JP2635641B2 - 新規ペプチド類及びその用途 - Google Patents

新規ペプチド類及びその用途

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JP2635641B2 JP62506690A JP50669087A JP2635641B2 JP 2635641 B2 JP2635641 B2 JP 2635641B2 JP 62506690 A JP62506690 A JP 62506690A JP 50669087 A JP50669087 A JP 50669087A JP 2635641 B2 JP2635641 B2 JP 2635641B2
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    • C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S530/825—Bacteria

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規ポリペプチド類、天然百日咳毒素によ
り誘導される抗体と反応するペプチド配列から主に構成
される新規ポリペプチド類及びその部分から選択される
人工百日咳毒素抗原、天然百日咳毒素により誘導される
抗体と反応する上記抗原を診断抗原として含む診断免疫
アッセイ用キット、天然百日咳毒素により誘導される抗
体と反応する上記抗原から選択される抗原を免疫成分と
して含むワクチン組成物、並びに天然百日咳毒素により
誘導される抗体と反応する上記抗原から選択される抗原
を含む皮内皮膚試験用組成物に関する。
背景 現在まで、百日咳毒素の一部を構成するペプチド抗原
については当業界でも何も確認されていない。このよう
な抗原が得られていないことから、診断抗原としてかか
る抗原を含む診断免疫アッセイ用キットを開発すること
も、かかる抗原に基づき百日咳に対するワクチンを開発
することも不可能であった。
ボーデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）抗
体に対する抗原又はB.パーツシスにより産生されるタン
パク質の補助による百日咳の診断法は公表済であるが、
但し診断抗原としてふさ状（fimbrial）赤血球凝集素
〔例えば、グランストレーム,M.（Granstrm,M.）、グ
ランストレーム,G.（Granstrm,G.）リンドフォース,
A.（Lindfors,A.）及びアスケレフ,P.（Askelf,P.）,
1982年，抗原としてふさ状赤血球凝集素を用いた酵素結
合免疫吸着剤アッセイによる百日咳の血清学的診断法，
ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ
（Journal of Infectious Diseases），第146巻，第741
−754頁参照〕又は超音波処理B.パーツシス細菌〔例え
ば、グッドマン,Y.E.（Goodman,Y.E.）、ワート,A.J.
（Wort,A.J.）及びジャクソン,F.L.（Jackson,F.L.）,1
981年，初期感染の指標としての鼻咽腔分泌物中の百日
咳免疫グロブリンＡ検出用酵素結合免疫吸着剤アッセ
イ，ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロ
ジー（Journal of Clinical Microbiology），第13巻，
第286−292頁，並びにビルジャネン,M.K.（Viljanen,M.
K.）、ルーカネン,O.（Ruuskanen,O.）、グランバーグ,
C（Granberg,C.）及びサルミ,T.T.（Salmi,T.T.）,1982
年，百日咳の血清学的診断法：酵素結合免疫吸着剤アッ
セイにより測定されるボーデテラ・パーツシスに対する
IgM、IgA及びIgG抗体，スカンジナビアン・ジャーナル
・オブ・インフェクシャス・ディジージス（Scandinavi
an Journal of Infectious Diseases），第14巻，第112
−117頁参照〕が用いられた。
当業界で周知のように、不活性化ボーデテラ・パーツ
シス細菌に基づいた百日咳に対するワクチンがUSA及び
他の多くの国で現在使用されている。M.ピットマンは百
日咳が外毒素（百日咳毒素）により媒介されていると19
79年に発表したが〔ピットマン,M.,1979年，百日咳毒
素：百日咳の有害作用及び遷延免疫の原因，ハイポセシ
ス・レビュー・オブ・インフェクシャス・ディジージズ
（Hypothesis Review of Infectious Diseases），第１
巻，第401−412頁〕、日本では不活性化百日咳毒素を含
有した非細胞ワクチンが現在使用されている。
最近、百日咳毒素のヌクレオチド配列が公表された
〔ロッチ,C.（Locht,C）及びキース,J.M.（Keith,J.
M.）,1986年，百日咳毒素遺伝子：ヌクレオチド配列及
び遺伝組織，サイエンス（Science），第232巻，第1258
−1264頁〕。この論文において、著者らは、感染防御エ
ピトープを含んだ合成オリゴペプチド類が新世代のワク
チンの開発にとっても有用であると抽象的に述べている
が、但しこのようなエピトープについては教示又は示唆
すらない。
更に最近、百日咳毒素遺伝子に関する論文が公表され
た：ニコシア,A（Nicosia,A.），ペルギニ,M.（Pergin
i,M.）フランジニ,C.（Franzini,C.），カサグリ,M.C.
