JPS58222032A - 百日咳毒素のサブユニツト蛋白 - Google Patents
百日咳毒素のサブユニツト蛋白Info
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- JPS58222032A JPS58222032A JP57103777A JP10377782A JPS58222032A JP S58222032 A JPS58222032 A JP S58222032A JP 57103777 A JP57103777 A JP 57103777A JP 10377782 A JP10377782 A JP 10377782A JP S58222032 A JPS58222032 A JP S58222032A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- activity
- subunit protein
- pertussal
- polyacrylamide gel
- gel electrophoresis
- Prior art date
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- Granted
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、百日咳毒素のサブユニット蛋白に関する。
更に詳しくは、本発明は、百日咳菌の培養液から分離・
精製される毒素、 ＬＰＦ −ＨＡ を、その構成要
素（サブユニット）に分離して得られるところの、６口
供感染防御抗原活性を有する蛋白、及びそれと組合せて
インスリン分泌促進−ｍ＋活性を発現しつる蛋白に関す
るものである。
精製される毒素、 ＬＰＦ −ＨＡ を、その構成要
素（サブユニット）に分離して得られるところの、６口
供感染防御抗原活性を有する蛋白、及びそれと組合せて
インスリン分泌促進−ｍ＋活性を発現しつる蛋白に関す
るものである。
６日１亥は、６口供蕗（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）の感染によっておこる伝染性疾患であり
、その予防のためにｉ’７ Ｂ １１４ワクチンが使用
されている（通虐はジフテリアと破傷風の予防も目的と
して三種混合ワクチンとして使用される）。しかし、百
日咳ワクチンは従来死菌全菌体ワクチンとしで使用され
ており、その有効性は十分に認められているものの、接
種局所の発赤、腫張、疼痛あるいは発熱、下痢、嘔吐、
−まれにはンヨンク症状尋の副作用も少なくないという
問題がある。
ｔｕｓｓｉｓ）の感染によっておこる伝染性疾患であり
、その予防のためにｉ’７ Ｂ １１４ワクチンが使用
されている（通虐はジフテリアと破傷風の予防も目的と
して三種混合ワクチンとして使用される）。しかし、百
日咳ワクチンは従来死菌全菌体ワクチンとしで使用され
ており、その有効性は十分に認められているものの、接
種局所の発赤、腫張、疼痛あるいは発熱、下痢、嘔吐、
−まれにはンヨンク症状尋の副作用も少なくないという
問題がある。
、そこで、かかる問題点を解決するために、精製ワクチ
ンすなわち百日咳防御抗原分画ワクチン（コンポーネン
トワクチン）の開発が試みられでいる（例えば、特公昭
５７−５２０３号、特開昭５７−５０９２５号参照）。
ンすなわち百日咳防御抗原分画ワクチン（コンポーネン
トワクチン）の開発が試みられでいる（例えば、特公昭
５７−５２０３号、特開昭５７−５０９２５号参照）。
ゴ口供菌の産生ずる毒素、 ＬＰＦ −ＨＡ は分子−
ｉｔ約１０７．０００の蛋白であり、これは、生体ｐｃ
自白血球増多症ひきおこす白血球増多活性（ＬＰＡ）。
ｉｔ約１０７．０００の蛋白であり、これは、生体ｐｃ
自白血球増多症ひきおこす白血球増多活性（ＬＰＡ）。
生体にヒスタミンに対する感受性を増強させる作用を示
すヒスタミン増感活性（ＩＳＡ） 、生体のインスリン
分泌を促進するインスリン分泌促進活性（ＩＡＡ）ある
いは赤血球凝集活性（Ｉ（Ａ活性） １゜を有し
ている１、そして、百日咳函の培養液から、副作用に関
与する内毒素や易熱性毒素を除去してＨＡ 活性を有
する両分を得、これにホルマリンを作用させてこれまた
副作用の原因と考えられているＬＰＡ ＋Ｈ８Ａを失活
（トキソイド化）させることによって、前述のコンポー
ネントワクチンがｖ４Ｍされている。かくして得られた
コンポーネントワクチンの内青累やＬＰＡは、全菌体ワ
クチンの１／１０〜１／２５以下に低下し、ており、ワ
クチン接種時の副作用も非常に改良されていることが臨
床的にも確められている。しかしながら、このコンポー
ネントワクチンにおいてもＬＰＡの低下は必ずしも十分
ではなく、特にＨ８ＡＯ減弱は不十分であり、その改良
が望まれていた。
すヒスタミン増感活性（ＩＳＡ） 、生体のインスリン
分泌を促進するインスリン分泌促進活性（ＩＡＡ）ある
いは赤血球凝集活性（Ｉ（Ａ活性） １゜を有し
ている１、そして、百日咳函の培養液から、副作用に関
与する内毒素や易熱性毒素を除去してＨＡ 活性を有
する両分を得、これにホルマリンを作用させてこれまた
副作用の原因と考えられているＬＰＡ ＋Ｈ８Ａを失活
（トキソイド化）させることによって、前述のコンポー
ネントワクチンがｖ４Ｍされている。かくして得られた
コンポーネントワクチンの内青累やＬＰＡは、全菌体ワ
クチンの１／１０〜１／２５以下に低下し、ており、ワ
クチン接種時の副作用も非常に改良されていることが臨
床的にも確められている。しかしながら、このコンポー
ネントワクチンにおいてもＬＰＡの低下は必ずしも十分
ではなく、特にＨ８ＡＯ減弱は不十分であり、その改良
が望まれていた。
本発明者らは、び口供毒素の分子構造と種々の活性発現
との関係を鋭意研究した結果、特定のサブユニットのみ
が６口供感染防御抗原活性ｋｍし−Ｃおり、このサブユ
ニット蛋白を用いれば、副作用の全くない百日咳ワクチ
ンが得られることを知見すると共に、このサブユニット
蛋白と他のサブユニット蛋白を組合せると、インスリン
分路促進活性が発現することを知見し、本発明に到達し
た。
との関係を鋭意研究した結果、特定のサブユニットのみ
が６口供感染防御抗原活性ｋｍし−Ｃおり、このサブユ
ニット蛋白を用いれば、副作用の全くない百日咳ワクチ
ンが得られることを知見すると共に、このサブユニット
