JPH06293799A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 細胞付着性ポリペプチドを得ること。 【構成】 以下の配列： 【化１】 のＮ末端から数えて１０番目のPro周辺の親水性部分に
相同性のあるアミノ酸配列を有し、細胞付着性を有する
ポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、フイブロネクチン
（fibronectin）に関係したポリペプチドに関し、特に
細胞表面と相互に作用して細胞表面への付着を促進する
人の血漿フイブロネクチンのポリペプチド・フラグメン
トに関する。

【０００２】

【従来の技術】フイブロネクチンは、約450×10³ダルト
ン（原子質量単位）と大きな糖タンパク質であって、い
くつかの独立した官能ドメインからなる。初期のフイブ
ロネクチンは細胞外マトリックスの主タンパク質として
発見された。そしてそれは、試験管内でコラーゲン、グ
リコサミノグリカン、プロトグリカン、フイブリノーゲ
ン、フイブリンおよびアクチンのような他の構成分子、
並びに細胞表面と相互に作用することが示された。フイ
ブロネクチンは、浮遊細胞のコラーゲンへの付着を促進
すると共に、このコラーゲンへの結合とは無関係に。浮
遊細胞の組織培養基質への直接付着を促進することが発
見された、従って、細胞表面と相互に作用するフイブロ
ネクチンの分野についての研究が続けられてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明により、フイブ
ロネクチンの細胞付着を促進する活性を具体的に示すフ
イブロネクチンのポリペプチド・フラグメントが単離、
精製された。そしてそれは次式を有する11.5kDalの（キ
ロダルトン）ペプチドとして特徴づけられる：

【０００４】

【化３】

【０００５】このペプチドは108個のアミノ酸残基を有
しうる。そして細胞付着、生物学的活性を有するそのペ
プチドまたはそのフラグメントは、細胞が付着する基質
の調製に使用することができる。そのような基質は細胞
培養皿に有用であると共に、ある種の細胞を表面へ引き
付けるところの人体における移植用医療プロテーゼ（補
綴）装置に用いるのに有効である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】ポリペプチドを定義する
ために使用した命名法はSchroderおよびLubke（"ThePep
tides",Academic Press(1965)）によって明記されたも
のであり、従来の表示に従ってＮ−末端は左側そしてＣ
−末端は右側に示される。アミノ酸残基が異性体の形を
もつ場合には、表示されるのはＬ形のアミノ酸である。

【０００７】本発明は次の式を有するポリペプチドを提
供する：

【０００８】

【化４】

【０００９】そして同一の細胞付着活性を有する前述の
分離フラグメント、例えば次の合成フラグメントを含む
ことを意図している：

【００１０】

【化５】

【００１１】上記フラグメントとして同一の細胞付着活
性を有するより短いフラグメントも細胞が付着する表面
を提供するのに有用であり、本発明に含まれる。さら
に、ペプチドを表面に結合することが、ある場合にＣ−
末端におけるCys（システイン）残基を添加することに
よって細胞付着促進活性に影響を与えることなく促進さ
れる。

【００１２】ペプチドまたはそのフラグメントは適当な
方法、例えば独占的固相法、部分的固相法、フラグメン
ト縮合法、または古典的溶液添加法によって合成するこ
とができる。さらに、その合成は最近開発された組換え
DNA法によっても行われる。

【００１３】ペプチドの化学合成に共通することは、種
々のアミノ酸部分の活性側鎖基を適当な保護用基（その
基が最終的に除去されるまでのその位置で化学反応が生
じるのを防ぐ基）での保護である。また、一般に、カル
ボキシル基において反応し、α−アミノ保護基の選択的
除去をしてその位置で後続の反応をさせる間、アミノ酸
またはフラグメントのα−アミノ基も保護される。従っ
て、一般に、合成の１工程としてペプチド連鎖に所望の
配列で配置されたアミノ酸残基の各々を含む中間化合物
が生成される、これらの種々の残基は側鎖保護基を有す
る。一般に、これらの保護基は、次に所望の生成物を得
るべく実質的に同時に除去される。

