JPH02502632A - 新規ポリペプチド及びその用途 - Google Patents
新規ポリペプチド及びその用途Info
- Publication number
- JPH02502632A JPH02502632A JP63500766A JP50076687A JPH02502632A JP H02502632 A JPH02502632 A JP H02502632A JP 63500766 A JP63500766 A JP 63500766A JP 50076687 A JP50076687 A JP 50076687A JP H02502632 A JPH02502632 A JP H02502632A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- arg
- ser
- thr
- antigen
- pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 125
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 64
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 76
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 76
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 76
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 claims description 49
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 23
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 17
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims description 16
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 15
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 15
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 9
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 9
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 9
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 4
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 claims description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 3
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- -1 microplates Substances 0.000 description 6
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 5
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 3
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 3
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- QPJSUIGXIBEQAC-UHFFFAOYSA-N n-(2,4-dichloro-5-propan-2-yloxyphenyl)acetamide Chemical compound CC(C)OC1=CC(NC(C)=O)=C(Cl)C=C1Cl QPJSUIGXIBEQAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- VVNYDCGZZSTUBC-LURJTMIESA-N (2s)-5-amino-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O VVNYDCGZZSTUBC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAHZZVIEFRTEY-UHFFFAOYSA-N 2-heptylcyclohex-2-en-1-one Chemical compound CCCCCCCC1=CCCCC1=O HBAHZZVIEFRTEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFNSXSSACWHHMN-UHFFFAOYSA-N 4-benzyl-1,2-dihydrotriazol-5-one Chemical compound N1N=NC(CC=2C=CC=CC=2)=C1O RFNSXSSACWHHMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 241000237369 Helix pomatia Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001367 Merrifield resin Polymers 0.000 description 1
- 241001024304 Mino Species 0.000 description 1
- 241001553014 Myrsine salicina Species 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108010067035 Pancrelipase Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical class O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- ULGVUALRYRFWGU-UHFFFAOYSA-N benzene-1,3-diol;4-benzyl-1,2-dihydrotriazol-5-one;methylsulfanylmethane Chemical compound CSC.OC1=CC=CC(O)=C1.O=C1NNN=C1CC1=CC=CC=C1 ULGVUALRYRFWGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910052758 niobium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010955 niobium Substances 0.000 description 1
- GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N niobium atom Chemical compound [Nb] GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940036134 pertussis immunoglobulin Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 1
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940126577 synthetic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
新規ポリペプチド及びその用途
本発明は、新規ポリペプチド;複合糖質、特に免疫グロブリンとの結合能をもつ
遊離又はキャリア結合形の新規ペプチド並びにそのペプチドの機能性アナログ及
び誘導体から選択される人工化合物;天然百日咳毒素により誘導される抗体と反
応するペプチド配列から主に構成される、新規ポリペプチド及びその一部から選
択される人工百日咳毒素抗原:天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する
上記抗原を診断抗原として含む診断免疫アッセイ用キット;天然百日咳毒素によ
り誘導される抗体と反応する上記抗原から選択される抗原を免疫成分として含む
ワクチン組成物;並びに、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する上記
抗原から選択される抗原を含む陵内皮膚試験用組成物に関する。
背景
免疫学の分野において、はとんどの生物が打々なタンパク質及び/又は炭水化物
構造体を選択的かつ特異的に2工する特異的タンパク質を産生ずることは周知で
ある。
細菌から誘導されるこのような特異的タンパク質の例はプロティンA及びプロテ
ィンGであって、これらは双方とも様々な種由来のある免疫グロブリンと結合す
る。植物又は下等の無を推動物から誘導されるこのような特異的タンパク質の例
はいわゆるレクチン類であって、これらは免疫グロブリン及び他の複合糖質の炭
水化物構造体と結合する。かかるレクチン類の例としては、カナバリンA1小麦
胚凝集素、植物性血球凝集素及びヘリックス・ボマチア(Helix poma
tia)レクチンがある。
上記各々の特異的タンパク質は、タンパク質構造体及び/又は炭水化物構造体の
特定基と結合する。
本発明は、複合糖質、特に免疫グロブリンとの結合能を有する人工化合物を提供
する。
現在まで、百日咳毒素の一部を構成するペプチド抗原については当業界で何も確
認されていない。このような抗原が得られていないことから、診断抗原としてか
かる抗原を含む診断免疫アッセイ用キットを開発することのみならず、かかる抗
原に基づき百日咳に対するワクチンを開発することも不可能であった。
ボーデテラ・パーツシス(Bordetella pertussis)抗体に
対する抗原又はB、パーツシスにより産生されるタンパク質の補助による百日咳
の診断法は公表済であるが、但し診断抗原としてふさ状(rImbrial)赤
血球凝集素〔例えば、グランストレーム、 M、 (Granstri:ia
、M、)、グランストレーム、 G、 (Granstrom、G、)、リ
ントフォース、A。
(Lfndfors、A、)及びアスケレフ、 P、 (Aske16f、P
、)。
1982年、抗原としてふさ状赤血球凝集素を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ
による百日咳の血清学的診断法。
ジャーナル拳オブ・インフエクショス・ディジージズ(Journal or
1nfectious Diseases)、第146巻、第741−745頁
参照〕又は音波処理B、パーツシス細菌〔例えば、グツドマン、 Y、 E、
(GoodIDan、Y、E、)、ワード、 A、 J、 (Wort、
Aj、)及びジャクソン、F、L。
(Jackson、F、L、)、 1981年、初期感染の指標としての鼻咽
腔分泌物中の百日咳免疫グロブリンA検出用酵素結合免疫吸着アッセイ、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(Journal orCli
nicalMjeroblology)、第13巻、第286−292頁、並び
にピルジャネン、 M、 K、 (Vjljanen、M、L) 、ルース
カネン、 O,(Ruuskanen、O,)、グランバーブ。
C(Granberg、C,)及びサルミ、 T、 T、 (Salmi、T、
T、)。
1982年、百日咳の血清学的診断法:酵素結合免疫吸着アッセイにより測定さ
れるボーデテラ・パーツシスに対するIgM、IgA及びIgG抗体、スカンジ
ナビアン・ジャーナル・オブ・インフェクショス・ディジージズ(Scandi
navian Journal of’ 1nfectious Diseas
es) 。
第14@、第112−117頁参照〕が用いられていた。
当業界で周知のように、不活性化ボーデテラ・パーツシス細菌に基づいた百日咳
に対するワクチンがUSA及び他の多くの国で現在使用されている。M、ピット
マン(M、Pi ttman)は百日咳が外毒素(百日咳毒素)により媒符表平
’−’−502632(3)
介されていると1979年に発表したが〔ピットマン。
M、、1979年、百日咳毒素:百日咳の育害作用及び遅延免疫の原因、ハイボ
セシス・レビュー・オブ・インフエクシ田ス・ディジージズ(Hypothes
is Review ofinfectious Diseases)、第1@
、第401−412頁参照〕、日本では不活性化百日咳毒素を含有した無細胞ワ
クチンが現在使用されている。
最近、百日咳毒素のヌクレオチド配列が公表された〔ロッチ、 C,(Loc
ht、C,)及びキース、 J 、 M、 (KeiLh。
J、M、) 、 1986年、百日咳毒素遺伝子:ヌクレオチド配列及び遺伝
組織、サイエンス(Science) 、第232巻。
第1258−1264頁〕。この論文において、著者らは、感染防御エピトープ
を含んだ合成オリゴペプチド類が新世代のワクチンの開発にとりでも有用である
と抽象的に述べているが、但しこのようなエピトープについては教示又は示唆す
らない。
更に最近、百日咳毒素遺伝子に関する論文が公表された:ニコシア、 A、 (
Njcosja、A、)、ベルギニ、M。
(Peruginl、M、) 、フランジニ、 C,(Franzlni、C
,) 、カサグリ、 M、 C,(Casagli、M、C,)、ポリ−、M、
c。
(Borri 、M、G、)、アントニー、 G、 (Antonj、G、)
、アルモニー、 M、 (Alaonl、M、) 、ネリ、 P、 (Nerl
、P、) 、ラフティ、 G、 (Rattl、G、)及びラポーリ、 R,(
Rappuolj、R,)。
1986年、百日咳毒素遺伝子のクローニング及び配列決定:オペロン構造及び
遺伝子複製、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンスU S A (Proceecllng of National Aca
demy of 5cjcnccUSA)、第83巻、第4631−4635頁
。この文献において、°遺伝子工学による毒素遺伝子操作は大量の無毒化タンパ
ク質を産生ずるための方法である°ことが、抽象的に述べられている。これは単
なる示唆にすぎず、操作された毒素遺伝子については何も開示されていない。
更に別の文献がこの分野に存在する:エングストレーム、 O,(Engst
r5Il、O,) 、 Oドマルム、 K。
(Rodmals、に、)、 ジエルンバール、 H,(J6rnva11.)
