SE468716B - Ny peptid och immunologiskt aktiva foereningar - Google Patents

Description

.Ls O\ 10 15 20 25 30 35 -n 36 2 i vilken X1 och X2 vardera representerar en eventuell aminosyra-kopplingsenhet, och Y representerar -OH eller -NH . 2 Exempel på lämpliga aminosyra-kopplingsenheter är -Lys- och -Cys-. Dessa kopplingsenheter underlät- tar koppling av en bärare, sàsom bovint serum albumin, till peptiden.

Peptiden enligt uppfinningen har syntetiserats i enlighet med per se kända fastfastekniker.

Såsom är välkänt på detta område syntetiseras en peptid antingen i syraform (COOH) eller amidform (CONH2) beroende pá tillgänglig harts-bunden utgångs- aminosyra.

I en annan aspekt av uppfinningen ástadkommes en artificiellt framställd förening i fri eller bärar- -associerad form med förmåga att binda till glyko-kon- jugat, vilken förening är vald från den grupp som består av peptiden med formeln NH2-X1-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr- -Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X2-COY 1 och X2 vardera representerar en eventuell i vilken X aminosyra-kopplingsenhet, och Y representerar -OH eller -NH2; och funktionella analoger samt funktionel- la derivat därav.

Såsom uttrycket "artificiellt framställd förening", användes i denna beskrivning och tillhörande patentkrav, avses uttrycket inbegripa föreningar som har framställts på ett artificiellt sätt, dvs som åstadkommits genom human ansträngning och inte genom naturliga orsaker som är fristående från human medverkan. Ehuru före- ningen, specifikt peptiden, enligt uppfinningen har kemiskt syntetiserats kan föreningen framställas med användning av någon annan teknik, till exempel nedbryt- ning, kloning etc, och det avses att uttrycket "arti- 10 15 20 25 30 35 r> cn co -J .....\ 0 3 ficiellt framställd" skall täcka produkter som fram- ställts genom vilken som helst sådan teknik.

När föreningen enligt uppfinningen är i bärar- -associerad form kan den vara associerad med vilken som helst bärare till vilken den kan kopplas genom fysikalisk/kemisk interaktion, såsom kovalent bindning, jonbindning, vätebindning eller hydrofob bindning.

Exempel på sådana bärare är mineralbärare, till exempel glas, aluminiumhydroxid, kalciumfosfat, etc, plastytor, till exempel mikroplattor, kulor, etc, lipider, lipo- somer, kolhydrater, aminosyror, peptider, proteiner, membraner eller fraktioner därav och hela celler eller fraktioner därav.

Uttrycket “glyko-konjugat", såsom det användes i föreliggande beskrivning och patentkrav, avses inbe- griper glykoproteiner, glykolipider, peptidoglykaner och proteoglykaner, vare sig de är i fri eller bärar- -associerad form (både in vivo och in vitro).

Bindningsmekanism har inte ännu fastställts, men man tror bestämt att föreningen enligt uppfinningen binder till glykodelen hos de ovan definierade glyko-kon- jugaten, ehuru det också kan förekomma andra säten på glyko-konjugaten som kan vara av lika stor betydelse vid interaktionen mellan nämnda förening och glyko-kon- jugaten. Man tror vidare att det är bindningskonfor- mationen hos peptiden enligt uppfinningen i vattenhaltig lösning (pH-värden som sträcker sig från l till 13) som är ansvarig för denna specifika bindning till glyko-konjugaten.

Med hänsyn till det ovanstående kan föreningen enligt uppfinningen väljas från en mångfald olika föreningar så länge som de har en liknande förmåga att binda till glyko-konjugat (till exempel glykopro- teiner) som peptiden enligt uppfinningen.

Sålunda avses uttrycket "funktionella analoger" av peptiden enligt uppfinningen täcka bl a kortare O* CO 10 15 20 25 30 35 ...à '.}\ 4 eller längre monomerer eller polymerer av peptiden (till exempel funktionella fraktioner eller fragment, eller polymerer av fraktioner eller fragment av pep- tiden) med eller utan utbyte av en eller flera amino- syrarester mot andra aminosyrarester, så länge som analogerna har en liknande förmåga att binda till glyko-konjugat (särskilt glykoproteiner, till exempel immunglobuliner) som peptiden enligt uppfinningen.

