PT86423B - Processo para a preparacao de um novo polipeptido e suas aplicacoes em imunologia - Google Patents
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Description
TRION FCRSKNING- OCH UTVECKLINGS AKTIEBOLAG
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE LM NCVC PCLIPEPTIEO 7 SUAS APLICAÇÕES EM IMUNCLOGIA
A presente invenção refere-se a um novo rolipéptido, a um composto artificial, escolhido entre o novo peptido e seus análogos funcionais e derivados em eventual associação com um veículo, com a capacidade de se ligar a glicoconjugados, especialmente a imunoglobulinas, a antigénios de toxina pertussis artificiais,que consistem principalmente em sequências peptídicas que reagem com anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural escolhidos entre o novo polipéptido e suas frac^ões, a um conjunto de imunoensaio para diagnóstico que consiste num antigénio para díarmésti co, o qual reage com anticorpos induzidos pela toxina pertussis na tural, a uma composição de uma vacina que consiste em antígenos, como componente imunizante, escolhidos entre os referidos antigénios que reagem com anticorpos induzidos pela toxina pertussis na tural e a uma composição para um teste de pele intra-térmico que inclui antigénios escolhidos entre os antigénios que reagem com os anticorpos induzidos pela toxina pertussis nativa natural.
Antecedentes da Invenção:
No campo da imunologia sabe-se bem que a maior parte dos organismos biológicos produzem proteínas esreoíficas que de um medo selectivo e específico reconhecem várias proteínas e/ou estruturas carbo-hidratadas. Exemplos de tais proteínas específicas provenientes de bactérias são a Proteína A e a Proteína G as /
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/ * quais se ligam ambas a certas imunoglobulinas de várias origens. Exemplos de tais proteínas específicas derivadas de plantas ou de invertebrados inferiores são as designadas por lectinas que se ligam a estruturas carbo-hidratadas das imunoglobulinas e a outros glicoconjugados. Exemplos de tais lectinas são a concanavalina A, a glutinina do germe do trigo, fitohemaglutinina e a lectina pomacia Helix.
Cada uma das proteínas específicas referidas antes liga-se a grupos específicos das estruturas proteicas e/ou das estruturas carbo-hidratadas.
A presente invenção proporciona um composto artificial que possui a capacidade de se ligar a glicoconjungados em especial a imunoglobulinas.
Até ao presente momento não tinham sido identificados antigénios peptídicos que constituíam parte da toxina pertussis. Uma vez que esses antigénios não têm sido proporcionados, não tem sido possível desenvolver conjuntos de imunoensaio de diagnóstico compreendendo tais antigénios ou epitopes neles incluídos como antigénios de diagnóstico nem desenvolver vacinas contra a tosse convulsa baseadas nesses antigénios.
diagnóstico da tosse convulsa, com auxílio de antigénios dirigidos contra anticorpos da Bordetella pertussis ou proteínas produzidas pela B. pertussis, tem sido descrito, mas como antigénios de diagnóstico têm sido utilizados hemaglutininas das fímbrias (ver p. ex. Granstróm, M. Granstróm, G., Lindfors, A. e Askelof, P. 1982). Diagnóstico serológico da tosse convulsa por meio de um ensaio de imuno-absorção ligada a enzimas utilizando hemaglutininas das fímbrias, como antigénio (J. Infect. Dis. vol.
i i
146; 741 - 745) ou bactérias de B. pertussis submetidas a ultra-sons (ver p. ex. Goodman, Y. E. Nort A. J. e Jackson, F. L.1981). 0 ensaio de imuno-absorção ligado a enzima para a detecção da imunoglobulina A pertussis nas secressões naso faringicas têm sido utilizado como um indicador de infecção recente. J. Clin Microbiol. vol. 13: 286-292, e Viljanen, Μ. K., Ruuskanen, 0., Granberg, C. e Salmi, T. T. 1982. Para 0 diagnóstico Serológico da pertussis tem sido utilizado um ensaio de imunoabsorção ligado I a enzima que mede os anticorpos IgY, IgA e IgG anti Bordetella pertussis (ver Scand. J. Infect. Dís. vol. 14: 112-117)·
Como é do conhecimento dos técnicos as vacinas anti-tosse convulsa utilizadas correntemente nos Estados Unidos e em muitos outros países são constituídas por bactérias de Bordetella pertussis inactivadas. M. Pittman propôs em 1979 que a Toxina da tosse convulsa era uma exotoxina (Toxina pertussis), (v<sr Pittman, Y. 1979. Pertussis toxin: A causa de efeitos agressivos e imunidade prolongada da Tosse convulsa. Uma hipótese. Rev. Infect. Pis, vol 1:401-412) e são correntemente utilizadas no Japão vacinas acelulares constituídas por toxina pertussis inactivada.
Recentemente foi publicada uma sequência nucleotídica de Toxina pertussis (Locht, C. e Keith, J. M. 1986. Pertussis Toxin Gene: Nucleotide Sequsnce e Genetic Organizaiion, Science, vol. 232, p. 1258-1264). Neste artigo os autores sugerem que oligopep tidos sintéticos que incluem epítopes protectores Também poderão ser utilizáveis no desenvolvimento de uma nova geração de vacinas mas não indicam ou sugerem quais os epítopes.
Um outro artigo de publicação recente referindo os genes da toxina pertussis é. Nicosia, A. Peru-ini, Y., Franzini. C.,
Casagli, M. C., Borri, M. G., Antoni, G., Almoni, M., Neri, P., Ratti, G., e Rappuoli, R., 1986. Cloning and sequencing of the pertussis toxin genes: Operon structure and gene duplication. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., vol 83, 4631-4635. Nesta publicação estabelece-se que: a manipulação do gene de Toxina por engenharia genética pode ser uma via para produzir grandes quantidades de proteína destoxifiçada. Esta é apenas uma sugestão e não foi descrita qualquer manipulação do gene da Toxina.
Ainda outra publicação a este respeito é: Engstrõm, 0., Rodmalm, K., Jornvall, H. Lundquist, G., Kálmãn, M., Simonscits, A., Bartfai, T., Lõfdahl, S., e Askelõf, P., 1986. A caracterização da estrutura do N-terminal da subunidade S1 da toxina pertussis e hibridação de sondas oligodesoxi- ribonucleotídicas com um fragmento de DNA de Bordetella pertussis, referem-se em FEMS Microbiology Letters, vol. 36, 219-223. Também este artigo faz sugestões, nomeadamente 0 gene pode também ser introduzido noutros organismos para a produção da Toxina. A sequência do gene poderá permitir a síntese de péptidos que correspondem a epítopes antigénicos da Toxina e portanto permitir o desenvolvimento de uma vacina pertussis sintética. Contudo, os epítopes antigénicos da toxina pertussis não foram indentifiçados, sintetizados ou ensaiados.