1.) 。
ルンドクイスト、 G、 (Lundqujst、G、)、 カルマン、
M。
(Kalman、M、) 、 シモンシッッ、 A、 (Slmonsc
its、A、) 。
バートファイ、 T、 (Bartfai、T、)、 レフダール、S。
(LHf’dah1.S、)、及びアスケレフ、 P、 (Aske16f
、P、)。
1986年、百日咳毒素サブユニットS1のN末端構造の特徴及びオリゴデオキ
シリボヌクレオチドプローブとボーデテラ・パーツシスDNA断片とのハイブリ
ッド化。
FEMSマイクロバイオロジー・レターズ(FEMSMierobiology
Letters) 、第36巻、第219−223頁。更にこの論文では、即
ち“遺伝子は毒素産生のために他の生物中にも導入される。遺伝子の配列決定は
毒素の抗原エピトープに相当するペプチド類の合成を可能とし、したがって合成
百日咳ワクチンの開発を可能にする′ことも示唆している。しかしながら、百日
咳毒素の抗原エピトープは確認、合成ばかりか、試験さえもされていなかった。
皮肉皮膚試験用組成物に関して、百日咳に対する免疫試験用のかかる組成物は今
まで当業界で開示されていない。
本発明の一面において、下記式の新規ポリペプチドが提供される:
H−Xl−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro
−Tyr−Thr−9cr−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser
−X2−Y上記式中、X 及びX2は各々任意のカップリング(共役)促進アミ
ノ酸残基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す。
適切な任意アミノ酸残基の例は−Lys−及び−C>−針である。これらの任意
アミノ酸残基は、上記ポリペプチドに対する牛血清アルブミン等のキャリアのカ
ップリングを促進する。
本発明のペプチドは、それ自体公知の固相技術に従い合成された。
この分野で周知のように、ペプチドは入手可能な樹脂結合出発アミノ酸に応じて
酸(COOH)又はアミド(CONH2)形のいずれかで合成される。
本発明のもう一面によれば、複合糖質との結合能をもつ遊離又はキャリア結合形
の人工化合物が提供されるが、その化合物は下記式のポリペプチド並びにその機
能性アナログ及び機能性誘導体からなる群より選択される:H−X’ −Gin
−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Tyr−Thr
−9er−Arg−Arg−5er−Val−Ala−9er−X2−Yす。
本発明の化合物がキャリア結合形である場合には、それはいずれのキャリアとも
結合しうるが、それはキャリアに共有結合、イオン結合、水素結合又は疎水結合
のような物理的/化学的相互作用によって結合される。二のようなキャリアの例
としては、例えばガラス、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム等のような無
機キャリア、例えばマイクロプレート、ビーズ等のようなプラスチック表面、脂
質、リポソーム、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、膜もしくはその
分画及び全細胞もしくはその分画がある。
本明細書及び請求の範囲で用いられる“複合糖質′という表現は、糖タンパク質
、糖脂質、ペプチドグリカン及びプロテオグリカンを含んだ意味であって、それ
らは遊離でも又はキャリア結合形であってもよい(双方ともインビボ及びインビ
トロにおいて)。
結合メカニズムはまだ明らかでないものの、本発明の化合物は上記で規定された
複合I!質の糖部分と結合していると堅く考えられているが、但し上記化合物及
び複合糖質問の相互作用に関して同様に重要な複合糖質の他の位置であってもよ
い。複合糖質とのかかる特異的結合性に影響を与えているのが水溶液(、pH値
範囲1〜13)中における本発明のペプチドの結合コンホメーションである、と
更に考えられている。
上記において、本発明の化合物は、それらが本発明のペプチドとして同様の複合
糖質(例えば、糖タンパク質)結合能を有している限り、様々な化合物から選択
することができる。
本発明のペプチドの“機能性アナログ′という表現は、アナログが本発明のペプ
チドとして同様の複合糖質(特に糖タンパク質、例えば免疫グロブリン)結合能
を有している限り、1又は数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で代用した又
は代用していない、ペプチドの短鎖又は長鎖モノマー又はポリマー(例えば、ペ
プチドの機能性部分もしくは断片、又はペプチドの部分もしくは断片のポリマー
)を包括的に含んだ意味である。
更に本発明のペプチドの°機能性誘導体°という表現は、本発明のペプチドとし
て同様の複合糖!(特に糖タンパク質、例えば免疫グロブリン)結合能を有する
化合物を含んだ意味である。このような化合物の例としては、本発明によるペプ
チドの構造を本質的に何するが但し1又は数個のアミノ酸残基が他の化学基、即
ち6機及び無機分子又は元素で代用された化合物がある。
前記複合糖質に対する上記ペプチドの結合性に影響を与えているのが水溶液中に
おける本発明のペプチドの結合コンホメーションであると考えられることから、
(本発明のペプチドの)機能性アナログ及び機能性誘導体は水溶液中における上
記ペプチドの結合コンホメーションに本質的に対応した少なくとも1つのコンホ
メーションを含んでいるべきである。
本発明の好ましい例では、免疫グロブリンとの結合能をもつ遊離又はキャリア結
合形の人工化合物が提供されるが、その化合物は下記式のポリペプチド並びにそ
の機能性アナログ及び機能性誘導体からなる群より選択される:
H−X’ −Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pr
o−Tyr−Thr−3er−Arg−^rg−Ser−Vat−Ala−3e
r−X2−Y上記式中、Xl及びX2は各々任意のカップリング促進アミノ酸残
基を表し、かつYは−pH又は−NF2を表す。
本発明のポリペプチド及び化合物は、免疫学の分野で極めて有用な高度の興味あ
る性質を仔している。
本発明の化合物は、複合糖質、特に糖タンパク質、例えば免疫グロブリンと結合
し、したがって酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)においてかかるアッセ
イで従来使用されてきた複合体の代わりに酵素結合形として使用することができ
る。
本発明の化合物は、複合糖質、例えば免疫グロブリン又は他の免疫活性物質、例
えばβ−ミクログロブリンのための一般的吸着剤として使用することができる。
吸着剤として、それは免疫複合体から体液を清浄化するために血漿交換法を用い
て(インビボで)生体外体液に適用されるか又はそのために利用することができ
る。血漿交換法における吸着剤として上記化合物に関する他の有用性の例は、ア
レルギー、白血病及びエイズのような疾患の治療に際してである。
吸着剤として、それは更にポリ及びモノクローナル抗体及び他の免疫活性物質を
精製するために(インビトロで)使用することもできる。
更に、キャリア結合形の本発明の化合物は、免疫化学の分野において(インビト
ロで)広い用途を有している。
キャリアとしては、特に金粒子、コロイド金、酵素(例えば、アルカリホスファ
ターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ)、アビジン、ビオチン又は一部の放射
性同位元素(例えば、ヨウ素)のような標識(マーカー)がある。
本発明の化合物は免疫活性細胞と結合し、したがって(インビボで)ターゲット
化用にキャリア結合形として用いることができる。この点に関するキャリアの例
としては、様々な医薬、静細胞剤及びホルモンがある。特に重要なターゲット化
用途は、人工、合成及びサブユニットワクチンを免疫能力細胞に向けることであ
る。
更に、本発明の化合物は細胞膜上のブロックレセプターにも用いることができ、
その性質によって腎臓、肝臓又は骨髄のような同種移植片をもつ患者の免疫抑制
のために上記化合物を′宵月化させているのである。
本発明の遊離形化合物において更に興味ある性質は、それがリンパ球活性化因子
(LAF)として挙動し、細胞の有糸分裂を誘導させ、もって本化合物が強いア
ジュバント活性を有する二とである。
本発明のもう1つの面において、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応す
る下記ポリペプチド及びその一部からなる群より選択される少なくとも1種のペ
プチド配列から主に構成される人工百日咳毒素抗原が提供される:
H−Xl−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro
−Tyr−Thr−Scr−Arg−Arg−9er−Val−Ala−8er
−X2−Y上記式中、Xl及びX2は各々任意のカップ1ルグ促進アミノ酸残基
を表し、かつYは−OH又は−NHっを表す。
本発明のポリペプチドは、動物体内で天然毒素と反応する抗体を誘導することが
できる。したがって、それは抗原と考えられる。抗原であるとした場合、本発明
のポリペプチドは、天然百日咳毒素と反応する抗体をそれ自体で誘導しつる更に
短いペプチド配列を含んでいてもよい。本発明において天然百日咳毒素により誘
導される抗体と反応する人工百日咳毒素抗原は、たとえそれがいくつかのかかる
短鎖ペプチド配列を含むことが好ましいとしても、キャリアと一緒に本発明のポ
リペプチドの一部分としてこのような短鎖ペプチド配列を必ずしも2以上含んで