Vidare avses uttrycket “funktionella derivat" av peptiden enligt uppfinningen täcka föreningar som har en liknande förmåga att binda till glyko-konjugat (särskilt glykoproteiner, till exempel immunglobu- liner), som peptiden enligt uppfinningen. Exempel gpá sådana föreningar är föreningar som har väsentligen samma struktur som peptiden enligt föreliggande uppfin- ning, men som har en eller flera aminosyrarester utbytta mot andra kemiska grupper, dvs organiska såväl som oorganiska molekyler eller element.

Eftersom man tror att det är bindningskonfor- mationen hos peptiden enligt uppfinningen i vattenhaltíg lösning som är ansvarig för bindningen av peptiden till de definierade glyko-konjugaten, så följer det härav att de funktionella analogerna och funktionella derivaten (av peptiden enligt uppfinningen) bör omfatta minst en konformation som motsvarar väsentligen bind- ningskonformationen hos nämnda peptid i vattenhaltig lösning. l Ordet "omfattar" användes här för att ange att någonting är inkluderat, men att detta någonting inte nödvändigtvis utgör det enda som inkluderas.

I en föredragen utföringsform av uppfinningen àstadkommes en artificiellt framställd förening i fri eller bärar-associerad form med förmåga att binda till immunglobuliner{ vilken förening är vald från den grupp som består av peptiden med formeln 10 15 20 25 30 35 _15.

Ch CO \\] __ .x f)\ NH2-X1-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr- -Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X2-COY i vilken X1 och X2 vardera representerar en eventuell aminosyra-kopplingsenhet, och Y representerar -OH eller -NH2; och funktionella analoger samt funktionella derivat därav.

Peptiden och föreningen enligt uppfinningen har i hög grad intressanta egenskaper som gör dem synnerli- gen användbara på immunologiområdet.

Föreningen enligt uppfinningen binder till glyko- -konjugat, särskilt glykoproteiner, till exempel immun- globuliner, och kan således användas i enzym-associerad form i ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) istället för konjugat som konventionellt användes i sådana analyser.

Föreningen enligt uppfinningen kan användas som en generell sorbent för glyko-konjugat, till exempel immunglobuliner eller andra immunologiskt aktiva sub- stanser, till exempel B2-mikroglobulin. Som en sorbent kan den sättas till eller utnyttjas för extrakorporeala kroppsvätskor (in vivo) när plasmaferes användes för att befria kroppsvätskan från immunkomplex. Andra exempel på föreningens användbarhet som en sorbent i plasmaferes är vid behandling av sådana sjukdomar som allergier, leukemier och AIDS.

Som en sorbent kan den vidare användas (in vitro) vid rening av poly- och monoklonala antikroppar eller andra immunologiskt aktiva substanser.

Vidare har föreningen enligt uppfinningen i bärar- -associerad form en vidsträckt tillämpbarhet (in vitro) på immunkemiområdet. Bäraren kan specifikt vara en markör (märksubstans), såsom guldpartíklar, kolloidalt guld, enzymer (till exempel alkaliskt fosfatas eller pepparrotsperoxidas), avidin, biotin eller någon radio- aktiv isotop, (till exempel jod).

-F>.

QX CO 10 15 20 25 30 35 w 6 Föreningen enligt uppfinningen binder till immuno- logiskt aktiva celler och följaktligen kan den användas i bärar-associerad form för málstyrning (in vivo).

Exempel på bärare i detta hänseende är olika farma- ceutiska medel, cytostatiska medel och hormoner. En tillämpning av málstyrning som är av speciellt intresse är málstyrning av artificiella och syntetiska vacciner samt subenhetsvacciner till immun-kompetenta celler.

Föreningen enligt uppfinningen kan vidare användas för att blockera receptorer på cellmembraner, en egen- skap som gör nämnda förening användbar för immunsup- pression hos patienter som erhåller transplantat, såsom njure, lever eller benmärg.

En ytterligare intressant egenskap hos föreningen enligt uppfinningen i fri form är att den beter som en lympfocytaktiverande faktor (LAF) och inducerar mitos i celler, och sålunda besitter föreningen en kraftig adjuvansaktivitet.

