JP2690767B2

JP2690767B2 - フィブロネクチン活性を有するポリペプチド

Info

Publication number: JP2690767B2
Application number: JP63507449A
Authority: JP
Inventors: フルヒト、レオ・ティー; マッカーシー、ジェイムズ・ビー
Original assignee: リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・ミネソタ
Priority date: 1987-08-25
Filing date: 1988-08-24
Publication date: 1997-12-17
Anticipated expiration: 2012-12-17
Also published as: DE3880139T2; EP0366728B1; EP0366728A1; US5019646A; AU605637B2; CA1305084C; DE3880139D1; JPH03500046A; AU2385988A; WO1989001942A1

Description

【発明の詳細な説明】関連出願に関する相互参照この出願は、1987年８月25日付けのアメリカ合衆国特
許出願第89073号の一部継続出願である。

助成に関する情報この発明は、ナショナル・インスティテュート・オブ
・ヘルスからの給費番号CA21463の助成を受けて為され
た。政府は、この発明においてある種の権利を有する。

発明の背景ほ乳類細胞の細胞外マトリックスへの接着は、成長、
接着、運動性および適切な細胞表現型の発生の調節にお
いて基本的に重要である。このことは、正常な発達、傷
の治癒、慢性炎症性疾患および腫よう転移と密接な関係
を有する。過去数年間にわたって蓄積された証拠は、正
常細胞および形質転換細胞の両方の接着に関する分子的
基礎が複雑であり、恐らく幾つかの独特な細胞表面分子
が含まれ得ることを示唆している。細胞外マトリックス
は、３タイプの巨大分子、すなわちコラーゲン、プロテ
オグリカンおよび非コラーゲン糖蛋白質により構成され
る。細胞接着に関して最も熱心に研究されてきた細胞外
マトリックス分子は、血しょう、細胞マトリックス、基
底板および細胞表面に存在する非コラーゲン細胞接着糖
蛋白質のフィブロネクチンである。フィブロネクチンの
血しょう形態は、450000ダルトンの分子量を有するジス
ルフィド結合した２量体により構成される。各々約2200
00ダルトンである２種のサブユニット鎖（「Ａ」および
「Ｂ」）は、還元条件下で観察される。以後、フィブロ
ネクチンのこの形態を「フィブロネクチン」と称する。

細胞外マトリックスの他の成分の場合と同様に、フィ
ブロネクチンは、分子上の独立した領域を介してそれ自
体、他のマトリックス成分および細胞表面へ結合する能
力を有する。例えばフィブロネクチンは、浮遊した細胞
のコラーゲンへの結合を促進する。（L.T.ファークト、
「モダン・セル・バイオロジー」、B.サティア編、アラ
ン・アール・リス、インコーポレイテッド、ニューヨー
ク、第Ｉ巻（1983年）、53−117頁参照）。フィブロネ
クチン内の一接着配列の一次構造は、初めはモノクロー
ナル抗体データおよび直接配列分析を用いてM.D.ピエル
シュバッヒェル等により導き出された。この配列は、ア
ルギニル−グリシル−アスパルチル−セリン（RGDS）か
ら成るテトラペプチドであることが見出された［M.D.ピ
エルシュバッヒェルおよびE.ルオスラーティ、「プロシ
ーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー」、
81、5985（1984）］。RGDS配列を含むペプチドは、ある
種の細胞タイプの接着を直接促進し得、高レベルの可溶
性RGDSは、無傷フィブロネクチンへの細胞接着を部分的
に崩壊させる。フィブロネクチンにおけるRGDS配列への
細胞接着は、「インテグリン」と称する細胞表面糖蛋白
質複合体とこの配列との相互作用により行なわれると信
じられている。

フィブロネクチン介在細胞接着におけるRGDS/インテ
グリン複合体は重要であるが、幾つかの明白な情報は、
このプロセスにおける追加的細胞レセプターおよび異な
るフィブロネクチン決定基の関与を指摘している。多く
の細胞タイプは、無傷フィブロネクチン上に焦点状接着
を形成する。これらの構造は、原形質膜および基質間に
おける近接した状態の領域を表す。これらの部位はま
た、アクチンに富む緊張線維の挿入点を表し、幾つかの
アクチン関連細胞骨格蛋白質を含むことが示された。焦
点状接着部位はまた、インテグリン、ヘパリンスルフェ
ート、コンドロイチン・スルフェートまたは他のプロテ
オグリカンおよびガングリオシドを含む、細胞接着に関
与する幾つかの種類の細胞表面分子を含む。

フィブロネクチンに関する多重レセプターの作用は、
接着プラーク形成に関係している。RGDS含有フラグメン
トまたはヘパリン結合性接着促進性リガンド（例、血小
板因子４またはフィブロネクチンのヘパリン結合フラグ
メント）の一方へ接着する細胞は、密な接点しか形成し
ない。反対に、RGDS含有フラグメントおよびヘパリン結
合リガンドの両方に接着する細胞は、充分発達した焦点
状接着を示す。さらに、フィブロネクチンのヘパリン結
合フラグメントに対する抗体は、焦点状接着形成を阻止
するが、無傷フィブロネクチンにおける細胞接着レベル
を徹底的に阻害することは無い。集約すると、これらの
結果は、正常および悪性細胞接着の促進並びに細胞の表
現型発現の調節におけるフィブロネクチンのヘパリン結
合領域（複数も可）の役割を支持している。

最近J.B.マッカーシー等は、「ジャーナル・オブ・セ
ル・バイオロジー」、102、179（1986）において、RGDS
非依存性機構により転移性メラノーマ細胞の接着および
拡大を促進するフィブロネクチンの33kDカルボキシル末
端ヘパリン結合フラグメントを同定する結果を発表し
た。このフラグメントはフィブロネクチン分子のＡ鎖か
ら始まる。それはヘパリンスルフェート・プロテオグリ
カンと結合し、またニューロンの接着およびこれらの細
胞による神経突起の伸長を促進する。

従って、その広範な生物学的活性に関与するこのフラ
グメント内のペプチドのサブセットの単離および特定検
定が要望される。それらの低分子量オリゴペプチドは、
33kDフラグメントよりも容易に入手可能であり、かつ狭
い生物学的活性プロフィールを呈するため、治療または
診断薬としてのそれらの潜在的有用性の高まることが予
想される。

発明の簡単な記載この発明は、フィブロネクチンのＡ鎖に位置する33kD
カルボキシル末端ヘパリン結合領域のフラグメントを表
す生物学的活性ポリペプチドを提供する。慣用的固相ペ
プチド合成により実質的に純粋形で製造され得るこれら
のポリペプチドのうちの２種は、式 tyr−glu−lys−pro−gly−ser−pro−pro−arg−glu −val−val−pro−arg−pro−arg−pro−gly−val
（Ｉ）および lys−asn−asn−gln−lys−ser−glu−pro−leu−ile −gly−arg−lys−lys−thr−asp−glu−leu （II）を有する。ポリペプチドＩは形式上単離されたフィブロ
ネクチン残基1906−1924を表し、ポリペプチドIIは形式
上単離されたフィブロネクチン残基1946−1963を表す。
これらのポリペプチドに関する一文字アミノ酸コード
は、各々YEKPGSPPREVVPRPRPGVおよびKNNQKSEPLIGRKKTDE
Lである。