（Casagli,M.C.），ボリー,M.G.（Borri,M.G.），アン
トニ,G.（Antoni,G.），アルモニ,M.（Almoni,M.），ネ
リ,P.（Neri,P.），ラッティ,G.（Ratti,G）及びラポー
リ,R.（Rappuoli,R.）,1986年，百日咳毒素遺伝子のク
ローニング及び配列決定：オペロン構造及び遺伝子複
製，プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンスUSA（Proceedings of National A
cademy of Science USA），第83巻，第4631−4635頁。
この文献において、“遺伝子工学による毒素遺伝子操作
は大量の無毒化タンパク質を産生するための方法であ
る”ことが、抽象的に述べられている。これは単なる示
唆にすぎず、操作された毒素遺伝子については何も開示
されていない。
更に別の文献がこの分野に存在する：エングストレー
ム,O.（Engstrom,O.），ロドマルム,K.（Rodmalm,
K.），ジェルンバール,H.（Ｊrnvall,H.），ルンドク
イスト,G.（Lundquist,G.），カルマン,M.（Ｋlmn,
M.），シモンシッツ,A.（Simonscits,A.），バートファ
イ,T.（Bartfai,T.），レフダール,S.（Ｌfdahl,
S.），及びアスケレフ,P.（Askelf,P.）,1986年，百
日咳毒素サブユニットS1のＮ末端構造の特徴及びオリゴ
デオキシリボヌクレオチドプロープとボーデテラ・パー
ツシスDNA断片とのハイブリット化,FEMSマイクロバイオ
ロジー・レターズ（FEMS Microbiology Letters），第3
6巻，第219−223頁。この論文では、“遺伝子は毒素を
産生する他の生物中にも導入される。遺伝子の配列決定
は毒素の抗原エピトープに相当するペプチドの合成を可
能とし、したがって合成百日咳ワクチンの開発を可能に
する”ことも示唆している。しかしながら，百日咳毒素
の抗原エピトープは確認、合成されていず、試験もされ
ていなかった。
皮内皮膚試験用組成物に関して、百日咳に対する免疫
試験用のかかる組成物は今まで当業界で開示されたこと
がなかった。
発明の説明 本発明の一面において、５種の下記新規ポリペプチド
が提供される：即ち ａ）ポリペプチド Ｈ−X1−Asp−Asp−Pro−Pro−Ala−Thr−Val−Tyr−Ar
g−Tyr−Asp−Ser−Arg−Pro−Pro−Glu−Asp−X2−Ｙ ｂ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ser−Glu−Tyr−Leu−Ala−His−Arg−Arg−Il
e−Pro−Pro−Glu−Asn−Ile−Arg−Arg−Val−Thr−Ar
g−Val−X2−Ｙ ｃ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ala−Phe−Val−Ser−Thr−Ser−Ser−Ser−Ar
g−Arg−Tyr−Thr−Glu−Val−Tyr−X2−Ｙ ｄ）ポリペプチド Ｈ−X1−Gly−Ile−Thr−Gly−Glu−Thr−Thr−Thr−Th
r−Glu−Tyr−Ser−Asn−Ala−Arg−Tyr−Val−X2−
Ｙ、及び ｅ）ポリペプチド Ｈ−X1−Leu−Glu−His−Arg−Met−Gln−Glu−Ala−Va
l−Glu−Ala−Glu−Arg−Ala−Gly−Arg−Gly−Thr−Gl
y−His−Phe−Ile−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） 適切な任意アミノ酸残基の例は−Lys−及び−Cys−で
ある。これらの任意のアミノ酸残基は、上記ポリペプチ
ド類に対する牛血清アルブミン等の担体のカップリング
を促進する。
これらのポリペプチド類は、共通の本質的性質、即
ち、百日咳患者の回復期血清からの抗体と反応しうる能
力を有している。
本発明のポリペプチド類は、それ自体公知の固相技術
に従い合成される。
本発明のもう一面によれば、下記からなる群より選択
される、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応す
る少なくとも１種のペプチド配列から主に構成される人
工百日咳毒素抗原が提供される： ａ）ポリペプチド Ｈ−X1−Asp−Asp−Pro−Pro−Ala−Thr−Val−Tyr−Ar
g−Tyr−Asp−Ser−Arg−Pro−Pro−Glu−Asp−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） 及びその部分； ｂ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ser−Glu−Tyr−Leu−Ala−His−Arg−Arg−Il
e−Pro−Pro−Glu−Asn−Ile−Arg−Arg−Val−Thr−Ar
g−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） 及びその部分； ｃ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ala−Phe−Val−Ser−Thr−Ser−Ser−Ser−Ar
g−Arg−Tyr−Thr−Glu−Val−Tyr−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） 及びその部分； ｄ）ポリペプチド Ｈ−X1−Gly−Ile−Thr−Gly−Glu−Thr−Thr−Thr−Th