蛋白と他のサブユニット蛋白を組合せると、インスリン
分路促進活性が発現することを知見し、本発明に到達し
た。
即ち、本発明は、蔗糖密層勾配法による分子量が約３２
，０００で、アミノ酸組成及び組成比（重′ｊＬ％）が
Ａｓｐ ７．０． Ｔｈｒ ５，６． Ｓｅｒ １１．
１゜Ｇｌｕ １３．６． Ｇｌｙ ８，４． Ａｌａ
６．０． Ｏｙｓ ２．８． Ｖａ１５．７． Ｍｅｔ
３．５．工１ｅ ４．０． Ｌｅｕ ７．０． Ｔｙ
ｒ ５．０゜Ｐｌｉｅ ５．１． Ｌｙｓ ４．０．
Ｈｌｓ ３．４． Ａｒｇ ４．６． Ｐｒ。
，０００で、アミノ酸組成及び組成比（重′ｊＬ％）が
Ａｓｐ ７．０． Ｔｈｒ ５，６． Ｓｅｒ １１．
１゜Ｇｌｕ １３．６． Ｇｌｙ ８，４． Ａｌａ
６．０． Ｏｙｓ ２．８． Ｖａ１５．７． Ｍｅｔ
３．５．工１ｅ ４．０． Ｌｅｕ ７．０． Ｔｙ
ｒ ５．０゜Ｐｌｉｅ ５．１． Ｌｙｓ ４．０．
Ｈｌｓ ３．４． Ａｒｇ ４．６． Ｐｒ。
３．２であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て単一のバンドを与え、白血球増多活性。
て単一のバンドを与え、白血球増多活性。
ヒスタミン増感活性、インスリン分泌促進活性は共に有
せず、百日咳感染防御抗原活性を自するところの６口供
毒素のサブユニット蛋白Ｔ２３４及びポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル邂気
泳動において共に１−ノバンドを与え、単独では、白血
球増多活性、ヒスタミン増感活性、インスリン分泌（１
Ｍ活性のいずれも有しないが、サブユニット蛋白Ｔ２３
４と組合せることによってインスリン分泌促進活性を発
現しうるところの百日咳毒素のすブ江ニット蛋白’Ｉ’
１００とＴ５００である。Ｔｌｏ。
せず、百日咳感染防御抗原活性を自するところの６口供
毒素のサブユニット蛋白Ｔ２３４及びポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル邂気
泳動において共に１−ノバンドを与え、単独では、白血
球増多活性、ヒスタミン増感活性、インスリン分泌（１
Ｍ活性のいずれも有しないが、サブユニット蛋白Ｔ２３
４と組合せることによってインスリン分泌促進活性を発
現しうるところの百日咳毒素のすブ江ニット蛋白’Ｉ’
１００とＴ５００である。Ｔｌｏ。
は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル′醒気泳動法による
分子量が約２５，０００で、アミノ酸組成及び組成比（
重量φ）がＡｓｐ ８，５． Ｔｈｒ ４．’ａ、 ５
ｅｒ１４．０． Ｇｌｕ １５．６． Ｇｌｙ １０．
７． Ａｌａ ５．７． （！ｙｓ２．５． Ｖａｌ
４．８． Ｍｅｔ ３，０． Ｉｌｅ ４．０． Ｌｅ
ｕ ５．１゜Ｔｙｒ ４．２． Ｐｈｅ ４．５． Ｌ
ｙｓ ３．３． Ｈｌｓ ３，７． Ａｒｇ５．４のサ
ブユニット蛋白であり、Ｔ５００は。
分子量が約２５，０００で、アミノ酸組成及び組成比（
重量φ）がＡｓｐ ８，５． Ｔｈｒ ４．’ａ、 ５
ｅｒ１４．０． Ｇｌｕ １５．６． Ｇｌｙ １０．
７． Ａｌａ ５．７． （！ｙｓ２．５． Ｖａｌ
４．８． Ｍｅｔ ３，０． Ｉｌｅ ４．０． Ｌｅ
ｕ ５．１゜Ｔｙｒ ４．２． Ｐｈｅ ４．５． Ｌ
ｙｓ ３．３． Ｈｌｓ ３，７． Ａｒｇ５．４のサ
ブユニット蛋白であり、Ｔ５００は。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量
が約１０，０００で、アミノ酸組成及び組成比（重ｔ％
）が、Ａｓｐ ９．０． Ｔｈｒ ４．７．’ ５ｅｒ
１３．０゜Ｇｌｕ １６．５． Ｇｌｙ １０．９．
Ａｌａ ５．２． Ｏｙｓ ２．６゜Ｖａｌ ４．４．
、Ｍｅｔ ３．０． ＩＩｓ ３．６． Ｌｅｕ ６
．８． Ｔｙｒ３．６． Ｐｈｅ ４．８． Ｌｙｅ
４．０． Ｈｌｓ ３．８． Ａｒｇ ４．０のす゛ブ
ユニノト蛋白である。
が約１０，０００で、アミノ酸組成及び組成比（重ｔ％
）が、Ａｓｐ ９．０． Ｔｈｒ ４．７．’ ５ｅｒ
１３．０゜Ｇｌｕ １６．５． Ｇｌｙ １０．９．
Ａｌａ ５．２． Ｏｙｓ ２．６゜Ｖａｌ ４．４．
、Ｍｅｔ ３．０． ＩＩｓ ３．６． Ｌｅｕ ６
．８． Ｔｙｒ３．６． Ｐｈｅ ４．８． Ｌｙｅ
４．０． Ｈｌｓ ３．８． Ａｒｇ ４．０のす゛ブ
ユニノト蛋白である。
本発明の白−口供毒素のザプユニノ）！白は、白−Ｈ収
繭の培養液から分離、・精製される毒素。
繭の培養液から分離、・精製される毒素。
ＬＰＦ −ＨＡ から得られる。培養の谷易さという
点から、６口供閑の中でも、百日１亥工相菌を用いるの
が好ましい、培養手段としては公知のいがなる手段を採
用しても良いが、いわゆる、ステナー・ンヨルテー培地
（ＳＳ培地と称する）（ジャーナル オブ ジェネラル
マイクロバイオロジー（Ｊ、 ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ） ６３巻、２１１−２２０頁、１９７１年参
照）が、近年、ａ口供菌の天童培養のために広く用いら
れている。
点から、６口供閑の中でも、百日１亥工相菌を用いるの
が好ましい、培養手段としては公知のいがなる手段を採
用しても良いが、いわゆる、ステナー・ンヨルテー培地
（ＳＳ培地と称する）（ジャーナル オブ ジェネラル
マイクロバイオロジー（Ｊ、 ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ） ６３巻、２１１−２２０頁、１９７１年参
照）が、近年、ａ口供菌の天童培養のために広く用いら
れている。
本発明者らが提案したシフ−デキストリン又はその誘導
体を含有する培地、例えば、メチルβ−シクロデキスト
リン（Ｍｅｔ−ＣＤ ）を含有するＳＳ培地は特に好ま
しいものである（例えば、特願昭５６−１６３４７８号
参照）。培養方法及び条件は特に限定されるものではな
く、従来公知の方法及び条件を採用できるが、静置培養
よりは振とり培養の方が好まし２く、培養温度は３５℃
前後、培養時間は１０〜１００時間が適当である。
体を含有する培地、例えば、メチルβ−シクロデキスト
リン（Ｍｅｔ−ＣＤ ）を含有するＳＳ培地は特に好ま
しいものである（例えば、特願昭５６−１６３４７８号
参照）。培養方法及び条件は特に限定されるものではな