【００１４】ペプチドは、前述の種々の化学合成法も使
用されるけれども、例えば、メリフイルド（Merrifiel
d,J.Am.Chem.Soc.,85.2149(1964)参照）によって開示さ
れたような固相合成法によって調製するのが望ましい。
固相合成法は、リビエル（Ｒｉｖｉｅｒ）らによる1982
年１月21日付け米国特許第4,244,946号に開示されてい
るように、保護されるα−アミノ酸を適当な樹脂へ結合
することによって、ペプチドのＣ−末端から始まる。こ
の一般的な形式の合成例は米国特許第4,305,872号およ
び第4,316,891号に示されている。ベールら（Vale et.
al ）の論文、すなわちScience,213,1394-1397（1981年
９月）には、41−残基のポリペプチドの固相合成が論議
されている。それはさらに詳細な合成の論議をしてお
り、マルキイら（Marki at al）らの論文であるJ.Am.Ch
em.Soc.,103,3178(1981)にみられる。

【００１５】ペプチドの合成において、適当に保護され
るα−アミノ基を有するMet（メチオニン）はクロロメ
チル化ポリスチレン樹脂などに結合される。メチルチオ
ールの側鎖は任意に保護または保護されないままであ
る。Cys（システイン）をＣ−末端に用いる場合、それ
は、そのα−アミノ基およびスルフヒドリル側鎖を保護
した後で樹脂に結合される。α−アミノ保護基の除去
後、塩化メチレンにトリフルオロ酢酸を使用するような
合成における次の工程を行なう。特定のアミノ保護基を
除去する他の標準開裂用試薬および条件が、前記単行本
「ペプチド」に記載されているように使用される。

【００１６】次に、アミノ酸を保護する残りのα−アミ
ノおよび側鎖を所望の順序で段階的に結合して樹脂に結
合された中間化合物を得る。合成において各アミノ酸を
別々に添加する別の方法としては、固相反応器に添加す
る前にそれらのいくらかが相互に結合される。適当な結
合試薬の選択は技術的な問題である。

【００１７】所望のアミノ酸配列を完成した後、中間ペ
プチドは、樹脂からペプチドを開裂するのみならず残り
の側鎖保護基を総て開裂する液体HFのような試薬で処理
することによって樹脂担体から除去される。次に、ポリ
ペプチドは、リビエールらの論文（Rivier et al.,Pert
ides:Struetuve and Biological Function(1979),pp.12
5-128）に記載されているように、半調製のHPLC（高性
能液体クロマトグラフィー）を伴うゲルパーミエーショ
ンによって精製することができる。少なくとも93％また
はそれ以上の純度（存在する全てのペプチドを基準にし
た値）が適度に得られ、この純度は臨床試験や使用に望
ましい値である。約98％と高純度が実際的であるが、あ
る種の試験管での用途には、さらに低純度が受け入れら
れる。従って、ポリペプチドは、この用途のためには、
存在する全てのペプチドを基準にして少なくとも約50重
量％を意味するからなりの純粋であるときに特に有用で
あると考えられる。

【００１８】

【実施例】

実験Ｉ 材料および方法 フイブロネクチンの細胞付着ドメインは、前述のように
精製した（Pierschbacher, M.D. et al,(1981)Cell 26,
259-267参照）。分子量の定量は、10〜20％のポリアク
リルアミドの濃度勾配を用いた硫酸ドデシルナトリウム
・ポリアクリルアミドのゲル電気泳動および超遠心分離
によって行った。超遠心分離は６−場所のアルミニウム
・ロータを備えた分析用遠心分離機（MSE Centriscan(T
M)）で行った。１cmの単一セクター・セル内の３mmカラ
ムで低速平衡沈降法を適用した。部分的特定体積はアミ
ノ酸の組成から計算した。

【００１９】フラグメンテーション法 メチオニン残基での開裂は、70％ギ酸中100倍（モル）
過剰の臭化シアンで試みた。

【００２０】アスパルチル・ボンドにおける酸開裂は、
密閉した真空管内の希塩酸中で110℃において２時間行
った。その試料は次に凍結乾燥した。

【００２１】トリプトファン残基における開裂は、等体
積の88％ギ酸とヘプタフルオロ酪酸中、数千倍（モル）
過剰の臭化シアンでタンパク質を処理することによって
行った。

【００２２】Staphylococcus aureus VSプロテアーゼ
（Miles,Elkhart,1N）の消化は、0.1％硫酸ドデシルナ
トリウムを含む0.1M重炭酸アンモニウム中で酵素と基質
との比１：50（W/W）を用いて行った。

【００２３】サーモリシン（TM）（Calbiochem, La Jol
la,CA）の消化は、酵素と基質との比１：100（W/W）で
５mM塩化カルシウムを含む0.1M重炭酸アンモニウム中で
45℃において１時間行った。その消化はEDTAを添加する
ことによって停止した。