いる必要はない。
“人工百日咳毒素抗原°という表現は、それが本明細書及び添付の請求の範囲で
用いられている場合に、人工的方法で産生される、即ち人間の活動から離れた自
然原因によらず人間の努力で得られる百日咳毒素抗原を含んだ意味である。本発
明の人工百日咳毒素抗原から構成される又はそれから部分的に構成されるペプチ
ド配列がそれ自体公知の固相技術に従い化学的に合成されたとしても、上記ペプ
チド配列はいくつかの他の技術、例えば液相中公知の方法で1つのアミノ酸を次
のものとカップリングさせる合成、分解、クローニング等を用いて産生ずること
もできるのであって、“人工°という表現はこのようないかなる技術によって産
生された産物であっても含む意味である。
“含む(含有する)゛という用語は、本明細書及び添付の請求の範囲において、
ある物が含まれていることを示すために用いられているが、但しある物とは必ず
しも唯一の物でなくてよい。
“天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応するペプチド配列2に関連した“
から主に構成される2という表現は、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反
応する人工百日咳毒素抗原の能力が上記ペプチド配列に由来することを示すため
に用いられている。
“キャリア゛という用語は広義に解釈されるべきであって、キャリアとは問題の
ペプチドが共有結合、イオン結合、水素結合又は疎水結合のような物理的/化学
的相互作用によって結合されうるのであればいかなるものであってもよい。この
ようなキャリアの例としては、例えば水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム等
のような無機キャリア、例えばマイクロプレート、ビーズ等のようなプラスチッ
ク表面、脂質、リポソーム、炭水化物、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質があ
る。
本発明の更にもう1つの面として、生物学的液体サンプル中において天然百日咳
毒素により誘導される抗体測定用の診断免疫アッセイ用キットが提供される。本
キットは、本発明に従い天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する人工抗
原から選択される少なくとも1種の抗原を診断抗原として含んでいる。天然百日
咳毒素により誘導される抗体測定用の免疫アッセイに応じて、キットは、他の適
切な試薬、例えば上記診断抗原がカップリングされるキャリア、陽性標準血清サ
ンプル、陰性標準血清サンプル、酵素複合体、例えばアルカリホスファターゼも
しくはペルオキシダーゼ、酵素複合体用の基質、例えばp−ニトロフェニルホス
フェート、寒天もしくはアガロースゲル、放射性同位元素標識抗原、緩衝液及び
/又は洗浄液を含んでいてもよい。場合により、キット中のすべての試薬は、特
定の標識でマークされた別個の密封試験管又はバイアル中に含まれる。
生物学的液体サンプルは、動物、例えばヒトからの鼻咽腔分泌物、唾液、血液又
は血清サンプルである二とが好ましい。
本発明のキットで利用可能な免疫アッセイの例としては、ELISA(酵素結合
免疫吸着アッセイ)、免疫拡散、放射線免疫アッセイ(RI A)及び免疫電気
泳動(IE)がある。
ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)が用いられる場合、本発明のキットは
:
a)本発明の診断抗原
b)場合により、上記診断抗原用のキャリアC)場合により、陽性標準血清サン
プルd)場合により、陰性標準血清サンプルe)酵素複合体
f)場合により、上記酵素複合体用の基質g)場合により、緩衝液、及び
h)場合により、洗浄液
を含む。
免疫拡散又は免疫電気泳動(IE)が用いられる場合、本発明のキットはe)及
びf)を除きELISAの場合と同様のものを含む。代わりに、寒天又はアガロ
ースゲルのようなゲルが必要とされるが、但しこのようなゲルは普通入手可能で
あることからキット中には通常含まれない。
放射線免疫アッセイ(RIA)が用いられる場合、本発明のキットはe)及びf
)を除きELISAの場合と同様のものを含むが、但し代わりに放射性同位元素
標忠抗原が用いられる。場合により、トリクロロ酢酸又は二次抗体のような、抗
体に結合した放射性同位元素標鷹抗原の沈降用溶液を含めてもよい。
本発明のもう一つの面では、免疫成分として、好ましくは百日咳疾患から患者を
保護するために有効な量で、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する本
発明の人工百日咳毒素抗原から選択される少なくとも1種の抗原並びに無毒性の
薬学上許容されるキャリア及び/又は希釈剤を含有したワクチン組成物が提供さ
れる。キャリアとは本明細書中で前記のように規定されたキャリアであり、希釈
剤は塩水溶液のような当業界で用いられる慣用的希釈剤でよい。本発明のワクチ
ン組成物は、上記量の抗原と共に、百日咳疾患から患者を保護するために有効な
量で抗原アジュバントを更に含有していてもよい。
ヒト用ワクチンで通常用いられるアジュバントの例は、問題の抗原が吸着される
例えばカルシウム又はアルミニウムのリン酸塩又は水酸化物のようないわゆる無
機キャリアである。常用される獣医学用ワクチンアジュバントの例は、フロイン
ト完全アジュバントである。ワクチン組成物は適宜緩衝剤及び/又は保存剤を更
に含Hしていてもよく、適切な緩衝剤及び保存剤は例えばUS薬局方で開示され
ている。
本発明の更にもう一つの面では、患者の特異的抗体力価に関して免疫学的皮膚反
応を生じさせるために有効な量で本発明による天然百日咳毒素により誘導される
抗体と反応する人工百日咳毒素抗原から選択される少なくとも1種の抗原並びに
無毒性の薬学上許容されるキャリア及び/又は希釈剤を含有した変向皮膚試験用
組成物が提供される。本発明の皮膚試験用組成物は、適宜緩衝剤及び/又は保存
剤を更に含有していてもよい。
有用なキャリア、希釈剤、緩衝剤及び保存剤については、本明細書中前記で規定
されている。
本発明によるペプチドの合成
本発明によるペプチドの固相〔メリフィールド(Merrj field))合
成は常法に従いアミノ酸を互いにカップリングさせることにより行われたが、そ
れによりペプチド結合が形成され、即ち最初のアミノ酸のC末端が結合された固
相(樹脂)から開始し、しかる後次のアミノ酸のC末端が最初のアミノ酸のN末
端にカップリングされる。最後に、組み立てられたペプチドが固相から放出され
る。
詳しくは、下記ペプチドが合成された:)1−Lys−G l n−Th r−
A rg−A I a−As n−Pro−A s n−P ro−Ty r−
Th r−Se r−A rg−A rg−Ser−Va I −A l a−
9er−OHペプチド断片の合成は、バイオサーチ・サム・ツー(Bjosea
rch Saw Two) Cノくイオサーチ社(Biosearch。
Inc、) 、カリフォルニア州USA)ペプチド合成機を用いてt−BOCア
ミノ酸に関するバイオサーチペプチド合成オートメーションソフトウェアのバー
ジョン2.38に従い実施された。標準(欠失)カップリング定数が、出発物質
1gについて適用された(置換度−0、33meq/ g ) 。
ペプチド合成のために用いられた樹脂は標準メリフィールド樹脂であった。適切
な保護アミノ酸は下記のとおりであった:
紅−^1 a−0)I Boc−Arf(
Tos)−OH(Boc(、−アラニン)
(a−Boe−N−トシル−L−アルギニン)Boc−Asn−O)l
’ Boc−Gln−OH
(Boc−L−アスパラギン) (Boc
−L−グルタミン)Boc−Lys(CL−Z)−08Boc−Pro−OH(
Boc−e−o−クロロペンジルオキシ力ルポニノL−L−リジン) (Bo
c−L−プロリン)Boc−8er (Bz l )−OHBoc−Th r
(Bz l )−OH(Boc−0−ベンジル−し−セリン)
(Bocヘトクンジル−L−)レオニン)アミノ酸濃度、溶媒容
量、反応時間等に関する詳細について、製造者(バイオサーチ)の推薦は下記の
とおりであった。
詳しくは、下記で掲載の化学物質が合成ペプチドの合成、開裂及び精製に用いら
れた。
物 質 グレード 供給者アセチルイミダ
ゾール p、 a、 アルドリッチ(Aldrj
ch)ジメチルホルムアミド p、 a、 フ
ル力(Fluka)ジイソプロピルエチルアミン ニンヒドリンIg/l
アルドリッチしかる後KOH5g/l
から二重蒸留:最初の
10%蒸留液廃棄
ヒドロキシベンジルトリアゾール p、 a、 アルドリ
ッチ塩化メチレン HPLCフイソンズ(Fisons)
(UK)ニンヒドリン p、 a、
アルドリッチ水酸化カリウム p、 a。
t−Bocアミノ酸 ベーチニム(Ba
ehem)フッ化水素
AGAレゾルシノール
ジメチルスルフィド
ヒドロキシベンジルトリアゾール p、 a、 (合成) アルドリ
ッチトリフルオロ酢酸 セファナル アルドリッチ
(sequana+) (HPLC)
アセトニトリル HPLCラスバーン(Rathburn)
酢酸 p、 a、 メルク(Mc
rck)ジエチルエーテル フル力完
成した樹脂結合ペプチドは合成室から取り出され、メタノールで洗浄され、真空
下で一定重量まで乾燥された。
樹脂支持体からのペプチドの開裂
洗浄及び乾燥された樹脂結合ペプチドの一部(0,5g)をレゾルシノール1g
1ジメチルスルフイド6.5ml及びポリテトラフルオロエチレン(pTFE)
被覆マグネット含有円筒形PTFE室に移した。室をドライアイス−エタノール