r−Glu−Tyr−Ser−Asn−Ala−Arg−Tyr−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） 及びその部分； ｅ）ポリペプチド Ｈ−X1−Leu−Glu−His−Arg−Met−Gln−Glu−Ala−Va
l−Glu−Ala−Glu−Arg−Ala−Gly−Arg−Gly−Thr−Gl
y−His−Phe−Ile−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） 及びその部分。
本発明のポリペプチド類は、天然百日咳毒素により誘
導される抗体と反応することができ、しかも動物体内で
天然毒素と反応する抗体を誘導することができる。した
がって、それらは抗原と考えられる。抗原であるとした
場合、本発明のポリペプチド類は、天然百日咳毒素によ
り誘導される抗体とそれ自体が反応する更に短いペプチ
ド配列を含んでいるものと思われる。本発明において天
然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する人工百日
咳毒素抗原は、たとえそれがいくつかのかかる短鎖ペプ
チド配列を含むことが好ましいとしても、担体と一緒に
本発明のポリペプチド類のうちの１つの一部分であるこ
のような短鎖ペプチド配列を必ずしも２以上含んでいる
とは限らない。
“人工百日咳毒素抗原”という表現は、それが本明細
書及び添付の請求の範囲で用いられている場合に、人工
的方法で産生される、即ち人間の活動から離れた自然原
因によらず人間の努力で得られる百日咳毒素抗原を含ん
だ意味である。本発明の人工百日咳毒素抗原から構成さ
れる又はそれから部分的に構成されるペプチド配列がそ
れ自体公知の固相技術に従い化学的に合成されたとして
も、上記ペプチド配列は一部の他の技術、例えば液相中
公知の方法で１アミノ酸を次のアミノ酸にカップリング
させる合成、分解、クローニング等を用いて産生するこ
ともできるのであって、“人工”という表現はこのよう
ないかなる技術によって産生された産物をも含む。
“含む（含有する）”という用語は、本明細書及び添
付の請求の範囲において、ある物が含まれていることを
示すために用いられているが、但しある物とは必ずしも
唯一の物でなくてよい。
“天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応するペ
プチド配列”に関連した“から主に構成される”という
表現は、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応す
る人工百日咳毒素抗原の能力が上記ペプチド配列に由来
することを示すために用いられている。
“担体”という用語は広義に解釈されるべきであっ
て、担体とは問題のペプチドが共有結合、イオン結合、
水素結合又は疏水結合のような物理的／化学的相互作用
によって結合されればいかなるものであってもよい。こ
のような担体の例としては、例えば水酸化アルミニウ
ム、リン酸カルシウム等のような無機物担体、例えばマ
イクロプレート、ビーズ等のようなプラスチック表面、
脂質、リポソーム、炭水化物、アミノ酸、ペプチド及び
タンパク質がある。
本発明の更に別の面として、生物学的液体サンプル中
において天然百日咳毒素により誘導される抗体測定用の
診断免疫アッセイ用キットが提供される。本キットは、
本発明に従い天然百日咳毒素により誘導される抗体と反
応する人工抗原から選択される少なくとも１種の抗原を
診断抗原として含んでいる。天然百日咳毒素により誘導
される抗体測定のために用いられる免疫アッセイに応じ
て、キットは、他の適切な試薬、例えば上記診断抗原が
カップリングされる担体、陽性標準血清サンプル、陰性
標準血清サンプル、酵素複合体、例えばアルカリホスフ
ァターゼもしくはペルオキシダーゼ、酵素複合体用の基
質、例えばｐ−ニトロフェニルホスフェート、寒天もし
くはアガロースゲル、放射性同位元素標識抗原、緩衝液
及び／又は洗浄液を含んでいてもよい。場合により、キ
ット中のすべての試薬は、特定の標識でマークされた別
個の密封試験管又はバイアル中に含まれる。
生物学的液体サンプルは、動物、例えばヒトからの鼻
咽腔分泌物、唾液、血液又は血清サンプルであることが
好ましい。
本発明のキットが使用可能な免疫アッセイの例として
は、ELISA（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）、免疫拡
散、放射線免疫アッセイ（RIA）及び免疫電気泳動（I
E）がある。
ELISA（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）が用いられる
場合、本発明のキットは： ａ）本発明の診断抗原 ｂ）場合により、上記診断抗原用の担体 ｃ）場合により、陽性標準血清サンプル ｄ）場合により、陰性標準血清サンプル ｅ）酵素複合体 ｆ）場合により、上記酵素複合体用の基質 ｇ）場合により、緩衝液、及び ｈ）場合により、洗浄液 を含む 免疫拡散又は免疫電気泳動（IE）が用いられる場合、
本発明のキットはｅ）及びｆ）を除きELISAの場合と同
様のものを含む。代わりに、寒天又はアガロースゲルの
ようなゲルが必要とされるが、但しこのようなゲルは普
通入手可能であることからキット中には通常含まれな
い。
放射線免疫アッセイ（RIA）が用いられる場合、本発
明のキットはｅ）及びｆ）を除きELISAの場合と同様の
ものを含むが、但し代わりに放射性同位元素標識抗原が
用いられる。場合により、トリクロロ酢酸又は二次抗体
のような、抗体に結合した放射性同位元素標識抗原の沈
降用溶液を含めてもよい。
本発明のもう一つの面では、免疫成分として好ましく
は百日咳疾患から被検者を保護するために有効な量で天
然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する本発明の