【００２４】カルボキシペプチダーゼＡの消化は、0.1
％硫酸ドデシル・ナトリウムを含む0.1M重炭酸アンモニ
ウムに溶解された細胞付着フラグメントを処理すること
によって行った〔カルボキシペプチターゼＡ（Sigma,S
t.Louis,MO)〕での酵素と基質との比は１：500（W/W）
であった）。種々の時点で一部を取り出し、最終濃度50
％に酢酸を添加することによって反応を停止させた。こ
れらの材料は次に凍結乾燥して、遊離アミノ酸を分析し
た。基質を含まないブランクの消化は平行して行った。

【００２５】ペプチドの精製 セファデックスG-75（TM）特級品またはセファクリルS-
200（TM）（PharmaciaA.B.,Uppsala,Sweden）のゲル・
クロマトグラフィーを最初の精製工程として採用した。
G-75カラムを平衡させて0.1M重炭酸アンモニウムで溶離
した。S-200カラムは６M塩酸グアニジンで行った。それ
以上の精製は、μ−ボンダパーク（Bondapak）C₁₈−カ
ラム（TM）に関する逆相液体クロマトグラフィー（Wate
rs〔Millford,MA〕二重ポンプ勾配のクロマトグラフィ
ー装置）によっておこなった。ペプチドの溶離には0.1M
重炭酸アンモニウム中0〜80％のエタノールの60分の直
線勾配を用いた。それはLDCスペクトロモニターIII（T
M）の可変波長検出器を使用して波長230nmにおける吸光
度によって測定された。

【００２６】ペプチドは、0.1％フェノールを含む６Ｎ
塩酸中で110℃において24時間加水分解し、ベックマン
（TM）121Mアミノ酸分析装置（Tragrdh,L,et al(197
0)）で分析した。セリンおよびトレオニンの値は、加水
分解中のロスは標準補正係数を用いて、またそのままの
細胞付着フラグメントの場合には24.48および72時間の
加水分解時間を用いて零時間への直線外挿法によって補
正を行った。トリプトファンは分光光度法で定量した。
システイン酸としてシステインの定量には過ギ酸の酸化
を用いた。

【００２７】アミノ酸配列の分析 自動エドマン分解は、ベックマン122974迅速タンパク質
ファドロール（TM）プログラムを使用したベックマン
（TM）890Ｃシーケンサーで行った。クアドロール（N,
N,N',N'-テトラキス（2-ヒドロキシプロピル）エチレン
ジアミンの商品名）の濃度は0.5Mであった。アミノ酸の
フェニルチオヒダントインの同定および定量は高性能液
体クロマトグラフィー（HPLC）で行った。

【００２８】結 果アミノ−末端アミノ酸配列 そのままの細胞付着ドメインの自動アミノ酸配列の分析
は最初の50残基の明瞭な同定をさせた。

【００２９】化学的フラグメンテーション アスパラチル（aspartyl）結合における開裂のための希
塩酸での細胞付着フラグメントの処理は、数種のペプチ
ドを生成した、その中のいくらかは凍結乾燥後不溶性で
あった。0.1Mの重炭酸アンモニウムに可溶性のペプチド
は、セファデックスG-75（TM）のカラムで１つの主ピー
クと４つの小ピークに分別された。アミノ酸の組成デー
タおよびA₂ペプチドの配列分析は残基87〜107の同定を
させた。0.1M重炭酸アンモニウムに不溶性の部分は6Mの
塩酸グアニジンに溶解し、6M塩酸グアニジンで平衡させ
たセファクリルS-200（TM）（Pharmacia AB,Sweden）の
カラムで分別した。これは、57残基ペプチド（フラグメ
ントA₁）の単離をさせた、そして自動エドマン分解法の
53サイクルは細胞付着フラグメントの残基30〜83のアミ
ノ酸配列を生じた。

【００３０】１つのフラグメントはトリプトファン配向
臭化シアンの開裂から均一に精製した。アミノ酸分析は
それが全細胞付着フラグメントのアミノ−末端28残基で
あることを示した。自動配列分析はこの領域のフラグメ
ントがアミノ酸配列であることを確認した。

【００３１】完全な細胞付着フラグメントのアミノ酸組
成およびそれから化学的フラグメンテーションによって
誘導した他のペプチドを次表に挙げる。部分A₂における
微少汚染物質はアミノ酸組成と、見出された残基の実際
の数との間に若干の不一致をもたらした。しかしなが
ら、自動配列分析における良好な収率並びに他のペプチ
ドとの広範囲の重量はこのペプチドの配列を明瞭にす
る。