Relativamente ãs composições para um ensaio da pele intradérmico destinadas a ensaiar a imunidade anti-pertussis não estão descritas até ao momento.
Descrição da presente invenção
Num aspecto da presente invenção proporciona-se um novo polipéptido de fórmula geral, f
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H-Á -Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-f er-Arg-Ár?’- S er-V a 1-A la- S er-A^-Y na qual cada X^ e X^ representa um resíduo de aminoácido que proporciona ligações facultativas e Y representa um grupo -OH ou
Exemplos de resíduos de aminoácidos opcionais sãc, a Lisina e a cisteína. Estes aminoácidos opcionais facilitam a liga yão de um veículo, tal como com albumina -e soro bobino, ao olipéptido referido.
peptido de acordo com esta invenção foi sintetizado de acordo com técnicas de fase sólida conhecidas.
Como é do conhecimento geral um peptido é sintetizado sob a forma ácida (CCOII) ou sob a forma amida (CCNH^) o que depende do aminoácido inicial ligado a resina disponível.
Num outro aspecto da presente invenção proporciona-se um composto artificial isolado ou associado com um veículo susceptível de se ligar a glicoconjugados o qual é escolhido entre um grupo constituído por um polipeptido de fórmula geral,
H-X^-Gln-Ihr-Arg-Ála-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X -Y na qual cada e X^ representa um resíduo de aminoácidos que proporciona ligações facultativas e v representa um grupo -CH ou -NH2; e os seus análogos e derivados funcionais.
Quando um composto da presente invenção está na forma associada a um veículo ele pode ser associado com qualquer veículo para poder ser ligado por meio de uma interacçãc- física ou
química tal como uma ligação covalente, uma ligação iónica, uma ligação de hidrogénio ou uma ligação hidrofébica.
São exemplos desses veículo os veículos minerais por exem pio como o vidro, hidróxido de alumínio, fosfato de cálcio, etc., superfícies plásticas, por exemplo, microplacas, pérolas, etc, 11pidos lipossomas, hidratos de carbono, aminoácidos, peptidos, proteínas, membranas ou suas fracções e células totais ou fracções destas.
A expressão glico-conjugado tal como aqui é utilizada durante a descrição da memória e reivindicações entende-se como incluindo glicoproteínas, glicolipldos, peptidog11canos e proteoglicanos, quer estejam isolados ou associados com um veículo quer ín vivo quer in vitro.
mecanismo de ligação não está completamente definido mas acredita-se que seguramente o composto de acordo com a presen te invenção se liga à fracção glico dos glicoconjugados definidos anteriormente ainda que também possam ocorrer outros sítios nos glico-conjungados que podem constituir sítios de igual importância na interacção do composto com os glico-conjugados. Também se aceita que a conformação da ligação do peptido da presente invenção em solução aquosa a pH com valores compreendidas entre 1 e 13 é responsável por esta ligação específica aos glico-conjugados.
Tendo em vista o que se referiu antes, o composto da presente invenção pode ser escolhido entre uma grande variedade de compostos desde que estes possuam uma capacidade de ligação a glico-conjugados (por exemplo glico-proteínas) semelhante à do peptido da presente invenção.
Portanto, a expressão análogos funcionais do péptido da presente invenção entende-se como abrangendo por exemplo mónomeros mais curtos ou mónomeros mais longos ou polímeros do peptido, (por exemplo fracções funcionais ou fragmentos funcionais ou polímeros das fracçÕes ou dos fragmentos do peptido) com ou sem substituição de um ou vários resíduos aminoácidos por outros aminoácidos desde que os análogos possuam uma capacidade de ligação a glico-conjugados, especialmente a glico-proteínas, como por exemplo imunoglobulinas, semelhante h do réptido da presente invenção.
Além disso, a expressão derivados funcionais do péptido desta invenção entende-se como abrangendo os compostos que possuem uma capacidade de ligação a ?lico-conjugados, especialnente glico-proteínas por exemplo imunoglobulinas, idêntica à do péptido da invenção. Exemplos de tais compostos são os compostos que possuem essencialmente a estrutura do peptido de acordo com esta invenção mas que possuem um ou vários resíduos de aminoácidos substituídos por outros grupes químicos, por exemplo, moléculas ou elementos orgânicos ou inorgânicos.
Uma vez que se aceita que é a estrutura de ligação do péptido desta invenção em solução aquosa a responsável pela ligação do peptido referido ao glico-conjugado definido segue-se que os análogos funcionais e derivados funcionais do peptido da presente invenção deverão incluir pelo menos uma estrutura que corresponda essencialmente à estrutura de ligação do referido péptido em solu ção aquosa.
No aspecto preferencial da presente invenção proporciona-se um composto artificial isolado ou associado com um veículo que é susceptível de ligação a imunoglobulinas e que é escolhido
num grupo constituído por polipéptidos de fórmula geral, H- X^-Gln-Thr-Arg-ala-A sn-P ro—sn-P ro-Tyr-Thr-Ser-Arg- Ar g- S e r-V a 1-A la- S sr-X^ - Ϊ na qual cada e representa um resíduo de um aminoácido que proporciona ligações facultativas e
Y representa um grupo -OH ou e os seus análogos e derivados funcionais.
I 0 polipéptido e os compostos de acordo com a presente invenção possuem propriedades altamente interessantes que o tornam extremamente útil no campo da imunologia.
composto da presente invenção liga-se a glico-conjugados, especialmente a glicoproteínas, por ex. inunoglobulinas e pode portanto ser utilizado sob uma forma associada a uma enzima ou num ensaio de imuno-absorção ligada à enzima (ELISA) em substituição dos conjugados utilizados convencionalmente nestes ensaios.
| 0 composto da presente invenção pode ser utilizado como um absorvente para glico-conju.gados, por ex. imunoglobulinas ou outras substâncias imunologicamente activas, por ex. ^2-microglo bulina. Como um absorvente pode ser aplicado ou utilizado para fluídos do corpo extra-corpóreos, in vivo, utilizando a plasmafó rese para eliminar imunocomplexos dos líquidos corporais. Outros exemplos da utilidade dos referidos compostos como absorventes na plasmaforese é o tratamento de doenças, por ex. alérgicas, leucemia e Sida.