SYNTES AV PEPTIDEN ENLIGT UPPFINNINGEN Fastfassyntes (Merrifield) av peptiden enligt uppfinningen har utförts på konventionellt sätt, genom koppling av aminosyrorna till varandra, varvid pep- tidbindningar bildas, börjande med en fast fas (harts) till vilken den första aminosyrans C-terminal är kopp- lad, varpå den följande aminosyrans C-terminal kopplas till den första aminosyrans N-terminal etc. Slutligen frigörs den uppbyggda peptiden från den fasta fasen.

Specifikt syntetiserades följande peptid: NH2-Lys-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr- -Ser-Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-COOH Syntes av peptidfragmenten utfördes med användning av en Biosearch Sam Two (Biosearch, Inc. California USA) peptidsyntesmaskin, varvid version 2.38 av Bio- search's peptidsyntesautomatiseringsmjukvara för t-BOC- 10 15 20 25 30 35 7 -aminosyror användes. Standardkopplingskonstanter (default) användes för 1 g utgàngsmaterial (substi- tutionsgrad = 0,33 mekv/g).

Hartset som användes för syntes av peptiden var ett standard Merrifield-harts. De lämpligt skyddade aminosyrorna var: Boc-Ala-OH (Boc-L-Alanin) Boc-Asn-OH (Boc-L-Asparagin) Boc-Lys(CL-Z)-OH (Boc-e-o-Kloro-Bensyl- oxikarbonyl-L-Lysin) Boc-Ser(Bzl)-OH (Boc-O-Bensyl-L-Serin) Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH (Boc-O-2,6-Dikloro- bensyl-L-Tyrosin) Boc-Arg(Tos)-OH (a-Boc-N-Tosyl-L-Arginin) Boc-Gln-OH (Boc-L-Glutamin) Boc-Pro-OH (Boc-L-Prolin) Boo-Thr(Bz1)-OH (Boc-O-Bensyl-L-Treonin) Boc-Val-OH (Boc-L-Valin) När det gäller detaljer beträffande aminosyrakon- centration, lösningsmedelsvolymer, reaktionstider etc, följdes tillverkarens (Biosearch) rekommendationer.

Specifikt användes följande kemikalier som nedan uppräknas vid syntes, spjälkning och rening av den syntetiska peptiden. -lä- Cv'\ C 31 C)\ SUBSTANS Acetylimidazol Dimetylformamid Diisopropyletylamin Hydroxibensyltriazol Metylenklorid Ninhydrin Kaliumhydroxid t-Boc-aminosyror Vätefluorid Resorcinol Dimetylsulfid Hydroxibensyltriazol Trifluoroättiksyra Acetonitril Ättiksyra Dietyleter 8 KVALITET p.a. plafl Dubbeldestillerat från 1 g/1 nin- hydrin, sedan 5 g/l KOH. Första 10% destillat kasserades. p.a.

HPLC p.a. pIaI p.a. (syntes) sequanal (HPLC) HPLC p.a.

LEVERANTÖR Aldrich Fluka Aldrich Aldrich Fisons (UK) Aldrich Bachem AGA Aldrich Aldrich Rathburn Merck Fluka Den fullbordade, hartsbundna peptíden avlägsna- des från synteskammaren och tvättades med metanol, samt torkades till konstant vikt under vakuum.

Spjälkning av peptiden från hartsbäraren Portioner (0,5 g) av den tvättade och torkade hartsbundna peptiden överfördes till en cylindrisk (PTFE) polytetrafluoroetenkammare som innehöll 1 g resorcinol, 6,5 ml dimetylsulfid och en PTFE-belagd magnet. Kammaren kyldes till -80°C i ett torris-eta- 'I 10 15 20 25 30 35 468 71 9 nolbad. Fluorvätesyra (HF) (slutlig volym 10 ml) släpp- tes sedan in i kammaren, vilken därefter hölls vid 0°C under 120 min på en magnetomrörare. Därefter av- lägsnades syran med användning av en vattenaspira- tor. Kammaren kyldes återigen till -80°C och 10 ml HF släpptes in i kammaren, vilken placerades över en magnetomrörare vid 0°C under 45 min. Därefter av- lägsnades syran återigen med användning av en vatten- aspirator och den resterande blandningen överfördes till ett sintrat glasfilter. Harts/peptid-blandningen tvättades sedan med 100 ml 10 vol% ättiksyra och där- på med 50 ml dietyleter. Ättiksyratvättvätskan tvät- tades också med 50 ml dietyleter i en skiljetratt, och eterfasen avlägsnades från den vattenhaltiga fasen.