【００３２】

【表１】

【００３３】メチオニンにおける開裂のための臭化シア
ンでの処理は検出可能なフラグメンテーションをもたら
さなかった。これは、アミノ末端配列にメチオニンが見
られなかったから、単一のメチオニン残基がカルボキシ
末端に、またはその直ぐ近くに位置していることを示
す。

【００３４】酵素の消化 全細胞付着フラグメントのカルボキシペプチターゼAに
よる消化によって、５分でタンパク質１モル当り１モル
のメチオニンを放出した。それはこのアミノ酸をカルボ
キシ−末端残基として決定した。

【００３５】２つの小ペプチドが、セファデックスG-75
クロマトグラフィーの後、S.aureusV8プロテアーゼ消化
から単離された。それらのアミノ酸組成から、それらが
それぞれ分子のアミノ−末端部分とカルボキシ−末端部
分に由来することは明らかである。アミノ酸配列の分析
は酸開裂フラグメントのカルボキシ−末端部分の配列を
確認した。

【００３６】セファデックスG-75（TM）のクロマトグラ
フィ、続く高性能液体のクロマトグラフィーによる熱分
解消化物から多数のペプチドが単離された。

【００３７】熱分解ペプチドのアミノ酸配列データは他
の配列ペプチドから得たデータを確認した。

【００３８】全ポリペプチドが細胞付着活性により測定
された所望の生物学的活性を示すこと、およびポリペプ
チドのあるフラグメントも実質的に同一の細胞付着活性
を示すことがわかる。従って、108-アミノ酸残基ポリペ
プチドのそれら生物学的に活性のフラグメントは、発明
の構成部分、例えば合成、試験そして全配列と同じ活性
を示すことがわかったＣ−末端における30−残基フラグ
メントと考えられる。Ｃ−末端における30−残基フラグ
メントと考えられる。Ｃ−末端におけるCys-残基を有す
るまたは有さない全ペプチド、または生物学的に活性の
フラグメントは、表面の処理に使用することによって細
胞を付着する基質を提供するために細胞付着タンパク質
として使用することができる。合成プラスチック樹脂材
料、例えばニトロセルロースのようなセルロース・エス
テル、または同じような材料の表面は、細胞付着を確実
にするために本発明のポリペプチドで処理することがで
きる。細胞付着用の同様の基質は、ポリペプチドを固体
担体、例えばガラスや合成プラスチック樹脂、またはポ
リペプチドに結合できる反応性基を含むアガロースのよ
うな長鎖多糖類にポリペプチドを共有結合で結合させる
ことによって生成させることができる。この方法は、ペ
プチド並びに合成30−残基フラグメントを臭化シアン−
活性化アガロース・ビード〔Pharmacia Fine Chemicals
(Uppsala,Sweden)社により商品名セファロースで販売さ
れている〕に結合させ、それらのビードを高圧滅菌によ
って殺菌し、しかる後にポリペプチドのコーティングが
受動的吸収によって得られる値よりも高濃度で細胞をそ
れらビードに付着さすのを誘導することを示すことによ
って証明された。

【００３９】細胞の付着位置の構造をさらに規定するた
めには、４つの合成ペプチドを考案した。各配列は11.5
-kDalフラグメントから29または30のアミノ酸の配列を
含む、共にこの全領域を構成する。これらのペプチドを
使用して、COOH末端の30のアミノ酸がフイブロネクチン
の11.5-kDalの細胞付着性フラグメントの細胞付着活性
を説明することが示された。

【００４０】実験II 材料および方法ペプチドの原料 前述のゼラチン−セファロース・クロマトグラフィーを
使用することによって、新しく吸い出した血漿から人の
フイブロネクチンを得た。フイブロネクチンの消化から
11.5-kDalのペプチドを単離した。メリフィルドの固相
法を用いて４つのペプチドを化学的に合成した。その合
成はペニンスラ研究所（San Carlos,CA）に与えられた
仕様書に従って行った。合成ペプチドのデザインは、各
配列が11.5-kDalの細胞付着フラグメントのアミノ酸配
列に従って、隣接ペプチドと共通の３または４つのアミ
ノ酸を有するものであった。各ペプチドは、11.5-kDal
のフラグメントからの一連の29または30のアミノ酸とCO
OH末端におけるシステインを有して、ペプチドの固体相
への結合を促進する。ペプチドの組成はアミノ酸の分析
によって実証された。ペプチドは、11.5-kDalフラグメ
ントのNH₂末端から始まるローマ数字で数えられる（第
１図）。

