JP2635742B2 - 新規ポリペプチド及びその用途 - Google Patents

新規ポリペプチド及びその用途

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JP2635742B2 JP63500766A JP50076687A JP2635742B2 JP 2635742 B2 JP2635742 B2 JP 2635742B2 JP 63500766 A JP63500766 A JP 63500766A JP 50076687 A JP50076687 A JP 50076687A JP 2635742 B2 JP2635742 B2 JP 2635742B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規ポリペプチド；複合糖質、特に免疫グ
ロブリンとの結合能をもつ遊離又はキャリア結合形の新
規ペプチド並びにそのペプチドの機能性アナログ及び誘
導体から選択される人工化合物；天然百日咳毒素により
誘導される抗体と反応するペプチド配列から主に構成さ
れる、新規ポリペプチド及びその一部から選択される人
工百日咳毒素抗原；天然百日咳毒素により誘導される抗
体と反応する上記抗原を診断抗原として含む診断免疫ア
ッセイ用キット；天然百日咳毒素により誘導される抗体
と反応する上記抗原から選択される抗原を免疫成分とし
て含むワクチン組成物；並びに、天然百日咳毒素により
誘導される抗体と反応する上記抗原から選択される抗原
を含む皮内皮膚試験用組成物に関する。
背景 免疫学の分野において、ほとんどの生物が様々なタン
パク質及び／又は炭水化物構造体を選択的かつ特異的に
認識する特異的タンパク質を産生することは周知であ
る。細菌から誘導されるこのような特異的タンパク質の
例はプロテインＡ及びプロテインＧであって、これらは
双方とも様々な種由来のある免疫グロブリンと結合す
る。植物又は下等の無脊椎動物から誘導されるこのよう
な特異的タンパク質の例はいわゆるレクチン類であっ
て、これらは免疫グロブリン及び他の複合糖質の炭水化
物構造体と結合する。かかるレクチン類の例としては、
カナバリンＡ、小麦胚凝集素、植物生血球凝集素及びヘ
リックス・ポマチア（Helix pomatia）レクチンがあ
る。
上記各々の特異的タンパク質は、タンパク質構造体及
び／又は炭水化物構造体の特定基と結合する。
本発明は、複合糖質、特に免疫グロブリンとの結合能
を有する人工化合物を提供する。
現在まで、百日咳毒素の一部を構成するペプチド抗原
については当業界で何も確認されていない。このような
抗原が得られていないことから、診断抗原としてかかる
抗原を含む診断免疫アッセイ用キットを開発することの
みならず、かかる抗原に基づき百日咳に対するワクチン
を開発することも不可能であった。
ボーデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）抗
体に対する抗原又はB.パーツシスにより産生されるタン
パク質の補助による百日咳の診断法は公表済であるが、
但し診断抗原としてふさ状（fimbrial）赤血球凝集素
〔例えば、グランストレーム,M.（Granstrm,M.）、グ
ランストレーム,G.（Granstrm,G.）、リンドフォー
ス,A.（Lindfors,A.）及びアスケレフ,P.（Askelf,
P.）,1982年，抗原としてふさ状赤血球凝集素を用いた
酵素結合免疫吸着アッセイによる百日咳の血清学的診断
法，ジャーナル・オブ・インフェクショス・ディジージ
ズ（Journal of infectious Diseases），第146巻，第7
41−745頁参照〕又は音波処理B.パーツシス細菌〔例え
ば、グッドマン,Y.E.（Goodman,Y.E.）、ワート,A.J.
（Wort,A.J.）及びジャクソン,F.L.（Jackson,F.L.）,1
981年，初期感染の指標としての鼻咽腔分泌物中の百日
咳免疫グロブリンＡ検出用酵素結合免疫吸着アッセイ，
ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー
（Journal of Clinical Microbiology），第13巻，第28
6−292頁，並びにビルジャネン,M.K.（Viljanen,M.
K.）、ルースカネン,O.（Ruuskanen,O.）、グランバー
グ,C（Granberg,C.）及びサルミ,T.T.（Salmi,T.T.）,1
982年，百日咳の血清学的診断法：酵素結合免疫吸着ア
ッセイにより測定されるボーデテラ・パーツシスに対す
るIgM、IgA及びIgG抗体，スカンジナビアン・ジャーナ
ル・オブ・インフェクショス・ディジージズ（Scandina
vian Journal of infectious Diseases），第14巻，第1
12−117頁参照〕が用いられていた。
当業界で周知のように、不活性化ボーデテラ・パーツ
シス細菌に基づいた百日咳に対するワクチンがUSA及び
他の多くの国で現在使用されている。M.ピットマン（M.
Pittman）は百日咳が外毒素（百日咳毒素）により媒介
されていると1979年に発表したが〔ピットマン,M.,1979
年，百日咳毒素：百日咳の有害作用及び遅延免疫の原
因，ハイポセシス・レビュー・オブ・インフェクショス
・ディジージズ（Hypothesis Review of infectious Di
seases），第１巻，第401−412頁参照〕、日本では不活
性化百日咳毒素を含有した無細胞ワクチンが現在使用さ
れている。
最近、百日咳毒素のヌクレオチド配列が公表された
〔ロッチ,C.（Locht,C.）及びキース,J.M.（Keith,J.