く、従来公知の方法及び条件を採用できるが、静置培養
よりは振とり培養の方が好まし２く、培養温度は３５℃
前後、培養時間は１０〜１００時間が適当である。
培養物（培養培地と菌体）から、生成されたＬＰＦ −
ＨＡ を採取する方法１手段も特に限定さ ：れ
るものではなく、公知の方法９手段を利用できる。例え
ば、６日収■相菌（ボルデテラ・パタシス束浜株）をａ
ｏ ｏ Ａｔ／ｒｎｌ ｏ Ｍｅｔ−ＣＤ をぎむ
ＳＳ培地にて３５℃で１８時間培養し、得られる培養液
の遠心上清（ｐ）（８，６）を、ｐＨ８，０の０．０１
Ｍ ＩＪン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタ
イトカラムに通過せしめる。そして、得られる通過液を
ｐＨ６，０に調整した後、今度は、ｐＨ６，０のｏ、ｏ
Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラムに吸着させ、これを０．５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
で溶出して蛋白分画を得る。
ＨＡ を採取する方法１手段も特に限定さ ：れ
るものではなく、公知の方法９手段を利用できる。例え
ば、６日収■相菌（ボルデテラ・パタシス束浜株）をａ
ｏ ｏ Ａｔ／ｒｎｌ ｏ Ｍｅｔ−ＣＤ をぎむ
ＳＳ培地にて３５℃で１８時間培養し、得られる培養液
の遠心上清（ｐ）（８，６）を、ｐＨ８，０の０．０１
Ｍ ＩＪン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタ
イトカラムに通過せしめる。そして、得られる通過液を
ｐＨ６，０に調整した後、今度は、ｐＨ６，０のｏ、ｏ
Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラムに吸着させ、これを０．５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
で溶出して蛋白分画を得る。
この蛋白分画をハプトグロビン−セファロースを支持体
とするアフィニティークルマドクラフィーに吸着させ、
０．５ Ｍ Ｎａｃｔ 及び３〜Ｍのチオシアン化カリ
ウムを含む０．１１ｉ１リン酸Ｍ衝液で脱着してＬＰＦ
−１（Ａ を得ることができる。
とするアフィニティークルマドクラフィーに吸着させ、
０．５ Ｍ Ｎａｃｔ 及び３〜Ｍのチオシアン化カリ
ウムを含む０．１１ｉ１リン酸Ｍ衝液で脱着してＬＰＦ
−１（Ａ を得ることができる。
上記のＱ１］＜ ｔ、て分離・精製されたＬＰＦ −Ｈ
Ａがら、そのサプユニン）（Ｊ白Ｔ２３４．Ｔ１００
及びＴ５００を分離し採取する方法も特に限定されるも
のではなく、公知の方法及び手段を適当に組合せて行な
うことができる。例えば、？＃製ＬＰＦ −ＨＡを、８
Ｍの尿素を含むｐ、Ｈ７，５の０．０１５ Ｍのリン酸
緩衝液中で各サブユニントに分離させ、得られた溶液を
同じ緩衝液で平衡化したＣＭセファロースＱＬ −６Ｂ
のカラムｅこかける。そして、未吸着画分を渠め、
これを透析膜を用いて濃縮し、その後七フアクリルＳ
−２００を用いてゲル濾過を行なう。かかるゲル濾過に
よってサブユニット蛋白Ｔ１００．！： Ｔ５００が分
離される。上記０Ｍセファロース０Ｌ−６Ｂ＋７）カラ
ムにおいて、吸着された蛋白を４Ｍの尿素と０．５Ｍの
Ｎａｃｔ を含むｐＨ７，５の０．１Ｍのリン酸緩簀液
を用いて流出させ蛋白のｋｉれるフラクションを集め、
これを前記と同様に＃縮とゲル濾過を行なう。かかる処
理によって、少量の未解離ＬＰＦ −ＨＡとサブユニッ
ト蛋白Ｔ２３４が分離される。
Ａがら、そのサプユニン）（Ｊ白Ｔ２３４．Ｔ１００
及びＴ５００を分離し採取する方法も特に限定されるも
のではなく、公知の方法及び手段を適当に組合せて行な
うことができる。例えば、？＃製ＬＰＦ −ＨＡを、８
Ｍの尿素を含むｐ、Ｈ７，５の０．０１５ Ｍのリン酸
緩衝液中で各サブユニントに分離させ、得られた溶液を
同じ緩衝液で平衡化したＣＭセファロースＱＬ −６Ｂ
のカラムｅこかける。そして、未吸着画分を渠め、
これを透析膜を用いて濃縮し、その後七フアクリルＳ
−２００を用いてゲル濾過を行なう。かかるゲル濾過に
よってサブユニット蛋白Ｔ１００．！： Ｔ５００が分
離される。上記０Ｍセファロース０Ｌ−６Ｂ＋７）カラ
ムにおいて、吸着された蛋白を４Ｍの尿素と０．５Ｍの
Ｎａｃｔ を含むｐＨ７，５の０．１Ｍのリン酸緩簀液
を用いて流出させ蛋白のｋｉれるフラクションを集め、
これを前記と同様に＃縮とゲル濾過を行なう。かかる処
理によって、少量の未解離ＬＰＦ −ＨＡとサブユニッ
ト蛋白Ｔ２３４が分離される。
本発明のサブユニット蛋白Ｔ２３４は、扉軸密度勾配法
で測定した分子量が約３２，０００（３２，０００±３
，０００ ）である。゛まだ、アミノ酸組成と組成比（
重量％）は第１表に示した通りである。そして、ポリア
クリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度７．５％、
Ｉ Ｎ ＫＯＨ−氷酢酸緩衝液（ｐＨ４，３））電気
泳動（ディスク電気泳動）において単一のバンドを与え
る。
で測定した分子量が約３２，０００（３２，０００±３
，０００ ）である。゛まだ、アミノ酸組成と組成比（
重量％）は第１表に示した通りである。そして、ポリア
クリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度７．５％、
Ｉ Ｎ ＫＯＨ−氷酢酸緩衝液（ｐＨ４，３））電気
泳動（ディスク電気泳動）において単一のバンドを与え
る。
各種生物学的活性の測定法の詳細は後述するが、その概
略は次の通りである。即ち、マウスにサブユニット蛋白
を靜注し、３日後に白血球数を測定することによりＬＰ
Ａを、４日後にグルコースを負荷し、血中のインスリン
レベル全１ｌｌ１１定することによりＩＡＡを、６日後
にヒスタミンを腹腔に注射し、３０分後の体温ｒチ千存
書喰ゆ金稀によってＨ８Ａを調べる。本発明のサブユニ
ット蛋白Ｔ２３４は、前記３槌類の活性はいずれも大質
的に有しない。６６咳感染防御抗原活性は次の様にして
測定される。即ち、まず抗原（トキソイド１ヒしたＬＰ
Ｆ −ＨＡ又はサブユニット蛋白）を不完全７０イント
アジユノ（ントにて家兎に免疫し、免疫血清から硫安分
画等により抗体（ＩｆＧ画分）を得る。次に、抗体とＬ