人工百日咳毒素抗原から選択される少なくとも１種の抗
原並びに無毒性の薬学上許容される担体及び／又は希釈
剤を含有したワクチン組成物が提供される。担体とは本
明細書中で前記のように定義された担体であり、希釈剤
は塩水溶液のような当業界で用いられる慣用的希釈剤で
よい。本発明のワクチン組成物は、上記量の抗原と共
に、百日咳疾患から被検者を保護するために有効な量で
抗原アジュバントを更に含有していてもよい。ヒト用ワ
クチンで通常用いられるアジュバントの例は、問題の抗
原が吸着される例えばカルシウム又はアルミニウムのリ
ン酸塩又は水酸化物のようないわゆる無機担体である。
通常用いられる獣医学用ワクチンアジュバントの例は、
フロイント完全アジュバントである。ワクチン組成物は
適宜緩衝液及び／又は保存剤を更に含有していてもよ
く、適切な緩衝液及び保存剤は例えばUS薬局方中に開示
されている。
本発明の更にもう一つの面では、特定の抗体力価にお
いて被検者に免疫学的皮膚反応を生じさせるために有効
な量で本発明による天然百日咳毒素により誘導される抗
体と反応する本発明の人工百日咳毒素抗原から選択され
る少なくとも１種の抗原並びに無毒性の薬学上許容され
る担体及び／又は希釈剤を含有した皮内皮膚試験用組成
物が提供される。本発明の皮膚試験用組成物は、適宜緩
衝液及び／又は保存剤を更に含有していてもよい。
有用な担体、希釈剤、緩衝液及び保存剤については、
本明細書中前記で定義されている。
本発明によるペプチド配列の合成 本発明によるペプチド配列の固相〔メリフィールド
（Merrifield）〕合成は常法に従いアミノ酸を互いにカ
ップリングさせることにより行われたが、それによりペ
プチド結合が形成され、最初のアミノ酸のＣ末端が結合
された固相（樹脂）から開始し、しかる後次のアミノ酸
のＣ末端が最初のアミノ酸のＮ末端に結合される。最後
に、組み建てられたペプチドが固相から放出される。
詳しくは、下記ペプチド配列が合成された： Ａ）Ｈ−Asp−Asp−Pro−Pro−Ala−Thr−Val−Tyr−Ar
g−Tyr−Asp−Ser−Arg−Pro−Pro−Glu−Asp−Lys−NH
2 Ｂ）Ｈ−Lys−Ser−Glu−Tyr−Leu−Ala−His−Arg−Ar
g−Ile−Pro−Pro−Glu−Asn−Ile−Arg−Arg−Val−Th
r−Arg−Val−OH Ｃ）Ｈ−Lys−Ala−Phe−Val−Ser−Thr−Ser−Ser−Se
r−Arg−Arg−Tyr−Thr−Glu−Val−Tyr−NH2 Ｄ）Ｈ−Lys−Gly−Ile−Thr−Gly−Glu−Thr−Thr−Th
r−Thr−Glu−Tyr−Ser−Asn−Ala−Arg−Tyr−Val−NH
2 Ｅ）Ｈ−Leu−Glu−His−Arg−Met−Gln−Glu−Ala−Va
l−Glu−Ala−Glu−Arg−Ala−Gly−Arg−Gly−Thr−Gl
y−His−Phe−Ile−Lys−NH2 ペプチド断片の合成は、バイオサーチ・サム・ツー
（Biosearch Sam Two）〔バイオサーチ社（Biosearch,I
nc.），カリフォルニア州USA〕ペプチド合成機を用いて
ｔ−BOCアミノ酸に関するバイオサーチペプチド合成オ
ートメーションソフトウェアのバージョン2.38により実
施された。標準（欠失）カップリング定数が、出発物質
1gについて適用された（置換度＝0.33meq/g）。
ペプチド配列Ａ）及びＣ）〜Ｅ）（アミド形）の合成
のために用いられた樹脂はｐ−メチルベンズヒドリルア
ミン樹脂であり、Ｂ）の合成のために用いられた樹脂は
標準メリフィールド樹脂であった。適切な保護アミノ酸
は下記のとおりであった： Boc−Ala−OH Boc−Arg（Tos）−OH （Boc−Ｌ−アラニン） （ａ−Boc−Ｎ−トシル
−Ｌ−アルギニン Boc−Asn−OH Boc−Asp（OBzl）−OH （Boc−Ｌ−アスパラギン） （Boc−Ｌ−アスパラギ ン酸ｂ−ベンジルエステ ル） Boc−Glu（OBzl）−OH Boc−Gln−OH （Boc−Ｌ−グルタミン酸 （Boc−Ｌ−グルタミン） γ−ベンジルエステル） Boc−Gly−OH Boc−His（Tos）−OH （Boc−グリシン） （Boc−Ｎ−トシル−Ｌ− ヒスチジン） Boc−Ile−OH.1/2H2Ｏ Boc−Leu−OH.H2Ｏ （Boc−Ｌ−イソロイシン （Boc−Ｌ−ロイシン −1/2H2Ｏ −H2Ｏ Boc−Lys（CL−Ｚ）−OH Boc−Met−OH （Boc−ｅ−ｏ−クロロ （Boc−Ｌ−メチオニン）
ベンジル オキシカルボニル−Ｌ−リジン） Boc−Phe−OH Boc−Pro−OH （Boc−Ｌ−フェニルアラ （Boc−Ｌ−プロリン）
ニン） Boc−Ser（Bzl）−OH Boc−Thr（Bzl）−OH （Boc−Ｏ−ベンジル−Ｌ− （Boc−Ｏ−ベンジル
セリン） −Ｌ−トレオニン） Boc−Tyr（Cl2−Bzl）−OH Boc−Val−OH （Boc−Ｏ−2,6−ジクロロ （Boc−Ｌ−バリン） ベンジル−Ｌ−チロシン） アミノ酸濃度、溶媒容量、反応時間等に関する詳細に
ついて、製造者（バイオサーチ）の推薦は下記のとおり
であった。
詳しくは、下記の掲載の化学物質が合成ペプチドの合
成、開裂及び精製に用いられた。
完成した樹脂結合ペプチドは合成室から取り出され、
メタノールで洗浄され、真空下で一定重量まで乾燥され
た。
樹脂支持体からのペプチドの開裂 洗浄及び乾燥された樹脂結合ペプチドの一部（0.5g）
をレゾルシノール1g、ジメチルスルフィド6.5ml及びポ
リテトラフルオロエチレン（PTFE）被覆マグネット含有
円筒形PTFE室に移した。室をドライアイス−エタノール
浴中で−80℃に冷却した。次いで、フッ化水素酸（HF）
（最終容量10ml）を室に入れ、しかる後磁気スターラー
上０℃で120分間維持した。次いで、酸を水アスピレー
