FI109704B - CENP-B-epitooppi - Google Patents

CENP-B-epitooppi Download PDF

Info

Publication number
FI109704B
FI109704B FI930106A FI930106A FI109704B FI 109704 B FI109704 B FI 109704B FI 930106 A FI930106 A FI 930106A FI 930106 A FI930106 A FI 930106A FI 109704 B FI109704 B FI 109704B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cenp
antigen
test
peptide
autoantibodies
Prior art date
Application number
FI930106A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI930106A (fi
FI930106A0 (fi
Inventor
Ronald Verheyen
Venrooij Waltherus Jacobus Van
Original Assignee
Akzo Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nv filed Critical Akzo Nv
Publication of FI930106A0 publication Critical patent/FI930106A0/fi
Publication of FI930106A publication Critical patent/FI930106A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI109704B publication Critical patent/FI109704B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)

Description

1 109704 CENP-B-epitooppi
Keksintö koskee peptidiä tai sen fragmenttia, joka reagoi immunokemiallisesti sentromeerin vastaisten auto-5 vasta-aineiden (ACA-vasta-aineet) kanssa.
Keksintö koskee myös menetelmää testattavassa nesteessä olevien sentromeerin vastaisten autovasta-aineiden tai sentromeeriantigeenin tunnistamiseksi ja myös immuno-kemiallista reagenssia ja testikäyttöpakkausta mainittujen 10 tunnistusmenetelmien suorittamiseksi.
Sentromeerikomponentit ovat eräitä erittäin selektiivisen autoimmuunivasteen kohteista tietyillä reumatau-tipotilailla. Vaikka sentromeerin vastaisia autovasta-aineita (ACA-vasta-aineita) havaittiin pääasiassa rajoit-15 tuneessa kovettumataudissa tai CREST-syndroomassa (kalkkiutuminen, Raynaud'in oire, ruokatorven liikehäiriö, sormien ja varpaiden ihokovettuma, verisuoniluoma), niitä on tunnistettu myös potilailla, joilla on useita muita reuma-tauteja ja suonitulehdus. Earnshaw et ai. osoittivat 1985, 20 että ACA-positiivisten potilaiden seerumit tunnistavat kolme immunologisesti sukua olevaa sentromeeriantigeenia, CENP-A- (17 kDa), CENP-B- (80 kDa) ja CENP-C-antigeenin (140 kDa). Koska CENP-B-antigeenia vastaan olevien vasta-aineiden havaittiin olevan läsnä korkeina tiittereinä 4 · · 25 kaikkien ACA-positiivisten potilaiden seerumeissa, kun : ’.· taas CENP-A- ja CENP-C-antigeeneja vastaan olevien vasta- * * * · aineiden tiitterit olivat usein alempia, CENP-B-antigeenin viitattiin olevan pääasiallinen sentromeeriantigeeni. On :\j osoitettu, että ACA ja topoisomeraasi I -entsyymiä vastaan * · 30 olevat vasta-aineet ovat hyödyllisiä kliinisiä merkkejä systeemisessä kovettumataudissa. Earnshaw et ai. onnistui-> " vat 1987 kloonaamaan cDNA:n, joka sisälsi noin 95 % siitä mRNAista, joka koodittaa CENP-B-antigeenia. He raportoivat myös proteiinin ensimmäisen käytön, se on CENP-B-proteii-35 nin, entsyymivälitteisessä immuunitestisysteemissä (ELISA) 109704 2 autovasta-aineiden tunnistamiseksi potilaiden seerumeista. Heidän kokeissaan käyttämässä proteiinissa oli kooditettu-na 147 aminohappotähdettä CENP-B-proteiinin karboksipään alueelta fuusioituna 113 kDa β-galaktosidaasiin. Sellaisen 5 spesifisen ja herkän menetelmän, joka mahdollistaa luotettavan diagnostisoinnin, kehittämiseksi on kuitenkin erittäin tärkeää tunnistaa mainitun proteiinin immunodominan-tit epitoopit. CENP-B-proteiinin viimeiset 60 C-pään aminohappotähdettä muodostavat yllättävästi tärkeän ja odot-10 tamattoman autoantigeenisen domeenin. Tulokset osoittavat, että ne potilaiden seerumit, joissa ACA voidaan tunnistaa immunofluoresenssilla ja immunoblottauksella, kaikki sisältävät vasta-aineita tätä C-pään CENP-B-fragmenttia vastaan. Lisäksi, tämän CENP-B-proteiinin tietyn osan eks-15 pressiotaso fuusioproteiinina E. coli -bakteerissa on paljon korkeampi kuin CENP-B-proteiinin viimeisten 157 C-pään aminohappotähteen ekspressiotaso, kun taas sen antigeeni-suus yllättävästi ilmeni olevan ainakin yhtä korkea kuin pidemmän CENP-B-fragmentin vastaava. Lisäksi tämä mate-20 riaali sopii erittäin hyvin antigeenin lähteeksi ELISA- ,·. systeemiin, jolla seulotaan potilaiden seerumeita anti- « · CENP-B-vasta-aineiden läsnäolon suhteen.