M.）,1986年，百日咳毒素遺伝子：ヌクレオチド配列及
び遺伝組織，サイエンス（Science），第232巻，第1258
−1264頁〕。この論文において、著者らは、感染防御エ
ピトープを含んだ合成オリゴペプチド類が新世代のワク
チンの開発にとっても有用であると抽象的に述べている
が、但しこのようなエピトープについては教示又は示唆
すらない。
更に最近、百日咳毒素遺伝子に関する論文が公表され
た：ニコシア,A.（Nicosia,A.），ペルギニ,M.（Perugi
ni,M.），フランジニ,C.（Franzini,C.），カサグリ,M.
C.（Casagli,M.C.），ボリー,M.G.（Borri,M.G.），ア
ントニー,G.（Antoni,G.），アルモニー,M.（Almoni,
M.），ネリ,P.（Neri,P.），ラッティ,G.（Ratti,G.）
及びラポーリ,R.（Rappuoli,R.）,1986年，百日咳毒素
遺伝子のクローニング及び配列決定：オペロン構造及び
遺伝子複製，プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンスUSA（Proceeding of Natio
nal Academy of Science USA），第83巻，第4631−4635
頁。この文献において、“遺伝子工学による毒素遺伝子
操作は大量の無毒化タンパク質を産生するための方法で
ある”ことが、抽象的に述べられている。これは単なる
示唆にすぎず、操作された毒素遺伝子については何も開
示されていない。
更に別の文献がこの分野に存在する：エングストレー
ム,O.（Engstrm,O.），ロドマルム,K.（Rodmalm,
K.），ジェルンバール,H.（Ｊrnvall,H.），ルンドク
イスト,G.（Lundquist,G.），カルマン,M.（Ｋlmn,
M.），シモンシッツ,A.（Simonscits,A.），バートファ
イ,T.（Bartfai,T.），レフダール,S.（Ｌfdahl,
S.），及びアスケレフ,P.（Askelf,P.）,1986年，百
日咳毒素サブユニットS1のＮ末端構造の特徴及びオリゴ
デオキシリボヌクレオチドプローブとボーデテラ・パー
ツシスDNA断片とのハイブリッド化,FEMSマイクロバイオ
ロジー・レターズ（FEMS Microbiology Letters），第3
6巻，第219−223頁。更にこの論文では、即ち“遺伝子
は毒素産生のために他の生物中にも導入される。遺伝子
の配列決定は毒素の抗原エプトープに相当するペプチド
類の合成を可能とし、したがって合成百日咳ワクチンの
開発を可能にする”ことも示唆している。しかしなが
ら、百日咳毒素の抗原エピトープは確認、合成ばかり
か、試験さえもされていなかった。
皮内皮膚試験用組成物に関して、百日咳に対する免疫
試験用のかかる組成物は今まで当業界で開示されていな
い。
発明の説明 本発明の一面において、下記式の新規ポリペプチドが
提供される： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング（共
役）促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2
を表す。
適切な任意アミノ酸残基の例は−Lys−及び−Cys−で
ある。これらの任意アミノ酸残基は、上記ポリペプチド
に対する牛血清アルブミン等のキャリアのカップリング
を促進する。
本発明のペプチドは、それ自体公知の固相技術に従い
合成された。
この分野で周知のように、ペプチドは入手可能な樹脂
結合出発アミノ酸に応じて酸（COOH）又はアミド（CONH
2）形のいずれかで合成される。
本発明のもう一面によれば、複合糖質との結合能をも
つ遊離又はキャリア結合形の人工化合物が提供される
が、その化合物は下記式のポリペプチド並びにその機能
性アナログ及び機能性誘導体からなる群より選択され
る： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す。
本発明の化合物がキャリア結合形である場合には、そ
れはいずれのキャリアとも結合しうるが、それはキャリ
アに共有結合、イオン結合、水素結合又は疎水結合のよ
うな物理的／化学的相互作用によって結合される。この
ようなキャリアの例としては、例えばガラス、水酸化ア
ルミニウム、リン酸カルシウム等のような無機キャリ
ア、例えばマイクロプレート、ビーズ等のようなプラス
チック表面、脂質、リポソーム、炭水化物、アミノ酸、
ペプチド、タンパク質、膜もしくはその分画及び全細胞
もしくははその分画がある。
本明細書及び請求の範囲で用いられる“複合糖質”と
いう表現は、糖タンパク質、糖脂質、ペプチドグリカン
及びプロテオグリカンを含んだ意味であって、それらは
遊離でも又はキャリア結合形であってもよい（双方とも
インビボ及びインビトロにおいて）。
結合メカニズムはまだ明らかでないものの、本発明の
化合物は上記で規定された複合糖質の糖部分と結合して
いると堅く考えられているが、但し上記化合物及び複合
糖質間の相互作用に関して同様に重要な複合糖質の他の
位置であってもよい。複合糖質とのかかる特異的結合性
に影響を与えているのが水溶液（pH値範囲１〜13）中に
おける本発明のペプチドの結合コンホメーションであ
る、と更に考えられている。
上記において、本発明の化合物は、それらが本発明の
ペプチドとして同様の複合糖質（例えば、糖タンパク
質）結合能を有している限り、様々な化合物から選択す
ることができる。
本発明のペプチドの“機能性アナログ”という表現
は、アナログが本発明のペプチドとして同様の複合糖質
（特に糖タンパク質、例えば免疫グロブリン）結合能を
有している限り、１又は数個のアミノ酸残基を他のアミ
ノ酸残基で代用した又は代用していない、ペプチドの短
鎖又は長鎖モノマー又はポリマー（例えば、ペプチドの
機能性部分もしくは断片、又はペプチドの部分もしくは