De sammanförda etertvättvätskorna och ättiksyratvätt- vätskan indunstades sedan respektive lyofiliserades, och peptidprodukten àtervanns. Peptiden återvanns endast från den vattenhaltiga fasen.

Ràprodukten lagrades i glasrör i en exsickator vid rumstemperatur.

Rening av den syntetiska peptiden Den råa syntesproduktens olika komponenter löstes upp genom att de applicerades på en högtryckskromato- grafikolonn med "reverse-phase" C-18 silika, med an- vändning av acetonitril/H20 (0,1 vol% trifluoroättik- syra (TFA)) som den mobila fasen. 20 pg- 100 mg av den råa peptiden löstes i upp till l ml H20 (0,l% TFA), centrifugerades och injicerades i en l ml slinga pà en Rheodyne (California, USA) HPLC-injektor. Lös- ningen pumpades genom en färdigpackad l0x500 mm Oligosil "reverse-phase" C-18 kolonn (Skandinaviska Genetec, Sverige) med användning av en 2152 gradientkontroller och tvâ 2150 HPLC-pumpar (LKB, Sverige). Gradienten var lineär från 0 till 100% acetonitril efter 60 min.

Flödeshastigheten var 2 ml/min. Elueringen av syn- tesprodukterna övervakades vid 206-238 nm med använd- r O CT\ CD 10 15 20 25 30 35 10 ning av en LKB 2131 absorptionsmonitor med varierbar våglängd. Fraktioner uppsamlades för hand och renades på nytt om så behövdes genom lyofilisering av de rele- vanta fraktionerna, àterupplösning samt upprepande av det kromatografiska förfarandet. Slutprodukterna lyofiliserades och lagrades i glasrör vid -20°C.

FRAMSTÃLLNING AV PEPTIDANTIGEN FÖR IMMUNOANALYS Den ovan syntetiserade peptiden kopplades till en bärare, dvs bovint serumalbumin (BSA) på följande sätt för att bilda ett peptidantigen (beläggningsan- tigen), vilket användes i ELISA. l mg peptid och 3,6 mg BSA löstes i 2,0 ml fosfat- buffrad fysiologisk saltlösning (PBS), pH 7,4.

Till denna lösning sattes 30 mikroliter av en 2,5% (vikt/vol) vattenhaltig glutardialdehydlösning.

Reaktionsblandningen inkuberas vid rumstempera- tur (20-25°C) under 1 h, stoppas genom tillsättning av 0,5 ml av en 5 M vattenhaltig etanolaminlösning och dialyserades sedan mot en liter PBS vid +4°C under 4 h, varvid dialysfluidumet utbytes efter 30 min och efter 2 h.

Därpå gelfiltreras dialyspàsens innehåll genom en kolonn (2,5x60 cm) innehållande SephacrylC> S-300 gel (Pharmacia, Uppsala, Sverige) som jämviktsinställts med PBS. 3,0 ml fraktioner uppsamlades.

De fraktioner som innehöll kopplat material sam- manfördes och det sammanförda materialet användes i ELISA som beläggningsantigen och sattes direkt, utan någon föregående utspädning, till míkroplattan.

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAYS (ELISA) Nedan följer en allmänn beskrivning av ELISA.

Konjugatet och konjugatets utspädning, samt den tid som förflutit innan mikroplattorna avlästes kan variera mellan de olika analyserna. Skillnaderna ges efter den allmänna beskrivningen. f> 10 15 20 25 30 35 -F C )\ CÛ \~1 ...x Cs* 11 êL-ëëëïí-ëêêßfššllëlëêl-YÄL-Iêê UTRUSTNING: Mikrotiterplattor (Dynatech, mod. nr l29B).

Antigen för beläggning av mikroplattor (t ex peptider och proteiner).

Beläggningsbuffert: Fosfatbuffrad fysiologisk saltlös- ning (PBS).

Inkubationsbuffert: PBS + 0,05 vol% Tween 20 Vattenhaltig tvättvätska: 0,9% NaCl + 0,05% Tween 20 Serum (t ex humana och animala referens- samt testsera) Konjugat (t ex alkaliskt fosfatas-konjugerat svin-anti- human IgG antikroppar (Orion Diagnostica) och get-anti- -kanin Ig-antikroppar (Sigma).