Keksintö käsittää 60 aminohapon pituisen peptidin, * * jonka aminohapposekvenssi on kuvattu yksikirjainkoodilla ' ·" 25 kuviossa 1, joka peptidi reagoi immunokemiallisesti sent- : . romeerin vastaisten autovasta-aineiden (ACA-vasta-ainei- v · den) kanssa.
Keksintö käsittää myös mainitun peptidin fragmen-: *,· tit, jotka edelleen reagoivat immunokemiallisesti ACA-vas- • 30 ta-aineiden kanssa, ja myös polypeptidit, jotka sisältävät mainitun peptidin tai sen mainitun fragmentin.
’ Kuvion 1 mukaisen peptidin analogit tai johdannai- set on myös sisällytetty keksintöön. Termi "analogit" viittaa esimerkiksi peptidin ekspression jälkeisiin modi- 109704 3 fikaatioihin, esimerkiksi glykosylaatioihin, asetylaatioi-hin, fosforylaatioihin, jne.
Keksintö koskee myös immunokemiallista reagenssia, joka sisältää ainakin yhden keksinnön mukaisista pepti-5 deistä.
Keksintö koskee myös menetelmää testattavassa nesteessä läsnäolevien ACA-vasta-aineiden tunnistamiseksi, jossa menetelmässä käytetään ainakin yhtä keksinnön mukaisista peptideistä.
10 Keksintö koskee myös menetelmää testattavassa nes teessä länäolevan sentromeeriantigeenin tunnistamiseksi käyttäen ainakin yhtä keksinnön mukaisista peptideistä.
Keksintö koskee myös testikäyttöpakkausta, jota käytetään immuunitestissä, tämän testikäyttöpakkauksen 15 sisältäessä ainakin yhden keksinnön mukaisen immunokemial-lisen reagenssin.
Tämän keksinnön piiriin kuuluu uuden nukleotidisek-venssin käyttö, joka sekvenssi koodittaa kuvion 1 mukaisia aminohappoja, sellaisen testin perustana, joka testi tun-20 nistaa CENP-B DNA:ta tai RNA:ta nukleiinihappoamplifikaa-tiotekniikalla, esimerkiksi polymeraasiketjureaktiotek-nilkalla (PCR) tai nukleiinihapposekvenssiin perustuvalla amplifikaatiolla (NASBA).
• · · ·
Yllä mainittujen peptidien on havaittu olevan eri-..." 25 koisen käyttökelpoisia käytettäväksi diagnostisessa mene- : telmässä testattavassa nesteessä olevan CENP-B-antigeenin 1j ! tai ACA-vasta-aineiden määrittämiseksi.
Keksinnön mukaisten peptidien valmistus suoritetaan yhdellä orgaanisen kemian tunnetulla peptidisynteesimene-30 telmällä tai yhdistelmä-DNA-menetelmien avulla. Jälkimmäinen menetelmä pitää sisällään halutun peptidin valmistuk-: " sen niin, että ekspressoidaan polynukleotidisekvenssissä olevaa rekombinanttipolynukleotidia, joka koodittaa yhtä ·*·,, tai useampia kyseessä olevia peptidejä, sopivassa isäntä- 35 mikro-organismissa.
109704 4
Orgaanisten kemiallisten peptidisynteesimenetelmien ajatellaan sisältävän tarvittavien aminohappojen kiinnityksen toisiinsa kondensaatioreaktion avulla joko homogeenisessa faasissa tai kiinteän faasin avulla.
