의 결합 부위에 대한 경쟁 반응이다.
본 발명에 따른 시험 키트는 상술한 바와 같이 면역 화학적 시약을 포함한다. 샌드위치 반응을 수행하기 위하여, 이 시험 키트는 예컨대, 마이크로테스트 웰의 내벽과 같은 고체 지지체에 결합된 본 발명에 따른 펩티드, 및 본 발명에 따른 표지된 합성 펩티드 또는 표지된 항-항체를 포함할 수 있다.
경쟁 반응을 수행하기 위해서, 시험 키트는 고체 지지체에 결합된 본 발명에 따른 펩티드, CENP-B 항원에 대한 표지된 항체, 바람직하게는 상기 펩티드에 대한 단일 클론 항체를 포함할 수 있는데, 이들 항체는 시험액중의 ACA와 경쟁하도록 사용된다.
응집 반응에서, 졸을 포함하는 입자에 결합된 본 발명에 따른 펩티드를 포함하는 면역 화학적 시약은, 검출하고자 하는 CENP-B 항원에 대한 항체가 존재하는 시험액과 직접적으로 접촉되어야 한다.
시험 키트의 다른 구체예는, 예컨대 고체 지지체에 결합되어 있는 CENP-B에 대한 항체의 결합 부위에 대한 검출하고자 하는 CENP-B 항원과의 경쟁 반응에, 면역 화학적 시약으로 본 발명에 따른 표지된 펩티드를 사용하는 것이다.
[실시예 1]
혈청
대부분의 환자 혈청은 네덜란드 니즈미겐의 세인트 래드보우드 대학 병원의 류마티스학부(the Department of Rheumatology of the University Hospital St. Radboud at Niumegen, The Netherlands)로부터 입수하였다. 몇몇 추가적인 혈청들은 네덜란드의 엔쉐드, 디벤터 및 그로닝겐(Enschede, Deventer and Groningen)의 병원으로부터 공급받았다.
CENP-B 단편들을 암호화하는 cDNA 클론의 분리
항 동원체 항체들을 포함하는 2종의 인간 혈청 혼합물을 λgt11 벡터로 구성된 인체 태반 cDNA 발현 라이브러리(Clontech HL100 8b)를 스크리닝하는데 사용하였다. 각 혈청은 1:1000의 희석비로 사용하였다. 특이적으로 결합된 항체를 검출하기 위해서,125I-표지화된 양 항-인체 면역글로불린 F(ab)2단편(Amersham, U.K.)을 사용하였다. 이 방법으로 4종의 면역 양성 클론을 검출하였다. 이들 클론들을 23(1009 bp), 7(1210 bp), 15(1306 bp) 및 13(970 bp)으로 표시하였으며, 각각 CENP-B의 카르복실-말단 영역으로부터 60, 125,157 및 161 아미노산 잔기들을 암호화하고 있다.
이 cDNA들을 pGEX 세균 발현 시스템의 플라스미드내로 연결시키고, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST; 26kDa)를 암호화하는 유전 서열에 융합시켰다. 클론 23은 pGEX-2T의 BamHI 부위에 삽입시켰으며, 클론 15는 pGEX-3X의 EcoRI 부위에 삽입시켰다. 생성된 융합 단백질을 GST-CENP-B/23(33 kDa) 및 GST-CENP-B/15(52kDa)로 명명하였다.
대장균 DH5α를 플라스미드의 유지 뿐만아니라 융합 단백질의 생성을 위한 숙주로서 사용하였다.
[DNA 서열 분석]
cDNA 단편들을 다양한 제한 효소들로 절단하였다. DNA 단편들을 M13mp18의 폴리링커 영역에 연결시켰다. 이 DNA 단편에 대한 서열 분석은 디데옥시 사슬 종결 방법으로 수행하였다.