ＰＦ −ＨＡとを３７℃、１時間インキユベートシ、マ
ウスに靜注し、各種抗体の中和１目を調べると共に、上
記の抗体をマウスの腹腔内に投与し、百日咳工相鉋を脳
内接種することによる感染実験から汀口供感染防御抗原
活性を検Ｈする。本発明のサブユニット蛋白Ｔ２３４は
、 ＬＰＨ−ＨＡと同様の６６咳感染防御抗原活性を有
している。
略は次の通りである。即ち、マウスにサブユニット蛋白
を靜注し、３日後に白血球数を測定することによりＬＰ
Ａを、４日後にグルコースを負荷し、血中のインスリン
レベル全１ｌｌ１１定することによりＩＡＡを、６日後
にヒスタミンを腹腔に注射し、３０分後の体温ｒチ千存
書喰ゆ金稀によってＨ８Ａを調べる。本発明のサブユニ
ット蛋白Ｔ２３４は、前記３槌類の活性はいずれも大質
的に有しない。６６咳感染防御抗原活性は次の様にして
測定される。即ち、まず抗原（トキソイド１ヒしたＬＰ
Ｆ −ＨＡ又はサブユニット蛋白）を不完全７０イント
アジユノ（ントにて家兎に免疫し、免疫血清から硫安分
画等により抗体（ＩｆＧ画分）を得る。次に、抗体とＬ
ＰＦ −ＨＡとを３７℃、１時間インキユベートシ、マ
ウスに靜注し、各種抗体の中和１目を調べると共に、上
記の抗体をマウスの腹腔内に投与し、百日咳工相鉋を脳
内接種することによる感染実験から汀口供感染防御抗原
活性を検Ｈする。本発明のサブユニット蛋白Ｔ２３４は
、 ＬＰＨ−ＨＡと同様の６６咳感染防御抗原活性を有
している。
以上の如く、本発明のサブユニット蛋白Ｔ２３４は、百
日咳ワクチンの副作用の原因であるＬＰＡやＨ８Ａを有
せず、感染防御抗原活性は十分に有しているので、副作
用のほとんどない白°口供ワクチンを製造するために用
いることができる。
日咳ワクチンの副作用の原因であるＬＰＡやＨ８Ａを有
せず、感染防御抗原活性は十分に有しているので、副作
用のほとんどない白°口供ワクチンを製造するために用
いることができる。
本発明のサブユニット蛋白Ｔ１００とＴ５００は、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定［７た分子
量が、それぞれ約２５，０００（２５，０００±２．０
００ ）と約ｉ ｏ、ｏ ｏ ｏ （１０，０００±１
，０００ ）である。アミノ酸組成と組成比（重１１％
）は、それぞれ第１表に示した通りである（６Ｎ塩酸で
、１１ １１０℃、２４時間加水分解を行ない、日立−８３５高
速アミノ酸分析機にて分析したン。そして、いずれも、
ポリアクリルアミドゲル醒気咳 １ 表 ４ ： λ 泳動とＳＤ日ポリアクリルアミドゲル畦気泳動（ポリア
クリルアミド濃度１０％、 ＳＤＳ Ｏ，１９６゜０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２））において共に争−の
バンドを得える。そして、いずれも、牟独では、ＬＰＡ
、 Ｈ８Ａ、 ＩＡＡ及び百日咳感染防御抗原活性を実
質的に有しない。しかしながら、いずれも、サブユニッ
ト蛋白Ｔ２３４と組合せる（併存させる）ことによって
、はぼ同程度のＩＡＡを発現するという特徴を射する。
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定［７た分子
量が、それぞれ約２５，０００（２５，０００±２．０
００ ）と約ｉ ｏ、ｏ ｏ ｏ （１０，０００±１
，０００ ）である。アミノ酸組成と組成比（重１１％
）は、それぞれ第１表に示した通りである（６Ｎ塩酸で
、１１ １１０℃、２４時間加水分解を行ない、日立−８３５高
速アミノ酸分析機にて分析したン。そして、いずれも、
ポリアクリルアミドゲル醒気咳 １ 表 ４ ： λ 泳動とＳＤ日ポリアクリルアミドゲル畦気泳動（ポリア
クリルアミド濃度１０％、 ＳＤＳ Ｏ，１９６゜０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２））において共に争−の
バンドを得える。そして、いずれも、牟独では、ＬＰＡ
、 Ｈ８Ａ、 ＩＡＡ及び百日咳感染防御抗原活性を実
質的に有しない。しかしながら、いずれも、サブユニッ
ト蛋白Ｔ２３４と組合せる（併存させる）ことによって
、はぼ同程度のＩＡＡを発現するという特徴を射する。
本発明のサブユニット蛋白Ｔ１００又はＴ５００ｉｊ、
副作用の原因であるＬＰＡやＨ８Ａを実質的に有せず、
Ｔ２３４と組合せると工ＡＡを有する様になるので、Ｔ
２３４と組合せて糖尿病の治療薬として利用できる可能
性がある。
副作用の原因であるＬＰＡやＨ８Ａを実質的に有せず、
Ｔ２３４と組合せると工ＡＡを有する様になるので、Ｔ
２３４と組合せて糖尿病の治療薬として利用できる可能
性がある。
なお、本発明において採用した各種の測定法は以下の通
りである。
りである。
（１） 蔗糖密度勾配法
１０チから２０チ迄の密度勾配をもった蔗糖溶液に、試
料溶液をのせ、４℃、毎分６５．０００回転で超遠心を
２０時間行ない試料の沈降位置から対照物質（ウシ血清
アルブミン。
料溶液をのせ、４℃、毎分６５．０００回転で超遠心を
２０時間行ない試料の沈降位置から対照物質（ウシ血清
アルブミン。
キモトリプ７ノーゲン）を基にして分子蓋を測定１．た
。
。
（２） ポリγクリルアミドゲル畦気泳動ポリアクリ
ルアミド濃度７．５ ％ 、 Ｉ ＮＫＯＨ−氷酢酸緩
衝液（１）Ｈ４，３＞を用い、Ｄａｖｉｓの方法に従っ
て行なった（Ｂ、 Ｊ、 Ｄａｖｉｓ、 Ａｍｒ。
ルアミド濃度７．５ ％ 、 Ｉ ＮＫＯＨ−氷酢酸緩
衝液（１）Ｈ４，３＞を用い、Ｄａｖｉｓの方法に従っ
て行なった（Ｂ、 Ｊ、 Ｄａｖｉｓ、 Ａｍｒ。
Ｎ、 Ｙ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 Ｎｏ１．１２１
、Ｐ２Ｏ３。
、Ｐ２Ｏ３。
１９６４参照）。
（３） ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ポ
リアクリルアミド濃度ｌＯ％、 ＳＤＳ Ｏ，１チ、
０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を用い、Ｆａｉ
ｒｂａｎｋｓらの方法に従って行なった（Ｇ、 Ｔ。
リアクリルアミド濃度ｌＯ％、 ＳＤＳ Ｏ，１チ、
０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を用い、Ｆａｉ