ターで除去した。室を再度−80℃に冷却し、HF10mlを室
に入れ、磁気スターラー上に０℃で45分間置いた。酸を
再度水アスピレーターで除去し、残留混合物を焼結ガラ
スフィルターに移した。次いで、樹脂／ペプチド混合物
を10％（v/v）酢酸100mlでしかる後ジエチルエーテル50
mlで洗浄した。酢酸洗液も分液ロート中ジエチルエーテ
ル50mlで洗浄し、エーテル相を水相から除去した。次い
で、プールされたエーテル洗液及び酢酸洗液を各々蒸
発、凍結乾燥させて、ペプチド生成物を回収した。すべ
ての場合において、ペプチドは水相のみから回収され
た。
粗生成物をデシケーター内のガラスバイアル中室温で
貯蔵した。
合成ペプチドの精製 粗合成生成物の様々な成分は、移動相としてアセトニ
トリル／H2O〔0.1％v/vトリフルオロ酢酸（TFA）〕を用
いた逆相Ｃ−18シリカ高圧クロマトグラフィーカラムに
それらを適用することにより分離された。粗ペプチド20
μｇ〜100mgをH2O（0.1％TFA）1ml以内に溶解させ、遠
心分離し、レオダイン（Rheodyne）（カリフォルニア
州,USA）HPLCインジェクターの1mlループ中に注入し
た。溶液を2152勾配コントローラー及び２つの2150HPLC
ポンプ（LKB,スウェーデン）により注文パックされた10
×500mmオリゴシル（Oligosil）逆相Ｃ−18カラム〔ス
カンジナビスカ・ゲネテック（Skandinaviska Genete
c），スウェーデン〕中にポンプ導入した。勾配は、60
分間にわたり０〜100％アセトニトリルで直線的であっ
た。流速は2ml/minであった。合成生成物の溶出は、LKB
2131可変波長吸収モニターを用いて206〜238nmでモニタ
ーされた。画分を手で集め、必要であれば関連画分の凍
結乾燥、再溶解及びクロマトグラフィー操作の繰返しに
より再精製した。最終生成物を凍結乾燥し、ガラスバイ
アル中−20℃で貯蔵した。
免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製 前期合成ペプチド配列Ａ）〜Ｅ）の各々は、 ELISAで用いられるav診断抗原（コーティング抗原）を
形成させるために、下記方法で担体、即ち牛血清アルブ
ミン（BSA）にカップリングさせた。
ペプチド1mg及びBSA3.6mgをpH7.4のリン酸緩衝液（PB
S）2.0mlに溶解させる。
この溶液に、2.5％（w/v）グルタルジアルデヒド水溶
液30μｌを加える。
反応混合物を室温（20〜25℃）で１時間インキュベー
トし、5Mエタノールアミン水溶液0.5mlの添加により反
応停止させ、しかる後＋４℃で４時間PBS1lに対して透
析し、30分間後及び２時間後に透析後を交換する。
次いで、透析バックの内容物をPBSで平衡化されたセ
ファクリル（Sephacryl）Ｓ−300ゲル〔ファルマシア
（Pharmacia），ウプサラ，スウェーデン〕含有カラム
（2.5×60cm）に通してゲル濾過する。3.0ml画分を集め
る。
カップリング物質含有画分をプールし、プールされた
物質をコーティング抗原としてELISAで用い、事前に希
釈することなくマイクロプレートに直接加える。
酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ELISA:s） 以下はELISA:sの一般的説明を補充するものである。
抗原及びマイクロプレートのコーティングに用いられる
抗原の量（下記参照）、複合体及び複合体の希釈、コン
トロール及びコントロールの希釈、並びにマイクロプレ
ート読取り前の経過時間は、様々なアッセイ毎に異なっ
ていてよい。差異は一般的説明の後に示されている。
ELISAの一般的説明 装備： 微量滴定プレート〔ダイナテック（Dynatech）,mod.nr1
29B〕 マイクロプレートコーティング用抗原（例えば、ペプチ
ド及びタンパク質） コーティング用緩衝液：リン酸緩衝液（PBS） インキュベート用緩衝液:PBS＋0.05％ツイーン（Twee
n）20（v/v） 水性洗浄液:0.9％NaCl＋0.05％ツイーン20 血清（例えば、ヒト及び動物参照並びに試験血清） 複合体〔例えば、アルカリホスファターゼ複合化ブタ抗
ヒトIgG抗体（オリオン・ジアグノスチカ（Orion Diagn
ostica））、ヤギ抗ウサギIg抗体（シグマ（Sigma））
及びヤギ抗マウスIgG抗体（シグマ）〕 酵素基質:p−ニトロフェニルホスフェート錠剤（シグ
マ）、基質緩衝液（下記参照）1mg/ml 基質緩衝液:pH9.8の1Mジエタノールアミン＋0.5mM MgC
l2＋0.02％NaN3ピペット及び試験管 操作： 1.マイクロプレートのコーティング マイクロプレートを室温（20〜25℃）で一夜PBS中抗原
0.1mlと共にインキュベートする。
2.牛血清アルブミン（BSA）及び血清とのインキュベー
ト プレートを４回洗浄し、しかる後37℃で１時間PBS中
１％（w/v）BSA0.1mlと共にインキュベートする。洗浄
後、インキュベート用緩衝液で適宜希釈された血清0.1m
lをウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベ
ートする。
3.複合体とのインキュベート 洗浄後、インキュベート用緩衝液で適宜希釈された複
合体0.1mlをウェルに加え、プレートを室温で２時間イ
ンキュベートする。
4.洗浄後、酵素基質溶液0.1mlをウェルに加える。プレ
ートを室温で維持し、405nmの吸光度を１時間以内の後
で読取る。
ELISAの具体的な説明 酵素結合免疫吸着剤アッセイ： 合成ペプチドＡ）〜Ｅ）と天然百日咳毒素での免疫化
により特異的に誘導される抗体（１）又は自然疾患後の
抗体（２）の各々との反応を測定するための酵素結合免