浴で一80℃に冷却した。次いで、フッ化水素酸(HF)(最終容量10m1)
を室に入れ、しかる後磁気スターラー上0℃で120分間維持した。次いで、酸
を水アスピレータ−で除去した。室を再度−80℃に冷却し、HF10m1を室
に入れ、磁気スターシー上に0℃で45分間装いた。酸を再度水アスピレータ−
で除去し、残留混合物を焼結ガラスフィルターに移した。次いで、樹脂/ペプチ
ド混合物を10%(v / v )酢酸100m1でしかる後ジエチルエーテル
50m1で洗浄した。酢酸洗液も分液ロート中ジエチルエーテル50m1で洗浄
し、エーテル相を水相から除去した。次いで、プールされたエーテル洗液及び酢
酸洗液を各々蒸発、凍結乾燥させて、ペプチド生成物を回収した。ペプチドは水
相のみから回収した。
粗生成物をデシケータ−内のガラスバイアル中室温で貯蔵した。
合成ペプチドの精製
粗合成生成物の様々な成分は、移動相としてアセトニトリル/H20(0,1%
v / v )リフルオロ酢酸(TFA))を用いた逆相C−18シリカ高圧ク
ロマトグラフイーカラムにそれらを適用することにより分離された。粗ペプチド
208 g 〜100 mgをH2O(0,1%TFA)1m1以内に溶解し、
遠心分離し、レオダイン(Rheodyne) (カリフォルニア州、USA)
)fPLcインジェクターの1mlループ中に注入した。溶液を2152勾配コ
ントローラー及び2つの2150HPLCポンプ(LKB、スウェーデン)によ
り注文バック化10X500 mmオリゴシル(0目gos i l )逆相C
−18カラム〔スカンジナビス力・ゲネテック(Skan+Hnaviska
Genetec) 。
スウェーデン〕中にポンプ導入した。勾配は、60分間にわたり0〜100%ア
セトニトリルで直線的であった。
流速は2ml/winであった。合成生成物の溶出は、LK82131可変波長
吸収モニターを用いて206〜238naでモニターされた。両分を手で集め、
必要であれば関連画分の凍結乾燥、再溶解及びクロマトグラフィー操作の繰返し
により再精製した。最終生成物を凍結乾燥し、ガラスバイアル中−20℃で貯蔵
した。
免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製
前記合成ペプチドは、ELISAで用いられるペプチド抗原(コーティング抗原
)を形成させるために、下記方法でキャリア、即ち牛血清アルブミン(BSA)
にカップリングさせた。
ペプチド1mg及びB5A3.6mg8pH7,4のリン酸緩衝液(PBS)2
.0mlに溶解した。
この溶液に、2.5%(W/V)グルタルジアルデヒド水溶液30μgを加えた
。
反応混合物を室温(20〜25℃)で1時間インキュベートし、5Mエタノール
アミン水溶液0.5mlの添加により反応停止させ、しかる後+4℃で4時間P
BSIgに対して透析し、30分間後及び2時間後に透析液を交換した。
次いで、透析バックの内容物をPBSで平衡化されたセファクリル■(Seph
acryl) S −300ゲル〔ファルマシア(Pharmacia) 、
ウプサラ、スウェーデン〕含有カラム(2,5X60■)に通してゲル濾過した
。3.Om1画分を集めた。
カップリング物質含有画分をプールし、プールされた物質をコーティング抗原と
してEL I SAで用い、事前に希釈することなく直接マイクロプレートに加
えた。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)以下は、ELISAの一般的説明であ
る。複合体及び複合体の希釈、並びにマイクロプレート読取り前の経過時間は、
様々なアッセイ毎に異なっている。差異は一般的説明の後に示されている。
ELISAの一般的説明
装fi:
微量滴定プレート〔ダイナチック(Dynatech) 。
aod、nr129B) ;
マイクロプレートコーティング用抗原(例えば、ペプチド及びタンパク質);
コーティング用緩衝液ニリン酸緩衝液(PBS);インキニベート用緩衝液:P
BS十0.059=ツイーン(Tween) 20 (v/v) ;水
性洗浄液:0.9%NaC1+0.05%ツイーン20;
血清(例えば、ヒト及び動物参照並びに試験血清):複合体〔例えば、アルカリ
ホスファターゼ複合化ブタ抗ヒトIgG抗体(オリオン・ジアグノスチカ(Or
ionDlagnostfca))及びヤギ抗つサギIg抗体(シグマ(Sig
ma))) ;
酵素基!:pニル−ニトロフェニルホスフェート(シグマ)、基質緩衝液く下記
参照) 1 a+g/ml ;基質緩衝液:pH9,8の1M水性ジェタノール
アミンピペット及び試験管;
操作:
1、マイクロプレートのコーティング
マイクロプレートを室温(20〜25℃)で−夜PBS中抗原0.1mlと共に
インキュベートした。
2、牛血清アルブミン(BSA)及び血清とのインキュベート
プレートを4回洗浄し、しかる後37℃で1時間PBS中1%(w、/ v)
B S A 0. 1 mlと共にインキュベートした。洗浄後、インキュベー
ト用緩衝液で適宜希釈された血清0.1mlをウェルに加え、プレートを室温で
1時間インキュベートした。
3、複合体とのインキュベート
洗浄後、インキュベート用緩衝液で適宜希釈された複合体0.1mlをウェルに
加え、プレートを室温で2時間インキュベートした。
4、洗浄後、酵素基質溶液0.1mlをウェルに加えた。
プレートを室温に保ち、405niの吸光度を下記時間の後で読取った。
EL I SAの具体的な説明
酵素結合免疫吸着アッセイ:
合成ペプチド及びウサギもしくはヒト血清中の抗体間の反応、又は合成ペプチド
及び複合体のみ間の反応を測定するための酵素結合免疫吸着アッセイ(ELIS
A)ELISAにおいてコーティング用抗原として用いられるペプチドを最初に
“免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製゛で記載されているように処理した。血清
サンプルは、2匹の異なるウサギ(ウサギ1及びウサギ2)から、ヒト1例(ヒ
ト1)から及び別人(ヒト2)のヒト血清プールからのものであった。血清は1
1500希釈で使用した。用いられた複合体は、11500希釈されたアルカリ
ホスファターゼヤギ抗つサギIg複合体(シグマ)又は1/100希釈されたア
ルカリホスファターゼブタ抗ヒトIg複合体(オリオン・ジアグノスチ力)であ
った。
プレートは自動ELISAリーダー〔タイターチック(Tltertek)、マ
ルチスキャン(Multiscan) )で下記時間に読取った。
結果は下記のとおりである:
血清 複合体 プレート読取り4050αの吸光度ウサギ1 ヤギ抗ウ
サギ 3分間後 1.21ウサギ2 ヤギ抗ウサギ 3分間後 1,0
5ヒト1 ブタ抗ヒト 20分間後 1.11ヒト2 ブタ抗ヒト
20分間後 1.26なし ヤギ抗ウサギ 5分間後 1,23なし
ブタ抗ヒト 13分間後 0.84すべての場合で上記結果が陽性反
応を示したことから、これらのデータは合成ペプチドが、ウサギ及びヒト双方の
血清、即ちこの後者の場合では1例(ヒト1)からの血清及びヒト血清のプール
(ヒト2)と及び/又は用いられたアルカリホスファターゼヤギ抗つサギ1g複
合体及びアルカリホスファターゼブタ抗ヒトIgG複合体の各々の場合に反応す
ることを支持している。
合成されたペプチドが各複合体と反応しかつ結合することは、ペプチドと結合し
うる複合体単独の能力によって更に示される。この結合性がペプチドとこれら複
合体中のアルカリホスファターゼとの相互作用によるものでい同様の実験で立証
された。
ヒトIgGに対する合成ペプチドの特異的結合性ヒトIgGと特異的に結合しう
る合成ペプチドの能力を下記実験で更に示した。
合成ペプチド(0,5mg)をセファ0−ス(Sepharoseo) 4 B
()7ルマシ乙 ウプサラ、スウニーデン)カラムに供した。CNBr活性化
セファロース4Bゲル(10ml)を予め室温で一夜かけて過剰のヒトIgG(
800mg)と反応させ、共有結合によりIgGを固定した。ヒトIg0150
agがゲルマトリックスと共有結合していることが判明した。
合成ペプチドの約85%は留まっており、即ち4℃及び25℃においてPBS中
pH7,2で二のカラムに結合していた。カラムに結合しなかった合成ペプチド
はほとんど汚染物質、即ち他の配列のペプチドを含んでいるよってあるが、これ
はペプチドがメリフィールドに従い合成された場合に生じることが周知である。
カラムでセファロース4Bゲル(10ml)を用いt二だけのコントロール実験
では、CNBr活性化部位を室温で一夜かけてエタノールアミン(I Mエタノ
ールアミン2ml+PB510ml)でブロックした。
次いで、合成ペプチド(0,5mg)をカラムに供し、カラムにPBSを注いだ
。すべての合成ペプチドが溶出液から回収された。
よって、ペプチドは、セファ0−ス4Bゲルに結合したヒトIgGには結合した
が、セファロース4B自体とは結合しなかった。
このようなカラム(即ち、ヒトIgGセファロース4B)を用いれば、活性ペプ
チドを不活性ペプチドから分別することが可能である。
活性ペプチド画分は、1%(V/V)水性酢酸の添加によりカラムから溶出され
る。こうして溶出されたペプチドは、pH7,2に戻された後再度同−のカラム
に結合することが示された。
一緒に行われたこれらの実験では更に、合成ペプチドが上記ELISA実験で実
際にヒ)IgGと結合したことを支持している。
この実験では、本発明の合成ペプチドがリンパ球又は胸腺細胞増殖活性を示すこ
とが判明したが、これは周知の分裂促進剤、即ち植物性血球凝集素により示され
る場合に匹敵する。
アッセイで用いられる物質及び装備
培地: 90mlRPMl [フロー・ラボラトリーズ(FlobLabor
atories) )
10ml牛血清アルブミン(シグマ、USA)2mlL−グルタミン水溶液14