ｒｂａｎｋｓらの方法に従って行なった（Ｇ、 Ｔ。
ｆｌ’ａｉｒｂａｎｋｅ ｅｔａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ
、、 Ｖｏｌ、 １０ 。
、、 Ｖｏｌ、 １０ 。
ｐ２６０６．１９７１参照）。
（４） 生物活性
（１） 白血球増多活性
マウス（ｄｄＹ、 ＳＰＦ、 ４Ｗ、♀）に試料を尾靜
脈よりイナ庄［７，３日後に、尾静脈より５μを採血１
〜、市販希釈液にて２０００倍に希釈し、セルカウンタ
ー（束亜直波に、に、！１１ｊ）にて白血球数を測定し
た。白血球増多活性は、試料群の白血球数と対照群の白
血球数との差（蜀を、基準ＬＰＦ、 −ＨＡを用いた場
合の白血球数と対照群の白血球数との差（Ｂ）に対する
相対的な力価として衣わしだ。
脈よりイナ庄［７，３日後に、尾静脈より５μを採血１
〜、市販希釈液にて２０００倍に希釈し、セルカウンタ
ー（束亜直波に、に、！１１ｊ）にて白血球数を測定し
た。白血球増多活性は、試料群の白血球数と対照群の白
血球数との差（蜀を、基準ＬＰＦ、 −ＨＡを用いた場
合の白血球数と対照群の白血球数との差（Ｂ）に対する
相対的な力価として衣わしだ。
（１１） インシュリン分泌促進活性白血球増多活性
を測定した後、即ち、３日目に絶食し、４日目にｓｏｄ
グルコースを腹腔内投与し、１５分後に尾静脈より２０
μを採血し１０倍希釈［また血清を得、ダイナテンク社
製うジオイムノアンセイキントにより、ＩＲＩ （Ｌｍ
ｍｕｎｏ Ｒｅａｃｔｌｖｅ Ｉｎｅｔｉ’ｌｉｒ＋）
を測定した。そして（１）の場合と同イボな方法により
相対的な力価を求めた。
を測定した後、即ち、３日目に絶食し、４日目にｓｏｄ
グルコースを腹腔内投与し、１５分後に尾静脈より２０
μを採血し１０倍希釈［また血清を得、ダイナテンク社
製うジオイムノアンセイキントにより、ＩＲＩ （Ｌｍ
ｍｕｎｏ Ｒｅａｃｔｌｖｅ Ｉｎｅｔｉ’ｌｉｒ＋）
を測定した。そして（１）の場合と同イボな方法により
相対的な力価を求めた。
０１１） ヒスタミン増感活性
インツユリン分泌促進活性を測定した後、即ち、６日目
にマウス腹腔内にヒスタミン塩酸塩をｏ 、８ ｍｇ
／ ｕ＋ｏｕｓｅ 投与し７．３０分後の直腸内体温
の低下を測定した。そして（１）の場合と同謙な方法に
より相対的な力価を求めた。
にマウス腹腔内にヒスタミン塩酸塩をｏ 、８ ｍｇ
／ ｕ＋ｏｕｓｅ 投与し７．３０分後の直腸内体温
の低下を測定した。そして（１）の場合と同謙な方法に
より相対的な力価を求めた。
（５） 抗サブユニット抗体のＬＰＦ−ＨＡに対する
結合能ＬＰＦ−ＨＡ 、Ｔ１００．Ｔ２３４．Ｔ５００
をそれぞれコートしたマイクロプレートに、抗サブ
ユニット抗体を入れ、室温で３０分間反Ｌしさせ、抗体
の結合能をＭＩＣＲＯＫＬＩＳＡ法により測定１７た。
結合能ＬＰＦ−ＨＡ 、Ｔ１００．Ｔ２３４．Ｔ５００
をそれぞれコートしたマイクロプレートに、抗サブ
ユニット抗体を入れ、室温で３０分間反Ｌしさせ、抗体
の結合能をＭＩＣＲＯＫＬＩＳＡ法により測定１７た。
各抗体の結合Ｉ！シは、ＬＰＦ −ＨＡに対する抗ＬＰ
Ｆ −ＨＡ抗体の結合能を１００としλときの相対値で
示した。
Ｆ −ＨＡ抗体の結合能を１００としλときの相対値で
示した。
なお、抗体としては、抗原（ＬＰＦ−ＨＡはトギソイド
化し、サブユニント蛋白はぞのま＼）を不完全７０イン
ドアジユバントにて×兎に免疫し、その血清から硫安分
画法により得られた工９Ｇ画分を用いた。
化し、サブユニント蛋白はぞのま＼）を不完全７０イン
ドアジユバントにて×兎に免疫し、その血清から硫安分
画法により得られた工９Ｇ画分を用いた。
（６） 抗すブユニント抗体のＬＰＦ−ＨＡに対する
中和ｍ１ＬＰｌＰ−ＨＡと譲駄を一定にした各抗体とを
混ぜ、３７℃、１時間インキュベートした後マウスに靜
注し、ＬＰＡ、 Ｈ８Ａ、 ＩＡＡの中和能をみた。中
和６ヒの値は、各活性を５０≠中和するのに必要な抗体
の希釈倍率を、圧意にきめた基準ＬＰＦ −ＨＡを用い
た場合の抗体の５０％中和希釈倍率に対する相対的値と
して求めた。
中和ｍ１ＬＰｌＰ−ＨＡと譲駄を一定にした各抗体とを
混ぜ、３７℃、１時間インキュベートした後マウスに靜
注し、ＬＰＡ、 Ｈ８Ａ、 ＩＡＡの中和能をみた。中
和６ヒの値は、各活性を５０≠中和するのに必要な抗体
の希釈倍率を、圧意にきめた基準ＬＰＦ −ＨＡを用い
た場合の抗体の５０％中和希釈倍率に対する相対的値と
して求めた。
以下、実施例により本発明を詳述する。
実施例１
（１） ＬＰＦ −ＨＡの分離・積装ボルデテラ バ
タシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｅｉｓｌ
（百日咳菌）東浜株工相薗の凍結乾燥画体を１％カザミ
ノ酸溶液に懸濁させ、脱繊維馬血液を２０％含むボルデ
・ジャングー（Ｂｏｒｄｅｔ −Ｇｅｎｇｏｕ）培地（
以下ＢＧ培地という）で３５℃、３日間培養し７た。こ
の菌を１白金４か蔭取り、更にＢＧ培地で２４時間リフ
レッシュした薗をＳＳ培地に懸濁し、接ｔＩｉＩ―懸濁
液を得た。
タシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｅｉｓｌ
（百日咳菌）東浜株工相薗の凍結乾燥画体を１％カザミ
ノ酸溶液に懸濁させ、脱繊維馬血液を２０％含むボルデ
・ジャングー（Ｂｏｒｄｅｔ −Ｇｅｎｇｏｕ）培地（
以下ＢＧ培地という）で３５℃、３日間培養し７た。こ
の菌を１白金４か蔭取り、更にＢＧ培地で２４時間リフ
レッシュした薗をＳＳ培地に懸濁し、接ｔＩｉＩ―懸濁
液を得た。
この接種菌懸濁液を、Ｍｅβ−ＣＤ を５００μｆ
／ ｔｎｌ含むｓｓ培地に１０７コｏ ニー ／ ａｔ
となる様に懸濁させ、振とり条件下、３５℃で１８時間
培養を行った。
／ ｔｎｌ含むｓｓ培地に１０７コｏ ニー ／ ａｔ
となる様に懸濁させ、振とり条件下、３５℃で１８時間
培養を行った。
培養後、以下の如きＪＪ法で厘生されたＬＰＦ−ＨＡを
採暖した。培養液の遠心上清（ｐＨｊｌ、６）を、ｐＨ
８，０の０．０１ Ｍリン酸緩衝液で平衡化（７たハイ
ドロキシアパタイトカラムに通ｍさせ（赤血球ＨＡ症を
持つ他の蛋白Ｆ −１（Ａをカラムに吸、；＊させて除
＜ ）、ＬｐＦ−ＨＡヲ含む通過液をｐＨ６，０に調整
した後、今度はｐＨ６，０の０．０１ Ｍ ＩＪン酸緩
衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに通し