疫吸着剤アッセイ（ELISA） ELISAにおいてコーティング用抗原として用いられる
ペプチドを最初に“免疫アッセイ用ペプチド抗原の作
製”で記載されているように処理した。各アッセイを３
回繰返した。
1.陽性血清サンプルは高精製百日咳毒素〔ナショナル・
バクテリオロジカル・ラボラトリー（National Bacteri
ological Laboratory），スウェーデン〕で高度免疫化
されたウサギ由来であり、陰性血清サンプルは免疫開始
時に集められた同一ウサギ由来であった。双方の血清を
1/500希釈で使用した。用いられた複合体は、1/500希釈
されたアルカリホスファターゼヤギ抗ウサギIg複合体
（シグマ）であった。
プレートを自動ELISAリーダー〔タイターテック（Tit
ertek），マルチスキャン（Multiscan）〕で15分間後に
読取った。
結果は下記のとおりであった： スチューデントｔ検定における有意差は、ペプチドＡ
〜Ｃ）の各々の場合にｐ＜0.001であった。ペプチド
Ｄ）及びＥ）の場合には、陽性及び陰性血清間の差異に
関して有意レベルを計算することができなかったが、但
し明らかに差異はペプチドＡ）〜Ｃ）の場合よりも更に
大きい。
上記結果から、ペプチドＡ）〜Ｅ）のすべてが天然百
日咳毒素により誘導される抗体と強く結合することは明
らかである。
2.陽性血清サンフルは百日咳患者からの回復期血清サン
プルであって、スウェーデンのナショナル・バクテリオ
ロジカル・ラボラトリー（NBL）から受け取った。ヒト
陽性血清サンプルはそのようにして選択され、ELISAに
おいてそれが抗原としての天然毒素と共にインキュベー
ト１時間後に405nmの吸光度約1.0を示すように調整され
る。陰性血清サンプルは同胞体からの血清プールであ
り、これもNBLから受け取ったものであった。双方の血
清を1/500希釈で使用した。用いられた複合体は、1/100
希釈されたアルカリホスファターゼブタ抗ヒトIgG複合
体（オリオン・ジアグノスチカ）であった。
プレートを自動ELISAリーダー（タイターテック，マ
ルチスキャン）で１時間後に読取った。
アッセイ結果は下記のとおりであった： スチューデントｔ検定における有意差は、ペプチド
Ａ）、Ｂ）、Ｃ）及びＥ）の場合にｐ＜0.001であり、
ペプチドＤ）の場合に0.01＜ｐ＜0.02であった。
上記結果から明らかなように、本発明のすべてのペプ
チドＡ）〜Ｅ）は陽性血清サンプルの場合に陰性血清サ
ンプルの場合よりも明らかに高い吸光度を有していた。
したがって、試験されたペプチドＡ）〜Ｅ）は抗原とし
て機能し、百日咳抗体と結合する。
結論として、ペプチドＡ）〜Ｅ）が百日咳患者の回復
期血清サンプル中で天然百日咳毒素により誘導される抗
体と特異的に結合することは、立証可能である。
合成ペプチドＡ）〜Ｅ）と全細胞ワクチンでのマウス
（１）もしくは同胞体（２）の又は百日咳毒素ワクチン
での同胞体（３）の免疫化により特異的に誘導される抗
体との反応を各々測定するための酵素結合免疫吸着剤ア
ッセイ（ELISA）。
ELISAにおいてコーティング用抗原として用いられる
ペプチドを最初に“免疫アッセイ用ペプチド抗原の作
製”で記載されているように処理した。各アッセイを３
回繰返したが、読取りエラーは10％以内である。
1.全細胞ワクチン〔ウェルカム（Wellcome），イングラ
ンド〕高度免疫血清サンプル及び陰性血清サンプルをマ
ウス５匹から各々得た。すべての血清を1/500希釈で試
験した。用いられた複合体は、1/500希釈されたアルカ
リホスファターゼヤギ抗マウスIgG複合体（シグマ）で
あった。
プレートを自動ELISAリーダー〔タイターテック，マ
ルチスキャン〕で１時間後に読取った。
結果は下記のとおりであった： 上記結果から、すべてのペプチドＡ）〜Ｅ）が全細胞
ワクチン（百日咳毒素を含有する）で免疫されたマウス
血清中の同量の抗体と特異的に結合しえたことは明らか
である。
2.前−及び後ワクチン処理血清サンプルは全細胞ワクチ
ン（ウェルカム，イングランド）を受けた同胞体５匹か
ら集められた。すべての血清を1/500希釈で試験した。
用いられた複合体は、1/100希釈されたアルカリホスフ
ァターゼブタ抗ヒトIgG複合体（オリオン・ジアグノス
チカ）であった。
プレートを自動ELISAリーダー〔タイターテック，マ
ルチスキャン〕で１時間後に読取った。
結果は下記のとおりであった： 上記結果から明らかなように、すべてのペプチドＡ）
〜Ｅ）は全細胞ワクチン（百日咳毒素を含有する）で免
疫された同胞体血清中の抗体と特異的に結合することが
できた。
3.前−及び後ワクチン処理血清サンプルは百日咳毒素ワ
クチン（微研，日本）を受けた同胞体５匹から集められ
た。すべての血清を1/500希釈で試験した。用いられた
複合体は、1/100希釈されたアルカリホスファターゼブ
タ抗ヒトIgG複合体（オリオン・ジアグノスチカ）であ
った。
プレートを自動ELISAリーダー〔タイターテック，マ
ルチスキャン〕で１時間後に読取った。
結果は下記のとおりであった： 上記結果から明らかなように、すべてのペプチドＡ）
〜Ｅ）は百日咳毒素ワクチン（ホルマリン不活性化百日
咳毒素を含有する）で免疫された同胞体血清中の抗体と
特異的に結合することができた。
天然毒素と合成ペプチドＡ）〜Ｅ）でのマウスの免疫
化により特異的に誘導される抗体との反応を測定するた
めの酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ELISA）。
マウス免疫用抗原として用いられるペプチドを最初に
“免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製”で記載されてい
るように処理した。
各群のマウス（NMRI）を、担体として水酸化アルミニ
ウムを用い各ペプチド抗原３×0.5mlの１か月間隔３回