断片のポリマー）を包括的に含んだ意味である。
更に本発明のペプチドの“機能性誘導体”という表現
は、本発明のペプチドとして同様の複合糖質（特に糖タ
ンパク質、例えば免疫グロブリン）結合能を有する化合
物を含んだ意味である。このような化合物の例として
は、本発明によるペプチドの構造を本質的に有するが但
し１又は数個のアミノ酸残基が他の化学基、即ち有機及
び無機分子又は元素で代用された化合物がある。
前記複合糖質に対する上記ペプチドの結合性に影響を
与えているのが水溶液中における本発明のペプチドの結
合コンホメーションであると考えられることから、（本
発明のペプチドの）機能性アナログ及び機能性誘導体は
水溶液中における上記ペプチドの結合コンホメーション
に本質的に対応した少なくとも１つのコンホメーション
を含んでいるべきである。
本発明の好ましい例では、免疫グロブリンとの結合能
をもつ遊離又はキャリア結合形の人工化合物が提供され
るが、その化合物は下記式のポリペプチド並びにその機
能性アナログ及び機能性誘導体からなる群より選択され
る： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す。
本発明のポリペプチド及び化合物は、免疫学の分野で
極めて有用な高度の興味ある性質を有している。
本発明の化合物は、複合糖質、特に糖タンパク質、例
えば免疫グロブリンと結合し、したがって酵素結合免疫
吸着アッセイ（ELISA）においてかかるアッセイで従来
使用されてきた複合体の代わりに酵素結合形として使用
することができる。
本発明の化合物は、複合糖質、例えば免疫グロブリン
又は他の免疫活性物質、例えばβ−ミクログロブリンの
ための一般的吸着剤として使用することができる。吸着
剤として、それは免疫複合体から体液を清浄化するため
に血漿交換法を用いて（インビボで）生体外体液に適用
されるか又はそのために利用することができる。血漿交
換法における吸着剤として上記化合物に関する他の有用
性の例は、アレルギー、白血病及びエイズのような疾患
の治療に際してである。
吸着剤として、それは更にポリ及びモノクローナル抗
体及び他の免疫活性物質を精製するために（インビトロ
で）使用することもできる。
更に、キャリア結合形の本発明の化合物は、免疫化学
の分野において（インビトロで）広い用途を有してい
る。キャリアとしては、特に金粒子、コロイド金、酵素
（例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペル
オキシダーゼ）、アビジン、ビオチン又は一部の放射性
同位元素（例えば、ヨウ素）のような標識（マーカー）
がある。
本発明の化合物は免疫活性細胞と結合し、したがって
（インビボで）ターゲット化用にキャリア結合形として
用いることができる。この点に関するキャリアの例とし
ては、様々な医薬、静細胞剤及びホルモンがある。特に
重要なターゲット化用途は、人工、合成及びサブユニッ
トワクチンを免疫能力細胞に向けることである。
更に、本発明の化合物は細胞膜上のブロックレセプタ
ーにも用いることができ、その性質によって腎臓、肝臓
又は骨髄のような同種移植片をもつ患者の免疫抑制のた
めに上記化合物を有用化させているのである。
本発明の遊離形化合物において更に興味ある性質は、
それがリンパ球活性化因子（LAF）として挙動し、細胞
の有糸分裂を誘導させ、もって本化合物が強いアジュバ
ント活性を有することである。
本発明のもう１つの面において、天然百日咳毒素によ
り誘導される抗体と反応する下記ポリペプチド及びその
一部からなる群より選択される少なくとも１種のペプチ
ド配列から主に構成される人工百日咳毒素抗原が提供さ
れる： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す。
本発明のポリペプチドは、動物体内で天然毒素と反応
する抗体を誘導することができる。したがって、それは
抗原と考えられる。抗原であるとした場合、本発明のポ
リペプチドは、天然百日咳毒素と反応する抗体をそれ自
体で誘導しうる更に短いペプチド配列を含んでいてもよ
い。本発明において天然百日咳毒素により誘導される抗
体と反応する人工百日咳毒素抗原は、たとえそれがいく
つかのかかる短鎖ペプチド配列を含むことが好ましいと
しても、キャリアと一緒に本発明のポリペプチドの一部
分としてこのような短鎖ペプチド配列を必ずしも２以上
含んでいる必要はない。
“人工百日咳毒素抗原”という表現は、それが本明細
書及び添付の請求の範囲で用いられている場合に、人工
的方法で産生される、即ち人間の活動から離れた自然原
因によらず人間の努力で得られる百日咳毒素抗原を含ん
だ意味である。本発明の人工百日咳毒素抗原から構成さ
れる又はそれから部分的に構成されるペプチド配列がそ
れ自体公知の固相技術に従い化学的に合成されたとして
も、上記ペプチド配列はいくつかの他の技術、例えば液
相中公知の方法で１つのアミノ酸を次のものとカップリ
ングさせる合成、分解、クローニング等を用いて産生す
ることもできるのであって、“人工”という表現はこの
ようないかなる技術によって産生された産物であっても
含む意味である。
“含む（含有する）”という用語は、本明細書及び添
付の請求の範囲において、ある物が含まれていることを
示すために用いられているが、但しある物とは必ずしも
唯一の物でなくてよい。
“天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応するペ
プチド配列”に関連した“から主に構成される”という
表現は、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応す
る人工百日咳毒素抗原の能力が上記ペプチド配列に由来
することを示すために用いられている。
“キャリア”という用語は広義に解釈されるべきであ
って、キャリアとは問題のペプチドが共有結合、イオン
結合、水素結合又は疎水結合のような物理的／化学的相