【００４１】ペプチドのポリスチレンへの結合 ４つの合成ペプチドはプラスチックの培養皿内で次のよ
うに細胞付着活性の試験をした。各ペプチド１mgをpH8
0.2mg/mlの濃度で6Mの尿素に溶解した。ペプチドは次
に、リン酸塩緩衝化塩類で平衡させた5mlセファデック
スG-25カラムを通すことによってこれらの反応物質を除
去した。ペプチドを含む部分は収集し、プールして、細
胞付着分析に使用した。未処理のポリスチレン製ミクロ
タイター板に設けた複数の縦穴（well）は、それらの穴
に20μg/mlの溶液を室温で２時間温置することによって
ウシの血清アルブミン（以下アルブミンを記す）で被覆
または被覆されなかった。付着しないタンパク質を除去
するために、それらの縦穴を洗浄した後、そのアルブミ
ン被膜を先ず３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル（Ｓｉｇｍ
ａ）、二官能架橋剤で室温において30分間、10μg/mlで
誘導し、次に還元されたペプチドを含む溶液を種々の濃
度で前記縦穴に添加して、少なくとも１時間反応させた
（架橋剤は主にアルブミン内のアミノ基と反応し、続い
てペプチド内のシステインを介してペプチドをアルブミ
ンに橋かけする）。未付着のペプチドを除去するためく
り返し洗浄をした後、ミクロタイター板は細胞付着分析
に使用した。ペプチドで直接被覆した縦穴における細胞
付着は、アルブミンの結合したペプチド、アルブミンの
結合したフイブロネクチン、フイブロネクチン単独、ま
たは誘導されたアルブミン単独で見られるものと比較し
た。

【００４２】ペプチドのセフアロース・ビードへの結合 ４つの合成ペプチド並びにフイブロネクチンの11.5-kDa
lのフラグメントおよび２００−ｋＤａｌのフラグメン
トを製造業者の仕様書に従って臭化シアンで活性化した
セフアロース−6MBビード（Pharmacia）に結合させた。
それらのペプチドは先ず前述のように還元されて、セフ
アロース1ml当りペプチド8mgで使用された。アルブミン
を被覆したビードおよびエタノールアミンで誘導したビ
ードは対照試料として使用した。

【００４３】細胞付着の分析 細胞付着の分析は、人のフイブロブラストまたは普通の
ネズミの腎臓（ＮＲＫ）でルオスラテイらの論文（Ruos
lahti,E.et al(1981)Methods Enzymology82,803〜831）
に記載されているように行った。要約すると、10個の細
胞を含む単一細胞けん濁液100mlをペプチドの１つまた
はフイブロネクチンで被覆した平底のミクロタイターの
縦穴に入れた。37℃で１時間後、未付着細胞は洗浄して
除去し、付着細胞は固定し、計数のために着色した。あ
る実験においては、媒質に可溶性のペプチドを添加し
て、付着中にその存在が阻止作用を有するか否かを決め
た。アガロース・ビードへの細胞付着は、全く前述のよ
うに丸底ミクロタイターの縦穴の底におけるビードの一
層に関して行った。

【００４４】ペプチドのヨウ素化 周知のクロルアミン−Ｔ法を用いてペプチドII、III、I
Vの50ｇをそれぞれ0.33mCi（１Ci（キュリー）＝3.7×1
0Bq）のＩ（ヨウ素）で識別した。未結合のヨウ化物は
除去し、セファデックスG-25のカラムを通すことによっ
て定量した。

【００４５】結 果 細胞付着に及ぼす作用を研究した４つの合成ペプチドを
第１図に示す。分裂、およびそれによる細胞識別位置を
失う可能性を避けるために若干の重量が含まれた。ペプ
チドはポリスチレンのミクロタイター縦穴へ直接吸着さ
せられたか、或いは二官能架橋剤を使用することによっ
てそれらのCOOH末端のシステイン残基を介してアルブミ
ンを被覆したポリスチレンに付着させられた。このよう
に誘導された表面は次に細胞の付着を支える能力を試験
した。第２図はそれらの実験結果を示す。