Enzymsubstrat: p-nitrofenylfosfattabletter (Sigma), l mg/ml substratbuffert (jfr nedan) Substratbuffert: lM vattenhaltig dietanolamin, pH 9,8, + 0,5 mM MgCl2 + 0,02% NaN3.

Pipetter och provrör UTFÖRANDE: l.

Beläggning av mikroplattor.

Mikroplattor inkuberades med 0,1 ml antigen i PBS vid rumstemperatur (20-25°C) över natten.

Inkubation med bovint serumalbumin (BSA) och serum.

Plattorna tvättades fyra gånger och inkuberades sedan med 0,1 ml av 1% (vikt/vol) BSA i PBS vid 37°C under l h. Efter tvättning sattes 0,1 ml serum som lämpligt utspätts i inkubationsbuffert till brunnarna och plattan (plattorna) inkuberades vid rumstemperatur under l h.

Inkubation med konjugat.

Efter tvättning sattes 0,1 ml konjugat som lämp- ligt utspätts i inkubationsbuffert till brunnarna och plattan (plattorna) inkuberades vid rums- temperatur under 2 h. _13.

CT- CZ*- 5 10 15 20 25 30 \J (j\ 12 Efter tvättning sattes 0,1 ml av enzymsubstrat- lösningen till brunnarna. Plattorna hölls vid rumstemperatur och absorbansen vid 405 nm avläs- tes efter den tid som nedan anges.

SPECIFIK BESKRIVNING AV ELISA ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAYS: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) för mätning av reaktionen mellan den syntetiska pep- tiden och antikroppar i kanin- eller humansera, eller reaktionen mellan den syntetiska peptiden och enbart konjugat.

Den peptid som användes som beläggningsantigen i ELISA behandlades först såsom beskrivits under "Framställning av peptidantigen för immunoanalys“.

Serumproverna var från två olika kaniner (kanin 1 och kanin 2) och frán en människa (human l) och från en sammanslagning av humansera från olika individer (human 2). Samtliga sera användes i en 1/500 utspädning. Det använda konjugatet var ett alkaliskt fosfatas-get-anti-kanin-Ig-konju- gat (Sigma) spätt l/S00 eller ett alkaliskt fosfa- tas-svin-anti-human-IgG-konjugat (Orion Diag- nostica) utspätt 1/100.

Plattorna avlästes vid de tidpunkter som nedan anges i en automatiserad ELISA-avläsningsappa- rat (Titertek, Multiscan).

Resultaten var följande: 10 15 20 25 30 35 ms O\ co ~a _..à QN 13 Serum Konjugat Plattor av- Absorbans lästa efter vid 405 nm Kanin l get-anti-kanin 3 min 1,21 Kanin 2 get-anti-kanin 3 min 1,05 Human l svin-anti-human 20 min l,ll Human 2 svin-anti-human 20 min 1,26 inget get-anti-kanin 5 min 1,23 inget svin-anti-human 13 min 0,84 Eftersom de ovan givna resultaten i samtliga fall visade positiva reaktioner understödjer dessa data att den syntetiserade peptiden reagerar med både kanin- och humansera - i det senare fallet báde med serum från en individ (human 1) och med en sammanslag- ning av humansera (human 2) - och/eller med i dessa fall använt alkaliskt fosfatas-get-anti-kanin-Ig-kon- jugat respektive alkaliskt fosfatas-svin-anti-human-IgG- -konjugat.

Att den syntetiserade peptiden reagerade med och band till respektive konjugat visades vidare av förmågan hos konjugaten ensamma att binda till pepti- den. Att denna bindning inte förorsakats av interak- tion mellan peptiden och alkaliskt fosfatas i dessa konjugat bekräftades i ett liknande experiment där enzym enbart användes och ingen bindning observerades.

SPECIFIK BINDNING AV DEN SYNTETISERADE PBPTIDEN TILL HUMANT IgG Den syntetiserade peptidens förmåga att specifikt binda till humant IgG visades vidare i följande expe- riment.