5 Kuten yllä on jo osoitettu, keksinnön mukainen pep tidi voidaan samalla tavalla valmistaa yhdistelmä-DNA-menetelmien avulla. Tämä mahdollisuus on tärkeä erikoisesti silloin, kun peptidi sisällytetään toistuvaan sekvenssiin ("peräkkäin") tai kun peptidi valmistetaan (paljon 10 suuremman) proteiinin tai polypeptidin osana. Tämän tyyppinen peptidin valmistus kuuluu sen vuoksi keksinnön piiriin.
Tämän tyyppinen polynukleotidi, joka koodittaa keksinnön mukaista peptidiä, ja rekombinantti-DNA, johon tämä 15 polynukleotidi on sisällytetty, kuuluvat samalla tavalla keksinnön piiriin.
Ilman, että patenttivaatimuksiin on erikoisesti sisällytetty on itsestään selvää, että yksi tai useampi aminohappo keksinnön mukaisissa peptideissä voidaan korva-20 ta muilla aminohapoilla tai aminohappoanalogeilla tai -johdannaisilla ilman, että vaikutetaan kyseessä olevien • · II. peptidien immunokemialliseen aktiivisuuteen.
• · ”'m Yllä kuvattujen peptidien toiminnallisia johdannai- * · » · siä, nimittäin: 1 2 3 4 5 6 a) peptidien happoadditiosuoloja; 2 » * · b) peptidien amideja ja erikoisesti C-pään amide- 3 : : : ja; 4 c) estereitä ja erikoisesti C-pään estereitä, ja 5 d) N-asyylijohdannaisia, erikoisesti N-pään asyy- 6 li johdannaisia ja erikoisesti N-asetyyli johdannaisia, pi detään myös keksinnön mukaisina peptideinä.
: ” Termi "immunokemiallinen reagenssi" merkitsee, että keksinnön mukaiset peptidit on sidottu sopivaan kantajaan tai ne tarjotaan leimaavan aineen kanssa.
109704 5 Käyttökelpoisia kantajia ovat esimerkiksi mikro-tiitterilevyn tai kyvetin sisäseinä, putki tai kapillaari, membraani, suodatin, testinauha tai partikkelin, kuten esimerkiksi lateksipartikkelin, punasolun, värisoolin, 5 metallisoolin tai soolipartikkelina olevan metalliyhdis-teen pinta.
Leimaavat aineet, joita voidaan käyttää, ovat muun muassa radioaktiivinen isotooppi, fluoresoiva yhdiste, entsyymi, värisooli, metallisooli tai soolipartikkelina 10 oleva metalliyhdiste.
Menetelmä testattavassa nesteessä olevien sentro-meeriantigeenia vastaan olevien vasta-aineiden tunnistamiseksi sisältää vaiheen, jossa keksinnön mukainen immu-nokemiallinen reagenssi saatetaan kosketukseen testattavan 15 nesteen kanssa. Sen jälkeen peptidin ja testattavassa nesteessä olevien vasta-aineiden välille muodostuneiden im-muunikompleksien läsnäolo on mitta mainittujen vasta-aineiden läsnäolosta testattavassa nesteessä.
Immunokemiallinen reaktio, joka tapahtuu käyttäen 20 näitä tunnistusmenetelmiä on suositeltavasti kerrosreak-tio, agglutinaatioreaktio, kilpailureaktio tai inhibitio-reaktio.
Testattavassa nesteessä olevan sentromeeriantigee- nin, esimerkiksi CENP-B-antigeenin, tunnistamiseksi kek- 25 sinnön mukainen immunokemiallinen reagenssi saatetaan kos- ; ketukseen testattavan nesteen ja ACA-vasta-aineiden kans- » * · ' : : sa, jonka jälkeen tunnistetaan muodostuneiden immuunikomp- leksien läsnäolo ja tästä määritetään testattavassa nes-:\j teessä oleva CENP-B-antigeeni.