.6g/N (シグマ、USA)
1mlピルビン酸ナトリウム(100mM)[ギブコ・リミテッド(Gibco
Lim1ted、UK))1mlペニシリン−ストレプトマイシン(10,0
00単位/m1)(ギブコ・リミテッド)
分裂促進剤:植物性血球凝集素、PHA HA16211g/m!H,;、0
ウェルカム診断
(メチル、 1”、2°−3H)チミジン: 4.44BQ/nmol、120
Cj/1iol Cアマ−ジャム・インターナショナル公社(Amersha
m International pie)、UK)ガス:4%CO2含有空気
、グランドガスBスタンド(Grundgas B−stand)OT C−2
0(A G A、スウェーデン)
遠心機:IEC臨床遠心機603B
クリメート・チャンバー(climate chamber) :WEDCO
インコーポレーテッド(Inc、orporated)E Z −17MM
インキュベートプレート: NUNCLONデルタ、インターメト、デンマーク
細胞ハーベスター:ダイナチック<Ds・natcch)、オートマツシュ(A
ut、oaash) 2000シンチレーションカウンター:ベックマン(Be
ckman)LS−100C液体シンチレーションシステムシンチレーシジン液
体ニオブチフェースM P (OpLiPhaseHP)、LKBプロダクター
(LKB produkLer)、すべての操作は無菌条件下で行われた。
膵臓をNkiRIマウスから除去し、室温で培地5ml中に置いた。次いで、膵
臓を100メツシユワイヤーネツトでホモゲナイズした。ホモゲネートを2分間
静置し、懸濁液を沈降物からデカントし、しかる後細胞を1220rpc+で8
分間遠心分離した。上澄を捨て、細胞を再度培地5mlに懸濁しかつ1220r
pmで8分間遠心分離することによりもう一度洗浄した。上澄を拮で、細胞を培
地5mlに懸濁した。細胞を1/100希釈し、ビニールカー(Bi;rker
)チャンバー内でカウントし、しかる後最終濃度5X10’細胞/ mlまで希
釈した。
インキュベートプレート中の外側列ウェルはサンプル用に用いなかったが、但し
安定温度ゾーンを形成させるために培地200μgで充填した。“陰性°コント
ロールは12ウエル/プレートに入れられたが、培地100μg及び細胞懸濁液
100μgからなっていた。サンプル100μgは新しいプレートに入れ、】:
2連続希釈がプレートの残りのウェルで行われた。サンプルについて少なくとも
3回の反復試験が行われた。参照(コントロール)として、分裂促進剤の植物性
血球凝集素(PHA)を用いた。別のウェルに、各々3回にわたり培地中PHA
2.5μg、5μg及び7μg並びに培地中本発明の合成ペプチド1μg及び1
0μgを加えた。
プレートを底部に蒸留水があるデシケータ−中に置き、しかる後デシケータ−内
の空気を上記ガスで2分間交換した。蓋をデシケータ−上に置き、しかる後デシ
ケータ−をクリメートチャンバー内に置き、37℃、湿度37%で48時間イン
キュベートした。インキニベート後、3H−チミジン25μgを各ウェル(0,
010μCi/ウエル)に加え、プレートをクリメートチャンバー内で更に16
時間インキュベートした。
次いで、ウェルを細胞ハーベスタ−で定量的に回収し、試験サンプルを濾紙で集
めた。細胞の完全回収を確保するために、ウェルを0.9%(W/V)塩化ナト
リウム水溶液で3回洗浄した。こうして濾紙で回収された細胞を押しつぶし、シ
ンチレーションバイアルに入れた。シンチレーション液体6mlを各バイアルに
加えた。バイアルを攪拌し、シンチレーションカウンターによる5 win/バ
イアルの放射能測定前に15分間放置させた。
結果:
添加物 cpm(実験3回の範囲)分裂促進剤なし 6
00− 870PHA2.5μg 6700− 8100PHA5μ
g 980(1−10400PHA7μg 70
00− 8100本発明のペプチド:
1Hg 8000−420010μg 70
00− 8500上記結果は、本発明の合成ペプチドが周知の分裂促進剤PHA
で示される場合と同様・の胸腺細胞増殖活性を6することを、明らかに示してい
る。
合成ペプチドによる免疫
本発明の合成ペプチドによるマウスの免疫感作で特異的に誘導される抗体及び天
然毒素間の反応を測定するための酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)。
マウス免疫用抗原として用いられるペプチドを最初に“免疫アッセイ用ペプチド
抗原の作製′において記載されたように処理した。
マウス(NMRI)のグループに、キャリアとして水酸化アルミニウムを用い、
1か刃間隔でベブ、チド抗原0.5mlを3回皮下免疫した。血清サンプルを投
与3回目の2か月後に集めた。ELISA用マイクロプレートを濃度1μg /
m+で精製百日咳毒素によりコーティングした。ゼラチン(1%)をBSAの
代わりに非特異的結合を阻止するため用いた(“ELISAの一般的説明′参照
)。血清の終点力価は、カットオフされる0、1の吸光度値を用いて、1/20
希釈から出発し2倍希釈で10回まで測定した。用いられた複合体は11500
希釈されたヤギ抗マウスIgG?ji合体(シグマ)であった。
プレートは自動EL I SAリーダー(タイターチック。
アッセイ結果は下記のとおりであった:随 応答数 平均力価 範囲
合成ペプチド 17 15 2334 320−40960コントロール 1
2 0 67 20−160本発明の合成ペプチドが免疫感作により抗
体を誘導しうろことは上記結果から明らかであり、免疫接種前サンプルの場合よ
りも免疫接種後サンプルの場合に明らかに高い吸光度を有している。したがって
、試験されたペプチドは抗原として機能し、百日咳毒素に対する抗体を誘導する
。
結果として、毒素は、マウス由来の免疫接種後血清サンプル中において合成ペプ
チドにより誘導された抗体と特異的に結合することが確認される。
更に、同一のマウスは精製百日咳fs 素(20μg/マウスーs X L D
so)で侵襲され、生存平均日数が終点力価との関係で調べられた。
表
マウス数 生存日数(平均) 終点力価17 3.765
80−4096015 4.000 320−
4096014 3.929 840−409608
4.875 2580−409606 5.33
3 5120−409803 B、333 1
0240−40960上記表から明らかなように、平均生存時間は終点方何の増
加と共に増加している。したがって、高力画の抗体を有するマウスは侵襲に対し
て部分的に保護される。
補装置の翻訳文提出!F(特許法第184条の8)平成 1 年 6 月ニジー
日
特許庁長官 吉 1)文 毅 殿
1、 特許出願の表示
PCT/SE 87100619
2、発明の名称
新規ポリペプチド及びその用途
3、特許出願人
住 所 スエーデン国ソレントウナ、アスブベーゲン、1ア一名 称 ト
リオン、フオルスクニングーオホ、ウトベクリングス、アクチェボラーグ
4、代理人
(郵便番号100)
東京都千代田区丸の内三丁目2番3号
5、 11[i正置の提出年月日
1989年4月18日
6、 添付書類の目録
(1) 補装置の翻訳文 1 通請求の範
囲
1、 下記式のポリペプチド:
)!−X’ −Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−P
ro−Tyr−Thr−9er−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−S
er−X2−Y〔上記式中、X 及びX2は各々任意のカップリング促2、 複
合糖質との結合能をもつ遊離又はキャリア結合形の人工化合物であって、
下記式のポリペプチド:
H−X’ −Gln−Thr−^rg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pr
o−Tyr−Thr−8er−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−3e
r−X2−Y〔上記式中、Xl及びX2は各々任意のカップリング促進アミノ酸
残基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す〕並びにその機能性アナログ及
び機能性誘導体(水溶液中における上記ポリペプチドの結合コンホメーションと
本質的に対応した少なくとも1種のコンホメーションを含む)からなる群より選
択されることを特徴とする人工化合物。
3、 免疫グロブリンとの結合能をもつ遊離又はキャリア結合形の人工化合物で
あって、
下記式のポリペプチド:
H−X’ −Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pr
o−Tyr−Thr−Ser−A rg−^rg−Ser−Val−Ala−8
er−X2−Y〔上記式中、Xl及びX−は各々任意のカップリング促進アミノ
酸残基を表し、かつYは一〇H又は−NH2を表す〕並びにその機能性アナログ
及び機能性誘導体(水溶液中におjする上記ポリペプチドの結合コンホメーショ
ンと本質的に対応した少なくとも1種のコンホメーションを含む)からなる群よ
り選択されることを特徴とする人工化合物。
4、 天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する下記ポリペプチド:
H−Xl−Gin−Thr−^rg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro
−Tyr−Thr−8cr−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−3er
−X” −Y〔上記式中、Xl及びX−は各々任意のカップリング促進アミノ酸