ペプチドＩはフィブロネクチンの全アイソ形態（isof
orm）で存在する。これと異なって、ペプチドIIの最初
の15残基は全アイソ形態で存在するが、ペプチドIIにお
ける最後の３残基は、フィブロネクチンにおいてある種
のアイソ形態（Ａ鎖と称す）でのみ生じる構造上不均一
な領域の一部である。血しょうフィブロネクチンの場
合、タイプIII csと称する構造上不均一なこの領域は89
以下の残基長であり得る。33kDヘパリン結合フラグメン
トはＡ鎖から生じ、このタイプIII cs配列の一部を含
む。

最近、ハンフリーズ等は、「ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー」、262、6886−6892（198
7）において、フィブロネクチンのタイプIII cs結合セ
グメントが細胞接着促進活性を有することを報告した。
ハンフリーズ等は、全タイプIII cs配列を表す部分的重
複ペプチドを構築し、線維芽細胞およびメラノーマ細胞
の接着および拡散を促進する能力についてこれらのペプ
チドを試験した。これらの試験の結果は、このタイプII
I cs結合配列の最初の24残基がメラノーマ細胞の接着お
よび拡散を促進することを示した。CS Iと称する生物学
的活性ペプチドの配列は、asp−glu−leu−pro−gln−l
eu−val−thr−leu−pro−his−pro−asn−leu−his−g
ly−pro−glu−ile−leu−asp−val−pro−ser−thr（D
ELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST）であり、残基1961−1985に
対応する。すなわち部分的重複は、ペプチドIIの最後の
３残基およびハンフリーズ等により報告されたCS Iペプ
チドの最初の３残基間に存在する。しかしながら、ハン
フリーズ等により報告されたペプチドは、ペプチドＩま
たはIIとは化学的に異なる。CS Iは疎水性が高く、リジ
ンまたはアルギニン残基を完全に欠く。各ペプチドの重
要な化学的特性を下記第１表に要約する。

「ハイドロパシー指数」は、カイトおよびドゥーリト
ル、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー」、157、105−132（1982）の方法に従い計算され
る。この方法によると、値が（−）で大きい数のとき、
親水性も高い。すなわち、CS Iペプチドは、ペプチドＩ
およびIIよりも疎水性がかなり高い。

各ペプチドの正味電荷は、（＋１）電荷を各リジン
（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）残基に割り当て、（−
１）電荷を各グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸
（Ｄ）残基に割り当てることにより計算される。追加の
残基は非荷電状態であるとみなす。これらの電荷は、ほ
ぼ中性（pH6.8〜7.4）で行なわれる。ヘパリン結合およ
び細胞接着検定の条件下で予想される。電荷合計に顕著
に影響し得る唯一の他の残基はヒスチジン（Ｈ）であ
り、CS Iペプチドでは２回見出されるが、使用された検
定のpH条件下では非荷電状態にある。

CS IおよびペプチドII間の化学的特性は相異するが、
ペプチドIIの生物学的活性がペプチドCS Iとの３残基部
分重複（残基1961−1963、DEL）に関係しているか否
かを測定するために実験を行った。すなわち、ポリペプ
チドIIの最初の15アミノ酸残基を含むポリペプチドを合
成した。このポリペプチドの式（II a）を下記に示す。

lys−asn−asn−gln−lys−ser−glu−pro−leu−ile−
gly−arg−lys−lys−thr （II a）このポリペプチドの一文字アミノ酸コードはKNNQKSEP
LIGRKKTであり、残基1946−1960に対応する。このペプ
チドは、ａ）合計正味電荷が（＋４）であり、合計ハイ
ドロパシー指数が−29.3である点でペプチドＩとは異な
る。

II aは濃度依存方式でヘパリンと結合するが、ペプチ
ドCS Iはいかなる試験濃度でもヘパリンと結合し得ない
ことが見出された。従って、各ペプチドの生物学的活性
は、別個で特有の構造決定基に因るものである。

ポリペプチドＩ、IIおよびII aの生物学的活性ペプチ
ド・フラグメントも製造されたが、これはペプチドIIの
アミノ末端３基（II a−Ａ）、中央部３基（II a−Ｂ）
およびカルボキシル末端３基（ａ−Ｃ）配列に対応する
３種のポリペプチドを含む。具体的には、これらのペプ
チドは下記第２表に示された配列を有する。

ペプチドII a−Ｃは、極めて高レベルのヘパリン結合
活性を有することが見出され、それ故この発明の範囲内
にあるものとする。

この発明はまた、同じくフィプロネクチンのＡ鎖に位
置する33kDカルボキシル末端ヘパリン結合領域のフラグ
メントを表す追加的生物活性ポリペプチドを提供する。
これらのポリペプチドIII、IVおよびＶは、構造上互い
におよびペプチドＩおよびII aとは区別されるが、それ
らは、下記第３表に要約されているある種の化学特性を
共有する。

各ペプチドは異なる塩基性残基からその電荷を誘導し
ているが、各ペプチドは同じ正味電荷を有する。ペプチ
ドIIIは、２つのアルギニン（Ｒ）残基および３つのリ
ジン（Ｋ）残基を含む。ペプチドIVおよびＶはアルギニ
ン残基のみを含む。さらに、電荷はペプチドIVおよびＶ
では集中しているが、ペプチドIIIにおける陽性電荷は
さらに分散している。ペプチドIII内の電荷の分散は、
現在までにこの領域から同定された他の４種のヘパリン
結合ペプチドの場合とは異なっている。ペプチドIIIの
親水性は、ペプチドIVまたはＶの場合よりも高いが、ペ
プチドＩまたはIIの場合よりも低い。

これらの合成ポリペプチドを生物活性について検定し
た結果、次の特性のうち少なくとも１つを呈することが
見出された。すなわち、それらは、（ａ）神経突起の伸
長を促進、（ｂ）内皮細胞の接着および拡散を促進、
（ｃ）メラノーマ細胞の接着および拡散を促進、および
／または（ｄ）合成基質へのヘパリンの結合を促進す
る。従って、これらのポリペプチドは、（ａ）神経再生
における補助、（ｂ）創傷治癒および移植体受容の促
進、（ｃ）培養基質への細胞結合の促進、（ｄ）悪性細
胞の転移阻止、および／または（ｅ）ヘパリン療法中に
インビボで生じ得る状態である、過剰ヘパリンの結合に
有用であり得るものと考えられる。これらのポリペプチ
ドが呈する生物活性の範囲は異なるため、それらの混合
物もまたこの発明の範囲内に含まれる。