ＬｐＨＦ −ＨＡをカラムに吸着させ、これを０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衛液（ｐＨ７，
０）で溶出してＬＰＦ −ＨＡを含む蛋白分画を得た。
採暖した。培養液の遠心上清（ｐＨｊｌ、６）を、ｐＨ
８，０の０．０１ Ｍリン酸緩衝液で平衡化（７たハイ
ドロキシアパタイトカラムに通ｍさせ（赤血球ＨＡ症を
持つ他の蛋白Ｆ −１（Ａをカラムに吸、；＊させて除
＜ ）、ＬｐＦ−ＨＡヲ含む通過液をｐＨ６，０に調整
した後、今度はｐＨ６，０の０．０１ Ｍ ＩＪン酸緩
衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに通し
ＬｐＨＦ −ＨＡをカラムに吸着させ、これを０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衛液（ｐＨ７，
０）で溶出してＬＰＦ −ＨＡを含む蛋白分画を得た。
この蛋白分画をハプトグロビン−セファロース４Ｂを支
持体とするアフィニティークロマトのカラムに通し、ハ
プトグロビンにＬＰＦ −ＨＡ を選択的に吸着させ
、これを０，５ＭＮａｃｔ及び３Ｍのチオシアン化カリ
ウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（’ｐＨ７，０）で脱
層してＬＰＦ −ＨＡ をぎむ分画を得た。得られた
分画を（１，ＩＭのリン酸緩価液に対し透析し、チオ／
アン化カリウムを除き純粋なＬＰＦ −ＨＡを得た。
持体とするアフィニティークロマトのカラムに通し、ハ
プトグロビンにＬＰＦ −ＨＡ を選択的に吸着させ
、これを０，５ＭＮａｃｔ及び３Ｍのチオシアン化カリ
ウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（’ｐＨ７，０）で脱
層してＬＰＦ −ＨＡ をぎむ分画を得た。得られた
分画を（１，ＩＭのリン酸緩価液に対し透析し、チオ／
アン化カリウムを除き純粋なＬＰＦ −ＨＡを得た。
（２） ＬＰＦ−ＨＡのサブユニント蛋白の分離・精
製前記（１）で得られた精製ＬＰＦ −ＨＡの０．５Ｍ
食塩を含む０．１ Ｍ ＩＪン敏緩衝液（ｐＨ７）溶液
を、４Ｍ尿素を含むｐＨ７，５の０．０１５ Ｍリン酸
緩拘液に対し透析し７、得られた溶液（１４，８ｄ、蛋
白濃度０．２ ｔｒｇ ／ ｍｌ ）に尿素５．７２を
加え８Ｍ尿素溶液にし、３０．分間室温に放置した。当
量のｐＨ７，５の０．０１５ Ｍリン酸緩衝液を加え、
４Ｍ尿素溶液にした後、４Ｍ尿素を含むｐＨ７，５の０
．０１５ Ｍリン酸緩衝液で平衡化した０Ｍセファロー
ス０Ｌ−６Ｂのカラムにかけた。流出パターンは第１図
に示した如くであった。蛋白のオまれるフラクション４
から３０までを集め、透析膜を用いて濃縮し、七フアク
リルＳ−２００を用いてグル濾過を行った。流出パター
ンは第２図に示した如くであった。か＼るグル濾過ＶＣ
よってサブユニ □ット蛋白Ｔ１００（フラク
ション６５〜７２） ’・とＴ５００（フラ
クション７５〜７８）が分離された。
製前記（１）で得られた精製ＬＰＦ −ＨＡの０．５Ｍ
食塩を含む０．１ Ｍ ＩＪン敏緩衝液（ｐＨ７）溶液
を、４Ｍ尿素を含むｐＨ７，５の０．０１５ Ｍリン酸
緩拘液に対し透析し７、得られた溶液（１４，８ｄ、蛋
白濃度０．２ ｔｒｇ ／ ｍｌ ）に尿素５．７２を
加え８Ｍ尿素溶液にし、３０．分間室温に放置した。当
量のｐＨ７，５の０．０１５ Ｍリン酸緩衝液を加え、
４Ｍ尿素溶液にした後、４Ｍ尿素を含むｐＨ７，５の０
．０１５ Ｍリン酸緩衝液で平衡化した０Ｍセファロー
ス０Ｌ−６Ｂのカラムにかけた。流出パターンは第１図
に示した如くであった。蛋白のオまれるフラクション４
から３０までを集め、透析膜を用いて濃縮し、七フアク
リルＳ−２００を用いてグル濾過を行った。流出パター
ンは第２図に示した如くであった。か＼るグル濾過ＶＣ
よってサブユニ □ット蛋白Ｔ１００（フラク
ション６５〜７２） ’・とＴ５００（フラ
クション７５〜７８）が分離された。
上ｄ己ＣＭ七７アロースＱＩ、−６Ｂのカラムにおいて
、フラクション４ｏ以降は４Ｍ尿素とｏ、ｒＢｔ＊ｊＭ
を含むｐＨ７，５の０．ＩＭＭリン酸緩衝液用い、蛋白
が含°まれるフラクション５１から５５゛までを集め、
前記と同様に濃縮とゲル濾過を行なった（第３図）。か
がる処理によって少鎚の未Ｊｇｌ１ＭＩＬＰＦ−ＨＡと
サブユニント蛋白Ｔ２３４（フラクション６２〜７２）
が分離された。
、フラクション４ｏ以降は４Ｍ尿素とｏ、ｒＢｔ＊ｊＭ
を含むｐＨ７，５の０．ＩＭＭリン酸緩衝液用い、蛋白
が含°まれるフラクション５１から５５゛までを集め、
前記と同様に濃縮とゲル濾過を行なった（第３図）。か
がる処理によって少鎚の未Ｊｇｌ１ＭＩＬＰＦ−ＨＡと
サブユニント蛋白Ｔ２３４（フラクション６２〜７２）
が分離された。
（３） サブユニットの分子量および電気泳動（２）
によって得られたサブユニント蛋白Ｔ１００ 。
によって得られたサブユニント蛋白Ｔ１００ 。
Ｔ５００ 、Ｔ２３４およびＬＰＦ−ＨＡ ′４ｒ１
ｔＩＤドデシル硫酸ナトリウム、１％２−メルカプトエ
タノールで１００℃２分間処理し５ｏ−ｘｑｉ’ドデシ
ル硫酸ナトリウムを含むｌｏチポリアクリルアミドゲル
で電気泳動し、第４図の如き結果を得た。ウシ崩清アル
ブミン、卵白アルシ。
ｔＩＤドデシル硫酸ナトリウム、１％２−メルカプトエ
タノールで１００℃２分間処理し５ｏ−ｘｑｉ’ドデシ
ル硫酸ナトリウムを含むｌｏチポリアクリルアミドゲル
で電気泳動し、第４図の如き結果を得た。ウシ崩清アル
ブミン、卵白アルシ。
ミン、ギモトリグシノーゲン等の基準物質を用いて、第
４図からサプユニノ） ｉ白Ｔ１００とＴａ２Ｏの分子
量をそれぞれ２５，０００±２，０００と１０，０００
±１，０００と前出した。一方、Ｔ２３４は、ＳＤＳポ
リアクリルアミド′電気泳動では３本のバンドに分離す
るが、ｐＨ４，３の７．５慢ポリアクリルアミド電気泳
動（第５図）では単一のバンドを示した。このものの分
子量は、１０９ｇから２Ｏ４迄の蔗糖密度勾配法により
３２．０００十ａ、ｏｏｏ と算出した。
４図からサプユニノ） ｉ白Ｔ１００とＴａ２Ｏの分子
量をそれぞれ２５，０００±２，０００と１０，０００
±１，０００と前出した。一方、Ｔ２３４は、ＳＤＳポ