残基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す〕及びその一部からなる群より
選択される少なくとも1種のペプチド配列から主に構成されることを特徴とする
人工百日咳毒素抗原。
5、 生物学的液体サンプル中において天然百日咳毒素により誘導された抗体測
定用の診断免疫アッセイ用キットであって、
天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する下記ポリペプチド:
H−Xl−Gin−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro
−Tyr−Thr−9er−A rg−^rg−9er−Val−^1a−Se
r−X2−Y〔上記式中、Xl及びX−は各々任意のカップリング促進アミノ酸
残基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す〕及びその一部からなる群より
選択される少な(とも1種のペプチド配列から主に構成される人工抗原から選択
される少なくとも1種の抗原を診断抗原として含むことを特徴とする診断免疫ア
ッセイ用キット。
6、 診断抗原が結合されたキャリア:陽性標準血清サンプル;
陰性標準血清サンプル;及び
場合により、緩衝液及び/又は洗浄液;を更に含む、請求の範囲第5項に記載の
診断免疫アッセイ用キット。
7、 寒天もしくはアガロースゲル、又は放射性同位元素標識抗原、又は酵素複
合体及び場合により酵素複合体用の基質を更に含む、請求の範囲第6項に記載の
診断免疫アッセイ用キット。
8、 免疫成分として、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する下記ポ
リペプチド:H−が−〇 I n−Th r−A rg−A I a−As n
−P ro−As n−Pro−Ty r−Th r−9e r−Arg−Ar
g−8er−Val−Ala−9er−X2−Y〔上記式中、X 及びX2は各
々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつYは−OH又は−NHっを
表す〕及びその一部からなる群より選択される少なくとも1種のペプチド配列か
ら主に構成される人工百日咳毒素抗原から選択される少なくとも1種の抗原を無
毒性の薬学上許容されるキャリア及び/又は希釈剤と共に含むことを特徴とする
ワクチン組成物。
9、 百日咳疾患から患者を保護するために6効な二で百日咳毒素抗原を含む、
請求の範囲第8項に記載のワクチン組成物。
10、 所定量の百日咳毒素抗原と共に、百1]咳疾患から患者を保護するた
めに有効な量で抗原アジュバントを更に含む、請求の範囲第8項に記載のワクチ
ン組成物。
11、緩衝剤及び/又は保存剤を更に含む、請求の範囲第8.9項又は10項に
記載のワクチン組成物。
12、 患者に特定抗体力価で免疫皮膚反応を生じさせるために有効な量で少
なくとも1種の抗原〔この抗原は、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応
する下記ポリペプチド:
)1−X’ −Gin−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−P
ro−Tyr−Thr−3cr−Arg−Arg−Ser−Vat−Ala−S
er−X2−Y(上記式中、Xl及びX−は各々任意のカップリング促進アミノ
酸残基を表し、かつYは一○H又は−NHっを表す)及びその一部からなる群よ
り選択される少なくとも1種のペプチド配列から主に構成される人工百日咳毒素
抗原から選択される〕を無毒性の薬学上許容されるキャリア及び/又は希釈剤と
共に含むことを特徴とする皮肉皮膚試験用組成物。
13、 緩衝剤及び/又は保存剤を更に含む、請求の範囲第12項に記載の皮
肉皮膚試験用組成物。
国際調査報告
い1.−、、ゆ9,11.□、5□、、1111..PCT/S[871006
19−一1−m−1^11−6−−be、PCT/SE8)100619
Claims (13)
- 1.下記式のポリペプチド: H−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro −Tyr−Thr−Sor−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser −X2−Y〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進アミノ酸残 基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す〕。
- 2.複合糖質との結合能をもつ遊離又はキャリア結合形の人工化合物であって、 下記式のポリペプチド: H−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro −Tyr−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser −X2−Y〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進アミノ酸残 基を表し、かつYは・OH又は・NH2を表す〕並びにその機能性アナログ及び 機能性誘導体からなる群より選択されることを特徴とする人工化合物。
- 3.免疫グロブリンとの結合能をもつ遊離又はキャリア結合形の人工化合物であ って、 下記式のペプチド: H−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro −Tyr−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser −X2−Y〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進アミノ酸残 基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す〕並びにその機能性アナログ及び 機能性誘導体からなる群より選択されることを特徴とする人工化合物。
- 4.天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する下記ポリペプチド: H−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro −Tyr−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser −X2−Y〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進アミノ酸残 基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す〕及びその一部からなる群より選 択される少なくとも1種のペプチド配列から主に構成されることを特徴とする人 工百日咳毒素抗原。
- 5.生物学的液体サンプル中において天然百日咳毒素により誘導された抗体測定 用の診断免疫アッセイ用キットであって、 天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する下記ポリペプチド: H−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro −Tyr−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser −X2−Y〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進アミノ酸残 基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す〕及びその一部からなる群より選 択される少なくとも1種のペプチド配列から主に構成される人工抗原から選択さ れる少なくとも1種の抗原を診断抗原として含むことを特徴とする診断免疫アッ セイ用キット。
- 6.診断抗原が結合されたキャリア; 陽性標準血清サンプル; 陰性標準血清サンプル;及び 場合により、緩衝液及び/又は洗浄液;を更に含む、請求の範囲第5項に記載の 診断免疫アッセイ用キット。
- 7.寒天もしくはアガロースゲル、又は放射性同位元素標識抗原、又は酵素複合 体及び場合により酵素複合体用の基質を更に含む、請求の範囲第6項に記載の診 断免疫アッセイ用キット。
- 8.免疫成分として、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する下記ポリ ペプチド;H−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−As n−Pro−Tyr−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Al a−Ser−X2−Y〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進 アミノ酸残基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す〕及びその一部からな る群より選択される少なくとも1種のペプチド配列から主に構成される人工百日 咳毒素抗原から選択される少なくとも1種の抗原を無毒性の薬学上許容されるキ ャリア及び/又は希釈剤と共に含むことを特徴とするワクチン組成物。
- 9.百日咳疾患から患者を保護するために有効な量で百日咳毒素抗原を含む、請 求の範囲第8項に記載のワクチン組成物。