Como um agente absorvente pode ainda ser utilizado in vitro para purificar anticorpos poli e monoclonais e outras subs2 / f
<______ >
tancias imunologicamente activas.
Também o composto da presente invenção associado com o veículo tem uma larga aplicabilidade in vitro no campo da imuno química. 0 veículo pode ser especificamente um marcador tal como partículas de ouro, ouro coloidal, enzimas, (por ex. a fosfatase alcalina ou a peroxidase de rábano), avidima, biotina ou alguns isotopos radioactivos como (por ex. o iodo).
composto da presente invenção liga-se a células com a£ tividade imunolégica e portanto, pode ser utilizado numa forma associada a um veículo para marcação (in vivo).
Exemplos de veículos para este efeito são diversos agen tes farmacêuticos, agentes citostáticos e hormonas. Uma aplica, ção de marcação com especial interesse é a marcação de vacinas ar tificiais, sintéticas e de subunidades para células imuno-compe, tentes· composto de acordo com a presente invenção pode também ser utilizado para o bloqueio de receptores em membranas célula res, propriedade esta que torna o referido composto útil para imunossupressão em doentes que receberam enxertos, tais como, um rim, fígado ou medula óssea.
Ainda uma outra propriedade de interesse do composto da presente invenção sob a forma livre, a sua actuação como factor de activação de linfócitos (LAF) e indução da mitose nas células e portanto o composto possui uma actividade adjuvante acentuada.
Num outro aspecto da presente invenção proporciona-se um antigénio de Toxina pertussis artificial que consiste principalmente em, pelo menos, uma sequência peptídica que reage com anti corpos induzidos pela toxina pertussis natural escolhido dentro /
/ η dum grupo constituído pelos polipéptidos de fórmula geral, H-X^-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Âsn-Pro-Tyr-Thr-Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X -Y, d
na qual cada e X2 representa um resíduo de aminoácido que proporciona ligações facultativas
Θ
Y representa um grupo -OH ou NH2
I ou suas fracções.
polipeptido de acordo com a presente invenção é capaz de induzir anticorpos em animais que reagem com a toxina natural. Uma vez que pode ser considerado como um antigénio, é provável que o polipéptído de acordo com a presente invenção englobe sequências peptídicas mais curtas as quais por sua vez induzem anticorpos que reagem coai a toxina pertussis natural.
antigénio da toxina pertussis artificial que reage com anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural de acordo com
I a presente invenção não incorpora necessariamente mais do que uma pequena sequência peptídica fazendo parte do polipeptido da presenteinvenção conjuntamente com o veículo ainda que seja preferível que incorpore diversas sequências peptídicas mais curtas.
A expressão antigénio de toxina pertussis artificial” tal como é utilizada nesta memória descritiva e nas reivindicações apensas entende-se como incluindo antigénios de Toxina pertussis que foram produzidos de um modo artificial, isto é, conse guidos devido ao esforço humano e não a causas naturais, indepen dente de recursos humanos. Ainda que a sequência peptídica que constitui ou que faz parte do antigénio de Toxina pertussis ar11
tificial de acordo com a presente invenção tenha sido sintetizado quimicamente de acordo com técnicas de fase sólida convencionais, as referidas sequências peptídicas podem ser produzidas utilizando-se outras técnicas isto é por síntese em fase líquida mediante ligação de um aminoácido ao seguinte de um modo habitual, por degradação, colonagem, etc, e entende-se que a expressão artificial tem que abranger os produtos produzidos por qual quer dessas técnicas.
I A designação consiste é utilizada nesta memória descritiva e nas reivindicações apensas para indicar alguma coisa que é incluída mas que não constitui necessariamente a única coisa incluída.
A expressão consiste principalmente em em conjunção com sequências peptídicas que reagem com anticorpos induzidos por toxina pertussis natural é utilizada para indicar que a capacidade do antigénio de toxina pertussis artificial para reagir com anticorpos induzidos pela Toxina pertussis natural deriva das re | feridas sequências peptídicas. A palavra veículo deve ser interpretada de um modo amplo e o veículo pode ser qualquer consti tuinte a que o péptido em questão possa estar ligado por interaç ção física/química tal como a ligação covalente, ligação iónica, ligação de hidrogénio ou ligação hidrofóbiea. Exemplos de tais veículos são por exemplo os veículos minerais como o hidróxido de alumínio, fosfato de cálcio etc, superfícies plásticas por exemplo microplacas, pérolas, etc, lípidos, lipossomas,hidratos de carbono, aminoácidos, péptidos e proteínas.
Ainda outro aspecto da presente invenção consiste em pro porcionar uni conjunto de imunoensaio de diagnóstico para a deter
minação d9 anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural numa amostra constituída por um líquido biológico. 0 conjunto inclui como um antigénio de diagnóstico, pelo menos um antigénio es colhido entre os antigénios artificiais que reagem com anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural de acordo com a presente invenção. Dependendo do imunoensaio utilizado para a determinação dos anticorpos induzidos pela tccdna pertusds natural, 0 canjmto pode incorporar outros reagentes apropriados, tais como, um veículo ao qual 0 referido antigénio de diagnóstico está ligado, uma amostra de soro padrão positivo, uma amostra de soro padrão negativo, um conjugado de enzimas, tais como, fosfatase alcalina ou peroxidase, substracto para 0 conjugado de enzimas, tais como, o paranitrofenilfosfato agar ou gel de agarose, antigénios marcados radioactivamente, soluções tampão e/ou soluções para lavagem.
Eventualmente todos os reagentes do conjunto são contidos em tubos de ensaio fechados separadamente ou ampolas-marcadas com os respectivos rótulos.
A amostra de líquido biológico é de preferência uma secreção naso-faríngea, saliva, sangue ou soro provenientes de um animal, como por exemplo de um ser humano.
Exemplos de imunoensaios em que 0 conjunto de acordo com a presente invenção pode ser utilizado, são, o ensaio de imunoabsorção ligado a enzima ELISA, ensaio de imunodifusão, radioimu noensaio (RIA) e imunoelectroforese (IE).