さらに、後続してインビトロまたはインビボでポリペ
プチドＩ、II、II aおよびIII−Ｖを消化／加水分解す
ると、実質的に均等な生物活性を有するフラグメントが
得られると予想されるため、それらの低分子量ポリペプ
チドはこの発明の範囲内に含まれるものと考えられる。

図面の簡単な記載第１図は、血しょうフィブロネクチンの概略図であ
り、Ａ鎖の33kDカルボキシル末端ヘパリン結合フラグメ
ントに位置する、この発明のヘパリン結合ペプチドＩ−
Ｖに関する蛋白質上のRGDSおよびCS−Ｉの相対位置を示
す。

第２図は、この発明のペプチドＩおよびIIのヘパリン
結合活性を描いたグラフである（ニトロセルロース結合
検定）。

第３図は、フィブロネクチン（fn）のヘパリン結合活
性を描いたグラフである（ニトロセルロース結合検
定）。

第４図は、ペプチドII aおよびCS Iの相対ヘパリン結
合活性を描いたグラフである（イムロンＣ結合検定）。

第５図は、ペプチドII a−Ａ、II a−ＢおよびII a−
Ｃのヘパリン結合活性を描いたグラフである（イムロン
Ｃ結合検定）。

第６図は、ペプチドＩ、II aおよびIII−Ｖの相対ヘ
パリン結合活性を描いたグラフである（イムロンＶ結合
検定）。

第７図は、ペプチドII aにより促された神経突起の伸
長を描いたグラフである。

第８図は、ペプチドCS Iにより促された神経突起の伸
長を描いたグラフである。

第９図は、ペプチドIIIにより促された神経突起の伸
長を描いたグラフである。

第10図は、ペプチドII aおよびIIIにより促された相
対メラノーマ細胞接着を描いたグラフである。

第11図は、これらのペプチドが形式上誘導される血し
ょうフィブロネクチン分子の部分アミノ酸配列の概略図
である。

発明の詳細な記載フィブロネクチンの構造。

第１図に注目すると、血しょうフィブロネクチンの２
タイプの鎖（ＡおよびＢ）は、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ
−）結合したヘテロダイマーとして示されている。先の
命名法（L.T.ファークト、「モダン・セル・バイオロジ
ー」、B.サティア編、アラン・アール・リス、イコーポ
レイテッド、ニューヨーク（1983）53−117頁）に従
い、フィブロネクチンの６つの領域（Ｉ−VI）を標識す
る。各領域内の生物活性には、（Ｉ）弱いヘパリン結
合、（II）非共有コラーゲン結合、（III）DNA結合、
（IV）ボックス（Ｏ）として示されたRGDS−介在性細胞
接着、（Ｖ）ヘパリン結合、RGDS非依存性細胞接着、お
よび（VI）遊離水硫基が含まれる。各領域を含む蛋白質
加水分解フラグメントの分子量評価は、先に記載した消
化および精製概要に基づく。（J.B.マッカーシー、「ジ
ャーナル・オブ・セル・バイオロジー」、102、179（19
86））。蛋白質加水分解開裂部位（Ｘ）は、トリプシン
（Ｔ）およびカテプシンＤ（Ｃ）について示されてい
る。これらの概要によると、Ｂ鎖の消化物から単離され
た領域ＶおよびVIは66kDフラグメントに位置する。反対
に、Ａ鎖消化物は、33kDフラグメント（領域Ｖ）および
31kDフラグメント（領域VI）を含む。この差異は、太い
線として示されたＡ鎖特異タイプIII cs挿入体における
トリプシン感受性部位の結果である。

トリプシン／カテプシン66kDおよび33kDヘパリン結合
フラグメント並びにカルボキシル末端トリプシン31kD遊
離水硫基含有フラグメントのアミノ末端配列。

フィブロネクチンの全一次構造は、直接的に決定され
たか（T.E.ピーターソン等、「プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー」、80、137（198
3））、または組換えDAN技術により予測された。（J.E.
シュバルツバウエル等、「セル」、135、421（198
3））。トリプシン／カテプシン（t/c）33kD、t/c66kD
およびトリプシン（ｔ）31kDフラグメントのアミノ末端
配列は、既知ヒト配列に関してこれらのフラグメントの
正確な位置を決定するため、アプライド・バイオシステ
ムズ・ガス相シーケネーター（モデル470A）における直
接アミノ酸配列決定法により確立された。

最初の21アミノ酸がt/c66ヘパリン結合フラグメント
について決定された（第11図、ラインＩで始まり、ライ
ン２に続く下線を引いた残基）。このフラグメントは、
無傷血しょうフィブロネクチンの残基1583に対応するア
ミノ酸アラニンから出発する（A.R.コーンブリット等、
「EMBOジャーナル」、４、1755（1985））。無傷フィブ
ロネクチンにおけるこのアラニンのアミノ末端側に対す
るチロシンの存在は、芳香族残基を伴うペプチド結合に
関するカテプシンＤの優先性と一致している。t/c66フ
ラグメントの配列は、残基番号1599のトレオニン（ダブ
ル・アステリスクの後、ライン１の最後のスラッシュ）
から残基1690のアラニン（第１残基、ライン２）へと進
むため、ED III挿入体を含まない。ED III領域を欠くと
いうこの事実は、細胞または線維芽細胞由来のフィブロ
ネクチンから血しょうまたは肝臓由来のフィブロネクチ
ンを区別する特徴である。

t/c33フラグメントはまた、1583位のアラニンから始
まる、t/c66フラグメントと共通のアミノ末端配列を共
有し（第11図、ライン１）、それはまたED III領域を欠
いている。これらの結果は、これらのフラグメントのア
ミノ末端配列が同一であることを説明し、t/c33およびt
/c66ヘパリン結合フラグメントのサイズ不均一性は、血
しょうフィブロネクチンのＡ鎖のタイプIII cs挿入体内
におけるトリプシンの作用によるものであるという主張
を支持する。