互作用によって結合されうるのであればいかなるもので
あってもよい。このようなキャリアの例としては、例え
ば水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム等のような無
機キャリア、例えばマイクロプレート、ビーズ等のよう
なプラスチック表面、脂質、リポソーム、炭水化物、ア
ミノ酸、ペプチド及びタンパク質がある。
本発明の更にもう１つの面として、生物学的液体サン
プル中において天然百日咳毒素により誘導される抗体測
定用の診断免疫アッセイ用キットが提供される。本キッ
トは、本発明に従い天然百日咳毒素により誘導される抗
体と反応する人工抗原から選択される少なくとも１種の
抗原を診断抗原として含んでいる。天然百日咳毒素によ
り誘導される抗体測定用の免疫アッセイに応じて、キッ
トは、他の適切な試薬、例えば上記診断抗原がカップリ
ングされるキャリア、陽性標準血清サンプル、陰性標準
血清サンプル、酵素複合体、例えばアルカリホスファタ
ーゼもしくはペルオキシダーゼ、酵素複合体用の基質、
例えばｐ−ニトロフェニルホスフェート、寒天もしくは
アガロースゲル、放射性同位元素標識抗原、緩衝液及び
／又は洗浄液を含んでいてもよい。場合により、キット
中のすべての試薬は、特定の標識でマークされた別個の
密封試験管又はバイアル中に含まれる。
生物学的液体サンプルは、動物、例えばヒトからの鼻
咽腔分泌物、唾液、血液又は血清サンプルであることが
好ましい。
本発明のキットで利用可能な免疫アッセイの例として
は、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、免疫拡散、
放射線免疫アッセイ（RIA）及び免疫電気泳動（IE）が
ある。
ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）が用いられる場
合、本発明のキットは： ａ）本発明の診断抗原 ｂ）場合により、上記診断抗原用のキャリア ｃ）場合により、陽性標準血清サンプル ｄ）場合により、陰性標準血清サンプル ｅ）酵素複合体 ｆ）場合により、上記酵素複合体用の基質 ｇ）場合により、緩衝液、及び ｈ）場合により、洗浄液 を含む。
免疫拡散又は免疫電気泳動（IE）が用いられる場合、
本発明のキットはｅ）及びｆ）を除きELISAの場合と同
様のものを含む。代わりに、寒天又はアガロースゲルの
ようなゲルが必要とされるが、但しこのようなゲルは普
通入手可能であることからキット中には通常含まれな
い。
放射線免疫アッセイ（RIA）が用いられる場合、本発
明のキットはｅ）及びｆ）を除きELISAの場合と同様の
ものを含むが、但し代わりに放射性同位元素標識抗原が
用いられる。場合により、トリクロロ酢酸又は二次抗体
のような、抗体に結合した放射性同位元素標識抗原の沈
降用溶液を含めてもよい。
本発明のもう一つの面では、免疫成分として、好まし
くは百日咳疾患から患者を保護するために有効な量で、
天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する本発明
の人工百日咳毒素抗原から選択される少なくとも１種の
抗原並びに無毒性の薬学上許容されるキャリア及び／又
は希釈剤を含有したワクチン組成物が提供される。キャ
リアとは本明細書中で前記のように規定されたキャリア
であり、希釈剤は塩水溶液のような当業界で用いられる
慣用的希釈剤でよい。本発明のワクチン組成物は、上記
量の抗原と共に、百日咳疾患から患者を保護するために
有効な量で抗原アジュバントを更に含有していてもよ
い。ヒト用ワクチンで通常用いられるアジュバントの例
は、問題の抗原が吸着される例えばカルシウム又はアル
ミニウムのリン酸塩又は水酸化物のようないわゆる無機
キャリアである。常用される獣医学用ワクチンアジュバ
ントの例は、フロイント完全アジュバントである。ワク
チン組成物は適宜緩衝剤及び／又は保存剤を更に含有し
ていてもよく、適切な緩衝剤及び保存剤は例えばUS薬局
方で開示されている。
本発明の更にもう一つの面では、患者の特異的抗体力
価に関して免疫学的皮膚反応を生じさせるために有効な
量で本発明による天然百日咳毒素により誘導される抗体
と反応する人工百日咳毒素抗原から選択される少なくと
も１種の抗原並びに無毒生の薬学上許容されるキャリア
及び／又は希釈剤を含有した皮内皮膚試験用組成物が提
供される。本発明の皮膚試験用組成物は、適宜緩衝剤及
び／又は保存剤を更に含有していてもよい。
有用なキャリア、希釈剤、緩衝剤及び保存剤について
は、本明細書中前記で規定されている。
本発明によるペプチドの合成 本発明によるペプチドの固相〔メリフィールド（Merr
ifield）〕合成は常法に従いアミノ酸を互いにカップリ
ングさせることにより行われたが、それによりペプチド
結合が形成され、即ち最初のアミノ酸のＣ末端が結合さ
れた固相（樹脂）から開始し、しかる後次のアミノ酸の
Ｃ末端が最初のアミノ酸のＮ末端にカップリングされ
る。最後に、組み立てられたペプチドが固相から放出さ
れる。
詳しくは、下記ペプチドが合成された： Ｈ−Lys−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−T
yr−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−OH ペプチド断片の合成は、バイオサーチ・サム・ツー
（Biosearch Sam Two）〔バイオサーチ社（Biosearch,I
nc.），カリフォルニア州USA〕ペプチド合成機を用いて
ｔ−BOCアミノ酸に関するバイオサーチペプチド合成オ
ートメーションソフトウェアのバージョン2.38に従い実
施された。標準（欠失）カップリング定数が、出発物質
1gについて適用された（置換度＝0.33meq/g）。
ペプチド合成のために用いられた樹脂は標準メリフィ
ールド樹脂であった。適切な保護アミノ酸は下記のとお