30 Erikoisen sopiva menetelmä testattavassa nesteessä olevan CENP-B-antigeenin tunnistamiseksi on kilpailureak-: ” tio keksinnön mukaisen peptidin, joka tarjotaan leimaavan aineen kanssa, ja CENP-B-antigeenin (läsnä testattavassa •\f nesteessä) välillä sitoutumiskohdasta CENP-B-antigeenia 109704 6 vastaan suunnatussa vasta-aineessa, joka vasta-aine on sidottu kiinteään kantajaan.
Keksinnön mukainen testikäyttöpakkaus sisältää yllä kuvatun immunokemiallisen reagenssin. Kerrosreaktion suo-5 rittamiseksi testikäyttöpakkaus voi sisältää esimerkiksi keksinnön mukaisen peptidin sidottuna kiinteään kantajaan, esimerkiksi mikrotiitterikuopan sisäseinään, ja joko keksinnön mukaisen leimatun synteettisen peptidin tai leimatun vasta-aineen.
10 Kilpailureaktion suorittamiseksi testikäyttöpakkaus voi sisältää keksinnön mukaisen peptidin sidottuna kiinteään kantajaan, CENP-B-antigeenia vastaan suunnatun leimatun vasta-aineen, suositeltavasta monoklonaalisen vasta-aineen, joka on suunnattu mainittua peptidiä vastaan, jota 15 sitten käytetään kilpailemaan testattavassa nesteessä olevien ACA-vasta-aineiden kanssa.
Agglutinaatioreaktiossa immunokemiallinen reagens-si, joka käsittää keksinnön mukaisen peptidin sidottuna partikkeleihin, jotka sisältävät soolit, täytyy saattaa 20 suoraan kosketukseen testattavan nesteen kanssa, jossa tunnistettavat CENP-B-antigeenia vastaan suunnatut vasta-aineet ovat läsnä.
Toinen testikäyttöpakkauksen suoritustapa on esimerkiksi keksinnön mukaisen leimatun peptidin käyttö immu-25 nokemiallisena reagenssina kilpailureaktiossa tunnistetta- van CENP-B-antigeenin kanssa CENP-B-antigeenia vastaan : : suunnatun vasta-aineen sitoutumiskohdasta, joka vasta- aine on sidottu kiinteään kantajaan.
•| Esimerkki 1 » · 30 Seerumit
Useimmat potilaiden seerumit saatiin Nijmegen'ssä Alankomaissa olevan University Hospital St. Radboud -sai-' raalan reumatologian osastolta. Jotkin lisäseerumit saa- j\( tiin Enscheden, Deventerin ja Groningenin sairaaloista 35 Alankomaista.
7 109704 CENP-B-fragmentteja koodittavien cDNA-kloonien eristys
Kahden ihmisen seerumien seosta, jotka molemmat seerumit sisälsivät sentromeerin vastaisia vasta-aineita, 5 käytettiin seulottaessa ihmisen istukan cDNA-ekspressio-kirjastoa (Clontech HL100 8b), joka oli rakennettu lambda gtll-vektorin avulla. Kumpaakin seerumia käytettiin laimennuksena 1:1 000. Spesifisesti sitoutuneen vasta-aineen tunnistamiseksi käytettiin 125I-leimattua lampaan anti-ih-10 mis-immunoglobuliinin F( ab )2-fragmenttia (Amersham, UK).
Tällä menetelmällä tunnistettiin neljä immunopositiivista kloonia. Nämä kloonit, joille annettiin nimet 23 (1 009 emäsparia), 7 (1 210 emäsparia), 15 (1 306 emäsparia) ja 13 (970 emäsparia), koodittavat vastaavassa järjestyksessä 15 60, 125, 157 ja 161 CENP-B-proteiinin karboksipään alueen aminohappotähdettä.
cDNA:t ligoitiin bakteeriekspressiosysteemin pGEX-plasmideihin ja fuusioitiin lukuraamiin sellaisten geneettisten sekvenssien kanssa, jotka koodittavat glutationi-20 S-transferaasia (GST; 26 kDa). Klooni 23 insertoitiin , pGEX-2T-plasmidin BamHI-kohtaan ja klooni 15 insertoitiin ;j#* pGEX-3X-plasmidin EcoRI-kohtaan. Tuotetuille fuusiopro- '···’ telineille annettiin nimet GST-CENP-B/23 (33 kDa) ja GST- CENP-B/15 (52 kDa).