【００４６】フイブロネクチンの11.5-kDalの細胞付着
フラグメントのCOOH−末端の30のアミノ酸（およびシス
テイン残基）からなるペプチドIVは、アルブミンに結合
または表面に直接吸着されたＮＲＫの細胞および人のフ
イブロブラストの付着を助けた。しかしながらアルブミ
ンへの結合はこのペプチドの活性を著しく増した。アル
ブミンに結合された場合、20ngとわずかのペプチドIV
が、１つのミクロタイター縦穴当りに検出された（第２
図参照）。一方、ペプチドＩ、II、およびIIIはこの分
析では活性を有さなかった。全フイブロネクチンの活性
は架橋剤で誘導したアルブミンで基質の前処理には無関
係であった。タンパク質が直接またはアルブミンを介し
てプラスチックに結合したか否かのフイブロネクチンに
対する結合曲線は類似したので、プラスチックに結合し
たフイブロネクチンを使用して得たデータのみを示す。

【００４７】不活性ペプチドの活性欠除がポリスチレン
表面への結合不足のためでないことを確認するために、
ペプチドII、III、およびIVを放射性ヨウ素化して、ミ
クロタイターの縦穴中で一晩温置した。第３図は、これ
ら３つのペプチドは全てミクロタイターの縦穴に同じ程
度に結合することを示す。ペプチドIVが他のペプチドよ
り少し弱い結合であるのは、多分それが最も親水性であ
るためと考えられる。３つのペプチドのポリスチレンへ
の結合は、対応する非標識化ペプチドによって抑制する
ことができた。これは放射性ヨウ素化がこの種の表面へ
の結合能を変えなかったことを示す。その上、細胞は非
標識化ペプチドで見られるものと同一の放射線量依存法
で¹²⁵Ｉ−標識化ペプチドIVに付着した。試験は、可溶
性の形でのペプチドIVの存在がコノペプチドまたはフイ
ブロネクチンを被覆したミクロタイター縦穴への細胞の
付着を抑制するか否かを決定するために行った。しかし
ながら、150μｇ／mlまでの濃度におけるペプチドIVは
１時間後にこれらの表面への細胞の付着に影響を与えな
かった。

【００４８】ペプチドIVに見られた活性の特異性を確認
するために、全てのペプチドを臭化シアンで活性化した
セファロース６ＭＢへ結合した。４つのペプチドの結合
効率は全て、紫外線吸収を基準にして判定したものより
90％以上大であった。ペプチドIVを結合したビートは、
11.5-kDelフラグメント全体またはフイブロネクチンの2
00-kDalフラグメントでビードにしたように、細胞の付
着を助けた。後者のフラグメントは、フラグメントで被
覆されたビードの安定性および生物的活性が高いので、
そのままのフイブロネクチンの代りに使用した。エタノ
ールアミンまたはアルブミンで誘導されたアガロース・
ビードは、それらの表面にペプチドＩ、、IIまたはIII
を有するビードのように、細胞付着活性を欠いた。

【００４９】データは、フイブロネクチンの細胞付着活
性の大部分（全てでない場合）を30のアミノ酸残基によ
って説明できることを示す。これはそのままのフイブロ
ネクチン・ポリペプチド単量体の約１％に過ぎないの
で、細胞表面とフイブロネクチン分子のこの部分との間
の極めて特異な相互作用を推測することができる。活性
ペプチドのペプチドIVは、フイブロネクチンの細胞付着
ドメインを構成する４つの合成ペプチドの中で最も親水
性である。一方ペプチドIIおよびIIIは極めて疎水性で
あって、ペプチドＩは中間の特性を示す。多分、これが
そのままのフイブロネクチン分子の対応する部分の表面
にさらされるペプチドIVの30の残基をもたらし、フラグ
メントのこの部分における活性の存在と一致する。

【００５０】ペプチドIVは疎水性のポリスチレン表面と
親水性のセファロース・ビードを含む３つの異なるタイ
プの表面に活性であったことに注目することが大切であ
る。これは、我々が細胞により引きつけさせる表面のあ
る種の非特異的改良をさせなくする。この意見は、我々
がこれら表面への異なるペプチドの結合が類似し、しか
もペプチドIVのみが細胞の付着に有効なことを示すこと
ができたことによって一層強められた。その上、このペ
プチドは特異な高活性を有した。架橋剤で誘導したアル
ブミンがペプチドのポリスチレン表面への結合の媒介に
使用されたとき、ペプチドIVはモルを基準にしてそのま
まのフイブロネクチン自体と殆ど同じ位活性であった。
ぺプチドIVがポリスチレンのマイクロタイター縦穴の直
接被覆に使用されたとき、細胞付着の促進においてその
ままのフイブロネクチンで見られるものと同一の効果を
得るためには、約10倍のモル量を必要とした。これは、
結合の結果として機能のそう失のためであるか、或は大
きなフイブロネクチン分子に比較してこのペプチドのポ
リスチレンへの結合の相対的な非効率または可逆性を反
映するものであろう。