血しょうフィブロネクチンのＡ鎖内の33kDヘパリン結
合フラグメントの配置は、トリプシン31kDフラグメント
の最初の21アミノ酸のアミノ末端配列を決定することに
より確立された。33および66kDヘパリン結合フラグメン
トの精製中に生成されるこのフラグメントは、遊離水硫
基を含み、血しょうフィブロネクチンのＡ鎖のカルボキ
シル末端から始まる。D.E.スミスおよびL.T.ファーク
ト、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー」、257、6518（1982）参照。さらに、31kDフラグメ
ントはまた、フィブロネクチンの33kDヘパリン結合フラ
グメントを与えるフィブロネクチン分子のサブセットか
ら始まる。

t31フラグメントのアミノ末端は、ヒスチジン残基204
0から始まる（下線部、第11図のライン５）。このヒス
チジンのアミノ末端側に対する残基はアルギニンである
ため、これはトリプシンの既知特異性と一致している。
この配列は、フィブロネクチン分子のサブセットに見出
されるタイプIII cs挿入体に存在する。このフラグメン
トはタイプIII cs挿入体からの９個の追加アミノ酸を含
み、この挿入体の最後の31アミノ酸（第11図、ライン
５、括弧内）を飛ばし、次いでこの配列情報が終わる残
基2062のチロシンまでタイプIII相同体（第11図、ライ
ン６、下線部）として続く。これらの結果は、t31フラ
グメントが最大限可能な120残基タイプIII cs挿入配列
の一部分（最初の89アミノ酸）を含み、血しょうフィブ
ロネクチンのこの領域に関して先に確立された配列デー
タと一致することを立証している。この配列情報は、タ
イプIII cs挿入体内での（第11図、ライン５）、アルギ
ニン残基2039におけるt/c33へパリン結合フラグメント
の最大限可能なカルボキシル末端限界を示す。

ポリペプチドの合成。メリフィールド固相方法を用い
てこの発明のポリペプチドを合成した。これは、ペプチ
ド合成に使用される最も一般的な方法であり、「ソリッ
ド・フェーズ・ペプタイド・シンセシス」、ピアス・ケ
ミカル・カンパニー出版、ロックフォード、イリノイ
（第２版、1984年）においてJ.M.スチュワートおよびJ.
D.ヤングにより詳細に記載されている（この開示を引用
して説明の一部とする）。

ペプチド合成のメリフィールド・システムは、ベンジ
ルクロリド基により官能化された１％架橋ポリスチレン
樹脂を使用する。ハロゲンは、保護アミノ酸の塩と反応
した場合エステルを形成し、それを樹脂と共有結合させ
る。ベンジルオキシ−カルボニル（BOC）基を用いて、
アミノ酸の遊離アミノ基を保護する。この保護基をジク
ロロメタン（DCM）中25％トリフルオロ酢酸（TCA）によ
り除去する。新たに露出したアミノ基を、DCM中10％ト
リエチルアミン（TEA）により遊離塩基に変換する。次
いで、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）の使用
により、次のBOC保護アミノ酸を先のアミノ酸の遊離ア
ミンに結合させる。TFA安定性ベンジル誘導体による合
成中、アミノ酸の側鎖官能基を保護する。これらの反復
性反応は全てオートメーション化され得るものであり、
この発明のペプチドは、ベックマン・システム990ペプ
チド合成装置の使用によりユニバーシティー・オブ・ミ
ネソタ・マイクロケミカル・ファシリティーにおいて合
成された。

樹脂上におけるブロック・ポリペプチドの合成後、ポ
リペプチド樹脂を無水フッ化水素酸（HF）で処理するこ
とにより、樹脂とのベンジルエステル結合を開裂させ、
すなわち遊離ポリペプチドを放出させる。ベンジル誘導
側鎖保護基はまた、HF処理により除去される。次いで、
1.0モル酢酸を用いてポリペプチドを樹脂から抽出した
後、抽出物を凍結乾燥する。

Ｃ−18カラムにおける逆相技術によるプレパラティブ
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、凍結乾燥
した粗ポリペプチドを精製する。一般的な溶離勾配は、
H₂O中0.1％TFAを用いた０％〜60％アセトニトリルであ
る。溶離剤の吸光度を220nmでモニターし、フラクショ
ンを集め、凍結乾燥する。

精製ポリペプチドの特性検定はアミノ酸分析により行
なわれる。システインまたはトリプトファンが存在する
場合、まずポリペプチドを、６モルCHl（一定の沸騰状
態）または4Nメタンスルホン酸中110℃で24時間嫌気的
に加水分解する。加水分解されたアミノ酸を、ベックマ
ンにより供給されたくえん酸緩衝液を用い、ベックマン
・システム6300アミノ酸分析装置を用いたイオン交換ク
ロマトグラフィーにより分離する。440および570nmでの
吸光度により定量を行い、標準曲線と比較する。さら
に、配列決定によりポリペプチドの特性検定を行い得
る。アミノ酸組成データが本質的にあまり情報を与える
ものではない場合、この方法は長いポリペプチドに対し
て特に有用である。配列決定は、R.M.ヒューウィック
等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー」、256、7990（1981）の方法による、モデル470Aガ
ス相シーケネーター（アプライド・バイオシステムズ、
インコーポレイテッド）においてオートメーション化さ
れた、アミノ末端から逐次エドマン分解法により行なわ
れる。

以下、詳細な実施例によりこの発明についてさらに詳
しく記載する。

実施例１ヘパリン結合検定。

ヘパリン結合検定では、基質としてニトロセルロース
・シートを利用することにより、ヘパリン結合活性に関
して試験されるペプチドまたは蛋白質を結合させる。ペ
プチドＩおよびIIまたは無傷フィブロネクチン（fn）を
50ミリモル（NH₄）₂CO₃中で可溶化し、第２図および第
３図に示した濃度に希釈した。50ミリモルNH₄CO₃に予め
浸漬しておいたニトロセルロース・シートを、96ウェル
のドット・ブロット装置（ベゼスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ、ベゼスダ、メリーランド）に設置し、250μ
の様々な濃度の各ペプチドをウェルから吸引した。次
いで、各ウェルを結合緩衝液（10ミリモルのトリス−HC
l、pH8.0、0.15モルNaCl）により３回洗浄し、ろ液を除
去し、一夜風乾させた。次いで、フィルターを、10ミリ
モルCaCl₂含有結合緩衝液中５分間室温で平衡状態にし
た。次いで、³H−ヘパリンを結合緩衝液（Ca⁺⁺含有）中
50000cpm/mlの濃度に希釈し、ニトロセルロース・シー
トを２時間この混合物の存在下でインキュベーションし
た。次いで、フィルターを結合緩衝液により４回洗浄
し、風乾した。試料の個々のスポットをニトロセルロー
スから切り取り、結合したヘパリンを液体シンチレーシ
ョン計数管により定量した。

A.ポリペプチドＩおよびII 結果は、ペプチドIIが濃度に依存した形で³H−ヘパリ
ンと結合したことを示す（第２図）。反対に、³H−ヘパ
リンは、いかなる試験濃度でもペプチドＩとはあまり結
合しなかった。³H−ヘパリン結合を促進するペプチドII
の最低濃度は0.25×10^-4モルであり、結合の飽和はさら
に高いコーティング濃度（0.25−0.5×10^-2モル）で観
察された。同様に、フィブロネクチンはまた、濃度に依
存した形で³H−ヘパリンと結合し、10^-6モルのフィブロ
ネクチンで最大結合が観察された（第３図）。