の皮下投与により免疫した。血清サンプルを３回目の投
与から２か月後に集めた。ELISA用マイクロプレートを
濃度１μg/mlの精製百日咳毒素でコーティングした。非
特異的結合を阻止するために、BSAに代えてゼラチン
（１％）を用いた（“ELISAの一般的説明”参照）。血
清の終点力価を1/20希釈から出発し10回まで２倍希釈し
て測定したが、吸光度0.1の単位を切り捨てた。用いら
れた複合体は、1/500希釈ヤギ抗マウスIgG複合体（シグ
マ）であった。
プレートを自動ELISAリーダー〔タイターテック，マ
ルチスキャン〕で30分後に読取った。
アッセイ結果は下記のとおりであった： 上記結果から明らかなように、本発明のすべてのペプ
チドＡ）〜Ｅ）は後ワクチン処理サンプルの場合に前ワ
クチン処理サンプルの場合よりも明らかに高い吸光度を
有する抗体を免疫処理から誘導することができる。した
がって、試験されたペプチドＡ）〜Ｅ）は抗原として機
能し、百日咳毒素に対する抗体を誘導する。
結論として、毒素がマウス後免疫処理血清サンプル中
で合成ペプチドＡ）〜Ｅ）により誘導される抗体と特異
的に結合することは、立証可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｆ

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）ポリペプチド Ｈ−X1−Asp−Asp−Pro−Pro−Ala−Thr−Val−Tyr−Ar
    g−Tyr−Asp−Ser−Arg−Pro−Pro−Glu−Asp−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｂ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ser−Glu−Tyr−Leu−Ala−His−Arg−Arg−Il
    e−Pro−Pro−Glu−Asn−Ile−Arg−Arg−Val−Thr−Ar
    g−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｃ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ala−Phe−Val−Ser−Thr−Ser−Ser−Ser−Ar
    g−Arg−Tyr−Thr−Glu−Val−Tyr−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｄ）ポリペプチド Ｈ−X1−Gly−Ile−Thr−Gly−Glu−Thr−Thr−Thr−Th
    r−Glu−Tyr−Ser−Asn−Ala−Arg−Tyr−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｅ）ポリペプチド Ｈ−X1−Leu−Glu−His−Arg−Met−Gln−Glu−Ala−Va
    l−Glu−Ala−Glu−Arg−Ala−Gly−Arg−Gly−Thr−Gl
    y−His−Phe−Ile−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） からなる群より選択される、天然百日咳毒素により誘導
    される抗体と反応する少なくとも１種のペプチド配列か
    ら主に構成されることを特徴とする人工百日咳毒素抗
    原。
  2. 【請求項２】生物学的液体サンプル中における天然百日
    咳毒素により誘導される抗体測定用の診断免疫アッセイ
    用キットであって、 ａ）ポリペプチド Ｈ−X1−Asp−Asp−Pro−Pro−Ala−Thr−Val−Tyr−Ar
    g−Tyr−Asp−Ser−Arg−Pro−Pro−Glu−Asp−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｂ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ser−Glu−Tyr−Leu−Ala−His−Arg−Arg−Il
    e−Pro−Pro−Glu−Asn−Ile−Arg−Arg−Val−Thr−Ar
    g−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｃ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ala−Phe−Val−Ser−Thr−Ser−Ser−Ser−Ar
    g−Arg−Tyr−Thr−Glu−Val−Tyr−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｄ）ポリペプチド Ｈ−X1−Gly−Ile−Thr−Gly−Glu−Thr−Thr−Thr−Th
    r−Glu−Tyr−Ser−Asn−Ala−Arg−Tyr−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｅ）ポリペプチド Ｈ−X1−Leu−Glu−His−Arg−Met−Gln−Glu−Ala−Va
    l−Glu−Ala−Glu−Arg−Ala−Gly−Arg−Gly−Thr−Gl
    y−His−Phe−Ile−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） からなる群より選択される、天然百日咳毒素により誘導
    される抗体と反応する少なくとも１種のペプチド配列か
    ら主に構成される人工抗原から選択される少なくとも１
    種の抗原を診断抗原として含むことを特徴とする診断免
    疫アッセイ用キット。