りであった： Boc−Ala−OH Boc−Arg（Tos）−OH （Boc−Ｌ−アラニン） （ａ−Boc−Ｎ−トシル− Boc−Asn−OH Ｌ−アルギニン） (Boc−Ｌ−アスパラギン) Boc−Gln−OH Boc−Lys（CL−Ｚ）−OH （Boc−Ｌ−グルタミン） （Boc−ｅ−ｏ−クロロベ Boc−Pro−OH ンジルオキシカルボニル− （Boc−Ｌ−プロリン） Ｌ−リジン） Boc−Thr（Bzl）−OH Boc−Ser（Bzl）−OH （Boc−Ｏ−ベンジル−Ｌ （Boc−Ｏ−ベンジル−Ｌ −トレオニン） −セリン） Boc−Val−OH Boc−Tyr（Cl2−Bzl）−OH （Boc−Ｌ−バリン） （Boc−Ｏ−2,6−ジクロロ ベンジル−Ｌ−チロシン） アミノ酸濃度、溶媒容量、反応時間等に関する詳細に
ついて、製造者（バイオサーチ）の推薦は下記のとおり
であった。
詳しくは、下記で掲載の化学物質が合成ペプチドの合
成、開裂及び精製に用いられた。
完成した樹脂結合ペプチドは合成室から取り出され、
メタノールで洗浄され、真空下で一定重量まで乾燥され
た。
樹脂支持体からのペプチドの開裂 洗浄及び乾燥された樹脂結合ペプチドの一部（0.5g）
をレゾルシノール1g、ジメチルスルフィド6.5ml及びポ
リテトラフルオロエチレン（PTFE）被覆マグネット含有
円筒形PTFE室に移した。室をドライアイス−エタノール
浴で−80℃に冷却した。次いで、フッ化水素酸（HF）
（最終容量10ml）を室に入れ、しかる後磁気スターラー
上０℃で120分間維持した。次いで、酸を水アスピレー
ターで除去した。室を再度−80℃に冷却し、HF10mlを室
に入れ、磁気スターラー上に０℃で45分間置いた。酸を
再度水アスピレーターで除去し、残留混合物を焼結ガラ
スフィルターに移した。次いで、樹脂／ペプチド混合物
を10％（v/v）酢酸100mlでしかる後ジエチルエーテル50
mlで洗浄した。酢酸洗液も分液ロート中ジエチルエーテ
ル50mlで洗浄し、エーテル相を水相から除去した。次い
で、プールされたエーテル洗液及び酢酸洗液を各々蒸
発、凍結乾燥させて、ペプチド生成物を回収した。ペプ
チドは水相のみから回収した。
粗生成物をデシケーター内のガラスバイアル中室温で
貯蔵した。
合成ペプチドの精製 粗合成生成物の様々な成分は、移動相としてアセトニ
トリル/H2O〔0.1％v/vトリフルオロ酢酸（TFA）〕を用
いた逆相Ｃ−18シリカ高圧クロマトグラフィーカラムに
それらを適用することにより分離された。粗ペプチド20
μｇ〜100mgをH2O（0.1％TFA）1ml以内に溶解し、遠心
分離し、レオダイン（Rheodyne）（カリフォルニア州,U
SA）HPLCインジェクターの1mlループ中に注入した。溶
液を2152勾配コントローラー及び２つの2150HPLCポンプ
（LKB,スウェーデン）により注文パック化10×500mmオ
リゴシル（Oligosil）逆相Ｃ−18カラム〔スカンジナビ
スカ・ゲネテック（Skandinaviska Genetec），スウェ
ーデン〕中にポンプ導入した。勾配は、60分間にわたり
０〜100％アセトニトリルで直線的であった。流速は2ml
/minであった。合成生成物の溶出は、LKB2131可変波長
吸収モニターを用いて206〜238nmでモニターされた。画
分を手で集め、必要であれば関連画分の凍結乾燥、再溶
解及びクロマトグラフィー操作の繰返しにより再精製し
た。最終生成物を凍結乾燥し、ガラスバイアル中−20℃
で貯蔵した。
免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製 前記合成ペプチドは、ELISAで用いられるペプチド抗
原（コーティング抗原）を形成させるために、下記方法
でキャリア、即ち牛血清アルブミン（BSA）にカップリ
ングさせた。
ペプチド1mg及びBSA3.6mgをpH7.4のリン酸緩衝液（PB
S）2.0mlに溶解した。
この溶液に、2.5％（w/v）グルタルジアルデヒド水溶
液30μを加えた。
反応混合物を室温（20〜25℃）で１時間インキュベー
トし、5Mエタノールアミン水溶液0.5mlの添加により反
応停止させ、しかる後＋４℃で４時間PBS1に対して透
析し、30分間後及び２時間後に透析液を交換した。
次いで、透析バックの内容物をPBSで平衡化されたセ
ファクリル （Sephacryl）Ｓ−300ゲル〔ファルマイシ
ア（Pharmacia），ウプサラ，スウェーデン〕含有カラ
ム（2.5×60cm）に通してゲル濾過した。3.0ml画分を集
めた。
カップリング物質含有画分をプールし、プールされた
物質をコーティング抗原としてELISAで用い、事前に希
釈することなく直接マイクロプレートに加えた。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA） 以下は、ELISAの一般的説明である。複合体及び複合
体の希釈、並びにマイクロプレート読取り前の経過時間
は、様々なアッセイ毎に異なっている。差異は一般的説
明の後に示されている。
ELISAの一般的説明 装備： 微量滴定プレート〔ダイナテック（Dynatech）,mod.nr1
29B〕； マイクロプレートコーティング用抗原（例えば、ペプチ
ド及びタンパク質）； コーティング用緩衝液：リン酸緩衝液（PBS）； インキュベート用緩衝液:PBS＋0.05％ツイーン（Twee
n）20（v/v）； 水性洗浄液:0.9％NaCl＋0.05％ツイーン20; 血清（例えば、ヒト及び動物参照並びに試験血清）； 複合体〔例えば、アルカリホスファターゼ複合化ブタ抗
ヒトIgG抗体（オリオン・ジアグノスチカ（Orion Diagn
ostica））及びヤギ抗ウサギIg抗体（シグマ（Sigm
a））〕； 酵素基質:p−ニトロフェニルホスフェート錠剤（シグ
マ）、基質緩衝液（下記参照）1mg/ml; 基質緩衝液:pH9.8の1M水性ジエタノールアミン＋0.5mM