B.ポリペプチドII aおよびCS I 追加のリジン残基をCS Iのカルボキシル末端に加える
ことにより、このペプチドとこの検定で使用される基質
との結合を容易にした。

次に、ペプチドII aおよびCS Iの両方を相対へパリン
結合活性について比較した。プラスチック・イムロンＣ
プレート（ダイナテク、アレクサンドリア、バージニ
ア）に、記載された通り指示レベルのペプチドII a、CS
IまたはBSA100μ（トリプリケイトで）を吸着させ
た。また33kDフラグメントのヘパリン結合能を比較用に
測定したが、前記ペプチドと比較したこのフラグメント
の相対サイズであるために、異なるコーティング濃度を
使用した。33kDフラグメントの実際のコーティング・レ
ベルは４、20、100および500μg/mlであった。BSAによ
る非特異的結合部位のブロック後、１分当たりの崩壊数
（dpm）が約4000のこのリガンドを加えることにより、
これらの様々な基質の³H−ヘパリン結合能を測定した。
この検定の全条件は、アメリカ合衆国特許出願第89073
号に記載された通りであった（この開示を引用して説明
の一部とする）。

第４図に示す通り、ペプチドII aは、濃度に依存した
形で³H−ヘパリンとの結合能を保持していた。反対に、
ペプチドCS Iはいかなる試験濃度でもヘパリンと結合し
得なかった。これは、ペプチドIIに帰因するヘパリン結
合活性がCS Iとの構造上の部分的重複領域を必要としな
いことを示す。

C.ポリペプチドII a−Ａ、II a−ＢおよびII a−C_o ペプチドII aおよび無傷ペプチドII aから誘導された
３種のペプチドを、指示濃度（100μ／ウェル）でイ
ムロンＣプレートに吸着させ（同じことを３回反復）、
上記と同様に³H−ヘパリンとの結合能について試験し
た。この試験の結果を第５図に要約する。これらのデー
タが立証する通り、ペプチドII a−Ａは非常に乏しいヘ
パリン結合活性を呈し、ペプチドII a−Ｂは高いコーテ
ィング濃度で僅かに高いヘパリン活性を呈するが、ペプ
チドII a−Ｃは、非常に低いコーティング濃度で使用し
た場合でも非常に高いヘパリン結合活性を呈する。ペプ
チドII a−Ｃにおける正味電荷が（＋３）であるのに対
し、ペプチドII aにおける正味電荷が（＋４）であると
いう事実にも拘わらず、ペプチドII a−Ｃは、事実、親
ペプチド（ペプチドII a）の場合よりもかなり良好にヘ
パリンと結合する。これは、正味電荷自体、フィブロネ
クチンから誘導された合成ペプチドにおいて観察される
ヘパリン結合活性に関する唯一の主たる重要事項ではな
いことを立証している。どちらかと言えば、特異的な一
次構造がこの活性にとっては重大である。ペプチドII a
の場合、（KNNQKSEPLIGRKKT）ヘパリン結合活性は、こ
のペプチドのカルボキシル末端３基（配列LIGRKKT、ペ
プチドII a−Ｃに対応する）に対して局在し得る。さら
に、アルギニンを含むペプチドII−（中央部）は、同じ
アルギニンおよび２個の追加的リジンを含むペプチドII
（カルボキシル）よりもかなり弱くヘパリンと結合する
ことから、このペプチドにおける２個のリジン残基のう
ち少なくとも１つはヘパリン結合活性にとって重要であ
る。

D.ポリペプチドIII−V_o ペプチドＩ、II aおよびIII−Ｖを、上記と同様に指
示濃度（100μ／ウェル）でイムロンＣプレートに吸
着させた（同じことを３回反復）。ペプチドIII−Ｖ
は、第６図に示す通り、固相ヘパリン結合検定において
³H−ヘパリンと実質的に結合し、ペプチドIIIおよびIV
は、ペプチドＶよりもさらに強くヘパリンと結合する。
重要なことに、ニトロセルロース結合検定においてヘパ
リンと充分には結合しなかったペプチドＩは、イムロン
Ｃ結合検定ではヘパリンと充分かつ特異的に結合した。

ヘパリン結合に関する各ペプチドの特異性は、デキス
トランスルフェートまたはコンドロイチン／デンマタン
スルフェートにより誘発される³H−ヘパリン結合の50％
阻害点が、ヘパリンが呈する値よりも１〜３オーダー
（等級）高い大きさの濃度であるという事実により示さ
れる。これらの結果は、無傷フィブロネクチンまたはペ
プチドＩおよびIIにおいて観察された結果と類似してい
る。

実施例２神経突起伸長検定。

A.プレートの調製。

ペプチドＩ、II、II a、III、CS Iまたは無傷フィブ
ロネクチンをボラー緩衝液（0.05モル炭酸緩衝液、pH9.
6）中で希釈し、各濃度100μを96ウェル組織培養プレ
ート中に分配した（同じことを３回反復）。次いで、プ
レートを一夜無菌フード中に置くことにより、緩衝液を
濃縮し、ペプチドをプレート上に乾燥させた。翌朝、5m
g/ml牛血清アルブミン含有燐酸緩衝食塩水（PBS/BSA）
（PBS＝燐酸緩衝食塩水）200μを各ウェルに加え、プ
レートをさらに３時間インキュベーションした。その時
点で、PBS/BSAを吸引し、適当な培地中の細胞を各ウェ
ルに加えた。

B.ニューロンの単離および神経突起伸長に関する検定。

ロジャーズ等、「デベロップメンタル・バイオロジ
ー」、98、212−220（1983）の方法により、胚芽CNSニ
ューロン培養を調製した。簡単に述べると、６日令の胚
芽期ひなから得た脊髄を単離し、それらの背側半分を除
去し、Ca⁺⁺−Mg⁺⁺不含有（CMF）ハンク平衡塩溶液中に3
7℃で10分間置いた。運動ニューロンを顕著に含む腹部
分のみを培養用に調製した。次いで、37℃で25分間CMF
ハンク中0.25％トリプシン（バクトトリプシン、ディフ
コ）中で脊髄を解離した。トリプシン含有培地を、HEPE
Sにより緩衝状態にし、10％牛胎児血清を補充したハム
のF12と置き換え、細胞を繰り返しピペットで取って完
全に解離させた。単一細胞懸濁液を遠心分離により沈殿
させ、ハムのF12−HEPES＋血清でリンスし、遠心分離
し、重炭酸ナトリウムおよびグルタミン（２ミリモ
ル）、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（1
00U/ml）を補充したハムのF12に再懸濁し、指示濃度の
ヘパリンの存在下および非存在下後記要領で調製してお
いたウェルを入れた。培養物を５％Co₂中加湿インキュ
ベーターにおいて24時間37℃でインキュベーションし、
次いでグルタルアルデヒドに固定させた。解剖用顕微鏡
の助けを借りて10視野を無作為に試料採取することによ
り、神経突起を有するニューロンの数を定量した。