25 E. coli -kantaa DH5a käytettiin isäntänä plasmidien j ’'1 yllä pitämisessä kuin myös fuusioproteiinien tuottamises- • sa. DNA-sekvenssianalyysi.
cDNA-fragmentit digestoitiin eri restriktioentsyy-meillä. DNA-fragmentit ligoitiin M13mpl8-plasmidin poly-.*··, 30 linkkerialueelle. DNA-fragmenttien sekvenssianalyysi suo- ’’’ ritettiin dideoksinukleotideja käyttävällä ketjuterminaa- : ” tiomenetelmällä.
» 109704 8
Geelielektroforeesi, proteiinien blottaus ja antigeenien tunnistus
Suoritettiin SDS-PAGE ja proteiinien siirto 13 % tai 18 % prosenttisista polyakryyliamidigeeleistä nitro-5 selluloosapapereille (Schleicher & Schuell -suodatin BA85,
Dassel, Saksa). Immunoblottauksia käsiteltiin ja prosessoitiin. Vasta-aine-antigeeni-kompleksit tunnistettiin joko piparjuuriperoksidaasilla konjugoitujen sekundaari-vasta-aineiden tai lampaasta peräisin olevan 125I-leimatun 10 anti-ihmis-immunoglobuliinin (kokonainen vasta-aine) (Amersham) kanssa.
Fuusioproteiinien tuotto ja puhdistus
Plasmidilla pGEX-2T/23 tai pGEX-3X/15 transformoituja E. coli -kannan DH5a yli yön kasvaneita viljelmiä 15 laimennettiin 1:20 100 ml:aan tuoretta L-lihalientä, joka sisälsi ampisilliinia 100 μΐ/ml, ja kasvatettiin yksi tunti 37 °C:ssa ilmastaen voimakkaasti ennen IPTG:n (isopro-pyyli-S-D-tiogalaktopyranosidi, Research Organics, Cleveland, USA) lisäystä lopulliseksi konsentraatioksi 0,1 mM. 20 Kun oli kasvatettu edelleen kolme tuntia, solut pelletoi- , tiin ja suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan fosfaatilla pus- • · kuroitua suolaliuosta (PBS), joka sisälsi 0,5 mM proteaa-···' si-inhibiittoria fenyylimetyylisulfonyylikloridia (PMSC).
‘ ’ Solut lyysattiin jäädyttäen/sulattaen kolme kertaa, 25 jonka jälkeen inkuboitiin niin, että läsnä oli deoksiri- bonukleaasi I -entsyymiä (DNaasi I)(Sigma) 50 pg/ml 20 mi- ; nuutin ajan 37 °C:ssa. Sen jälkeen lisättiin 0,1 mg lysot- syymiä 0,4 ml:ssa liuosta, jossa oli 50 % (w/v) sakkaroo-: siä, 10 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, 1 mM Na-EDTA:aa, .···, 30 pH 8,0 ja 100 mM NaCl:ia. Inkuboitiin 30 minuuttia jäissä.
·’ Sen jälkeen, kun oli lisätty liuosta, jossa oli 0,2 ml '* 10 % (v/v) Nonidet P-40:ää ja 0,2 ml Na-EDTA:aa, pH 7,5, suspensiota inkuboitiin jäissä toiset 15 minuuttia. Kun oli lisätty Zwittergent-detergenttiä 3 - 14 3,5 mg/ml 35 (Calbiochem, San Diego, USA), suspensio sonikoitiin kolme 109704 9 kertaa yhden minuutin ajan jäissä käyttäen Branson-soni-kaattoria B-12 mikrokärjellä. Suspensio laitettiin kerrokseksi 1 ml:n päälle liuosta, jossa oli 40 % (w/v) sakkaroosia PBS:ssä, ja sentrifugoitiin 30 minuuttia 10 000 x g 5 ja +4 °C:ssa. Sitten pelletti suspendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan 8 M ureaa. Tämä materiaali laimennettiin 1:20 000 päällystyspuskuriin (Na-karbonaatti-puskuri, pH 9,6: 35 mM NaHC03/15 mM Na2C03) käytettäväksi ELISA-tes-tissä.