MgCl2＋0.02％NaN3; ピペット及び試験管； 操作： 1.マイクロプレートのコーティング マイクロプレートを室温（20〜25℃）で一夜PBS中抗
原0.1mlと共にインキュベートした。
2.牛血清アルブミン（BSA）及び血清とのインキュベー
ト プレートを４回洗浄し、しかる後37℃で１時間PBS中
１％（w/v）BSA0.1mlと共にインキュベートした。洗浄
後、インキュベート用緩衝液で適宜希釈された血清0.1m
lをウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベ
ートした。
3.複合体とのインキュベート 洗浄後、インキュベート用緩衝液で適宜希釈された複
合体0.1mlをウェルに加え、プレートを室温で２時間イ
ンキュベートした。
4.洗浄後、酵素基質溶液0.1mlをウェルに加えた。プレ
ートを室温に保ち、405nmの吸光度を下記時間の後で読
取った。
ELISAの具体的な説明 酵素結合免疫吸着アッセイ： 合成ペプチド及びウサギもしくはヒト血清中の抗体間
の反応、又は合成ペプチド及び複合体のみ間の反応を測
定するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA） ELISAにおいてコーティング用抗原として用いられる
ペプチドを最初に“免疫アッセイ用ペプチド抗原の作
製”で記載されているように処理した。血清サンプル
は、２匹の異なるウサギ（ウサギ１及びウサギ２）か
ら、ヒト１例（ヒト１）から及び別人（ヒト２）のヒト
血清プールからのものであった。血清は1/500希釈で使
用した。用いられた複合体は、1/500希釈されたアルカ
リホスファターゼヤギ抗ウサギIg複合体（シグマ）又は
1/100希釈されたアルカリホスファターゼブタ抗ヒトIg
複合体（オリオン・ジアグノスチカ）であった。
プレートは自動ELISAリーダー〔タイターテック（Tit
ertek），マルチスキャン（Multiscan）〕で下記時間に
読取った。
結果は下記のとおりである： すべての場合で上記結果が陽性反応を示したことか
ら、これらのデータは合成ペプチドが、ウサギ及びヒト
双方の血清、即ちこの後者の場合では１例（ヒト１）か
らの血清及びヒト血清のプール（ヒト２）と及び／又は
用いられたアルカリホスファターゼヤギ抗ウサギIg複合
体及びアルカリホスファターゼブタ抗ヒトIgG複合体の
各々の場合に反応することを支持している。
合成されたペプチドが各複合体と反応しかつ結合する
ことは、ペプチドと結合しうる複合体単独の能力によっ
て更に示される。この結合性がペプチドとこれら複合体
中のアルカリホスファターゼとの相互作用によるもので
ないことは、酵素単独で用いられかつ結合が観察されな
い同様の実験で立証された。
ヒトIgGに対する合成ペプチドの特異的結合性 ヒトIgGと特異的に結合しうる合成ペプチドの能力を
下記実験で更に示した。
合成ペプチド（0.5mg）をセファロース（Sepharos
e ）4B（ファルマシア，ウプサラ，スウェーデン）カ
ラムに供した。CNBr活性化セファロース4Bゲル（10ml）
を予め室温で一夜かけて過剰のヒトIgG（800mg）と反応
させ、共有結合によりIgGを固定した。ヒトIgG150mgが
ゲルマトリックスと共有結合していることが判明した。
合成ペプチドの約85％は留まっており、即ち４℃及び
25℃においてPBS中pH7.2でこのカラムに結合していた。
カラムに結合しなかった合成ペプチドはほとんど汚染物
質、即ち他の配列のペプチドを含んでいるようである
が、これはペプチドがメリフィールドに従い合成された
場合に生じることが周知である。
カラムでセファロース4Bゲル（10ml）を用いただけの
コントロール実験では、CNBr活性化部位を室温で一夜か
けてエタノールアミン（1Mエタノールアミン2ml＋PBS10
ml）でブロックした。
次いで、合成ペプチド（0.5mg）をカラムに供し、カ
ラムにPBSを注いだ。すべての合成ペプチドが溶出液か
ら回収された。
よって、ペプチドは、セファロース4Bゲルに結合した
ヒトIgGには結合したが、セファロース4B自体とは結合
しなかった。
このようなカラム（即ち、ヒトIgGセファロース4B）
を用いれば、活性ペプチドを不活性ペプチドから分別す
ることが可能である。
活性ペプチド画分は、１％（v/v）水性酢酸の添加に
よりカラムから溶出される。こうして溶出されたペプチ
ドは、pH7.2に戻された後再度同一のカラムに結合する
ことが示された。
一緒に行われたこれらの実験では更に、合成ペプチド
が上記ELISA実験で実際にヒトIgGと結合したことを支持
している。
リンパ球又は胸腺細胞増殖活性用のアッセイ:LAFアッセ
イ この実験では、本発明の合成ペプチドがリンパ球又は
胸腺細胞増殖活性を示すことが判明したが、これは周知
の分裂促進剤、即ち植物性血球凝集素により示される場
合に匹敵する。
アッセイで用いられる物質及び装備 培地:90ml RPMI〔フロー・ラボラトリーズ（Flow Labor
atories）〕 10ml牛血清アルブミン（シグマ,USA） 2ml L−グルタミン水溶液14.6g/（シグマ,USA） 1mlピルビン酸ナトリウム（100mM）〔ギブコ・リミテッ
ド（Gibco Limited,UK）〕 1mlペニシリン−ストレプトマイシン（10,000単位/ml）
（ギブコ・リミテッド） 分裂促進剤：植物性血球凝集素,PHA HA16 2mg/ml H2O ウェルカム診断 （メチル,1′,2′−3H）チミジン:4.44Bq/nmol、120Ci/
mmol〔アマーシャム・インターナショナル公社（Amersh
am International plc）、UK〕 ガス:4％CO2含有空気，グランドガスＢスタンド（Grund
gas B−stand）OTC−20（AGA,スウェーデン） 遠心機:IEC臨床遠心機603B クリメート・チャンバー（climate chamber）:WEDCOイ