C.ポリペプチドＩおよびII。

この検定の結果を下記第４表および第５表に要約す
る。

これらの結果は、神経突起の伸長を促進する点で、ペ
プチドIIがペプチドＩよりもかなり有効であること、お
よびペプチドIIの神経突起促進活性がこのペプチドのヘ
パリン結合活性と明らかに関係していることを示す。す
なわち、ペプチドIIは、神経再生が望ましい状況で
（例、粉砕損傷で）神経生長を促進する合成基質の提供
に有用であり得る。

D.ポリペプチドII aおよびCS I。

これらのペプチドにより被覆された基質上に置かれた
場合に中枢および抹消系胚芽期ひなニューロンが呈する
神経突起の生長を調べることにより、ペプチドII aおよ
びCS Iの特徴的な性質に関するさらに別の証拠が得られ
た。

上記と同様、100μの示されたペプチドの500μg/ml
溶液またはフィブロネクチンの33kDヘパリン結合フラグ
メントの５μg/ml溶液により基質を被覆した。BSAによ
り非特異的部位をブロック後、胚芽期ひなの脊髄から単
離された中枢神経系（CNS）ニューロン、または胚芽期
ひなの後根神経節から単離された抹消神経系（PNS）ニ
ューロンの懸濁液を、様々な被覆基質上に置いた。デー
タは、これらの培養において神経突起を発現するニュー
ロンの平均数を表し、トリプリケイト培養の平均を表
す。

第７図および第８図に示されている通り、両ペプチド
とも胚ニューロンによる神経突起伸長を促進することが
できた。しかしながら、CNSニューロンは好ましくはペ
プチドCS Iにより刺激されると思われるが、ペプチドII
a抹消ニューロンによる系突起伸長の刺激に最も有効で
あると思われた。すなわち、我々は、ペプチドIIおよび
ペプチドCS I間の３残基部分的重複にも拘わらず、各ペ
プチドの生物学的活性は別個の特有な構造決定基による
ものであるという結論に達した。

E.ペプチドIII。

インビトロでの胚芽期ひなニューロンによる神経突起
伸長の促進能力についてペプチドIIIを試験した。第９
図に示されている通り、ペプチドII aおよびIIIは、PNS
およびCNSニューロンによる神経突起伸長を促進する能
力において明確な差異を示した。ペプチドII aおよびII
Iは両方とも両集団のニューロンにおいて神経突起促進
活性を示すが、ペプチドIIIの方はCNSニューロンによる
神経突起伸長をはかるに促進させ得、ペプチドII aはPN
Sニューロンによる神経突起伸長の促進により有効であ
ると思われる。

実施例３内皮細胞の接着。

A.ウシ大動脈内皮細胞の単離。

次のプロトコルに従い、ウシ大動脈内皮細胞を単離し
た。近くの屠殺場から大動脈を得、冷燐酸緩衝食塩水
（PBS）（136ミリモルNaCl、2.6ミリモルKCl、15.2ミリ
モルNa₂HPO₄、pH7.2）中で洗浄し、２時間以内に処理し
た。粗コラゲナーゼ（CLS III、乾燥重量1mg当たり125
−145単位、クーパー・バイオメディカル）を、ダルベ
ッコ修飾イーグル培地（DMEM）（ギブコ）中2mg/mlの割
合で使用した。管の遠位末端を締め付け、コラゲナーゼ
−PBS溶液で満たし、10分間消化を行った。管腔内容物
を採取後、さらに２回10分間かけて新鮮なコラゲナーゼ
を加えた。酵素−細胞懸濁液を等容量の10％ウシ胎児血
清（FBS）含有DMEMに加えて酵素を阻害し、10分間400×
ｇでの遠心分離にかけた。生成した細胞沈殿物を、10％
FBS、100単位/mlのペニシリンＧ、100μg/mlのストレプ
トマイシンおよび100μg/mlの粗線維芽細胞成長因子を
含むDMEMに再懸濁した。37℃で加湿した５％CO₂雰囲気
中75cm²フラスコにおいて細胞を培養した。培養に同培
地を周２回供給し、約75％全面生長時点で細胞を検定で
使用した。特徴的な丸石形態、全面生長到達後の生長の
接触阻害、および第VIII因子:RAgに関する陽性免疫蛍光
染色（マイルズ・ラボラトリーズ）により、細胞は事実
上内皮細胞として同定された［S.シュバルツ、「インビ
トロ」、14、966（1978）］。内皮細胞、血小板生成細
胞および血小板のみ、第VIII因子:RAgを含むことが知ら
れている。この方法は、位相差顕微鏡および免疫染色か
ら判断すると、常用の手順で平滑筋細胞、周囲細胞また
は線維芽細胞による汚染を殆ど伴わずに（５％未満）内
皮細胞を高収率で与える。

B.大動脈内皮細胞接着検定。

フィブロネクチンまたはペプチドＩおよびIIを吸着さ
せた96ウェルのマイクロタイター・プレートを用いて接
着性を測定した。60−80％全面生長した細胞培養を、10
μCi/mlの³H・アミノ酸を加えることにより一夜代謝標
識した。検定当日、細胞をトリプシン処理により採取
し、血清を加えることによりトリプシンを阻害し、細胞
を洗浄してこの混合物を除き、HEPESで緩衝させたpH7.2
のDMEMに再懸濁した。接着培地はまた5mg/mlのBSAを含
んでいた。細胞を３−４×10⁴/mlの濃度に調節し、この
細胞懸濁液100μをウェルに加えた。次いで、検定混
合物を37℃で90分間インキュベーションした。インキュ
ベーションの最後に、ウェルを、10ミリモルCa⁺⁺を含む
温PBSで洗浄し、接着性集団を、１％ドデシル硫酸ナト
リウムを含む0.5NのNaOHにより可溶化した。次いで、液
体シンチレーション計数管を用いて可溶化した細胞を定
量した。各測定を３回反復して行った。この試験の結果
を下記第６表に要約する。

第６表コーティング濃度接着した細胞（１分当たりの数）基底値 403 ペプチドＩ 40μg/ml 1024 400μg/ml 1107 4000μg/ml 981 ペプチドII 40μg/ml 901 400μg/ml 1734 4000μg/ml 14199 フィブロネクチン５μg/ml 13714 これらの結果は、ペプチドIIが内皮細胞接着促進にお
いてペプチドＩよりもかなり有効であることを示すもの
で、ニューロンに関して観察された結果と一致する。す
なわち、ペプチドIIは、人工または天然基質への内皮細
胞接着を促進するのに有用であり得る。