Quando se utiliza o ensaio ELISA, ensaio de imunoabsorção ligada a enzima, o conjunto de acordo com a presente invenção poderá consistir em:
a) um antigénio de diagnóstico da presente invenção,
b) eventualmente um veículo para o referido antigénio diagnós tico,
c) facultativamente uma amostra de soro padrão positiva,
d) facultativamente uma amostra de soro padrão negativa.
e) um conjugado de enzima,
f) um substrato para o referido conjugado de enzima, facultativo,
g) solução ou soluções tampão, facultativas e,
h) solução ou soluções para lavagem, facultativas.
guando se realiza um ensaio por imunodifusão ou imunoeleç troforese (ΙΕ) o conjunto de acordo com a presente invenção poderá incorporar os mesmos elementos que para ELISA, com excepção dos items referidos nas alíneas e) e f). Em sua substituição é necessário um gel, tal como um gel de agar ou um gel de agarose, mas este gel não é normalmente incluído no conjunto, uma vez que pode ser adquirido facilmente·.
guando se realiza um radioimunoensaio (RIA) o conjunto de acordo com a presente invenção poderá incluir os mesmos elementos que para o ensaio ELISA, com excepção dos items consignados nas alíneas e) e f) que deverão ser substituídos por antip-énios marca dos radioactivamente.
Eventualmente pode também incluir-se uma solução para pre cipitação do antigénio marcado radioactivamente ligado aos anticorpos tal como ácido tricloroacético ou anticorpos secundários.
Num outro aspecto adicional da presente invenção proporciona-se uma composição para uma vacina que utiliza como componente imunizante pelo menos um antigénio escolhido entre os antigénios de toxina pertussis artificial qpe reagem com os anticorpos f -* induzidos pela toxina pertussis natural de acordo com a presente invenção, de preferência numa quantidade eficaz para proteger um indivíduo da tosse convulsa, conjuntamente com um veículo e/ou diluente não tóxico, aceitável em farmácia. 0 veículo consiste num veículo tal como se definiu anteriormente e o diluente pode ser um diluente convencional utilizado na técnica, tal como uma solução salina. A composição da vacina de acordo com a presente invenção pode ainda incluir um adjuvante de antigénio numa quanti I dade que conjuntamente com a quantidade do referido antigénio é eficaz para proteger um indivíduo da tosse convulsa. Exemplos de agentes adjuvantes utilizados correntemente nas vacinas para seres humanos são os veículos designados por minerais, como por ex. fos fato de cálcio ou hidróxido de cálcio ou de alumínio, em que o antigénio em questão está absorvido. Como exemplo de um adjuvante para uma vacina de utilização veterinária é o adjuvante completo de Freund’s. A composição da vacina pode adicionalmente incorporar tampão ou tampões e/ou agente ou agentes conservantes apropria | dos e tampões e agentes conservantes adequados como os que estão inscritos na farmacopeia dos Estados Unidos, por exemplo.
Ainda um outro aspecto da presente invenção é proporcionar uma composição para um teste da pele intradérmico, que compreende pelo menos um antigénio escolhido entre os antigénios de Toxina pertussis artificial, que reagem com os anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural de acordo com a presente invenção numa quantidade eficaz suficiente para produzir uma reacção na pele imunológica com uma concentração de anticorpo específico num indi víduo, e um veículo e/ou um diluente aceitável em farmácia não tó xico. A composição para ensaio da pele, de acordo com a presente /
/' ** invenção, pode ainda incorporar agentes tampão e/ou conservantes como adequado .
Veículos utilizáveis, solventes, agentes tampão e agentes conservantes foram definidos anteriormente.
Síntese do péptido de acordo com a presente invenção
A síntese de fase sólida (Merrifield) de acordo com. a pre sente invenção foi realizada de um modo convencional,, por ligação de aminoácidos um ao outro, pelo que as ligações peptídicas se formam, iniciando-se com uma fase sólida (resina) à qual o C-terminal do primeiro aminoácido se liga, depois do que o C-terminal do amino-ácido seguinte, está ligado ao N-terminal do primeiro aminoácido, etc , finalmente o péptido construído é libertado da fase sólida.
Sintetizou-se especificamente o péptido seguinte:
íI-Lys-Sln-Thr-Arg-Ala-Asn— Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-OH.
Asíntese dos fragmentos peptídicos foi obtida utilizando-se um Biosearch Sam Two (Biosearch, Inc. Califórnia U.S.A.) utilizando-se uma máquina de síntese peptídica da versão 2,38 da software de síntese automática peptídica da Biosearch1s para t-BOC aminoácidos. Foram utilizadas constantes de ligação padrão (por defeito) para um grama de material inicial (grau de substição = 0,33 meg/g).
a resina utilizada para a síntese do péptido era uma Resi na Merrifield Padrão. Os aminoácidos protectores adequados foram:
Boc-Ala-OH (Boc-L-Alanina)
Boc-Asn-OH (Eoc-L-Asparagina)
Boc-Lys(Cl-Z)-OH
Ç Boc-e-o-Cloro-Benziloxi carbonil·-L-L izina)
Boc-Ser(Bzl)-OH (Boc-G-Benzil-L-Serina)
Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-0H (Boc-0-2,6-Diclorobenzil-L-Tyrosina)
Boc-Arg(Tos)-OH (a-Boc-Ií-Tosil-L-Arginina)
Boc-Gln-OH (Boc-L-Glutamina)
Boc-Pro-OH (Boc-L-Prolina)
Boc-Thr(Bzl)-CH (Boc-O-Benzil-L-Treonina)
Boc-Val-OH (Boc-L-Yalina)
Como para os pormenores relacionados com a concentração de aminoácidos, volumes dos solventes, tempos de reacção, etc , foram seguidas as indicações do fabricante (Biosearch).
Especificamente foram utilizados na síntese, cisão e purificação do péptido sintético as substâncias químicas referidas a seguir
| Substância | Grau | Fornecedor |
| Acetilimidazol | p. a. | Aldrich |
| Dimetilformamida | p. a. | Fluka |
Diisopropi1-etilamina
Ninidrina duplamen Áldrich te destilada a par tir de 1 g/1, em seguida 5 V1 de KÕH.