겔 전기 영동, 단백질 블로팅 및 항원의 검출
SDS-PAGE와 니트로셀룰로오스 시이트(Schleicher & Schuell filters BA 85, Dassel, Germany)상의 13% 또는 18%의 폴리아크릴아미드 겔로부터의 단백질의 이동을 수행하였다. 면역 블롯(immunoblots)을 처리하고 가공하였다. 이 항체-항원 복합체를 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제-결합된 2차 항체 또는 양으로부터의125I-표지된 항-인체 Ig(전체 항체)(Amersham)로 검출하였다.
융합 단백질의 생성 및 정제
pGEX-2T/23 또는 pGEX-3X/15로 형질 전환시킨 대장균 DH5α를 하룻밤 동안 증식시킨 배양물을 100μl/ml 암피실린을 함유하는 신선한 L-브로쓰(broth) 100ml로 1:20으로 희석하고, 0.1mM의 최종 농도로 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피 라노시드 : Research Organics, Cleveland, U.S.A.)를 첨가하기 전에 격렬하게 통기하면서 37℃에서 1시간 동안 증식시켰다. 다시 3시간 동안 증식시킨 후, 세포들을 펠렛화(pellet)하고, 0.5mM의 프로테아제 억제인자 페닐메틸술포닐 클로라이드(PMSC)를 함유하는 2ml의 인산 완충 식염수(PBS) 중에 재현탁시켰다.
세포들을 동결/해빙에 이어서 37℃에서 20분간 50㎍/ml의 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I)(Sigma)을 사용하여 항온 처리하는 것을 3회 반복하여 용해시켰다. 그 다음, 50%(w/v) 수크로오소, 10mM 트리스-HCl(pH8.0), 1mM Na-EDTA(pH 8.0) 및 100mM NaCl의 0.4ml 중에 0.1mg의 리소자임을 첨가하였다. 얼음중에서 30분간 항온 처리하였다. 0.2ml의 10%(v/v) 논이데트(Nonidet) P-40과 0.2ml의 Na-EDTA(pH 7.5)를 첨가한 후, 현탁액을 다시 15분간 얼음중에서 항온 처리하였다. 3.5mg/ml의 즈위터젠트 세정제(Zwittergent detergent) 3-14(Calbiochem, San Diego. U.S.A.)를 첨가한 후, 현탁액을 마이크로팁(microtip)이 부착된 브랜슨 초음파 발생기(Branson sonifier) B-12를 사용하여 얼음중에서 1분씩 3회 초음파 처리하였다. 이 현탁액을 PBS중의 40%(w/v) 수크로오스 용액 1ml을 적층시키고, +4℃에서 10,000g로 30분간 원심 분리하였다. 이어서, 펠렛을 0.5ml의 8M 우레아 중에 재현탁시켰다. 이 물질을 ELISA에 사용하기 위해서 코팅 완충 용액(Na-탄산염 완충 용액 pH 9.6 : 35 mM NaHCO3/15 mM Na2CO3)중에 1:20,000으로 희석하였다.
[실시예 2]
효소-결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay:ELISA)
CENP-B에 대한 항체의 검출을 위해서, 즈위터젠트(Zwittergent) 정제의 융합 단백질 GST-CENP-B/23을 사용하여 효소 면역 측정법을 실시하였다. 적절한 체스 보드(chess board) 적정 후, 최적 농도의 항원, 환자 혈청 및 결합체가 확립되었다.
폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Greiner; 96웰)를 코팅 완충 용액 중의 GST-CENP-B/23(0.5㎍/ml)의 희석액으로 100μl/웰로 코팅하였으며, +4℃에서 하룻밤동안 유지시켰다. 이어서, 항원 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS/0.05%(v/v) Tween-20으로 5회 세정하였다. 코팅 완충 용액중에 희석된 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 150μl/웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 항온 처리하여 남아 있는 유리된 결합 부위를 차단시켰다. 그후, 이 플레이트를 PBS/트윈으로 5회 세정하였다. 10%(v/v)의 정상 토끼 혈청으로 보충된 RIA-완충 용액(0.3%(w/v) BSA, 350mM NaCl, 10mM 트리스-HCl (pH7.6), 1%(v/v) 트리톤 X-100, 0.5%(w/v) Na-데옥시콜레이트, 0.1%(w/v) Na-도데실 설페이트)으로 1:100, 1:200 및 1:400으로 희석한 50μl 혈청/웰을 사용하여 분석법을 수행하였다. 이 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온 처리하고, PBS/트윈으로 6회 세정하였다.