【００５１】フイブロネクチンの細胞付着場所と相互に
作用する細胞表面における成分（受容体）の性質は知ら
れていない。ここに、開示されたデータは、個々の細胞
表面受容体または受容体の類が存在することを強く示唆
している。合成ペプチドまたは活性の場合その短い誘導
体はこの受容体の同定に有効である。ペプチドIVのプロ
リン残基NO.10の周囲の親水性部分におけるペプチド鎖
に曲がり（ねじれ）が予想される。これは細胞との相互
作用に利用されるループをもたらす。次の実験は後で論
議するようにこの結果を確認した。

【００５２】十分に理解されない理由であるが、フイブ
ロネクチンの細胞付着機能の発現はフイブロネクチンが
プラスチックの表面やコラーゲンのマトリックスのよう
な固相に結合された細胞に提供されることが必要である
が、可溶性のフイプロネクチンは細胞へ分離自在に結合
しない。可溶性ペプチドIVが細胞の固定されたペプチド
IVまたはフイブロネクチンへの付着を阻止しないことに
おいてペプチドIVは同様に振舞う。生産的な相互作用に
は細胞表面といくつかのフイプロネクチン分子との共同
結合が必要のようである。細胞表面にさらに強く結合す
るこのペプチドの類似体を作ることが可能であろう。こ
れはフイブロネクチンに対する細胞表面受容体の同定を
促進するのみならず、細胞付着を変えさせるであろう。

【００５３】周囲の組織との結合を促進するために最適
の細胞培養および種々の補綴物質用の表面調製のような
実際的な応用ももくろむことができる。30のアミノ酸の
ペプチドは１つ以上の結合場所を有するようであるか
ら、今扱うことができる問題の１つは、フイブロネクチ
ンと全ての種類の細胞との相互関係がこの同一領域の分
子を含むか否かである。例えば、血小板はそれらの表面
に異なるメカニズムによってフイブロネクチンを結合す
る。これは、このペプチドを細胞付着の調節に使用する
こと、または補綴物質の設計において重要な部分であ
る。それは、生体内においてフイブロネクチンのはたす
役割も明らかにするであろう。

【００５４】（作用効果）培養基質の細胞付着ポリペプ
チドでの被覆は媒質にフイブロネクチンの使用を不要に
し、従って培養の条件をより良好に規定すると共に、再
現性を良好にする。細胞付着表面の商的使用の１例とし
て、フアルマシア社で製造されたシトデックス（Ｃｙｔ
ｏｄｅｘ）粒子はゼラチンで被覆される。それによって
同数の付着性細胞を皿内で可能な体積よりも著しく小さ
い体積で成長させることを可能にする。これらビードの
活性は一般に成長媒質におけるフイブロネクチンの使用
に依存する。そして細胞付着ポリペプチドはそのような
目的に対して優れた化学的に規定された被覆を提供する
ことが期待される。

【００５５】生体内で細胞を表面に引き付けたり、或い
は移植前に特定の表面に所望の細胞の成長を促進さすよ
うな基質を使用させる医用装置を設計することができ
る。そのような方法の例は、一般にポリエステル繊維、
特にダクロン繊維（ポリエチレン・テレフタレート）か
ら織るまたは編んだ補綴血管または空胞皮片に内皮細胞
の成長を誘導する方法である。殆どの種類の細胞はフイ
プロネクチンおよびこのポリペプチドに引き付けられる
が、特に内皮細胞およびフイブロプラスト細胞はフイブ
ロネクチンに引き付けられる。後者の事項は、事故や手
術の傷口の閉鎖およびゆ合を助けるためにパッチ移植皮
片などの被覆においてこの規定されたポリペプチドの潜
在的な有用性を示す。そのような場合、コラーゲン、グ
リコサミノグリカンまたはプロテオグリカンのような生
物学的分子にペプチドを結合するのが有利である。例え
ば、Ｃ−末端にCys残基を有する30−残基フラグメント
を単量体コラーゲンに結合する。これは、３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルのような架橋剤を使用して、システイン
をコラーゲンのリシン残基に橋かけすることによって行
うことができる。また、それは、一時的また半永久的に
体内、例えば血管または腹膜腔内に挿入する目的の補綴
器具（経皮器具とも呼ばれる）の表面を被覆することに
おいてその価値を示す。本発明は、例えば細胞付着の促
進に塗布される点眼液またはローション、または軟膏或
いはゲルのような液体の形、または他の便利な形にされ
る。フイブロネクチンはフイブロブラストおよびマクロ
ファージに対して走化性であるように示された。この活
性は細胞付着ドメインの存在に関係する。ここに記載し
た合成ペプチドおよびその類似特性のフラグメントの細
胞付着活性の明示は走化性（又は化学走性）、活性であ
る。