Substância
G-rau
Fornecedor
Os primeiros 10 / de destilado não foram aproveitados.
| Hidroxibenzil tria- | p. a. | Aldrich |
| zole | ||
| Cloreto de meti leno | HPLC | Fisons (UK) |
| Ninidrina | p. a. | Aldrich |
| F Hidróxido de potássio | p. a. | |
| Aminoácidos t-Boc | Bachem | |
| Acido fluorídrico | A GA | |
| Resorcinol | ||
| Sulfureto de dimetilo | ||
| Hidroxibenzil Triazole | p. a. (síntese) | Aldrich |
| Ácido Trifluoroacético | sequanal HPLC | Aldrich |
| Acetonitrilo | HPLC | Rathburn |
| Acido acético | p. a. | Merck |
| F 3ter etílico | Fluka | |
| 0 péptido ligado | à resina completo, | foi eliminado da câ- |
| mara de síntese e lavado | com metanol seco e | até peso constante |
sob vácuo.
Cisão do péptido a partir do suporte de resina
Foram transferidas frac^ões de 0,5 g de péptido ligado à resina lavado e seco para uma câmara de politetrafluoroetileno cilíndrica (PTFS) que continha 1 g de resorcinol 6,5 ml de sulfu reto de dimetilo e um magníto revestido com PTFE . A câmara foi ia /
V...arrefecida h temperatura de -80°C num banho de etanol gelo. Em seguida fez-se entrar na câmara ácido fluorídrico (num volume final de 1C ml e, em seguida mantida à temperatura de 0°C duran te 120 minutos sob agitação magnética. Em seguida eliminou-se o ácido utilizando-se urna bomba de aspiração de água. A câmara foi uma vez mais arrefecida até h temperatura de -80°C e adicionaram-se 10 ml de ácido fluorídrico (HF) na câmara, que foi colo cada sob uma agitação magnética à temperatura de 0°G durante 45 minutos. 0 ácido foi uma vez mais eliminado utilizando-se aspiração por meio de uma bomba de água e a mistura restante transfe rida para um filtro de vidro sinterizado, A mistura resina/péptido foi em seguida lavada com 100 ml de ácido acético a 10 / v/v e depois com 50 ml de éter dietílico. 0 ácido acético foi também lavado com ?0 ml de éter dietílico numa ampola de decantação e a fase etérea removida da fase aquosa. 0 éter das lavagens reunido e o ácido acético lavado, foram em seguida evaporados e liofilizados respectivamente e o produto peptídico isolado. 0 péptido foi recolhido apenas na fase aquosa.
produto bruto foi armazenado em ampolas de vidro num exsicaóor à temperatura ambiente.
Purificação do péptido sintético
Cs diversos componentes do produto sintético bruto foram separados mediante aplicação deste a uma coluna para cromatografia de alta pressão de sílica G-18 para de fase inversa utilizan do-se acetonitrilo/água (ácido Trifluoroacético (TFA) a 0,1 / / g v/v) como fase móvel. 20 a 100 mg de péptido bruto foram dissolvidos até 1 ml em água (TFA a 0,1 /) centrifugados e injeç tados numa ansa de um injector para HPLC Rheodyne de 1 ml (Califórnia, USA). A solução foi bombeada através de uma coluna C-lg de fase inversa Oligosil de 10 x 500 mm corrente (Skandinaviska Gsnetec, Sweden) utilizando-se um controlador de gradiente 2152 e duas bombas de HPLC 2150 (LKB, Sweden). 0 gradiente foi linear de 0 a 100 % de acetonitrilo durante 60 minutos. 0 débito era de 2 ml por minuto. A eluição do produto de síntese foi controlada a 206-238 nm, utilizando-se um monitor de absorção de comprimento de onda variável LKB 2131. As fracções foram recolhidas manualmente e repurificadas se necessário por liofilização as fracções mais importantes, redissolvidas e o processo de cromatografia repetido. 0 produto final foi liofilizado e conservado em ampolas de vidro à temperatura de -20°C.
Preparação do antigénio peptídico para imunoensaio péptido sintetizado antes foi ligado a um veículo, isto é, a albumina de soro bovino (BSA) do modo seguinte para formar um antigénio peptídico (antigénio revestido) que foi utilizado em ELISA.
Um mg do péptido e 3j6 mg de BSA firam dissolvidos em 2,C ml de tampão de cloreto de sódio tamponado com fosfato (PBS), de pH 7,4.
A esta solução adicionaram-se 30 microlitros de una solução aquosa a 2,5 % (p/v) de glutardialdeído.
A mistura reaccional foi incubada a temperatura ambiente (20-25°C) durante 1 hora, detida pela adição de 0,5 ml de uma so2C / X χ
lução aquosa de etanolamina 5 M e em seguida dialisada com um litro de PBS b temperatura de +4°C durante 4. horas com mudança do líquido de diálise após 3θ minutos e após 2 horas.
Sm seguida o conteúdo da câmara de .diálise foi filtrada por gel através de uma coluna de 2,5 x 60 cm que continha gel f T> \ de Sefacril v ' S-300 (Farmacia, Uppsala, Suécia) equilibrada com PBS. Recolheram-ss as fracções de 3,0 ml.
Reuniram-se as fracções que continham o material ligado | e este material foi utilizado para o ensaio ELISA, como antigénio de revestimento e adicionad.o directamente, sem qualquer diluição prévia, à microplaca.
Ensaio de imunoabsorção ligada a enzima (ELISA: s)
Em seguida faz-se uma descrição geral dos ensaios de
ELISA. 0 conjugado e a diluição do conjugado e o tempo decorrido antes das microplacas serem lidas pode variar entre os di versos ensaios. As diferenças são referidas após a descrição | geral.
Descrição geral do ensaio ELISA
Equipamento:
Microplacas tituladoras Dynatech, mod. nr 129B .
Antigénio para revestimento de microplacas, por exemplo, péptido e proteínas.
Tampão de revestimento: Solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS).
Tampão de incubação: PBS + Tween 20 a 0,05 p v/v.
Líquido de lavagem, aquoso: NaCl a 0,9 % + Tween 20 a 0,05
Soro: (por exemplo soro humano ou soro de animal de referência e soro de ensaio).
Conjugado (por exemplo fosfatase alcalina conjugada com anticorpos de anti-IgG humana desenvolvidos em suínos (Orion Diagnostica) e anticorpos de anti-IgG de coelho desenvolvidos na cabra (Sigma).
Substrato de enzima: comprimidos de p-nitrofenilfosfato (Sigma), 1 mg por ml de tampão de substrato (c. f. em seguida).