ンコーポレーテッド（Incorporated）EZ−17MM インキュベートプレート:NUNCLONデルタ、インターメ
ド、デンマーク 細胞ハーベスター：ダイナテック（Dynatech）、オート
マッシュ（Automash）2000 シンチレーションカウンター：ベックマン（Beckman）L
S−100C液体シンチレーションシステム シンチレーション液体：オプチフェースMP（Opti Phase
MP）、LKBプロダクター（LKB produkter）、AB、スウ
ェーデン 操作の説明 すべての操作は無菌条件下で行われた。
脾臓をNMRIマウスから除去し、室温で培地5ml中に置
いた。次いで、脾臓を100メッシュワイヤーネットでホ
モゲナイズした。ホモゲネートを２分間静置し、懸濁液
を沈降物からデカントし、しかる後細胞を1220rpmで８
分間遠心分離した。上澄を捨て、細胞を再度培地5mlに
懸濁しかつ1220rpmで８分間遠心分離することによりも
う一度洗浄した。上澄を捨て、細胞を培地5mlに懸濁し
た。細胞を1/100希釈し、ビュールカー（Ｂrker）チ
ャンバー内でカウントし、しかる後最終濃度５×10-6細
胞/mlまで希釈した。
LAFアッセイ インキュベートプレート中の外側列ウェルはサンプル
用に用いなかったが、但し安定温度ゾーンを形成させる
ために培地200μで充填した。“陰性”コントロール
は12ウェル／プレートに入れられたが、培地100μ及
び細胞懸濁液100μからなっていた、サンプル100μ
は新しいプレートに入れ、1:2連続希釈がプレートの残
りのウェルで行われた。サンプルについて少なくとも３
回の反復試験が行われた。参照（コントロール）とし
て、分裂促進剤の植物性血球凝集素（PHA）を用いた。
別のウェルに、各々３回にわたり培地中PHA2.5μｇ、５
μｇ及び７μｇ並びに培地中本発明の合成ペプチド１μ
ｇ及び10μｇを加えた。
プレートを底部に蒸留水があるデシケーター中に置
き、しかる後デシケーター内の空気を上記ガスで２分間
交換した。蓋をデシケーター上に置き、しかる後デシケ
ーターをクリメートチャンバー内に置き、37℃、湿度37
％で48時間インキュベートした。インキュベート後、3H
−チミジン25μを各ウェル（0.010μCi/ウェル）に加
え、プレートをクリメートチャンバー内で更に16時間イ
ンキュベートした。
次いで、ウェルを細胞ハーベスターで定量的に回収
し、試験サンプルを濾紙で集めた。細胞の完全回収を確
保するために、ウェルを0.9％（w/v）塩化ナトリウム水
溶液で３回洗浄した。こうして濾紙で回収された細胞を
押しつぶし、シンチレーションバイアルに入れた。シン
チレーション液体6mlを各バイアルに加えた。バイアル
を撹拌し、シンチレーションカウンターによる5min/バ
イアルの放射能測定前に15分間放置させた。
結果： 添加物 cpm（実験３回の範囲） 分裂促進剤なし 600− 870 PHA2.5μｇ 6700− 8100 PHA5μｇ 9800−10400 PHA7μｇ 7000− 8100 本発明のペプチド： １μｇ 3000− 4200 10μｇ 7000− 8500 上記結果は、本発明の合成ペプチドが周知の分裂促進
剤PHAで示される場合と同様の胸腺細胞増殖活性を有す
ることを、明らかに示している。
合成ペプチドによる免疫 本発明の合成ペプチドによるマウスの免疫感作で特異
的に誘導される抗体及び天然毒素間の反応を測定するた
めの酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）。
マウス免疫用抗原として用いられるペプチドを最初に
“免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製”において記載さ
れたように処理した。
マウス（NMRI）のグループに、キャリアとして水酸化
アルミニウムを用い、１か月間隔でペプチド抗原0.5ml
を３回皮下免疫した。血清サンプルを投与３回目の２か
月後に集めた。ELISA用マイクロプレートを濃度１μg/m
lで精製百日咳毒素によりコーティングした。ゼラチン
（１％）をBSAの代わりに非特異的結合を阻止するため
用いた（“ELISAの一般的説明”参照）。血清の終点力
価は、カットオフされる0.1の吸光度値を用いて、1/20
希釈から出発し２倍希釈で10回まで測定した。用いられ
た複合体は1/500希釈されたヤギ抗マウスIgG複合体（シ
グマ）であった。
プレートは自動ELISAリーダー（タイターテック，マ
ルチスキャン）で30分間後に読取られた。
アッセイは下記のとおりであった： No. 応答数 平均力価 範囲 合成ペプチド 17 15 2334 320−40960 コントロール 12 0 67 20− 160 本発明の合成ペプチドが免疫感作により抗体を誘導し
うることは上記結果から明らかであり、免疫接種前サン
プルの場合よりも免疫接種後サンプルの場合に明らかに
高い吸光度を有している。したがって、試験されたペプ
チドは抗原として機能し、百日咳毒素に対する抗体を誘
導する。
結果として、毒素は、マウス由来の免疫接種後血清サ
ンプル中において合成ペプチドにより誘導された抗体と
特異的に結合することが確認される。
更に、同一のマウスは精製百日咳毒素（20μg/マウス
＝５×LD50）で侵襲され、生存平均日数が終点力価との
関係で調べられた。
表 マウス数 生存日数（平均） 終点力価 17 3.765 80−40960 15 4.000 320−40960 14 3.929 640−40960 10 4.600 1280−40960 8 4.875 2560−40960 6 5.333 5120−40960 3 6.333 10240−40960 コントロール 12 3.333 上記表から明らかなように、平均生存時間は終点力価
の増加と共に増加している。したがって、高力価の抗体