- 10.所定量の百日咳毒素抗原と共に、百日咳疾患から患者を保護するために有 効な量で抗原アジュバントを更に含む、請求の範囲第8項に記載のワクチン組成 物。
- 11.緩衝剤及び/又は保存剤を更に含む、請求の範囲第8、9項又は10項に 記載のワクチン組成物。
- 12.愚考に特定抗体力価で免疫皮膚反応を生じさせるために有効な量で少なく とも1種の抗原〔この抗原は、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する 下記ポリペプチド; H−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro −Tyr−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser −X2−Y(上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進アミノ酸残 基を表し、かつYは−OH又は−NH2を表す)及びその一部からなる群より選 択される少なくとも1種のペプチド配列から主に構成される人工百日咳毒素抗原 から選択される〕を無毒性の薬学上許容されるキャリア及び/又は希釈剤と共に 含むことを特徴とする皮内皮膚試験用組成物。
- 13.緩衝剤及び/又は保存剤を更に含む、請求の範囲第12項に記載の皮内皮 膚試験用組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8605513-4 | 1986-12-22 | ||
SE8605513A SE468716B (sv) | 1986-12-22 | 1986-12-22 | Ny peptid och immunologiskt aktiva foereningar |
SE8700761-3 | 1987-02-24 | ||
SE8700761A SE457353B (sv) | 1986-12-22 | 1987-02-24 | Pertussistoxinantigen jaemte immunanalystestsats, vaccinkomposition och intradermal hudtestkomposition med naemnda antigen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02502632A true JPH02502632A (ja) | 1990-08-23 |
JP2635742B2 JP2635742B2 (ja) | 1997-07-30 |
Family
ID=26659639
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63500766A Expired - Lifetime JP2635742B2 (ja) | 1986-12-22 | 1987-12-21 | 新規ポリペプチド及びその用途 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5283321A (ja) |
EP (1) | EP0279151B1 (ja) |
JP (1) | JP2635742B2 (ja) |
AU (1) | AU616649B2 (ja) |
DE (1) | DE3785664T2 (ja) |
FI (1) | FI892985A (ja) |
PT (1) | PT86423B (ja) |
WO (1) | WO1988004665A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005283380A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE455946B (sv) * | 1986-10-20 | 1988-08-22 | Trion Forskning & Utveckling | Nya pertussistoxin-polypeptider och antigener samt testsatser, vacciner och intradermala hudtestkompositioner |
EP0296765B1 (en) * | 1987-06-24 | 1994-06-08 | Teijin Limited | Bordetella pertussis variants |
US5000952A (en) * | 1988-08-02 | 1991-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford, Jr. University | Polypeptide pertussis toxin vaccine |
CA1340530C (en) * | 1989-04-28 | 1999-05-04 | Kok Kheong Lee | Synthetic pseudomonas aeruginosa pilin peptide and related vaccines and diagnostics |
IT1229766B (it) * | 1989-05-19 | 1991-09-10 | Sclavo Spa | Peptidi sintetici capaci di stimolare una immunita' t cellulare. |
WO1996007102A1 (en) * | 1994-09-01 | 1996-03-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Therapeutic remodeling in aids |
WO2000014547A1 (en) * | 1998-09-04 | 2000-03-16 | Powderject Research Limited | Immunodiagnostics using particle delivery methods |
US6027731A (en) * | 1998-11-17 | 2000-02-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Pertussis toxin induced lymphocytosis |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6019733B2 (ja) * | 1977-06-10 | 1985-05-17 | 科研製薬株式会社 | 蛋白質性活性物質 |
JPS5767591A (en) * | 1980-10-11 | 1982-04-24 | Kaken Pharmaceut Co Ltd | Protein element substance and its preparation |
JPS5767592A (en) * | 1980-10-11 | 1982-04-24 | Kaken Pharmaceut Co Ltd | Protein having reassociating properties and its preparation |
JPS58222032A (ja) * | 1982-06-18 | 1983-12-23 | Teijin Ltd | 百日咳毒素のサブユニツト蛋白 |
CA1213234A (en) * | 1983-03-30 | 1986-10-28 | Akihiro Ginnaga | Method for the production of ha fraction containing protective antigens of bordetella pertussis and pertussis vaccine |
FR2590483B1 (fr) * | 1985-11-22 | 1988-12-09 | Pasteur Institut | Antigenes purifies ayant des proprietes vaccinantes contre b. pertussis, moyens notamment adns recombinants pour les produire et compositions de vaccins les contenant |
CA1340373C (en) * | 1986-01-28 | 1999-02-02 | Rino Rappuoli | Cloning and sequencing of the dna fragment which codes for the five subunits of the pertussis toxin, a hybrid plasmid containing the dna fragment and micro-organisms transformed by the hybrid plasmid and capable of expressing all or some of the subunits of the pertussis toxin |
US4883761A (en) * | 1986-03-25 | 1989-11-28 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pertussis toxin gene: cloning and expression of protective antigen |
SE455946B (sv) * | 1986-10-20 | 1988-08-22 | Trion Forskning & Utveckling | Nya pertussistoxin-polypeptider och antigener samt testsatser, vacciner och intradermala hudtestkompositioner |