Tampão de suostrato: distanolamina aquosa 1M, pH 9,8 + 0,5 mM de MgClg + NaN a 0,02 % ·
Pipetas e tubos de ensaio.
Técnica:
1. - Revestimento das microplacas
As microplacas foram incubadas com 0,1 ml de antigénio em PBS à temperatura ambiente durante a noite (2C-2?°C)
2. - Incubação com albumina de soro bovino (BSA) e soro.
As placas foram lavadas quatro vezes e em seguida incubadas com G,1 ml de BSA a 1 $ p/v em PBS e h temperatura de 37°C durante uma hora. Após lavagem adicionou-se 0,1 ml de soro diluído de modo adequado em tampão de incubação, às ca vidades e as placas foram incubadas h temperatura ambiente durante uma hora.
3· - Incubação com um conjugado
Após lavagem, 0,1 ml de conjugado diluído de modo correcto em tampão de incubação foi adicionado às cavidades e a pia22
ca(s) foi incubada a temperatura ambiente durante 2 horas.
4. - Após lavagem adicionou-se às cavidades 0,1 ml de solução de substrato de enzima. As placas foram mantidas h temperatura ambiente e foi lida a absorção a 4θ5 nm após o tempo indicado a seguir.
Descrições específicas dos ensaios de imunoabsorção ligados a enzima, ELISA
I ensaio de imunoabsorção ligado ao enzima (ELISA) para avaliação da reacção entre o péptido sintético e os anticorpos era soros de coelho ou soros humanos ou a reacção entre o péptido sintético e apenas o conjugado.
péptido utilizado como antigénio de revestimento no ensaio ELISA foi primeiramente tratado como descrito na rubrica: Preparajão do antigénio péptídico para imunoensaio''.
As amostras do soro eram de dois coelhos diferentes (coelho 1 e coelho 2) e um soro humano (humano 1) e ainda de um conjunto de soros humanos de diferentes indivíduos, (humano 2). Os soros foram utilizados com uma diluição de 1/500. 0 conjugado utilizado consistiu em fosfatase alcalina conjugada na cabra com anti-Ig de coelho (Sigma) diluído a 1/500 ou por uma fosfatase alcalina conjugada no porco com anti-IgG humano (Orion Diagnostica) diluído a 1/1C0.
As placas foram lidas nos tempos indicados a seguir num leitor automático para ELISA, (Titertek, Multiscan).
• · ·
Os resultados foram os seguintes:
Soro Conjugado
Placas lidas após
Absorvência a 4-0 5 nm
| Coelho | 1 | anti-Ig de coelho conjugado na cabra | 3 minutos | 1,21 |
| Coelho | 2 | anti-Ig de coelho conjugado na cabra | 3 minutos | 1,05 |
| Humano | 1 | anti-IgG humano conjugado no porco | 20 minutos | 1,11 |
| Humano | 2 | anti-IgG humano conju gado no porco | 20 minutos | 1,26 |
| Nenhum | anti-Ig de coelho conju gado na cabra | 5 minutos | 1,23 | |
| Nenhum | anti-IgG humano conjugado no porco | 13 minutos | 0,8^ |
Uma vez que todos os resultados referidos anteriormente em todas as instâncias mostraram reacções positivas, estes dados apoiam o facto de os péptidos sintetizados reagirem com os soros quer de coelho, quer humanos - neste Ultimo caso com ambos os soros de um indivíduo (humano 1) assim como com um conjunto de soros humanos (humano 2) - e/ou nestas situações em que se uti lizou fosfatase alcalina conjugada na cabra com anti-Ig de coelho e, fosfatase alcalina conjugada no porco com anti-IgG humano respectivamente.
que o péptido sintetizado reagiu e se ligou ao conjugado respeetivo foi indicado adicionalmente pela capacidade de os conjugados isolados se ligarem ao oéptido. Que esta ligação não foi / / provocada pela interacção do péptido com a fosfatase alcalina nos conjugados foi provado numa experiência idêntica onde o enzima isolado foi utilizado e que não ss observou qualquer ligação.
Ligação específica do péptido sintetizado a IgG humana
A capacidade do péptido sintetizado para especificamente se ligar a IgG humana, foi ainda demonstrada na seguinte experiência:
péptido sintetizado, 0,5 mg foi aplicado numa coluna (r) 0 de Sefarosek } 4B (Farmacia, Uppsala, Suécia). 0 gel de Sefarose 4B activado com CNBr, 10 ml, tinha reagido previamente com um excesso, 80θ mg, de IgG humana durante a noite, h temperatura ambiente para imobilizar a IgG por uma ligação covalente. Verificou-se que 150 mg de IgG humana se tinham ligado dum modo covalen te ao gel matriz.
Aproximadamente 85 / do péptido sintetizado foi retido, isto é, ligado a esta coluna a um pH de 7,2 em PBS à temperatura de 4°C, assim como 'a temperatura de 25°C. A fracção do péptido sintetizado que não se ligou a coluna era constituída na sua maior parte por contaminantes, isto é, péptidos de outras sequên cias que se sabe muito bem ocorrerem conjuntamente com os péptidos quando estes são sintetizados de acordo com o processo de Merrifield.
Numa experiência de controlo em que se utilizou apenas gel de Sefarose^ 4b, 10 ml, xma cdhmaos sítios activados caa CNBr fo rara bloqueados com etanolamina (2 ml, de etanolamina 1 ¥ + 10 ml de PBS) à temperatura ambiente durante a noite.
Sm seguida o péptido sintetizado, 0,5 mg foi aplicado nu2j>
/ ( ” ma coluna e a coluna irrigada com PBS. Todo o péptido sintetizado foi recolhido no eluato.
Logo o péptido não se ligou à Sefarose^ ' 4b, mas a IgG humana ligada ao gel de Sefarosek ' 4B.
Mediante a utilização de uma coluna desse tipo (isto é, Sefarosek ' 4B IgG humana) é possível fraccionar o péptido(s) activo, a partir do péptido(s) inactivo.
A fracção de péptido activo pode ser eluída numa coluna
I mediante a adição de ácido acético aquoso a 1 % v/v. 0 réptido(s) eluído deste modo pode ainda ser reconstituído a pH 7,2 mostrando ainda ligar-se à mesma coluna.
Estas experiências consideradas conjuntamente confirmam ainda que o péptido sintetizado se liga de facto a IgG humanas experiências descritas anteriormente de ELISA.