リアクリルアミド′電気泳動では３本のバンドに分離す
るが、ｐＨ４，３の７．５慢ポリアクリルアミド電気泳
動（第５図）では単一のバンドを示した。このものの分
子量は、１０９ｇから２Ｏ４迄の蔗糖密度勾配法により
３２．０００十ａ、ｏｏｏ と算出した。
（４） 生物活性等の性質
■ サブユニント蛋白Ｔ１００．Ｔ２３４及びＴ５００
のＬＰＡ、 Ｈ８Ａ 及びＩＡＡは、第２表に示した
遡りである。
のＬＰＡ、 Ｈ８Ａ 及びＩＡＡは、第２表に示した
遡りである。
第２表から、Ｔ１００．Ｔ２３４ 、Ｔ５００はいずれ
も、ＬＰＡ、 ）（ＳＡ、 ＩＡＡを有しないことがわ
かる。一方、Ｔ１００とＴ２３４を組合せると、または
、Ｔ５００とＴ２３４を組合せると、ｒＡＡが発現する
ことがわかる。
も、ＬＰＡ、 ）（ＳＡ、 ＩＡＡを有しないことがわ
かる。一方、Ｔ１００とＴ２３４を組合せると、または
、Ｔ５００とＴ２３４を組合せると、ｒＡＡが発現する
ことがわかる。
■ 抗すブユニント抗体等のＬＰＦ −ＨＡに対する結
合能は、第３表に示した通りである。
合能は、第３表に示した通りである。
第３表
第３表から、抗Ｔ２３４抗体は、抗ＬＰＦ″−ＨＡ
抗体の約６割に相当するＬＰＦ −ＨＡに対する結合＃
Ｑ ｋ有していることがわかる。この結果は、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ において、Ｔ２３４がＬｐドーＨＡと同体
の抗原としての活性を有していることを示しているっ ■ 抗サブユニット抗体等のＬＰＦ −１（Ａ Ｋ対す
る中和能は第４表に示ｌ〜だ通りである。
抗体の約６割に相当するＬＰＦ −ＨＡに対する結合＃
Ｑ ｋ有していることがわかる。この結果は、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ において、Ｔ２３４がＬｐドーＨＡと同体
の抗原としての活性を有していることを示しているっ ■ 抗サブユニット抗体等のＬＰＦ −１（Ａ Ｋ対す
る中和能は第４表に示ｌ〜だ通りである。
第４表
抗Ｔ２３４は、ＬＰＡ、 Ｈ８Ａ、 ＩＡＡのいずれの
活性においても、ＬＰＦ−ＨＡに対する相当な中和能を
有していることがわかる１、 ■ 感染防御実験 マウス（４Ｗ、 ＳＰ？、♀）１群１０〜１５匹を用い
、抗ＬＰ？ −１（Ａ抗体又は抗Ｔ２３４抗体を腹腔内
に０．５ ｍｌずつ受動免疫し、３０分後に汀口供工相
菌を５ Ｘ １０’個脳内に接種し、１４日後の生残率
を求めた。抗Ｌｌ）Ｆ −ＨＡ 抗体を用いた場合の生
残率は５０％で、抗Ｔ２３４抗体を用いた場合の生残率
は６０≠であり、抗Ｔ２３４抗体は抗ＬＰ’Ｆ’ −Ｈ
Ａ 抗体とほぼ同じ感染防御比を有していることが確認
された。
活性においても、ＬＰＦ−ＨＡに対する相当な中和能を
有していることがわかる１、 ■ 感染防御実験 マウス（４Ｗ、 ＳＰ？、♀）１群１０〜１５匹を用い
、抗ＬＰ？ −１（Ａ抗体又は抗Ｔ２３４抗体を腹腔内
に０．５ ｍｌずつ受動免疫し、３０分後に汀口供工相
菌を５ Ｘ １０’個脳内に接種し、１４日後の生残率
を求めた。抗Ｌｌ）Ｆ −ＨＡ 抗体を用いた場合の生
残率は５０％で、抗Ｔ２３４抗体を用いた場合の生残率
は６０≠であり、抗Ｔ２３４抗体は抗ＬＰ’Ｆ’ −Ｈ
Ａ 抗体とほぼ同じ感染防御比を有していることが確認
された。
なお、対照群（抗体を用いない解）の生残率は０襲であ
った、
った、
第１図、第２図、第３図は実施例１の（２）に関するグ
ラフであり、第１図はＣＭセファローズＱＬ−６１３カ
ラムクロマトグラフィーであり、第２図ＩＪ３図は、セ
ファクリル８−２００ ’ｌ ／しＰｉクロマトグラフ
ィーである。蛋白＃［はＬＯＷ ｒ Ｙ法によった。第
４図は、ＬＰＦ’ −ＨＡおよび各サブユニット激白の
Ｅ３ＤＳポリγクリルアミド′這気泳動図であり、第５
図は、ＬＰＦ −ＨＡおよびＴ−２３４（７） ｐＨ４
，３のポリアクリルアミド電気泳動図である。 茅３１（２） ７テ７シヨン８号
７う７シ５〉番号率ｔｆ−凶 茅 ５ 閃
ラフであり、第１図はＣＭセファローズＱＬ−６１３カ
ラムクロマトグラフィーであり、第２図ＩＪ３図は、セ
ファクリル８−２００ ’ｌ ／しＰｉクロマトグラフ
ィーである。蛋白＃［はＬＯＷ ｒ Ｙ法によった。第
４図は、ＬＰＦ’ −ＨＡおよび各サブユニット激白の
Ｅ３ＤＳポリγクリルアミド′這気泳動図であり、第５
図は、ＬＰＦ −ＨＡおよびＴ−２３４（７） ｐＨ４
，３のポリアクリルアミド電気泳動図である。 茅３１（２） ７テ７シヨン８号
７う７シ５〉番号率ｔｆ−凶 茅 ５ 閃
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ！、 蔗＃Ｉ＆密度勾配法による分子量が約３２，００
０で、アミノ酸組成及び組成比（重量％）がＡｌ３ｐ７
．Ｑ、 Ｔｈｒ ５．６． Ｂａｒ−１１，１，Ｇｌｕ
ｌ ３．６゜Ｇｌｙ ８．４． Ａ／ｌａ ６．Ｑ、
Ｃ！ｙｓ ２．８． Ｖａｌ ５．７． Ｍｅｔ３．
５．工１ｅ ４．ｏ、 Ｌｅｕ ７．０． Ｔｙｒ ５
．０． Ｐｈｅ ５．１゜Ｌｙｓ ４．０． Ｈｌｓ
３−４． Ａｒｇ ４．６． Ｐｒｏ３．２ であり
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において嚇−のバン
ドを与え、白血球増多活性、ヒスタミン増感活性、イン
スリン分泌促進活性は共に有せず、百日咳感染防御抗原
活性を有するところの百日咳毒素のサブユニット蛋白Ｔ
２３４ 。 ２、 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る分子量が約２５，０００で、アミノ酸組成及び組成比
（１目）がＡｓｐ ８．５． Ｔｈｒ ４．９゜Ｓｅｒ
１ ４．０．Ｇｌｕ １ ５．６．Ｇｌｙ １
０．７．Ａ１ａ５．７゜Ｏｙｓ ２．５．Ｖａｌ
４，８．Ｍｅｔ ３．０．Ｉｃｅ ４．０．Ｌｅ
ｕ５．１．Ｔｙｒ ４．２．Ｐｈｅ ４．５．Ｌｙ
ｓ ３．３．Ｈｌｓ、３．７゜Ａｒｇ５．４であり、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＳＤ＆ポリアクリ
ルアミ）” ケル１［気泳動において共に単一のバンド
を与え、単独では、白血球増多活性、ヒスタミン増感活
性。 インスリン分泌促進活性のいずれも有しないが、サブユ
ニット蛋白Ｔ２３４と組合せることによってインスリン
分泌促進活性を発現しつるところの百日咳毒素のサブユ