Den syntetiserade peptiden (0,5 mg) anbringades på en Sepharosec) 4B (Pharmacia, Uppsala, Sverige), kolonn. Den CNBr-aktiverade Sepharose" 4B-gelen (10 ml) ~R> en co 10 15 20 25 30 35 sa (j\ 14 hade i förväg bringats att reagera med ett överskott (800 mg) av humant IgG över natten vid rumstemperatur för att immobilisera IgG genom kovalent bindning. 150 mg humant IgG befanns vara kovalent bundet till gelmatrisen.- Ungefär 85% av den syntetiserade peptiden kvarhölls dvs band till denna kolonn vid pH 7,2 i PBS vid 4°C samt vid 25°C. Den fraktion av den syntetiserade pep- tiden som inte band till kolonnen omfattar sannolikt kontaminanter, dvs peptider med andra sekvenser. Det är välkänt att sådana kontaminanter uppträder när peptider syntetiseras enligt Merrifield.

I ett kontrollförsök som enbart utnyttjade Sepharoseqp 4B gel (10 ml) i kolonnen blockerades de CNBr-aktiverade sätena med etanolamin (2 ml, lM etanolamin + 10 ml PBS) vid rumstemperatur över natten.

Därefter anbringades den syntetiserade peptiden (0,5 mg) på kolonnen och kolonnen spolades med PBS.

Allt av den syntetiserade peptiden återvanns från eluatet.

Följaktligen band inte peptiden till Sepharose 4B som sådant utan till det humana IgG som bundits till Sepharoseqg 4B gel.

Genom att använda en sådan kolonn (dvs human- -IgG-Sepharosegp 4B) är det möjligt att fraktionera den aktiva peptiden (peptiderna) från den inaktiva peptiden (peptiderna).

Den aktiva peptidfraktionen kunde elueras från kolonnen genom tillsättning av 1 vol% vattenhaltig ättíksyra. Den sålunda eluerade peptiden (peptiderna) kunde efter àterinrättande av pH 7,2 återigen visas binda till samma kolonn.

Sammantagna understödjer dessa experiment vidare att den syntetiserade peptiden faktiskt band till humant IgG i de ovan beskrivna ELISA-experimenten. fw 10 15 20 25 30 35 4-68 716 15 ANALYS BETRÄFFANDE LYMFOCYT- ELLER TYMOCYT-PROLIFERANDE AKTIVITET: LAF-ANALYS I detta experiment visas den syntetiserade pepti- den enligt uppfinningen uppvisa en lymfocyt- eller tymocyt-prolifererande aktivitet, vilken är jämförbar med den som uppvisas av ett välkänt mitogen, dvs fyt- hemagglutinin. êuësëaaäss_9së_u§§u§§nin9_§9@_an!ëa§§_i_§aëly§§:në Medium: 90 ml RPMI-medium, Flow Laboratories 10 ml Fetalt kalvserum, Sigma, USA 2 ml Vattenhaltig L-glutaminlösning 14,6 g/liter, Sigma, USA l ml Natriumpyruvat (100 mM), Gibco Limited, UK 1 ml Penicillin-Streptomycin (10 000 enheter/ml), Gibco Limited, UK Mitogen: Phytohaemagglutinin, PHA HAI6 2 mg/5 ml H20, Wellcome Diagnostics (Metyl, l',2'-3H)-Tymidin: 4,44 Bq/nmol, 120 Ci/mmol, Amersham International plc, UK Gas: luft inkluderande 4% C02, Grundgas B-stand. OTC-20, AGA, Sverige Centrifug: IEC klinisk centrifug, 603 B Klimatskàp: WEDCO Incorporated, EZ-l7MM Inkubatíonsplattor: NUNCLON Delta, InterMed, Danmark Cellskördare: Dynatech, Automash 2000 Scintillationsräknare: Beckman LS-lO0C vätskescintil- lationssystem Scintillationsvätska: OptiPhase MP, LKB produkter AB, Sverige êsëk§i!§¿n9_s!-âë:§ë§ën§§§ Alla åtgärder utfördes under sterila betingelser.