US5000952A (en) * | 1988-08-02 | 1991-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford, Jr. University | Polypeptide pertussis toxin vaccine |
-
1987
- 1987-12-21 PT PT86423A patent/PT86423B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-12-21 US US07/375,004 patent/US5283321A/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-12-21 JP JP63500766A patent/JP2635742B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-21 EP EP87850394A patent/EP0279151B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-21 AU AU10891/88A patent/AU616649B2/en not_active Ceased
- 1987-12-21 DE DE8787850394T patent/DE3785664T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-12-21 WO PCT/SE1987/000619 patent/WO1988004665A1/en active Application Filing
-
1989
- 1989-06-19 FI FI892985A patent/FI892985A/fi not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005283380A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5283321A (en) | 1994-02-01 |
AU1089188A (en) | 1988-07-15 |
JP2635742B2 (ja) | 1997-07-30 |
AU616649B2 (en) | 1991-11-07 |
DE3785664D1 (de) | 1993-06-03 |
PT86423B (pt) | 1990-11-20 |
FI892985A0 (fi) | 1989-06-19 |
EP0279151A1 (en) | 1988-08-24 |
FI892985A (fi) | 1989-06-19 |
DE3785664T2 (de) | 1993-08-12 |
PT86423A (en) | 1988-01-01 |
EP0279151B1 (en) | 1993-04-28 |
WO1988004665A1 (en) | 1988-06-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2624973B2 (ja) | エプスタイン・バーウイルス初期抗原(拡散)に関連する合成ポリペプチドおよび抗体 | |
Hodges et al. | Antigen-antibody interaction. Synthetic peptides define linear antigenic determinants recognized by monoclonal antibodies directed to the cytoplasmic carboxyl terminus of rhodopsin. | |
EP1879914B1 (en) | Ehrlichia canis diva (differentiate infected from vaccinated animals) antigens | |
US20040265935A1 (en) | Botulinum toxin a peptides and methods of predicting and reducing immunoresistance to botulinum toxin therapy | |
Sakata et al. | Immunochemistry of serum albumin. X. Five major antigenic sites of human serum albumin are extrapolated from bovine albumin and confirmed by synthetic peptides | |
Berzofsky et al. | Genetic control of the immune response to staphylococcal nuclease. III. Time-course and correlation between the response to native nuclease and the response to its polypeptide fragments. | |
JP3127996B2 (ja) | 合成老化細胞抗原 | |
Glenney Jr et al. | Comparison of spectrin isolated from erythroid and non‐erythroid sources | |
Dabo et al. | Bartonella henselae Pap31, an extracellular matrix adhesin, binds the fibronectin repeat III13 module | |
JPH02502632A (ja) | 新規ポリペプチド及びその用途 | |
Watts et al. | Mapping of the antigenic determinants of Pseudomonas aeruginosa PAK polar pili | |
FI109704B (fi) | CENP-B-epitooppi | |
WO1991008220A1 (en) | A method for the stepwise, controlled synthesis of chemical species, particularly peptides, coupled products obtained by the method and the use of these coupled products, e.g. as vaccines | |
JP2765902B2 (ja) | アポaiの定量のための診断法及び診断システム | |
Ball Jr et al. | Immunochemical studies of (Na++ K+)-ATPase using site-specific, synthetic peptide directed antibodies | |
Paterson | Delineation and conformational analysis of two synthetic peptide models of antigenic sites on rodent cytochrome | |
Young et al. | Isolation of antibodies specific to sickle hemoglobin by affinity chromatography using a synthetic peptide. | |
JP3245052B2 (ja) | I型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドに対する抗体およびそれを用いるアッセイ法 | |
JP2635641B2 (ja) | 新規ペプチド類及びその用途 | |
US5407833A (en) | Peptides of the SM-D antigen and their use for diagnosis of systemic lupus erythematosus | |
Scofield et al. | Anti-Ro fine specificity defined by multiple antigenic peptides identifies components of tertiary epitopes | |
PT676965E (pt) | Método para reduzir a imunogenicidade da região variável de anticorpos | |
Motte et al. | A two-site immunoradiometric assay for serum calcitonin using monoclonal anti-peptide antibodies | |
Tinsley et al. | Antibodies recognizing a variety of different structural motifs on meningococcal Lip antigen fail to demonstrate bactericidal activity | |
Prokopchuk et al. | One-way humoral immune cross-reactivity between bovine spinal cord protein and bovine myelin basic protein |