ニット蛋白Ｔ１００゜ ３、 ８ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による
分子量が約１０，０００で、アミノ酸組成及び組成比（
重鼠悌）が、Ａｓｐ ９．０． Ｔｈｒ ４．７゜Ｂａ
ｒ １３．０． Ｇｌｕ １６．５． （Ｊｌｙ １０
Ｊ、 Ａ１ａ５．２゜０７８２．６． Ｖａｌ ４．４
． Ｍｅｔ ３．０．工１ｅ ３．６． Ｌｅｕ６．８
． Ｔｙｒ ３．６． Ｐｈｅ ４．．８． Ｌｙｓ
４．０． Ｈｌｓ ３．８゜Ａｒｇ ４，０であり、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及び１３ＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において共に単一のバンドを与え
、単独では、白血球増多活性、ヒスタミン増感活性。 インスリン分泌促進活性のいずれも有しないが、サブユ
ニット蛋白Ｔ２３４と組合せることによってインスリン
分泌促進活性を発現しつるところの百日咳毒素のサブユ
ニット蛋白Ｔ５００゜
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57103777A JPS58222032A (ja) | 1982-06-18 | 1982-06-18 | 百日咳毒素のサブユニツト蛋白 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57103777A JPS58222032A (ja) | 1982-06-18 | 1982-06-18 | 百日咳毒素のサブユニツト蛋白 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58222032A true JPS58222032A (ja) | 1983-12-23 |
| JPH0123447B2 JPH0123447B2 (ja) | 1989-05-02 |
Family
ID=14362860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57103777A Granted JPS58222032A (ja) | 1982-06-18 | 1982-06-18 | 百日咳毒素のサブユニツト蛋白 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58222032A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988002754A1 (en) * | 1986-10-20 | 1988-04-21 | Trion Forskning- Och Utvecklings Aktiebolag | New peptides and applications thereof |
| WO1988004665A1 (en) * | 1986-12-22 | 1988-06-30 | Trion Forskning- Och Utvecklings Aktiebolag | A new pertussis toxin derived polypeptide and applications thereof |
| EP0296765A2 (en) * | 1987-06-24 | 1988-12-28 | Teijin Limited | Bordetella pertussis variants |
| JPS6485926A (en) * | 1987-06-24 | 1989-03-30 | Teijin Ltd | Mutant of bordetella pertussis |
| US4849358A (en) * | 1987-04-24 | 1989-07-18 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
| EP0747058A1 (en) | 1989-05-08 | 1996-12-11 | Evans Medical Limited | Acellular vaccine |
-
1982
- 1982-06-18 JP JP57103777A patent/JPS58222032A/ja active Granted
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988002754A1 (en) * | 1986-10-20 | 1988-04-21 | Trion Forskning- Och Utvecklings Aktiebolag | New peptides and applications thereof |
| WO1988004665A1 (en) * | 1986-12-22 | 1988-06-30 | Trion Forskning- Och Utvecklings Aktiebolag | A new pertussis toxin derived polypeptide and applications thereof |
| US4849358A (en) * | 1987-04-24 | 1989-07-18 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
| EP0296765A2 (en) * | 1987-06-24 | 1988-12-28 | Teijin Limited | Bordetella pertussis variants |
| JPS6485926A (en) * | 1987-06-24 | 1989-03-30 | Teijin Ltd | Mutant of bordetella pertussis |
| EP0747058A1 (en) | 1989-05-08 | 1996-12-11 | Evans Medical Limited | Acellular vaccine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0123447B2 (ja) | 1989-05-02 |
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