Ensaio para a actividade de proliferação de linfccitos ou timócitos: Ensaio LA.F
Nesta experiência o péptido sintetizado ’de acordo com a presente invenção mostrou exibir actividade de proliferação de linfócitos ou de timócitos que é comparável à que é exibida por um agente mitogénico bem conhecido, isto é, pela fito-hemagluti nina.
Substância e equipamento utilizado nos ensaios
Meio: 90 ml de meio RPMI, Flow Laboratories ml de soro fetal de vitela, Sigma, USA ml de solução aquosa de L-Glutamina a 14,6 g/1 Sigma USA f
, ml de piruvato de sódio (100 ml·'), Gibco Limited, UK ml de Estreptomicina-Penicilina a 10.000 U/ml
Gibco Limited, UK
Mitogene Fito-hemaglutinina, PHA HA16 2 mg/5 ml H^O,
Wellcome Diagnóstics (Metil, 1 , 2 -3H)-Timidina: 4,44 Bq/nmole, 120 Ci/mmole
Amersham International plc, UK
Gás: ar com 4 de 00^, Grundgas B-stand, 0TC-20, AGA, Suécia. Centrifugadora: Centrifugadora clínica e IEC, 603 B
Câmara de climatização: WSDCO Incorp.orated, EZ-17MM
Placas de incubação: Nunclon Delta, InterMed, Dinamarca
Coleetor de células: Dynatech, nutomash 2000
Contador de cintilação: Beckman LS-100C sistema de cintilação líquida
Líquido de cintilarão: OptiPhase MP, LKB produkter AB, Suécia
Descrição do processo
Todos os processos foram realizados sob condições estéreis. Retirou-se o baço de um murganho NMRI e colocou-se em 5 ml de meio à temperatura ambiente. Em seguida o baço foi homogenei zado através dum peneiro de 100 mesh. 0 homogeneizado foi deixa do em repouso durante 2 minutos e a suspensão foi decantada do rendimento após cetrifugação das células durante 8 minutos a 1220 rpm. 0 sobrenadante foi desaproveitado e as células foram lavadas uma vez ainda por meio de suspensão e 5 ml de meio e
centrifugadas durante 8 minutos a 1220 rpm. A fracção sobrena dante foi retirada e foi feita a suspensão das células em 5 ml de meio. Diluíram-se as células a 1:100 e contaram-se numa câmara de BUrker e em seguida diluiram-se para uma concentração fi nal de 5 * 10 células/ml.
Ensgio^IAF
As fileiras mais externas das cavidades das placas de in cubação não foram utilizadas com as amostras, mas foram preenchi das com 200 pl de meio, a fim de se criar uma zona de temperatura estável. Os controlos negativos foram colocados em 12 cavidades por placa e consistiram em 100 jul de meio e 100 pl de suspensão celular. 100 jal das amostras foram colocados em novas cavidades e uma diluição em série a 1:2 nas restantes cavidades das placas. Fizeram-se pelo menos três réplicas para cada amostra. Como con trolo de referência utilizpu-se fito-hemaglutinina (PHA). Em ca vidades separadas adicionou-se em triplicado 2,5 Jig, 5 J^g ® 7 jug de PHA ao meio, assim como 1 pg e 10 pg de péptido, sintetizado de acordo com a presente invenção, ao meio.
A placa foi colocada num dessecador com água destilada no fundo e em seguida o ar foi substituído pelo gás mencionado anteriormente durante 2 minutos. Tapou-se o dessecador e em seguida colocou-se numa câmara de climatização e incubou-se à tem peratura de 37°C com uma humidade de 37% durante 48 horas. Apôs incubação adicionaram-se 25 jtil de 3H-timidina em cada cavi dade (0,010 jtiCi/cavidade) e a placa foi ainda incubada durante mais 16 horas na câmara de climatização.
Em seguida o conteúdo das cavidades foi quantitativamen te recolhido por meio de um colector celular e as amostras em en
saio foram recolhidas sobre um papel de filtro. Para se assegurar uma recolha completa das células, as cavidades foram lavadas três vezes com solução aquosa de cloreto de sódio a 0,9 $ p/v.
As células assim obtidas sobre o papel de filtro foram comprimidas e colocadas em ampolas de cintilação. Em cada ampola adicionou-se 6 ml de líquido de cintilação. As ampolas foram agitadas e deixadas a repousar durante 15 minutos antes de se medir a radioactividade com um contador de cintilação durante 5 minutos/por ampola.
Resultados:
Adições
Sem mitogene
PHA 2,5
PHA 5 /ig
PHA í JUg cpm em triplicado
600 - 870
6700 - 8100
9800 -10400
7000 - 8100
Péptido da presente invenção:
)ug 3000 - 4200 jug /000 - 8500
Os resultados referidos anteriormente mostram claramente que o péptido sintetizado de acordo com a presente invenção possui uma actividade de proliferação de Timócitos que é idêntica 4 exibida pelo mitogene PHA bem conhecido.
Imunização com 0 péptido sintético
Emsaio de imunoabsorção ligada a enzima (ELISA) para ava-
Ilação da reacção entre a toxina natural e anticorpos especificamente induzidos pela Imunização de murganhos com o péptido sintético de acordo com a presente invenção.
péptido utilizado como antigénio para a imunização de murganhos foi primeiramente tratado como se descreveu na rubrica Preparação do antigénio peptídico para imunoensaio.
Grupos de murganhos(NMRI) foram imunizados por via sub-cutânea com três doses de 0,5 ml afastadas num período de um | môs uma da outra do antigénio peptídico utilizando-se hidróxido de alumínio como veículo. As amostras de soro foram recolhidas dois meses após a tércêira dose. As microplacas para ELISA foram revestidas com toxina pertussis purificada com uma concentração de 1 ^ug/ml. Utilizou-se gelatina a 1 % para bloquear a ligação não específica em substituição de BSA (c.f. Descrição Geral de ELISA). C ponto de viragem da titulação dos soros foi determina do por diluições de dez vezes, iniciando-se com uma diluição a 1/20 e utilizando um valor de absorvãncia de 0,1 como extinção.
L 0 conjugado utilizado consistiu em conjugado em cabra de anti►
-IgG de murganho (Sigma) diluído a 1/500.
As placas foram lidas após 3θ minutos num leitor para ELISA automático (Titertsk, Multiscan).