実施例４癌細胞の接着。

A.転移性メラノーマ細胞の単離。

高転移性ネズミ・メラノーマ細胞K1735M4は、初めテ
キサス、ヒューストンのI.J.フィドラー博士により提供
された。細胞を受け取ったとき、多数の初期継代細胞が
伸長し、液体窒素中で冷凍されていた。腫よう細胞は、
通常６週間以下の期間インビトロ培養される。この期間
の後、細胞を捨て、別のインビトロまたはインビボ実験
で使用するために新しい細胞を貯蔵庫から引き出す。こ
の予防措置を行うことにより、連続インビトロ継代の結
果として生じ得る表現型浮動を最少限に抑える。５％加
熱不活性胎児ウシ血清を含むグルベッコ修飾イーグル培
地で細胞を培養した。５％CO₂含有加湿雰囲気により培
養物を37℃インキュベーター中で生長させた。0.05％ト
リプシンおよび１ミリモルEDTAを用いて、フラスコから
細胞を静かに放出させることにより、細胞を週２回継代
培養した。

アミノ酸の代わりに２μCi/ml³HTd（トリチウム化チ
ミジン）を各培養に加えること以外は、上記内皮細胞の
場合と同じ方法でメラノーマ細胞を適用した。内皮細胞
に関する記載と同様に標識細胞を採取した。この細胞接
着検定は、上記ウシ大動脈内皮細胞検定の場合と同じで
あった。

1.ポリペプチドＩおよびII_o この検定の結果を下記第７表に要約する。

第７表．腫よう細胞接着＊コーティング濃度接着した細胞（１分当たりの数）基底値 1400 ペプチドＩ 40μg/ml 3900 200μg/ml 3500 400μg/ml 3000 2000μg/ml 4000 ペプチドII 40μg/ml 4600 200μg/ml 4700 400μg/ml 4300 2000μg/ml 3900 フィブロネクチン１μg/ml 4700 10μg/ml 7900 50μg/ml 11000 100μg/ml 9700 ＊検定開始の１時間後に測定。

ニューロンおよび内皮細胞を用いて得られた上記結果
とは反対に、ペプチドＩおよびIIは両方ともメラノーマ
細胞の接着を促進することができる。これは、フィブロ
ネクチンのこの領域に対する異なる細胞タイプの接着に
おける特異的な差異を示唆し得る。

2.ポリペプチドII、II aおよびCS I。

メラノーマ細胞の接着を促進する能力についてポリペ
プチドII、II aおよびCS Iを試験した。メラノーマ接着
促進活性の比較を下記第８表に示す。

第８表ポリペプチドへのメラノーマ細胞の接着濃度（μg/ml）接着パーセントペプチドII（80） 13.7 ペプチドII（400） 11.3 ペプチドII a（80） 6.4 ペプチドII a（400） 18.1 ペプチドCS I（80） 71.7 ペプチドCS I（400） 71.0 ウシ血清アルブミン 3.5 第８表におけるデータが立証する通り、ペプチドII、
II aおよびCS Iは、培養中のメラノーマ細胞の接着を促
進した。重要なことに、ペプチドIIからのDEL配列の欠
失は、このペプチドの細胞接着促進能力を排除しなかっ
た。さらに、CS Iにおけるメラノーマ接着促進活性の比
較的高いレベルは、ペプチドが³H−ヘパリンと結合し得
なかったのは、基板上にペプチドを欠いたためではなか
ったことを示す（細胞接着およびヘパリン結合検定の両
方に同じコーティング・プロトコルを使用したため）。

ペプチドII aおよびCS Iが異なる機構によってメラノ
ーマ細胞と結合することは明らかである。II aのヘパリ
ン結合活性は、このペプチドのメラノーマ細胞の接着が
このペプチドのヘパリン結合特性と関係していることを
強く示唆している。これらの結果は、メラノーマ細胞上
の細胞表面プロテオグリカン−グリコサミノグリカン
（ヘパリン様特質を有する）と相互作用するペプチドII
aの能力と一貫している。反対に、ペプチドCS Iは、明
らかにヘパリン非依存性機構による腫よう細胞の接着を
促進する。すなわち、メラノーマ細胞はCS Iおよびペプ
チドII aの両方に接着するが、各ペプチドの生物学的活
性は異なるものである。

3.ペプチドIII 上記と同様に、メラノーマ細胞接着および拡大促進能
力についてペプチドIIIを試験した。

第10図に示されている通り、ペプチドIIIは、濃度に
依存した形でメラノーマ細胞接着の促進において活性を
示す。事実、ペプチドIIIは最高試験濃度でペプチドII
aの２培の活性を示し、メラノーマ細胞の表面に関して
ペプチドII aよりも高い親和力を有し得ることを示唆し
ている。この結果は、ペプチドII aと比較して、低濃度
のペプチドIIIの方が³H−ヘパリンとの結合能力の大き
いことと一致している。

これらのポリペプチドの幾つかの実践的適用について
構想をたてることができる。それらの適用には、体内に
天然または合成基質を埋め込むことにより生じる傷の治
癒促進が含まれる。それらの合成基質には、細胞接着が
正常宿主組織による合成移植体の受け入れにおける重要
因子である。人工血管、眼内コンタクトレンズ、股関節
部置換移植体、神経ガイドなどが含まれ得る。

アメリカ合衆国特許第4578079号に記載されている通
り、これらのポリペプチドを利用して、細胞をインビボ
表面に誘引するか、または移植前に特定表面における所
望の細胞タイプの生長を促進させる医療装置を設計する
ことができる。その方法の一例は、補綴装置、例えば血
管または脈管移植における内皮細胞生長の誘導であり、
これは一般に合成樹脂、例えばニトロセルロース、膨張
性ポリテトラフルオロエチレンまたはポリエステル繊
維、特にダクロン（商標）（ポリエチレンテレフタレー
ト）繊維から織られるか編まれる。またヒドロゲル、例
えばポリメチロールメタクリルアミド（PMMA）は、体内
での移植体または粘膜と接触した形で使用される物体、
例えばコンタクトレンズに使用され得る。アメリカ合衆
国特許第3966902号参照。

心臓への挿入を意図した装置には、一時的左心室補助
装置、心臓バルブ、大動脈内バルーン・ポンプおよび人
工心臓がある。それらの装置は、好ましくは合成樹脂、
例えばポリエーテル−タイプのポリウレタン・エラスト
マー（カーディオタン（商標）、コントロン）または加
硫ポリオレフィン・ゴム（ヘキスシン（商標）、グッド
イヤー）から形成される。

殆どのタイプの細胞はフィブロネクチンおよびこれら
のポリペプチドに接着するが、内皮細胞、上皮細胞およ
び線維芽細胞は特にこれらのポリペプチドに誘引され
る。後者の点は、事故または手術後の傷口の閉鎖および
治癒を助けるためのパッチ移植などのコーティングにお
ける前記ポリペプチドの潜在的有用性を示している。合
成ポリマーのコーティングおよび移植はまた、粉砕性外
傷、例えば脊髄損傷後の神経再生を助け得る。