각각의 웰에 대해서 하기의 토끼 항-인체 퍼옥시다제-결합 항체 중의 하나를 50μl 첨가하였다 :
-RIA-완충 용액중에 1:1000으로 희석한 IgG, IgA, IgM, 카파, 람다(DAKOpatts, Glostrup, Denmark:P-212).
-RIA-완충 용액중에 1:5000으로 희석한 IgG(쇄) (DAKOpatts : P-214).
-RIA-완충 용액중에 1:2000으로 희석한 IgA(α-쇄) (DAKOpatts : P-216).
-RIA-완충 용액중에 1:2000으로 희석한 IgM(μ-쇄) (DAKOpatts : P-215).
이 플레이트들을 실온에서 1시간 동안 항온 처리하고, PBS/트윈으로 6회 세정하였다.
결합된 항체들을 표준 방법에 따라 3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, Sigma)으로 가시화시켰다. 10분후 웰 당 100μl 2M H2SO4를 가하여 염색 반응을 종료시켰다. 플레이트들을 450nm에서 바이오-래드(Bio-Rad) 모델 2550 ELISA 판독기로 판독하였다. 모든 혈청을 4벌씩 시험하였으며, 그 결과를 평균하였다. 모아진 정상 인체 혈청(NS)의 수준보다 2배 이상 높은 값을 양성으로 간주 하였다.
면역 블롯 분석법에서 항-CENP-A와 항 CENP-B 항체 모두에 양성인 81개의 혈청 모두 GST-CENP-B/23 단백질과 양성 면역 반응을 나타냈다. 매우 강한 면역 반응(OD 값>2)이 81개의 혈청중 65개에서 얻어졌다. 이 그룹중의 다른 16개의 혈청에 대한 OD값은 0.6 내지 2.0의 범위에 걸쳐 있었다.
결론적으로, 본 발명에 따른 CENP-B 펩티드를 사용한 ELISA는 환자의 혈청을 ACA의 존재에 대해서 스크리닝하는데 있어서 진보된 것으로 간주될 수 있다.

Claims (7)

  1. 제1도에 도시된 아미노산 서열로 구성되는 항동원체 자가 항체(anticentrmere autoantibody)와 면역 화학적으로 반응성이 있는 폴리 펩티드.
  2. 고체 지지체에 결합되거나 또는 표지 물질이 구비된 제1항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 면역 화학적 시약.
  3. 제1항에 따른 폴리펩티드를 시험액과 접촉시키고, 펩티드와 시험액 중의 항체 사잉 형성되는 면역 복합체의 존재를 검출하여, 시험액 중의 항동원체 자가 항체의 존재에 대한 지표로 삼는 것을 특징으로 하는, 시험액 중의 항동원체 자가 항체의 검출 방법.
  4. 제1항에 따른 폴리펩티드를 시험액 및 항동원체 자가 항체와 접촉시킨 다음, 시험액 중의 동원체 자가 항체의 존재에 대한 지표인 형성된 면역 복합체의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는, 시험액 중의 항동원체 자가 항체의 검출 방법.
  5. CENP-B DNA 또는 RNA 서열의 핵산 증폭을 수행하고 검출하기 위해서, 프라이머로서 제1항에 따른 아미노산 서열을 암호화하는 서열 또는 그 단편을 사용하는, 시험액중의 동원체 핵산 서열의 증폭 및 검출 방법.
  6. 마이크로테스트 웰, 입자 및 졸로 구성되는 군에서 선택된 고체 지지체에 결합되거나 또는 표지 물질이 구비된 제1항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 시험 키트.
  7. 프라이머로서 제1항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 그 단편, 적어도 증폭된 핵산 서열 부분에 실질적으로 상보적이고 검출 가능한 표지를 구비한 핵산 서열, 및 적당한 증폭 시약을 포함하는 시험 증폭 키트.
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