【００５６】以上、本発明を２、３の望ましい実施態様
に関して説明したが、当業者には明らかなように請求の
範囲に限定されている発明の範囲を逸脱することなく種
々の変化および改良が可能であることを理解されたい。
例えば、他の基によってアミド化または置換されるよう
に、ｃ−末端に遊離酸を有する必要がない。本発明の特
徴は次の請求の範囲において強調される。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、細胞付着を誘導する11.5kDalのフイ
ブロネクチン・フラグメントの周知配列の後で考案され
た４つの合成ペプチドを示す。これらのペプチド・フラ
グメントの開裂からの残基に対応する。図示の線は２つ
のペプチドに共通するアミノ酸を示す。

【図２】第２図は、人のフイブロネクチン（HFN）また
は合成ペプチドを被覆したポリスチレン製ミクロタイタ
ー縦穴に普通のネズミの腎臓（ＮＲＫ）細胞を付着する
ことを示すグラフである。それぞれの縦穴において、１
０個の細胞が１時間温置され、そして付着した細胞を計
数した。フイブロネクチンおよびペプチドＩ、II、III
およびIVは、ポリスチレンに直接吸着されたとき、およ
びアルブミン（ＢＳＡ）に結合されたとき分析した。ア
ルブミン単独も試験した。フイブロネクチンのモル数は
１つのサブ・ユニット（２４０kDal）の分子質量を用い
て計算した。細胞はフイブロネクチンおよびペプチドIV
を含む縦穴に付着するが、他のペプチドまたはアルブミ
ンのみを含む縦穴には付着しない。

【図３】第３図は、ヨウ素標識化ペプチドII、III、お
よびIVのプラスチック・ミクロタイター縦穴への結合を
示すグラフである。各縦穴において結合されたペプチド
の量は各ペプチドの特定放射能から計算した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルースラチ．エルキ アイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92024 オリーベンハイン．ビア デル セリト 262

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞付着活性を有するポリペプチドであ
   って、 以下に示すアミノ酸配列のＮ末端から数えて第１０番目
   のプロリン残基（Pro）周辺の親水性部分に相同性のあ
   るアミノ酸配列を有するポリペプチド： 【化１】
2. 【請求項２】 基質表面への細胞付着を促進させる方法
   であって、 該基質表面に細胞付着活性を有するポリペプチドを付着
   させることを包含し、 該ポリペプチドが、以下に示すアミノ酸配列のＮ末端か
   ら数えて第１０番目のプロリン残基（Pro）周辺の親水
   性部分に相同性のあるアミノ酸を配列有する、方法： 【化２】
3. 【請求項３】 請求の範囲第２項に記載の方法であっ
   て、前記基質表面は補綴器具の表面である。
4. 【請求項４】 請求の範囲第２項に記載の方法であっ
   て、前記基質表面は合成樹脂繊維の表面である。
5. 【請求項５】 請求の範囲第２項に記載の方法であっ
   て、前記基質表面は経皮器具の表面である。
6. 【請求項６】 請求の範囲第２項に記載の方法であっ
   て、前記基質は固体基質である。
7. 【請求項７】 請求の範囲第６項に記載の方法であっ
   て、前記固体基質はガラス、合成樹脂または長鎖の多糖
   類である。
8. 【請求項８】 請求の範囲第７項に記載の方法であっ
   て、前記固体基質は合成樹脂である。
9. 【請求項９】 請求の範囲第８項に記載の方法であっ
   て、前記固体基質はニトロセルロースまたはポリエステ
   ルである。
10. 【請求項１０】 請求の範囲第６項に記載の方法であっ
    て、前記固体基質はアガロースである。
11. 【請求項１１】 請求の範囲第２項に記載の方法であっ
    て、前記ポリペプチドはコラーゲンに結合された形で前
    記基質に付着させる。
12. 【請求項１２】 請求に範囲第２項に記載の方法であっ
    て、前記基質は管移植皮片であり、前記ポリペプチドは
    該管移植皮片に結合された形で付着し、その一部分を形
    成する。
13. 【請求項１３】 請求の範囲第２項に記載の方法であっ
    て、前記ポリペプチドは液体、ローション、軟膏または
    ゲルの形で前記基質に付着させる。