それらの場合、ペプチドを生物分子、例えばコラーゲ
ン、グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンに結
合させることは有利であり得る。コラーゲン、プロテオ
グリカンおよびグリコサミノグリカンは、結合組織およ
び基底膜の主成分である。場合によっては、合成ポリマ
ーの代わりに天然ほ乳類組織から完全または部分的に形
成された補綴装置が使用される。一例は、欠陥のあるヒ
ト心臓バルブの代用としてのブタ心臓バルブの使用であ
る。それらの人工バルブはまた、ヒト硬膜またはウシ心
膜を含み得る。別の例は、血管移植体としてのウシ動脈
の使用である。

インビボでの細胞応答を修飾することにより治療成果
を改善するために、これらのポリペプチドを用いてこれ
らの基質の表面を被覆することは有用であり得る。これ
は、当業界で知られている様々な方法、例えば上記親和
力に基づいて標的表面へポリペプチドを直接結合させる
か、または様々な架橋反応または試薬を用いてポリペプ
チドを基質と共有結合させることにより達成され得る。
補綴装置における合成樹脂および生体適合物質の使用の
概説については、「ケミカル・アンド・エンジニアリン
グ・ニュース」（1986年４月14日）30−48頁参照（この
開示を引用して説明の一部とする）。

それはまた、体内、例えば血管または腹腔中への一時
的または半永久的挿入体（経皮的装置と称する場合もあ
る）として用いることを意図した補綴装置のコーティン
グ表面におけるそれらの価値の指標である。それらの装
置には、カテーテル、および制御形薬剤デリバリー貯蔵
器または注入ポンプがある。

また、ポリペプチド、例えばＩおよびIIを用いて、イ
ンビトロでの使用を意図した天然または人工基質への内
皮細胞、線維芽細胞または上皮細胞の接着を促進させる
ことができる。例えば、培養基質、例えばマイクロタイ
ター・プレートのウェルまたは微多孔質繊維もしくはビ
ーズの培地接触表面は、細胞付着ポリペプチドにより被
覆され得る。これは培地におけるフィブロネクチンの使
用をうまく回避し得るため、培養に関してより充分に定
義された条件およびより良好な再生性を提供し得る。

細胞付着表面の商業用途の一例として、ファルマシア
により製造されたサイトデックス粒子をゼラチンで被覆
することにより、皿の場合よりもかなり小さい容量の培
地において同数の接着した細胞を生長させることが可能
となる。これらのビーズの活性は、一般に生長培地にお
けるフィブロネクチンの使用により異なり、これらのポ
リペプチドは、それらの目的に対して改善され、化学的
に特性されたコーティングを提供するものと予想され
る。他の表面または材料、例えばガラス、アガロース、
合成樹脂または長鎖多糖類を被覆することにより、付着
性を高めることができる。

様々な具体的で好ましい実施態様および技術を述べな
がらこの発明の説明を行った。しかしながら、この発明
の精神および範囲から逸脱せずに、多くの変形および修
飾が為され得るものと理解すべきである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｌ 27/00 Ａ６１Ｌ 27/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｄ (56)参考文献特開昭62−89699（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】tyr−glu−lys−pro−gly−ser−pro−pro
−arg−glu−val−val−pro−arg−pro−arg−pro−gly
−val、 lys−asn−asn−gln−lys−ser−glu−pro−leu−ile−
gly−arg−lys−lys−thr−asp−glu−leu、 lys−asn−asn−gln−lys−ser−glu−pro−leu−ile−
gly−arg−lys−lys−thr、 leu−ile−gly−arg−lys−lys−thr、 tyr−arg−val−arg−val−thr−pro−lys−glu−lys−
thr−gly−pro−met−lys−glu、 ser−pro−pro−arg−arg−ala−arg−val−thr、 trp−gln−pro−pro−arg−ala−arg−ile から成る群から選ばれた式で示されるポリペプチドおよ
びそれらの混合物。
【請求項２】tyr−glu−lys−pro−gly−ser−pro−pro
−arg−glu−val−val−pro−arg−pro−arg−pro−gly
−val、 lys−asn−asn−gln−lys−ser−glu−pro−leu−ile−
gly−arg−lys−lys−thr−asp−glu−leu、 lys−asn−asn−gln−lys−ser−glu−pro−leu−ile−
gly−arg−lys−lys−thr、 leu−ile−gly−arg−lys−lys−thr、 tyr−arg−val−arg−val−thr−pro−lys−glu−lys−
thr−gly−pro−met−lys−glu、 ser−pro−pro−arg−arg−ala−arg−val−thr、 trp−gln−pro−pro−arg−ala−arg−ile から成る群から選ばれた式で示されるポリペプチドおよ
びそれらの混合物を含む被覆層を表面に有する、インビ
ボ設置用に設計された補綴装置。
【請求項３】表面が血管移植体の一部分を構成する、請
求項２記載の補綴装置。
【請求項４】表面が眼内コンタクトレンズの一部分を構
成する、請求項２記載の補綴装置。
【請求項５】表面が心臓バルブの一部分を構成する、請
求項２記載の補綴装置。
【請求項６】表面が股関節部置換移植体の一部分を構成
する、請求項２記載の補綴装置。
【請求項７】表面が経皮的装置の一部分を構成する、請
求項２記載の補綴装置。
【請求項８】表面が合成樹脂でできている、請求項２記
載の補綴装置。
【請求項９】合成樹脂がニトロセルロース、ポリウレタ
ン、膨張ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステルお
よびポリオレフィンから成る群から選ばれる、請求項８
記載の補綴装置。
【請求項１０】表面が天然組織でできている、請求項２
記載の補綴装置。
【請求項１１】tyr−glu−lys−pro−gly−ser−pro−p
ro−arg−glu−val−val−pro−arg−pro−arg−pro−g
ly−val、 lys−asn−asn−gln−lys−ser−glu−pro−leu−ile−
gly−arg−lys−lys−thr−asp−glu−leu、 lys−asn−asn−gln−lys−ser−glu−pro−leu−ile−
gly−arg−lys−lys−thr、 leu−ile−gly−arg−lys−lys−thr、 tyr−arg−val−arg−val−thr−pro−lys−glu−lys−
thr−gly−pro−met−lys−glu、 ser−pro−pro−arg−arg−ala−arg−val−thr、 trp−gln−pro−pro−arg−ala−arg−ile から成る群から選ばれた式で示されるポリペプチドおよ
びそれらの混合物を含む被覆層を表面に有する、細胞培
養基質。
【請求項１２】表面が合成樹脂でできている、請求項11
記載の細胞培養基質。
【請求項１３】表面がビーズの一部分を構成する、請求
項11記載の細胞培養基質。
【請求項１４】表面が微多孔質繊維の一部分を構成す
る、請求項11記載の細胞培養基質。４
【請求項１５】表面がマイクロタイター・プレートの
ウェルを構成する、請求項11記載の細胞培養基質。