10 Esimerkki 2
Entsyymi välitteinen inunuunitesti (ELISA) CENP-B-antigeenia vastaan olevien vasta-aineiden tunnistamiseksi suoritettiin entsyymi-immuunitesti käyttäen Zwittergent-puhdistettua fuusioproteiinia GST-CENP-15 B/23. Antigeenin, potilaiden seerumien ja konjugaattien optimaaliset konsentraatiot saatiin selville sopivien sak-kilautatitrausten avulla.
Polystyreenimikrotiitterilevyt (Greiner; 96-kuop-paiset) päällystettiin 100 μΐ/kuoppa laimennoksella, jossa 20 oli GST-CENP-B/23-proteiinia (0,5 mg/ml) päällystyspusku- . rissa, ja pidettiin +4 °C:ssa yli yön. Sitten antigeeni- • · ’ liuos poistettiin ja levyt pestiin viisi kertaa PBS/0,05 % t · ··<* (v/v) Tween-20:11a. Jäljelle jäänteet vapaat sitoutumis- ’ * kohdat blokeerattiin lisäämällä päällystyspuskuriin lai- ,..·* 25 mennettua 0,1 % (w/v) naudan seerumialbumiinia (BSA) • 150 μΐ/kuoppa ja inkuboimalla kaksi tuntia huoneenlämpöti- lassa. Sen jälkeen levyt pestiin viisi kertaa PBS/Tween:llä. Testi suoritettiin käyttäen seerumia . : 50 μΐ/kuoppa, laimennoksia 1:100, 1:200 ja 1:400 RIA-pus- 30 kurissa (0,3 % (w/v) BSA, 350 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, » pH 7,6, 1 % (v/v) Triton X-100, 0,5 % (w/v) Na-deoksiko-’ '· laatti, 0,1 % (w/v) Na-dodekyylisulfaatti), johon oli li- ',,,· sätty 10 % (v/v) normaalia kanin seerumia. Levyjä inkuboi- tiin huoneenlämpötilassa yksi tunti ja pestiin kuusi ker-35 taa PBS/Tween:llä.
109704 10
Kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 μΐ yhtä seuraavista peroksidaasilla konjugoiduista kanin anti-ihmis-vasta-aineista:
IgG, IgA, IgM, kappa, lambda (DAKOpatts, 5 Glostrup, Tanska: P-212), laimennettu 1:1000 RIA-pusku- riin.
IgG (Γ-ketjut)(DAKOpatts: P-214), laimennettu 1:5 000 RIA-puskuriin.
IgA (α-ketjut)(DAKOpatts: P-216), laimennettu 10 1:2 000 RIA-puskuriin.
IgM (μ-ketjut)(DAKOpatts: P-215), laimennettu 1:2 000 RIA-puskuriin.
Levyjä inkuboitiin yksi tunti huoneenlämpötilassa ja pestiin kuusi kertaa PBS/Tween:llä.
15 Sitoutuneet vasta-aineet tehtiin silmin nähtäviksi 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiinillä (TMB, Sigma) standardien menetelmien mukaisesti. Värjäysreaktio pysäytettiin 10 minuutin kuluttua lisäämällä 2 M H2S04:ää 100 μΐ/kuoppa. Levyt luettiin Bio-Rad model 2550 -ELISA-lukijalla 20 450 nm:11a. Kaikki seerumit testattiin neljänä rinnakkai- . sena ja tuloksista laskettiin keskiarvot. Arvoja, jotka olivat kaksi kertaa korkeampia kuin yhdistetyn normaalin • * ··’ ihmisen seerumin (NS) taso, pidettiin positiivisina.
‘ ' Immunoblottausanalyysissä sekä anti-CENP-A- että 25 anti-CENP-B-vasta-aineiden suhteen positiiviset 81 seeru- * '/· mia kaikki antoivat positiivisen immuunireaktion GST-CENP- : B/23-proteiinin kanssa. Hyvin vahvat immuunireaktiot (0D- arvot > 2) saatiin 65:ssä 81 seerumista. Muiden tämän ryh-. j män 16 seerumin OD-arvot vaihtelivat välillä 0,6 - 2,0.
30 Päätelmä on se, että ELISA-testiä, jossa käytetään keksinnön mukaista CENP-B-peptidiä, voidaan pitää edistyksenä seulottaessa potilaiden seerumeita ACA-vasta-aineiden suhteen.