を有するマウスは侵襲に対して部分的に保護される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｆ

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記式のポリペプチド： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
    r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す〕。
  2. 【請求項２】複合糖質と結合能をもつ遊離又はキャリア
    結合形の人工化合物であって、 下記式のポリペプチド： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
    r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す〕か
    らなる群より選択されることを特徴とする人工化合物。
  3. 【請求項３】免疫グロブリンとの結合能をもつ遊離又は
    キャリア結合形の人工化合物であって、 下記式のポリペプチド： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
    r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す〕か
    らなる群より選択されることを特徴とする人工化合物。
  4. 【請求項４】天然百日咳毒素により誘導される抗体と反
    応する下記ポリペプチド： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
    r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す〕か
    らなる群より選択される少なくとも１種のペプチド配列
    から主に構成されることを特徴とする人工百日咳毒素抗
    原。
  5. 【請求項５】生物学的液体サンプル中において天然百日
    咳毒素により誘導された抗体測定用の診断免疫アッセイ
    用キットであって、 天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する下記ポ
    リペプチド： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
    r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す〕か
    らなる群より選択される少なくとも１種のペプチド配列
    から主に構成される人工抗原から選択される少なくとも
    １種の抗原を診断抗原として含むことを特徴とする診断
    免疫アッセイ用キット。
  6. 【請求項６】診断抗原が結合されたキャリア； 陽性標準血清サンプル； 陰性標準血清サンプル；及び 場合により、緩衝液及び／又は洗浄液； を更に含む、請求の範囲第５項に記載の診断免疫アッセ
    イ用キット。
  7. 【請求項７】寒天もしくはアガロースゲル、又は放射性
    同位元素標識抗原、又は酵素複合体及び場合により酵素
    複合体用の基質を更に含む、請求の範囲第６項に記載の
    診断免疫アッセイ用キット。
  8. 【請求項８】免疫成分として、天然百日咳毒素により誘
    導される抗体と反応する下記ポリペプチド： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
    r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ 〔上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す〕か
    らなる群より選択される少なくとも１種のペプチド配列
    から主に構成される人工百日咳毒素抗原から選択される
    少なくとも１種の抗原を無毒性の薬学上許容されるキャ
    リア及び／又は希釈剤と共に含むことを特徴とするワク
    チン組成物。
  9. 【請求項９】百日咳疾患から患者を保護するために有効
    な量で百日咳毒素抗原を含む、請求の範囲第８項に記載
    のワクチン組成物。
  10. 【請求項１０】所定量の百日咳毒素抗原と共に、百日咳
    疾患から患者を保護するために有効な量で抗原アジュバ
    ントを更に含む、請求の範囲第８項に記載のワクチン組
    成物。
  11. 【請求項１１】緩衝剤及び／又は保存剤を更に含む、請
    求の範囲第８、９項又は10項に記載のワクチン組成物。
  12. 【請求項１２】患者に特定抗体力価で免疫皮膚反応を生
    じさせるために有効な量で少なくとも１種の抗原〔この
    抗原は、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応す
    る下記ポリペプチド： Ｈ−X1−Gln−Thr−Arg−Ala−Asn−Pro−Asn−Pro−Ty
    r−Thr−Ser−Arg−Arg−Ser−Val−Ala−Ser−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す）か
    らなる群より選択される少なくとも１種のペプチド配列
    から主に構成される人工百日咳毒素抗原から選択され
    る〕を無毒性の薬学上許容されるキャリア及び／又は希
    釈剤と共に含むことを特徴とする皮内皮膚試験用組成
    物。
  13. 【請求項１３】緩衝剤及び／又は保存剤を更に含む、請
    求の範囲第12項に記載の皮内皮膚試験用組成物。
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