Mjälten avlägsnades frán en NMRI-mus och place- rades i 5 ml medium vid rumstempreatur. Därefter homo- 10 15 20 25 30 35 Ch 16 geniserades mjälten genom ett 100 mesh trádnät. Homo- genisatet fick sedimentera i 2 min och suspensionen dekanterades från sedimentet, varpå cellerna centri- fugerades i 8 min vid 1220 r/min. Supernanten kassera- des och cellerna tvättades återigen genom suspendering i 5 ml medium och centrifugering i 8 min vid 1220 r/min. Supernanten kasserades och cellerna suspende- rades i 5 ml medium. Cellerna späddes 1/100 och räkna- des i en Bürker-kammare och späddes sedan till en slutkoncentration av 5xlO6 celler/ml. äèš:ënelx§ De yttre raderna av brunnar i inkubationsplat- torna användes inte för prover utan fylldes med 200 pl medium för att skapa en stabil temperaturzon. "Negativa" kontroller placerades i 12 brunnar/platta och bestod av 100 pl medium samt 100 pl cellsuspension. 100 pl prover placerades sedan i nya brunnar och en 1:2 serie- utspädning gjordes i plattans resterande brunnar.

Minst triplikat av proverna gjordes. Som en referens (kontroll) användes mitogenet fythemagglutinin (PHA).

Till separata brunnar sattes i triplikat 2,5 pg, 5 pg och 7 pg PHA i medium samt l pg och 10 pg av den synte- tiserade peptiden enligt uppfinningen i medium.

Plattan placerades i en exsickator som hade de- stillerat vatten på bottnen, varpå luften i exsickatorn utbyttes mot den ovannämnda gasen på 2 min. Locket sattes på exsickatorn, varpå exsickatorn placerades i klimatskápet och inkuberades vid 37°C, 90% luftfuktig- het under 48 h. Efter inkubationen sattes 25 pl 3H- -tymidin till varje brunn (0,010 pCi/brunn) och plattan inkuberades ytterligare 16 h i klimatskàpet.

Sedan skördades brunnarna kvantitativt medelst cellskördaren och testproverna uppsamlades på filtrer- papper. För att säkerställa fullständig skörd av celler- na tvättades brunnarna 3 ggr med O,9% (vikt/vol) vatten- haltig natriumkloridlösning. De sålunda pà filtrer- papperet skördade cellerna stansades ut och placerades 10 15 20 25 30 35 17 i scintillationsburkar. 6 ml scintillationsvätska sattes till varje burk. Burkarna skakades øch fick stå under 15 min före mätning av radioaktiviteten i scintillationsräknaren under 5 min/burk.

BÉELU Tillsättningar cpm (intervall av triplikat) Inget mitogen 600- 870 PHA 2,5 pg 6700- 8100 PHA 5 pg 9800-10400 PHA 7 pg 7000- 8100 Peptiden enligt uppfiningen: 1 pg 3000- 4200 10 pg 7000- 8500 De ovan angivna resultaten visar tydligt att den syntetiserade peptiden enligt uppfinningen upp- visar en tymocytprolifererande aktivitet vilken liknar den som uppvisas av det välkända mitogenet PHA.

Claims (3)

1. (IX CO se 10 15 20 25 30 ('i.~'\ 18 PATENTKRAV l. Peptid med formeln H-X1-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser- -Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X2-Y 1 och X2 vardera representerar en eventuell kopplingsunderlättande amínosyrarest, -OH eller -NH . 2

2. Artificiellt förening i fri eller bärar-associ- i vilken X och Y representerar erad form med förmåga att binda till glyko-konjugat, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är vald från den grupp som består av peptiden med formeln H-X1-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser- -Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X2-Y 1 och X2 vardera representerar en eventuell i vilken X kopplingsunderlättande aminosyrarest, och Y representerar -OH eller -NH2; och funktionella analoger och funktionella derivat därav omfattande minst en konformation som motsvarar väsentligen bindningskonformationen hos nämnda peptid i vattenhaltig lösning.

3. Artificiell förening i fri eller bärar-associerad form med förmåga att binda till immunglobuliner, k ä n - n e t e c k n a d därav, att den är vald från den grupp som består av peptiden med formeln H-X1-Gln-Thr-Arg-A1a-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser- -Arg-Arg-Ser-ValfAla-Ser-X2-Y i vilken X1 och X2 vardera representerar en eventuell 10 19 kopplingsunderlättande aminosyrarest, och Y representerar -OH eller -NH2; Q och funktionella analoger och funktionella derivat därav omfattande minst en konformation som motsvarar väsentligen bindningskonformationen hos nämnda peptid i vattenhaltig lösning.