Claims (7)

1. Polypeptidi, tunnettu siitä, että sillä on kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi tai sen 5 osa, jolloin mainittu polypeptidi tai sen osa ovat immuno-kemiallisesti reaktiivisia sentromeerin vastaisten autovasta-aineiden kanssa.
2. Immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen po- 10 lypeptidin kiinteään kantajaan sidottuna tai leima-aineella varustettuna.
3. Menetelmä sentromeerin vastaisten autovasta-aineiden havaitsemiseksi koenesteessä, tunnettu siitä, että saatetaan patenttivaatimuksen 1 mukainen poly- 15 peptidi kosketukseen koenesteen kanssa ja havaitaan peptidin ja vasta-aineiden välille muodostuneiden immu-nokompleksien läsnäolo koenesteessä, jolloin kompleksien läsnäolo on sentromeerin vastaisten autovasta-aineiden läsnäolon mitta koenesteessä. :'j 20
4. Menetelmä sentromeeriantigeenin havaitse- "h miseksi koenesteessä, tunnettu siitä, että saate- • · · ...j taan patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi kosketuk- seen koenesteen ja sentromeerin vastaisten autovasta- * · · aineiden kanssa, jonka jälkeen havaitaan muodostuneiden *;. 25 immunokompleksien läsnäolo, joka on sentromeeriantigeenin » · läsnäolon mitta koenesteessä.
, ; 5. Menetelmä CENP-B DNA- tai RNA-sekvenssin amp- ,·*·, lifioimiseksi ja havaitsemiseksi koenesteessä käyttäen pa- tenttivaatimuksen 1 mukaista aminohapposekvenssiä koodit- I t '· ” 30 tavaa sekvenssiä tai sen osaa alukkeena (alukkeina) maini- • t · ’··* tun CENP-B DNA- tai RNA-sekvenssin amplifikaation suorit- ! tamiseksi ja havaitsemiseksi. i II» 1 > 109704
6. Testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen polypeptidin sidottuna kiinteään kantajaan, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu mikrotestikaivosta, partikkeleista ja soo- 5 leista, tai varustettuna leima-aineella.
7. Testiamplifikaatiopakkaus CENP-B DNA:n tai RNA:n havaitsemiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää alukkeena (alukkeina) patenttivaatimuksen 1 mukaista polypeptidiä koodittavan nukleiinihapposekvenssin 10 tai sen osan. • · • • » · • t » ♦ 1 · • 1 · 1 * t t | » · • · * 1 t • · I · * * * I · * » 1 » » t · » * · * » · • » ♦ » 1 III » 13 109704
FI930106A 1992-01-13 1993-01-12 CENP-B-epitooppi FI109704B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP92200065 1992-01-13
EP92200065 1992-01-13

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI930106A0 FI930106A0 (fi) 1993-01-12
FI930106A FI930106A (fi) 1993-07-14
FI109704B true FI109704B (fi) 2002-09-30

Family

ID=8210361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI930106A FI109704B (fi) 1992-01-13 1993-01-12 CENP-B-epitooppi

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0552829B1 (fi)
JP (1) JPH05310790A (fi)
KR (1) KR100296198B1 (fi)
AT (1) ATE179183T1 (fi)
AU (1) AU664063B2 (fi)
CA (1) CA2087143A1 (fi)
DE (1) DE69324509T2 (fi)
DK (1) DK0552829T3 (fi)
ES (1) ES2132171T3 (fi)
FI (1) FI109704B (fi)
GR (1) GR3030727T3 (fi)
ZA (1) ZA93174B (fi)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7193128B2 (en) 1997-06-03 2007-03-20 Chromatin, Inc. Methods for generating or increasing revenues from crops
US6900012B1 (en) 1997-06-03 2005-05-31 The University Of Chicago Plant artificial chromosome compositions and methods
US7227057B2 (en) 1997-06-03 2007-06-05 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US7119250B2 (en) 1997-06-03 2006-10-10 The University Of Chicago Plant centromere compositions
US7235716B2 (en) 1997-06-03 2007-06-26 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US6177254B1 (en) * 1998-12-15 2001-01-23 Jerome Bernard Rattner Nucleolus autoantigenic marker for systemic lupus erthyematosus
US7989202B1 (en) 1999-03-18 2011-08-02 The University Of Chicago Plant centromere compositions
WO2005083096A1 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
KR100693042B1 (ko) * 2004-11-10 2007-03-12 삼성전자주식회사 무선 전원 공급 장치 및 그 방법
AU2006287553A1 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
WO2008112972A2 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Chromatin, Inc. Centromere sequences and minichromosomes
WO2011011693A1 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Chromatin, Inc. Sorghum centromere sequences and minichromosomes
DE102009039705A1 (de) 2009-08-31 2011-04-07 Dr. Fooke Laboratorien Gmbh Peptide des CENP-A und ihre Verwendung
ES2395100B2 (es) * 2011-07-11 2013-09-13 Univ Cadiz Metodo de obtencion de datos utiles para el diagnostico diferencial de la esclerodermia.