Os resultados ensaios foram os seguintes:
| Ns | Eespostas | Título médio | Escala | |
| Péptido | ||||
| Sintético | 17 | 233^ | 320 - 40960 | |
| Controlo | 12 | 0 | 67 | 20 - 160 |
Dos resultados referidos antes, é evidente que o péptido sintético de acordo com a presente invenção é susceptível de induzir anticorpos após imunização que mostram uma abecrvência claramente mais elevada com as amostras após vacinação de que com as amostras antes da vacinação. Assim,o péptido ensaiado funcio na como um antigénio e induz anticorpos contra a toxina pertussis.
Como uma consequência pode-se estabelecer que a Toxina se liga de um modo específico aos anticorpos induzidos pelo péptido I sintético após imunização com as amostras de soro de murganho.
Além disso, os mesmos murganhos foram provocados com toxi na pertussis purificada (20 jug/por murganho = 5 x ΟΙ^θ) e verificou-se que a média de dias de sobrevivência estava em relação com o ponto de viragem da titulação
Quadro
Número de murganhos
Dias de sobrevivência (média)
Sndpoint de titulação
| 17 | 3*765 | 80 - 40960 |
| 15 | 4.000 | 320 - 40960 |
| 14 | 3.929 | 64o - 40>*60 |
| 10 | 4.600 | 1280 - 40960 |
| 8 | 4.875 | 2560 - 40960 |
| 6 | 5.333 | 5120 - 40960 |
| 3 | 6.333 | 10240 - 40960 |
Contrõlo
3-333 /
Como é evidente no quadro anterior a média de tempo de sobrevivência aumenta com os títulos de ponto de viragem mais elevado. Os murganhos que possuíam títulos elevados de anticorpos estão portanto parcialmente protegidos contra a inoculação.
Claims (9)
- Reivindicações1, - Processo para a preparação de um polipeptido de fórmula geralH-X^-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X^-Y na qual X^ eXj representam, cada um, um resíduo de um aminoãcido que proporciona ligações facultativas e Y representa um grupo -OH ou -NH^, caracterizado pelo facto de se realizar a síntese de acordo com . uma técnica em fase sólida ou em fase líquida madiante acoplamento de um aminoãcido com o seguinte, ou de se realizar uma degradação ou clonagem de acordo com técnicas convencionais apropriadas.
- 2, - Processo para a preparação de um composto artificial sob a forma isolada ou sob a forma de associação com um veículo, capaz de proporcionar ligação a glico-conjugados, caracterizado pelo facto de se sintetizar um composto escolhido no grupo constituído pelo polipeptido de fórmula geralH-X^-Gln^hr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X -Y £.na qualX e X representam, cada um, um resíduo de um aminoácido que proporciona ligações facultativas; e Y representa um grupo -OH ou~KH2, e os seus análogos e derivados funcionais, de acordo com uma técn£ ca em fase sólida ou em fase líquida mediante acoplamento de um aminoScido com o seguinte, ou mediante técnicas de degradação ou clonagem convencionais apropriadas, e de se ligar eventualmente o composto artificial assim obtido a um veículo por ligação covalente, ligação iónica, ligação de hidrogénio ou ligação hidrofóbica.
- 3,- Processo para a preparação de um composto artificial sob a forma isolada ou sob a forma de associação com um veículo, com capacidade para se ligar a imunoglobulinas, caracterizado pelo facto de se sintetizar um composto escolhido no grupo constituído pelo péptido de fórmula geralH-X -Gln-Thr-Arg-Ala-Ãsn-Pro-AEn'Prc,’Tyr’Thr·-Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X^-Y na qual _X £_X _rep.resent.am, .cada um, um resíduo -de .um1 2 aminoácido capaz de proporcionar ligações facultativas; e Y representa um grupo -OH ou -NH , e os seus análogos ou derivados funcionais, de acordo com uma técnica em fase solida ou em fase, líquida mediante acoplamento de ura aminoácido com o seguinte, ou mediante técnicas de degradação ou clonagem convencionais .apropriadas, e de se ligar eventualmente o composto artificial assim obtido a um veículo por ligação covalente, ligação iõnica, ligação de hidrogénio ou ligação hidrofõbica.
- 4,- Processo para a preparação de um antigénio de toxina pertussis artificial, caracterizado pelo facto de se sintetizar pelo menos uma sequência peptídica que reage com anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural escolhida no grupo que consiste no pçlipeptido de fórmula geralH-X^-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X2-Y na qual e representam, cada um, um resíduo de aminoácido que proporciona ligações facultativas; e Y representa um grupo -OH ou -NH^, ou as suas fracções, de acordo com uma técnica em fase sólida ou em fase líquida mediante técnicas de acoplamento de um aminoácido ao seguinte, ou mediante técnicas de degradação ou clonagem conven cionais apropriadas,H-X^Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X^-Y na qualΧχ e X2 representam, cada um,um resíduo de aminoácido que proporciona ligações.facultativas; eY representa um grupo -OH ou -NH2;ou as suas fracções, com um veículo e/ou diluente não tóxico, acei tãvel em farmácia.
- 9.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se incorporar, como ingrediente activo, o(s) referido(s) antigêneo(s) de toxina pertussis em uma quantidade eficaz para proteger um indivíduo da tosse convulsa.
- 10.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se incorporar também um agente adjuvante antigénico em uma quantidade que, em conjunto com o(s) referido(s) antigéneo(s) de toxina pertussis, é eficaz para proteger um indivíduo da tosse convulsa.I
- 11.- Processo de acordo com uma das reivindicações 8,9, ou 10, caracterizado pelo facto de se incluir ainda agente(s) tampão e/ou agente(s) conservante(s).
- 12.- Processo para a preparação de uma composição para um teste intradérmico, caracterizado pelo facto de se associar pelo menos um antigénio em uma quantidade eficaz para produzir uma reacção dêrmica imunológica para um anticorpo específico em um indivíduo, sendo o referido antigénio escolhido entre antigénios pertussis artificiais, que consistem principalmente em pelo menos uma sequência peptídica que reage com anticorpos induzidos · por pertussis natural escolhida no grupo constituído pelo polipéptido de fórmula geral:H-X^-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X2-Y na qual e X2 representam, cada um, um resíduo de um aminoãcido que proporciona ligações facultativas; eY representa um grupo -OH ou -NH2, e as suas fracções, com um veículo e/ou diluente aceitável em farmácia.
- 13.- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se incorporar ainda agente(s) tampão e/ou agente(s) conservante(s).
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