  3. 【請求項３】診断抗原がカップリングされる担体； 陽性標準血清サンプル； 陰性標準血清サンプル；並びに 場合により、緩衝液及び／又は洗浄液； が更に含有された、請求の範囲第２項に記載の診断免疫
    アッセイ用キット。
  4. 【請求項４】寒天もしくはアガロースゲル、又は放射性
    同位元素標識抗原、又は酵素複合体及び場合により酵素
    複合体用の基質が更に含有された、請求の範囲第３項に
    記載の診断免疫アッセイ用キット。
  5. 【請求項５】ａ）ポリペプチド Ｈ−X1−Asp−Asp−Pro−Pro−Ala−Thr−Val−Tyr−Ar
    g−Tyr−Asp−Ser−Arg−Pro−Pro−Glu−Asp−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｂ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ser−Glu−Tyr−Leu−Ala−His−Arg−Arg−Il
    e−Pro−Pro−Glu−Asn−Ile−Arg−Arg−Val−Thr−Ar
    g−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｃ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ala−Phe−Val−Ser−Thr−Ser−Ser−Ser−Ar
    g−Arg−Tyr−Thr−Glu−Val−Tyr−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｄ）ポリペプチド Ｈ−X1−Gly−Ile−Thr−Gly−Glu−Thr−Thr−Thr−Th
    r−Glu−Tyr−Ser−Asn−Ala−Arg−Tyr−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｅ）ポリペプチド Ｈ−X1−Leu−Glu−His−Arg−Met−Gln−Glu−Ala−Va
    l−Glu−Ala−Glu−Arg−Ala−Gly−Arg−Gly−Thr−Gl
    y−His−Phe−Ile−X2−Ｙ（上記式中、X1及びX2は各々
    任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは
    −OH又は−NH2を表す） からなる群より選択される、天然百日咳毒素により誘導
    される抗体と反応する少なくとも１種のペプチド配列か
    ら主に構成される人工百日咳毒素抗原から選択される少
    なくとも１種の抗原を無毒性の薬学上許容される担体及
    び／又は希釈剤と共に免疫成分として含むことを特徴と
    するワクチン組成物。
  6. 【請求項６】百日咳疾患から被検者を保護するために有
    効な量で百日咳毒素抗原を含む、請求の範囲第５項に記
    載のワクチン組成物。
  7. 【請求項７】ある量の百日咳毒素抗原と共に、百日咳疾
    患から被検者を保護するために有効な量で抗原アジュバ
    ントを更に含む、請求の範囲第５項に記載のワクチン組
    成物。
  8. 【請求項８】緩衝液及び／又は保存剤を更に含む、請求
    の範囲第5,6又は７項に記載のワクチン組成物。
  9. 【請求項９】特定の抗体力価において被検者に免疫学的
    皮膚反応を生じさせるために有効な量で少なくとも１種
    の抗原〔この抗原は、 ａ）ポリペプチド Ｈ−X1−Asp−Asp−Pro−Pro−Ala−Thr−Val−Tyr−Ar
    g−Tyr−Asp−Ser−Arg−Pro−Pro−Glu−Asp−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｂ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ser−Glu−Tyr−Leu−Ala−His−Arg−Arg−Il
    e−Pro−Pro−Glu−Asn−Ile−Arg−Arg−Val−Thr−Ar
    g−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｃ）ポリペプチド Ｈ−X1−Ala−Phe−Val−Ser−Thr−Ser−Ser−Ser−Ar
    g−Arg−Tyr−Thr−Glu−Val−Tyr−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｄ）ポリペプチド Ｈ−X1−Gly−Ile−Thr−Gly−Glu−Thr−Thr−Thr−Th
    r−Glu−Tyr−Ser−Asn−Ala−Arg−Tyr−Val−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） ｅ）ポリペプチド Ｈ−X1−Leu−Glu−His−Arg−Met−Gln−Glu−Ala−Va
    l−Glu−Ala−Glu−Arg−Ala−Gly−Arg−Gly−Thr−Gl
    y−His−Phe−Ile−X2−Ｙ （上記式中、X1及びX2は各々任意のカップリング促進ア
    ミノ酸残基を表し、かつＹは−OH又は−NH2を表す） からなる群より選択される、天然百日咳毒素により誘導
    される抗体と反応する少なくとも１種のペプチド配列か
    ら主に構成される人工百日咳毒素抗原から選択される〕
    を無毒性の薬学上許容される担体及び／又は希釈剤と共
    に含むことを特徴とする皮内皮膚試験用組成物。
  10. 【請求項１０】緩衝液及び／又は保存剤を更に含む、請
    求の範囲第９項に記載の皮内皮膚試験用組成物。
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