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5091303A (en) * 1989-10-27 1992-02-25 The General Hospital Corporation Diagnosis of wegener's granulomatosis

Also Published As

Publication number Publication date
AU664063B2 (en) 1995-11-02
DK0552829T3 (da) 1999-10-25
JPH05310790A (ja) 1993-11-22
FI930106A (fi) 1993-07-14
EP0552829B1 (en) 1999-04-21
ES2132171T3 (es) 1999-08-16
DE69324509D1 (de) 1999-05-27
KR930016439A (ko) 1993-08-26
AU3114993A (en) 1993-07-15
KR100296198B1 (ko) 2001-10-22
CA2087143A1 (en) 1993-07-14
ZA93174B (en) 1993-08-13
DE69324509T2 (de) 1999-10-07
GR3030727T3 (en) 1999-11-30
EP0552829A1 (en) 1993-07-28
FI930106A0 (fi) 1993-01-12
ATE179183T1 (de) 1999-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI109704B (fi) CENP-B-epitooppi
Surh et al. Antimitochondrial autoantibodies in primary biliary cirrhosis recognize cross-reactive epitope (s) on protein X and dihydrolipoamide acetyltransferase of pyruvate dehydrogenase complex
JP2624973B2 (ja) エプスタイン・バーウイルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体
Božič et al. Sera from patients with rheumatic diseases recognize different epitope regions on the 52‐kD Ro/SS‐A protein
US5618533A (en) Flagellin-based polypeptides for the diagnosis of lyme disease
EP0445423A2 (en) Hepatitis C assay
US5457029A (en) Nuclear antigen La
EP2588495B1 (en) Histone citrullinated peptides and uses thereof
Gohill et al. Antibodies in procainamide-induced and systemic lupus erythematosus bind the C-terminus of histone 1 (H1)
EP0640101B1 (en) Methods and reagents for diagnosis of autoantibodies
US5945105A (en) Peptides of the antigen Sm-D and their use, in particular for the diagnostics of systemic lupus erythematosus (SLE)
JPH09308490A (ja) 原発性胆汁肝硬変自己抗原
WO2012160127A1 (en) Method for the diagnosis of rheumatoid arthritis
PT676965E (pt) Método para reduzir a imunogenicidade da região variável de anticorpos
JPH02502632A (ja) 新規ポリペプチド及びその用途
JP2021098746A (ja) 遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージｊｌ７抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用
JP5676263B2 (ja) バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）に対する抗体を検出するための組成物及びその使用の方法
Muro et al. A charged segment mainly composed of basic amino acids forms an autoepitope of CENP-A
JP3176570B2 (ja) Ｈｃｖの検出又は測定方法
US11492381B2 (en) Quantitative enzyme-linked immunoassay (ELISA) to approximate complement fixing antibody titers in serum from patients with coccidioidomycosis
Kania et al. The isolation, detection, and cross-reactivity in Asian elephant IgG for the development of serological diagnostic tests.
JP3327549B2 (ja) Ｃ１００領域に対する組換え抗原を利用したｃ型肝炎アッセイ
WO2000047613A1 (fr) Proteine a membrane externe modifiee de treponema pallidum, son utilisation comme analyse immunologique et jeu d&#39;analyse immunologique
JPH06207941A (ja) 非ａ非ｂ型肝炎の検査方法
JP2001224371A (ja) Ｈｃｖの検出又は測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed