PT85960B - Processo para a preparacao de novos peptidos e suas aplicacoes - Google Patents
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Description
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS PÊPTIDOS E SUAS APLICAÇÕES
A presente invenção refere-se a novos polipéptidos, de antigênios de toxinas pertussis artificiais, que con sistem principalmente em sequências peptídicas que reagem com anti-corpos induzidos pela toxina pertussis natural escolhida de novos polipêptidos e suas fracções, para um conjunto de imunoensaio para diagnóstico, que consiste mm antigénio de diagnóstico reagindo com os referidos antigênios com anti-corpos induzidos pela toxina pertussis nativa, a uma composição 5e ume vacina, que consiste em antigênios imu nizantes colhidos de antigênios que reagem co... anti-corpos induzidos pela toxina pertussis raturai, e a um teste, e a uma composição de ensaio intradêrmico, que consiste em antigênios seleccionaàos, a partir dos referidos antigênios que reagem con anti-corpos induzidos pela toxina pertussis nativa.
Antecedentes
Até ao oresente não tinham sido identificados nao tem si io po de :i agnóstico que constituam tais antigênios, como antigo
nio-diagnóstico ou desenvolver vacinas contra a tosse convul sa a partir de tais antigénios.
diagnóstico da tosse convulsa com o auxílio de antigénios dirigidos contra os anti-corpos da bordetella per tussis ou proteínas produzidas pela B. Pertussis, têm sido publicados, mas como antigénios de diagnóstico têm sido utilizados hemaglutinina das fímbrias (ver o exemplo, Granstrom, M., Granstrõm, G., Lindfors, A, e Askelóf, P. 1982. Diagnóstico serológico da tosse convulsa por um ensaio de imunoabsor ção ligado a enzima utilizando como antigénio a hemaglutinina de fímbrias. J. Infect. Dis. Vol. 146 : 741 - 745), ou Bactéria B. Pertussis tratada com ultra-sons (ver o exemplo, Goodman, Y.E., Wort, A.J. e Jackson, P.L. 1981. 0 ensaio de imuno-absorção ligado ao enzima para a detecção da imunoglobulina a pertussis nas secreções nasofaríngeas como um indicador de recente infecção. J. Clin. líicrobiol. vol. 13 : 286 - 292, e Viljanen, M.K., Ruuskanen, 0., Granberg, C. E.,Salmi, T.T. 1982. Diagnose serológica de pertussis : Iglí, IgA e IgG anti-corpos contra a Bordatella Pertussis medidos pelo ensaio de imunoabsorção ligada ao enzima. Scand. J. Infect. Dis. Vol. 14 : 112 - 117).
Como ê bem conhecido da técnica, as vacinas eorrentemente utilizadas para a tosse convulsa nos Estados Unidos da América do Norte e em muitos outros países são constituídas por bactérias Bordetella Pertussis inactivadas. M. Pittman propôs em 1979 que a tosse convulsa fosse mediada por uma exotoxina (toxina pertussis) (ver Pittman, LI. 1979. Toxina pertussis : a causa de efeitos nocivos e imunidade /
prolongada de tosse convulsa. Uma hipótese. Rev. Infect, Dis.
vol. 1 : 401 - 412) e vacinas acelulares no Japão que compreendem toxina pertussis inactivada são correntemente utilizadas.
Recentemente a sequência nucleotídica da toxina pertussis foi publicada (Locht, G. and Keith, J.LI., 1986. Pertussis Toxin Gene : Nucleotide Sequence and Genetic Organization, Science, vol. 232, p. 1258 - 1264). .este artigo os autores sugerem i.a. que oligopeptidos sintéticos que incluem epitopes protectores também podem ser útLLizáveis no desenvolvimento de uma nova geração de vacinas, mas não se explica ou sugere quais os epitopes.
Um outro artigo recentemente publicado sobre os genes da toxina pertussis é: Nicosia, A., Perugini, LI., Franzini, C., Gasagli, U.G., Borri, LI.G., Antoni, G., Almoni, M., Neri, P., Ratti, G., and Rappuoli, R., 1986. Gloning and Sequencing of the Toxin Genes: Operon Structure and Gene Duplication. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 83, 4631 - 4635· Nesta publicação estabelece-se i.a. que a manipulação do gene da toxina por meio de técnicas de engenharia genética pode ser uma via para a produção de largas quantidades de proteína destoxificada. Esta ê meramente uma sugestão e não é descrito o gene da toxina manipulado.
Ainda uma outra publicação neste compo é: Sngstrom 0., Rodmalm, K., JSrnvall, H., Lundquist, G., Kalman, LI., Simonscits, A., Barffai; T., Lófdahl, S., and Askelof, P., 1986. A caracterização da estrutura do N-terminal da subunidade SI da toxina pertussis e a hibridação de sondas oligode
- 4 / soxiribonucleotídicas com fragmento de DITA de Bordetella
Pertussis, PEIvIS Microbiology Letters, VOL. 36, 219 - 223.
Também neste artigo se fazem sugestões, nomeadamente, ”0 gene pode ser também introduzido noutros organismos para a pro dução de toxina. A sequenciação do gene permitirá a síntese de péptidos correspondentes a epitopes antigénicos da toxina e a partir daí 0 desenvolvimento de uma vacina pertussis sin tática'’. Contudo, os epitopes antigénicos da toxina pertussis não foram identificados, e os sintetizados não foram ensaiados.
Até ao presente a técnica nunca descreveu composições para testar a imunidade contra a pertussis, por aplicação intradérmica.
DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO
Num aspecto da presente invenção fornecem-se cinco novos polipêptidos, nomeadamente:
- Um polipéptido de fórmula geral
H-X^-Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Ser-A rg-P ro-Pr0-Glu-Asp-X 2-Y
b) o polipéptido
H-X^-S er-Glu-Tyr-L eu-Ala-Iíi s-Arg-Arg-Il e-Pro -Pro-Glu-A sn-11e-Arg-Arg-Val-Thr-Arg-Val-X2-Y
c) 0 polipéptido
H-χΙ-Ala-Phe-Val-S er-Thr-S er-S er-S er-Arg-Arg-Tyr-Thr-Glu-Val-Tyr-X2-f
d.) o polipêptido
H-^-Gly-Ile-Thr-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Thr-Glu-Tyr-Ser-Asn-Ala-Arg-Tyr-Val-X^-Y, e
e) o polipêptido
H-X^-Leu-Glu-His-Arg-Met-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Ala-Glu-Arg-Ala-Gly-Arg-Gly-Thr-Gly-His-Phe-Ile-X^-Y
dos que facilitam eventuais acoplamentos, e Y representa um grupo -OH ou -M2,
Exemplos de resíduos de aminoácidos apropriados eventuais são -Lys- e -Gys-. Estes resíduos de aminoácidos facilitam eventuais acoplamentos de um veiculo tal como serum albumina bovina, aos referidos polipéptidos.
Estes polipéptidos têm propriedades essenciais comuns, i.a. a sua capacidade para reagirem com anticorpos de soros de doença de tosse convulsa no estado de convalescénçia.
Os polipéptidos de acordo com a presente invenção foram sintetizados de acordo com técnicas de fase sólida conhecidas.
Hum outro aspecto da presente invenção proporciona-se um antigénio de toxina pertussis artificial, que é constituído principalmente por pelo menos uma sequência peptídica que reage com anti-corpos induzidos pela toxina pertussis natural escolhida de entre um grupo constituído por:
a) um polipéptido de fórmula geral
H-X1-Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr-Asp-S er-Arg-Pro-Pro-Glu-Asp-X2-Y na qual
X e X , representam, cada um, resíduos de aminoácidos que facilitam eventuais acoplamentos e
Y representa um grupo -OH ou e as suas fracções.
b) um polipéptido de fórmula geral
H-X^—Ser-Glu-Tyr-L eu-Ala-Hi s-Arg-Arg-11e-Pro-P ro-Glu-Asn-Ile-Arg-Arg-Val-Thr-Arg-Val-X2-Y na qual
X e X , representam, cada um, resíduos de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos e
Y representa um grupo -OH ou e as suas fracções.
c) um polipéptido de fórmula geral
H-X1-Ala-Phe-Val-Ser-Thr-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Tyr-Thr-Glu-Val-Tyr-X2-Y na qual,
X e X , representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos e
Y representa um grupo -OH ou JTHg; e a.s suas fracções
d) um polipéptido de fórmula tçeral
H-X^Gly-Ile-Thr-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Thr-Glu-Tyr-Ser-Asn-Ala-Arg-Tyr-Val-X2-Y na qual
X e X , representam, caia um, resíduo de aminoàcido que facilita eventuais acoplamentos e
Y representa um grupo -OH ou -ITHgj e as suas fracções.
c) o polipéptido de fórmula geral
H-X^Leu-Glu-His-Arg-Iiet-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Ala-Glu-Arg-Ala-Gly-Arg-G1y-Thr-Gly-His -Phe -11 e -X 2-Y na qual
2
X e X , representam, cada um, um resíduo de aminoâcido que facilita eventuais acoplamentos e
Y representa um grupo -OH ou -NHgj θ as suas fracções.
Os polipéptidos de acordo com a presente invenção são capazes de reagir com anti-corpos induzidos por toxina pertussis natural e que são susceptíveis de induzir anti-corpos que reagem com a toxina nativa natural em animais. Assim podem ser considerados como antigénios.SfeÕlo antigéníós, os poLi péptídos da acordo com a presente invenção incluem provavelmente sequências polipeptidícas mais curtas as quais reagem elas próprias com anti-corpos induzidos pela toxina pertussis nativa. 0 antigénio da toxina pertussis artificial que reage
- 8 com anti-corpos induzidos pela to?:ina pertussis natural de acordo com a presente invenção não incorpora necessariamente mais do que uma sequência peptídica mais pequena que faz par te de um polipéptido da presente invenção conjuntamente com um veículo, ainda que seja preferível incorporar várias de tais sequências peptídicas mais curtas.
A expressão antigénio de toxina pertussis artificial, tal como se utiliza nesta memória descritiva e nas reivindicações adjuntas, significa que inclui antigênios de toxina pertussis que foram produzidos de um modo artificial, isto é inventada pelo esforço humano e não por causas naturais provenientes lo equipamento humano. Ainda que as sequên cias peptídicas constituindo ou constituindo parte de, o antigénio da toxina pertussis artificial de acordo com a presente invenção tenham sido sintetizadas quimicamente por meio de técnica de fase sólida conhecidas as ref eridas sequên cias peptídicas, podem ser fornecidas utilizando-se outras técnicas, como por exemplo, síntese em fase líquida por acoplamento de um aminoácido ao seguinte, de maneira conhecida por degradação, clonagem, etc., e entende-se que a expressão artificial pode cobrir produtos produzidos por qualquer outra técnica.
A palavra incorpora é utilizada nesta memória descritiva e nas reivindicações apensas, para indicar que alguma coisa está incluída, mas que esta qualquer coisa não ê necessariamente componente apenas da coisa incorporada.
A expressão consiste principalmente em em conjunção com a expressão sequências peptílicas que reagem com anti-corpos induzidos pela toxina pertussis natural, que é utilizada para indicar a capacidade do antigênio da toxina pertussis artificial para reagir com anti-corpos induzidos pela toxina pertussis natural deriva das sequências peptídicas referidas.
A palavra veículo deve ser interpretada de uiaa maneira geral e o veículo pode ser qualquer componente a que o péptido em questão pode ser ligado por meio físico/químico, tal como ligação covalente, ligação iônica, ligação hidrogénio ou ligação hilrofóbica. Exemplos de tais veículos são veículos minerais, por exemplo, hidróxido de tlumlnio, fosfato de cálcio, etc., superfícies plásticas, por exemplo, microplacas, pérolas,etc., lípidos, lipossomas, hidratos de carbono, aminoácidos, péptidos e proteínas.
Ainda outro aspecto da presente invenção é proporcionar para diagnóstico por imunoensaio para a determinação de anti-corpos induzidos por toxina pertussis nativa numa amostra de líquido biológico. Este conjunto possui como anti-gene de diagnóstico pelo menos um antigênio escolhido entre os antigénios artificiais que reagem com anti-corpos induzidos pela toxina pertussis natural de acordo com a presente invenção. Dependendo do imunoensaio utilizado para a determinação dos anti-corpos induzidos pela toxina pertussis natural o conjunto pode incluir outros agentes apropriados, tais como um veículo a que o referido antigênio de diagnóstico está ligado, uma amostra de soro padrão positivo, uma amostra de soro padrão negativo, um conjugado enzimático, tal como, fosfatase alcalina ou peroxidase, substrato conjugado de enzima, tal como paranitrofenil-fosfato, agar ou gel de agarose, antigénios marcados com radioactividade, soluções tampão e/ou soluções de lavagem. Eventualmente todos os reagentes do conjunto estão contidos em tubos de ensaio sela dos e separados ou em ampolas marcadas com os rótulos especí ficos.
A amostra de líquido biológico é preferivelmente uma secreção nasofaríngea, saliva, sangue ou uma amostra de soro de um animal ou de um ser humano.
Exemplos de imunoensaios em que o conjunto de acordo com a presente invenção pode ser utilizado são ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado a enzima), imunodifusão, radioimunoensaio (RIA), e imunoelectroforese (TE).
Quando se utiliza ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado a enzima), o conjunto de acordo com a presente invenção é constituído por:
a) um antigênio de diagnóstico da presente invenção
b) um veículo para o referido antigênio de diagnóstico
c) uma amostra de soro padrão positiva
d) uma amostra de soro padrão negativa
e) um conjugado de enzima
f) um substracto para o referido conjugado de enzima
g) solução 6®) tampão, e
h) solução (ças) de lavagem.
Quando se utiliza um ensaio de imunodifusão ou imunoelectroforese (ΙΕ) o conjunto de acordo com a presente invenção pode consistir no mesmo material referido para ELISA, com excepção dos items e) e f). Em sua substituição é necessário um gel, tal como um gel de agar ou de agarose, mas tal gel não está normalmente incluído no conjunto, uma vez que ê de uso corrente.
Quando se utiliza o radíoimunoensaio (RIA) o con junto de acordo com a presente invenção compreenderá o mesmo material para ELISA, com excepção dos items e) e f), que serão substituídos por antigénio marcado por radioactividade. Eventualmente também se pode incluir uma solução para a precipitação do antigénio radioactivo ligado aos anti-corpos, tal como o ácido tri-cloro-acêtico ou anti-corpos secundários.
Num outro aspecto da presente invenção fornece-se uma composição de urna vacina, que constitui um complemen to imunizante que incorpora p.-lo menos um antigénio escolhido entre os antigênios de toxina pertussis artificiais que reagem com anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural, de acordo com esta invenção, de preferência numa quanti dade eficaz para proteger um paciente da tosse convulsa, e um veículo não-tóxico aceitável em farmácia e/ou diluente. 0 veiculo è um veiculo como se definiu antes e o diluente pode ser um diluente convencional técnico, tal como uma solu çao de cloreto de sódio.
A composição da vacina, de acordo com a presente invenção, pode incorporar ainda um adjuvante ao antigénio numa quantidade que conjuntamente com a quantidade do referi do antigénio é eficaz para proteger um ser humano da tosse
- 12 convulsa. Exemplos de adjuvantes correntemente utilizados nas vacinas para seres humanos são os chamados veículos mine rais, por exemplo, fosfato de cálcio ou hidróxido de cálcio ou hidróxido de alumínio, e que tem a propriedade de absorver o antigénio em questão.
Um exemplo de adjuvantes de vacinas utilizado correntemente em veterinária é o Adjuvante Completo de Freund. A composição da vacina pode incorporar-se adicionalmente a agentes tampão e/ou agentes conservantes apropriados, e agentes tampão e agentes conservantes estão descritos na Pharmacopoeia dos Estados Unidos da América.
Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece-se uma composição para um ensaio intra-dérmico que compreende pelo menos um antigénio escolhido entre os antigénios de toxina pertussis artificiais que reagem com os anti-corpos induzidos pela toxina pertussis natural, de acordo com a presente invenção. Numa quantidade eficaz para produzir uma reac ção imunológica na pele com um anti-corpo específico num indivíduo e um veículo aceitável em farmácia não-tóxico e/ou diluente. A composição para ensaio na pele de acordo com a presente invenção pode também incorporar agentes tampão e/ou agentes conservantes, como necessário.
Veículos, diluentes, agentes tampão e agentes conservantes utilizáveis estão definidos anteriormente.
SÍNTESE DE SEQUÊNCIAS PEPTÍDICAS DE iCORDO COE A PRESENTE
INVENÇÃO
Síntese de fase sólida (Merrifield) de sequências peptídicas de acordo com a presente invenção, foram realiza-
das de um modo convencional, por acoplamento de amino ácidos uns aos outros, enquanto que ligações peptídicas sao formadas, iniciando-se com uma fase sólida (resina) à qual o C-teiminal do primeiro amino ácido é acoplado, enquanto que o C-terminal do amino ácido seguinte é ligado com o Ιϊ-terminal do primeiro aminoácido, etc. Finalmente, o pêptido construído e libertado da fase sólida.
Sspecificamente foram sintetizadas as sequências seguintes:
A) H-A sp-A sp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr-A sp-
-Ser-Arg-Pro-Pro-Glu-Asp-Lys-lTHg
B) H-Lys-Ser-Glu-Tyr-Leu-Ala-His-Arg-Arg-Ile-Pro-
-Pro-Glu-Asn-I1e-Arg-Arg-Val-Thr-Arg-Val-OH
C) H-Lys-Ala-Phe-Val-Ser-Thr-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Tyr-Thr-Glu-Val-Tyr-IJH2
D) H-Lys-Gly-Ile-Thr-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Thr-Glu-
-Tyr-Ser-Asn-Ala-Arg-Tyr-Val-NH2
E) H-Leu-Glu-His-Arg-M et-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Àla-
-Glu-Arg-Ala-Gly-Arg-Gly-Thr-Gly-His-Phe-Ile-Lys-NH2
A síntese dos fragmentos peptídicos foi realizada utilizando-se uma Biosearch Sam Tr/o (Biosearch, Inc. Cali fornia USA) máquina para síntese peptídica, versão 2,3θ da Software automática de síntese peptídica da Biosearch para T - BOG aminoácidos. 0 padrão (não citado) de ligação unifor
- 14 me foi utilizado para um grania de material inicial (grau de substituição = 0,33 LiSQ/G).
A resina utilizada para a síntese das sequências peptídicas A) e C) até 3) (sob a forma de amida), foi a para metilbenzidrilamino - resina e a resina utilizada para sínte se de B) foi a resina Lierrifield Padrão. Os aminoácidos protegidos adequados foram:
Boc-Ala-OH (Boc-L-Alanine)
Boc-Asn-OH (Β o c-L-A sparagine)
Boc-Glu(OBzl)-OH (Boc-L-Glutamic Acid gamma-Benzyl Ester)
Boc-Gly-OH (Boc-Glycine)
Boc-Ile-0H.l/2H20 (Boc-L-Isoleucinel/2H20)
Boc-Lys(CL-Z)-OH (Boc-e-o-Chloro-Benzyloxycarbonyl-L-Lysine)
Boc-Arg(Tos)-0H (a-B o c -ΪΪ -T o syl -L -Arginine)
Boc-Asp(OBzl)-OH (Boc-L-Aspartic Acid b-Benzyl
Bster)
Boc-Gln-OH (Boc-L-Glut amin e)
Boc-His(Tos)-OH (3 o c -II —T o syl -L -Hi s t i din e)
Β o c-L eu-OH.H20 (Boc-L-Leucine-HgO)
Boc-LIet-OH (Boc-Ii-Hethionine)
Boc-Phe-OH (Boc-L-Phenylalanine)
Boc-Ser(Bzl)-OH (Boc-O-Benzyl-L-Serine)
Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH (Boc-0-2,6-Dichlorobenzyl-L-Tyr o sin e)
Boc-Pro-OH (Boc-L-Proline)
Boc-Thr(Bzl)-OH (Boc-O-Benzyl-L-Threonine)
Boc-Val-OH (Boc-L-Valine)
Para os detalhes que dizem respeito à concentração de aminoácidos, volumes dos dissolventes, tempos de reac. ção, etc., foram seguidas as recomendações do construtor (Biosearch).
Especificamente a lista de químicos a seguir foi utilizada na síntese, cisão e purificação dos péptidos sintéticos.
| SUBSTANCE | GRADE | SUPPLIER |
| Acetyl imidazole | p.a. | Aldrich |
| Dimethyl formamide | p.a. | Pluka |
Diisopropylethyl amine
Double-distilled
Aldrich from 1 g/1 min hydrin, then g/1 HOH. First
10% destillate discarded
| Hydroxybenzyl triazole | p.a. | Aldrich |
| Methylene chioride | HPLC | Fisons (UK) |
| Ninhydrin | p.a. | Aldrich |
| Potassium hyd.roxide | p.a. | |
| Diisopropyl carbodi- | p.a. | Aldrich |
| imide | ||
| Nitrogen | 4.1 (dry) | AGA |
| SUBSTANCE | GRADE | SUPPLIER |
| t-Boc amino acids | Bachem | |
| Hydrogen Fluoride | AGA | |
| Resorcinol | ||
| Dimethyl sulfide | ||
| Hydroxybenzyl triazole | p.a. (synthesis) | Aldrich |
| Trifluoroacetic acid | sequanal (HPLC) | Aldrich |
| Acetonitrile | HPLC | Rathburn |
| Acetic acid | p.a. | Merck |
| Diethyl ether | Pluka |
A resina completada ligada aos péptidos foi eliminada da câmara de síntese e lavada com metanol e seca até peso constante sob vácuo.
CISÃO DOS PÉPTIDOS DO SUPORTE RESINOSO
Fracções (0,5 g) de resina de ligação péptidica lavada e seca foram transferidos para uma câmara de poli-tetra-fluoro-etileno cilíndrica (PTFE) que continha um grama resorcinol, 6,5 ml de sulfureto de dimetilo e um magneto re vestido com poli-tetra-fluoro-etileno.
A câmara foi arrefecida atê -80°G num banho de gelo seco - etanol. Em seguida, foi admitido na câmara ácido fluorídrico (HF) (10 ml de volume final) que em seguida foi conservado à temperatura de 0°G durante 120 minutos com um agitador magnético. 0 ácido foi em seguida eliminado utilizando-se uma bomba de água. A câmara foi mais uma vez arrefecida à temperatura de -80°C e admitida nela 10 ml de ácido fluorídrico, que foi colocado sob o agitador magnético à temperatura de 0°C durante 45 minutos. 0 ácido foi novamente removido utilizando-se uma bomba de água, e a mistura restan te foi transferida para um filtro de vidro. A mistura resina/ /péptido foi em seguida lavada com 100 ml de ácido acético a 10% (v/v) e em seguida com 50 ml de éter dietilico. 0 ácido acético lavado, também foi lavado com 50 ml de éter dietilico num funil separador e a fase etérea separada da fase aquosa. As fase etéreas de lavagem reunidas e o ácido acético de lavagem foram em seguida evaporadas e liofilizadas, respectivamente e o produto peptídico recolhido. Hm todos os casos o péptido foi recolhido apenas na fase aquosa.
produto bruto foi então conservado em ampolas de vidro num excicador à temperatura ambiente.
PURIFICAÇÃO DOS PÉPTIOOS SINTÉTICOS
Os vários componentes do produto sintético bruto foram separados por aplicação de uma cromatografia elevada por pressão de fase inversa em sílica C - 13 utilizando-se acetonitrilo/HgO (ácido tri-fluoro-acético a 0,1%, TPA) como fase móbil. Vinte microgramas a 100 ml do péptido bruto foram dissolvidos até 1 ml com água (0,1% de TPA), centrifugado e injectado numa ansa de 1 ml num injector para HPLC Rheodyne (Califórnia, USA). A solução foi bombeada através de uma coluna de C-18 de fase inversa Oligosil de 10 x 500 mm (Skandinaviska Genetec, Sweden) utilizando-se um controlador de gradiente 2152 e duas bombas para IiPLC 2150 (LHB, Suécia).
gradiente foi linear de 0 - 100% de acetonitrilo durante 60 minutos. 0 débito foi de 2 ml/minuto. A eluição dos produtos de síntese foi controlada a 206 - 238 nm utilizando-se um monitor de absorção de comprimento de sonda variável 2131 LKB. As fracções foram recolhidas manualmente e repurifiçadas, se necessário, por meio de liofilisação das fracções importantes, redissolucão e repetição do processo cromatográfico. 0 produto final foi liofilizado e armazenado em ampolas de vidro à temperatura de -20°C.
PREPARAÇÃO DE ANTIGÉNIOS PEPTÍDIC03 PARA IliWOENSAIO
Cada uma das sequências peptídicas sintetizadas antes, de A) até E) foi ligada a um veículo isto é, a albumina de soro bovino (BSA) da seguinte maneira para formar o antigênio de diagnóstico av (coating antigsn) que foi utilizado em ELISA.
Um mg de péptido e 3,6 mg de BSA foram dissolvidos em 2,0 ml de cloreto de sódio tamponado com fosfato (PBS), de pH 7,4.
A esta solução foram adicionados 30 microlitros de uma solução aquosa a 2,5% (ρ/v) de glutar dialdeido.
A mistura reaccional foi incubada à temperatura
- 19 / * ambiente (20 - 25°C) durante 1 hora detida pela adição de
0,5 ml de solução de etanolamina aquosa 5 Μ θ em seguida iializada contra 1 litro de PBS à temperatura de 4°C durante quatro horas, com mudanças de líquido de diãlise após 30 minutos e após duas horas.
Em seguida o conteúdo da bolsa da diãlise foi filtrado por gel através de uma coluna de gel de Sefacril S-300 (2,5 x 60 cm), (Pharmacia, Uppsala, Sweden) equilibrada com PBS. Poram recolhidas fracções de 3,0 ml.
As fracções que continham o material ligado foram reunidas e o material reunido utilizado em ELISA como antigénio de revestimento e adicionado directamente, sem diluição prévia à micro placa.
ENSAIOS DE IMUNO ABSORÇÃO LIGADA À ENZIMA (ELISA)
Em seguida descreve-se de um modo geral os ensaios por ELISA.
antigênio e a quantidade de antigênio utilizada para revestimento das microplacas (referido abaixo), o conjugado e a diluição de conjugado, os controlos e a diluição dos controlos e o tempo necessário para que as microplacas estejam prontas pode variar entre os vários ensaios. As diferenças são referidas após a descrição geral.
DESCRIÇÃO GERAL DE ELISA
Equipamento:
Microplacas tituladoras (Dynatech, Mod. nr 129 B).
Antigênio para, revestimento de microplacas (por exemplo: péptidos e proteínas).
í
Tampão de revestimento: cloreto de sódio tamponado com fosfato (PBS).
Tampão de incubação: PBS + 0,05% de Tween 20 (v/v}
Líquido ie lavagem aquoso: cloreto de sódio a
0,9% + 0,05% de Tween 20.
Soro (por exemplo, humano ou animal e soro de ensaio) .
Conjugado (por exemplo, anti-corpos de anti-imunoglobulina 0 humana desenvolvidos em suino, conjugados com fosfatase alcalina (Orion Diagnóstica), anti-corpos de anti-imunoglobulina de coelho desenvolvida em craprino (Sigma) e anti-corpos de anti-imunoglobulina G de murganho desenvolvidos em caprinos (Sigma)).
Substrato enzimático: comprimidos de p-nitro-fenil-fosfato (Sigma) 1 mg/ml de tampão de substrato (indicado a seguir).
Tampão de substrato: di-et ano lamina 1 Ι.Ί, de pH
9,8 + 0,5 mM Íe MgCl 2 + 0,02% de Na^.
Pipetas e tubos de ensaio.
TÉCNICA:
1. Revestimento das microplacas.
As microplacas são incubadas com 0,1 ml de antigénio de PBS à temperatura ambiente (20 - 25°C) durante a noite.
2. Incubação com albumina de soro bovino (BSA) e soro.
As placas sao lavadas quatro vezes e em seguida
incubadas com 0,1 ml de BSA alS (p/v) em PBS à temperatura de 37°C durante uma hora. Após lavagem adiciona-se 0,1 ml de soro numa diluição apropriada em tampão de incubação, às cavidades e faz-se a incubação das placas á temperatura ambien te durante 1 hora.
3. Incubação com conjugado.
Após lavagem, adiciona-se 0,1 ml de conjugado diluído apropriadamente em tampão de incubação, às cavidades e faz-se a incubação da placa (S) à temperatura ambiente durante duas horas.
4. Após lavagem adicionou-se 0,1 ml de solução de substrato de enzima às cavidades. Guardam-se as placas à tem peratura ambiente e lê-se a absorção a 405 nm após no máximo uma hora.
DESCRIÇÃO DB ELISA BSPBCÍPICA
Ensaios de imunoabsorção ligado ao enzima:
ensaio de imunoabsorção ligado ao enzima (ELISA) para a avaliação da reacção entre os péptidos sintéticos A) a E) e anti-corpos específicamente induzidos por imunização com toxina pertussis natural (1), ou anti-corpos após doença natural (2), respectivamente.
Os péptidos utilizados como antigénios de revestimento em ELISA foram primeiramente tratados como se descre veu na referência preparação de antigénios peptídicos para imunoensaio. Cada ensaio decorreu em triplicado.
1. A amostra do soro positiva era de um coelho hi- perimunizalo com toxina pertussis de elevada pureza (Hational
Bacteriological Laboratory, Sweden) e a amostra de soro nega tiva era do mesmo coelho colhida no início da imunização. Ambos os soros foram utilizados numa diluição de 1/500. 0 conjugado utilizado foi o conjugado de anti-imunoglobulina de coelho desenvolvido em caprino-fosfatase alcalina (Sigma) diluído a 1/500.
As placas foram lidas após 15 minutos num leitor automático para ELISA (Titertek, Multiscan).
Os resultados foram os seguintes:
| Peptide | Rabbit Positive serum sample | Rabbit Negative serum sample |
| (absorbance) | (absorbance) | |
| A) | 1,14 + 0,07 | 0,12 + 0,01 |
| B) | 1,34 + 0,07 | 0,11 + 0,01 |
| c) | 1,29 ± 0,12 | 0,02o + 0,001 |
| D) | >1,5 | 0,013 + 0,003 |
| E) | >1,5 | 0,018 + 0,006 |
grau de significância no teste de Students T foi para cada péptido de A) até C) p < 0,001. Para os péptidos de D) e Ξ) não foi possível calcular o grau de significância para as diferenças entre o soro positivo e o soro negativo, mas claramente a diferença é ainda maior do que para os péptidos de A) a C).
Dos resultados referidos antes é evidente que os
péptidos de A) até E) se ligaram todos fortemente a anti-cor pos induzidos pela toxina pertussis natural.
2, A amostra do soro positiva era uma amostra de um soro num convalescente de tosse convulsa, que foi recebida do Laboratório de Bactereologia Nacional (ESL) da Suécia. A amostra de soro positivo humano foi escolhida e ajustada para ELISA com toxina natural como antigénio proporcionou uma absorvância 405 nm de 1,0 aproximadamente após uma hora de incubação. A amostra de soro negativa era um conjunto de soros aparentados que também foram recebidos do II3L. Ambos os soros foram utilizados com uma diluição de 1/500. 0 conjugado utilizado foi um fosfatase alcalina - conjugado de anti-IgG humana dissolvido em suínos (Orion Diagnostica) diluído a 1/100.
As placas foram lidas após uma hora num leitor automático ELISA (Titertek, Multiscan).
Os resultados tos ensaios foram os seguintes:
| Peptide | Human Positive serum sample | Human ITegative serum sample |
| (absorbance) | (absorbance) | |
| A) | 0,86 + 0,02 | 0,103 ± 0,008 |
| 3) | 0,88 + 0,08 | 0,120 + 0,005 |
| C) | 0,17 + 0,01 | 0,06 + 0,01 |
| D) | 0,14 ± 0,04 | 0,05 + 0,01 |
| E) ' | 0,23 + 0,01 | 0,09 + 0,02 |
/
- 24 -/ grau de significância do teste T de Students foi para os péptidos A), B), G) e Ε) p 0,001 e para o péptido D) 0,01 p 0,02.
Gomo é evidente, nos casos referidos antes, todos os péptidos de A) a E), de acordo com a presente invenção, tinham uma absorvãncia nitidamente mais elevada com amostras de soros positivos do que com amostras de soro negativo. Portanto, os péptidos ensaiados de A) a E) funcionam como antigénios e ligavam-se a anti-corpos pertussis.
Como uma sequência pode-se estabelecer que os péptidos de A) a E) se ligavam especificamente a anti-corpos induzidos por toxina pertussis natural em amostras de soros de convelescentes de tosse convulsa.
ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA) para a avaliação entre a reacção entre péptidos sintêcticos de A) a E) e de anti-corpos especificamente induzidos por imunização de murganhos (1) ou de aparentados (2) com uma vacina de célula completa, ou de aparentados (3) com uma vacina de toxoide pertussis, respectivamente.
Os péptidos utilizados como antigénios de revesti?ento em ELISA foram primeiramente tratados como se descreveu na rubrica preparação de antigênio peptidico para imunoensaio”. Cada ensaio realizou-se em triplicado, com um erro d,e leituras de 10%.
1. A vacina celular total (Wellcome, Inglaterra) as amostras do soro hiperimunizado e as amostras do soro negativo obtidas de cinco ratos, respectivamente. Todos os soros foram ensaiados com uma diluição de 1/500. 0 conjugado
utilizado foi fosfatase alcalina - conjugado anti IgG de rato desenvolvido em caprinos. (SIGMA) diluída a 1/500.
As placas foram lidas após uma hora no leitor automático ELISA (Titertek, Llultiscan).
Os resultados foram os seguintes:
| Peptide | ||||||
| Mouse | Sample | A | B | c | D | .Mj |
| 1 | Control | 0,16 | 0,23 | 0,10 | 0,24 | 0,18 |
| 2 | Control | 0,10 | 0,10 | 0,10 | 0,12 | 0,03 |
| 3 | Control | 0,12 | 0,14 | 0,14 | 0,16 | 0,12 |
| 4 | Control | 0,12 | 0,13 | 0,12 | 0,13 | 0,10 |
| 5 | Control | 0,14 | 0,14 | 0,11 | 0,14 | 0,11 |
| 6 | Immunized | 0,21 | 0,29 | 0,27 | 0,29 | 0,26 |
| 7 | Immunized | 0,41 | 0,49 | 0,50 | 0,55 | 0,45 |
| 8 | Immunized | 0,75 | 0,80 | 0,71 | 0,84 | 0,74 |
| 9 | Immunized | 1,41 | 1,45 | 1,44 | 1,48 | 1,42 |
| 10 | Immunized | 1,14 | 1,47 | 1,41 | 1,59 | 1,42 |
Dos resultados referidos antes ê evidente que os péptidos de A) a E) todos são capazes de se ligar especifica mente a quantidades comparáveis de anti-corpos no soro de murganhos imunizados com a vacina celular completa (que contêm toxina pertussis).
2. Amostras de soro pré e pós vacinação foram recolhidas de cinco parentes que receberam uma vacina celular completa, (íVellcome, Inglaterra). Todos os soros foram ensaiados com uma diluição de 1/500. 0 conjugado utilizado foi fosfatase alcalina - conjugado anti IgG humano desenvolvido em suinos (Orion Diagnostica) diluída a 1/100.
As placas foram lidas após uma hora num leitor automático para ELISA (Titertek, Multiscan).
Os resultados foram os seguintes:
| Peptide | ||||||
| Sibling | Sample | A | B | C | D | |
| 1 | Ire | 0,05 | 0,07 | 0,06 | 0,07 | 0,07 |
| Post | 0,07 | 0,26 | 0,21 | 0,22 | 0,20 | |
| 2 | Pre | 0,12 | 0,07 | 0,05 | 0,07 | 0,07 |
| Post | 0,41 | 0,30 | 0,20 | 0,26 | 0,21 | |
| 3 | Pre | 0,21 | 0,49 | 0,52 | 0,49 | 0,46 |
| Post | 0,06 | 0,31 | 0,31 | 0,31 | 0,28 | |
| 4 | Pre | 0,10 | 0,18 | 0,14 | 0,19 | 0,15 |
| Post | 0,23 | 0,72 | 0,73 | 0,67 | 0,62 | |
| 5 | Pre | 0,06 | 0,16 | 0,12 | 0,15 | 0,13 |
| Post j | 0,06 | 0,12 | 0,08 | 0,10 | 0,10 |
Como é evidente nos resultados referidos antes todos os péptidos de A) a B) foram capazes de se ligar espoei
- 27 ficamente a anti-corpos nos soros de parentes imunizados com vacina total celular (que continha toxina pertussis).
Amostras de soro de pré e pósvacinação foram recolhidas de cinco parentes que receberam vacinas toxoide per tussis (Biken, Japão). Todos os soros foram ensaiados com uma diluição de 1/500. 0 conjugado utilizado foi fosfatase alcalina - conjugado de anti-IgG humano desenvolvido em suinos (Orion Diagnostica) diluída a 1/100.
As placas foram lidas após uma hora num leitor automático para ELISA (T itertek, Llultiscan).
Os resultados foram os seguintes:
| Peptide | ||||||
| Sibling | Sample | A | B | 0 | D | 21 |
| 1 | Pre | 0,05 | 0,07 | 0,05 | 0,03 | 0,04 |
| Post | 0,21 | 0,11 | 0,07 | 0,07 | 0,07 | |
| 2 | Pre | 0,05 | 0,18 | 0,12 | 0,11 | 0,11 |
| Post | 0,21 | 0,52 | 0,46 | 0,43 | 0,40 | |
| 3 | Pre | 0,39 | 0,26 | 0,16 | 0,18 | 0,17 |
| Post | 0,29 | 0,08 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| 4 | Pre | 0,13 | 0,14 | 0,11 | 0,09 | 0,10 |
| Post | 0,68 | 0,32 | 0,30 | 0,26 | 0,25 | |
| 5 | Pre | 0,12 | 0,09 | 0,06 | 0,05 | 0,06 |
| Post | 0,10 | 0,08 | 0,07 | 0,05 | 0,07 |
f
Gomo ê evidente nos resultados referidos antes os péptidos de A) a E) foram capazes de se ligar especificamente a anti-corpos nos soros de parentes imunizaios com vacina toxoide pertussis (o que contém toxina pertussis inactivada com formalina).
ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA) foi utilizado para se avaliar a reacção entre a toxina natural e os anti-corpos específicamente inlusidos por imunização de murganhos com os péptidos sintéticos de A) até E).
Os péptidos utilizados como antigênios para a imu nização de murganhos foram primeiramente tratados como se re feriu antes sob a rubrica preparação de antigênios peptídicos para imunoensaio.
Os grupos de murganhos (IL.Jtl) foram imunizados por via subcutânea com três doses com un mês de intervalo, de 3 x 0,5 ml de o antigénio peptídico respectivo utilizando -se com um veículo constituído por hidróxido de alumínio. As amostras de soro foram recolhidas dois meses após a terceira dose. As microplacas para ELISA foram revestidas com toxina pertussis purificada com uma concentração deljig/ml.
A gelatina (1%) foi utilizada para bloqueamento da ligação não específica em substituição de BSA (C.E. Gene ral Description of ELISA). 0 ponto de viragem da titulação dos soros foi determinado por dez diluições de duas vezes iniciando-se a uma diluição de 1/20 e utilizando-se um valor de absorvância de 0,1 como valor de transição. 0 conjugado utilizado foi um conjugado de anti-IgG de murganho desenvolvido em caprinos (SIGLA) diluído a 1/500.
As placas foram lidas apôs 30 minutos num leitor automático para ELISA (Titertek, 1'ultiscan).
Os resultados do ensaio foram os seguintes:
| Peptide | Ho | Responders | I.íean Titre | Range |
| A | 11 | 9 | 6967 | 320 - 40960 |
| B | 17 | 3 | ' 640 | 320 - 2560 |
| C | 17 | 7 | 580 | 320 - 2560 |
| D | 12 | 1 | 2560 | - |
| E | 17 | 10 | 1194 | 320 - 10240 |
| Control | 12 | 0 | 67 | 20 - 160 |
Como é evidente nos resultados referidos antes, todos os péptidos de A) até 3) de acordo com a presente invenção são capazes de induzir anti-corpos após imunização, que possuem uma absorção claramente mais elevada com amostras de pós-vacinação lo que com amostras de prevacinação. Assim os péptidos ensaiados de A) até 3) funcionam como antigênios e induzem anti-corpos contra toxina pertussis.
Como uma consequência pode estabelecer-se que a toxina liga-se especificamente a anti-corpos induzidos por péptidos sintéticos de A) até 3) em amostras de soro de pós-imunização de murganho.
Claims (11)
- Reivindicações1,- Processo para a preparação de um polipeptido de fórmula gerala) H-X^-Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Ser-Arg-Pro-Pro-Glu-Asp-X2~Y,b) H-X^-Ser-Glu-Tyr-Leu-Ala-His-Ara-Arg-Ile-Pro-Pro--Glu-Asn-Ile-Arg-Arg-Val-Thr-Arg-Val-X2-Y,c) E-X^-Ala-Phe-Val-Ser-Thr-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Tyr-Thr-Glu-Val-Tyr-X2-Y,d) H-X^-Gly-Ile-Thr-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Thr-Glu-Tyr-Ser-Asn-Ala-Arg-Tyr-Val-X2~Y, oue) Η-Χ,-Leu-Glu-His-Arg-Met-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-31--Ala-Glu-Arg-Ala-Gly--Arg-Gly-Thr-Gly-His-Phe-Ile-X2-Y na qual,X e X- representam, cada um, resíduos de aminoácidosI 4-<que facilitam eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2, caracterizado pelo facto de se promover a síntese de acordo com uma técnica em fase sólida ou em fase líquida mediante acoplamento de um aminoácido com o aminoácido seguinte, ou por degradação ou clonagem.
- 2.- Processo para a preparação de um antiaénio de toxina pertussis artificial, caracterizado pelo facto de se fazer reagir pelo menos uma sequência peptídica com anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural, escolhidos de entre um grupo constituído por:a) um polipeptido de fórmula geralH-X^-Asp-Asp- Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arq-Tyr-Asp-Ser-Arg-Pro-Pro-Glu-Asp-X2~Y na qualX^ e X2, representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um gruoo -OH ou -HH2> e as suas fracçõesb) um polipeptido de fórmula geralH-X^-Ser-Glu-Tyr-Leu-Ala-His-Arg-Ara-Ile-Pro-Pro-Glu-Asn-Ile-Arg-Ara-Val-Thr-Arg-Val-X2-Y-32na qualX1 e X2, representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2? e as suas fracções,c) um polipéptido de fórmula geralI H-X^-Ala-Phe-Val-Ser-Thr-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Tyr-Thr-Glu-Val-Tyr-X2-Y na qualX.j e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoâcido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções,d) um polipéptido de fórmula geralH-X1-Gly-Ile-Thr-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Thr-Glu-Tyr-Ser-Asn-Ala-Arq-Tyr-Val-X2-Y na qual e X2 representam, cada um, ura resíduo de aminoâcido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções,e) um polipéptido de fórmula geralH-X^-Leu-Glu-His-Arg-Met-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Ala-Glu-Arg-Ala-Gly-Arg-Gly-Thr-Gly-His-Phe-Ile-X2-Y na qualX1 e Χ2 representam, cada um, um resíduo de aminoácido que eventualmente facilita acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções, sendo a síntese conduzida de acordo com uma técnica em fase sólida ou em fase líquida irediante acoplamento de um aminoácido com o aminoácido seguinte, ou por degradação ou clonagem.
- 3.- Processo para a preparação de um conjunto para imunoensaio de diagnóstico, para a determinação de anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural, em uma amostra de um líquido biológico, caracterizado pelo facto de se incorporar na formulação respectiva pelo menos um antigénio de diagnóstico, escolhido de entre antigénios artificiais e de consistir, principalmente, em uma sequência peptídica, que reage com anticorpos induzidos pela toxina pertussis natural,escolhidos de entre um grupo constituído por:a) um polipeptido de fórmula geralH-X^-Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Ser- Arg-Pro-Pro-Glu-Asp-X2~Y na qualX^ e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoácido que eventualmente facilita acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2, e as suas fracções,-J4B) um polipeptido de fórmula geralH-X^-Ser-Glu-Tyr-Leu-Ala-His-Arg-Arg-Ile-Pro-Pro-Glu-Asn-Ile-Arg-Arg-Val-Thr-Arg-Val-X2-Y na qual e X2r representam, cada um, um resíduo de aminoácido que, facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções,c) um polipeptido de fórmula geralH-X^-Ala-Phe-Val-Ser-Thr-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Tyr-Thr-Glu-Val-Tyr-X2-Y na qualX1 e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções,d) um polipeptido de fórmula geralH-X1-Gly-Ile-Thr-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Thr-Glu-Tyr-Ser-Asn-Ala-Arg-Tvr-Val-X2-Y na qualX^ e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções,e) um polipeptido de fórmula geralH-X^-Leu-Glu-His-Arq-Met-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Ala-Glu- Arg-Ala-Gly-Arg-Gly-Thr-Gly-His-Phe-Ile-X2-Y na qualX^ e X^ representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções.
- 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se incluir, adicionalmente, um veículo e de se acoplar, a este, o antigénio de diagnóstico, uma amostra de soro-padrão positiva, uma amostra de soro-padrão negativa e, eventualmente, uma solução(ões) tampão e/ou uma solução(ões) de lavagem.
- 5. -Processo de acordo con a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se incluir, adicionalmente, agar ou gel de agarose ou um antigénio marcado com radioactividade ou um enzima conjugado e, eventualmente, um subtrato para o enzima conjugado.
- 6. - Processo para a preparação de uma composição de uma vacina, caracterizado pelo facto de se misturar, como componente imunizante, pelo menos um antigénio escolhido entre antigénios de toxina pertussis artificiais, que consiste, principalmente, em pelo menos uma sequência peptídica que reage com anticorpos induzidos por toxina pertussis natural e de se escolher de entre um grupo constituído por,a) um polipêptido de fórmula geral H-X^-Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Ser-Arg-Pro-Pro-Glu-Asp-X2-Y na qualX.j e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoacido, que facilita, eventuais acoplamentos; eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções,b) um polipêptido de fórmula geralH2-X^-Ser-Glu-Tyr-Leu-Ala-His-Arg-Arg-Ile-Pro-Pro-Glu-Asn-Ile-Arg-Arg-Val-Thr-Arg-Val-X2-Y na qualX^ e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoacido que facilita eventuais acoplamentos; eY representa um grupo -OH ou -NH2 ; θ as suas fracções,c) um polipêptido de fórmula geralH-X1-Ala-Phe-Val-Ser-Thr-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Tyr-Thr-Glu-Val-Tyr-X2-Y na qual X^ e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoacido, que facilita eventuais acoplamentos; eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções,d) um polipêptido de fórmula geral-3ΊH-X^-Gly-Ile-Thr-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Thr-Glu-Tyr-Ser-Asn-Ala-Arg-Tyr-Val-X2-Y na qualX^ e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplementos; eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções,e) um polipeptido de fórmula geralH-X^-Leu-Glu-His-Arg-Met-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Ala-GluArg-Ala-Gly-Arg-Gly-Thr-Gly-His-Phe-Ile-X2-Y na qualX^ e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos; eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções, com veículos e/ou diluente não tóxicos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.
- 7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se incorporar uma quantidade eficaz do(s) refe- rido(s) antigénio(s) de toxina pertussis, capaz de proteger um ser humano da tosse convulsa.
- 8. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se incorporar um antigénio como agente adjuvan- te, em uma quantidade que, conjuntamehte com uma quantidade do(s) referido(s) antigênio(s) de toxina pertussis, é eficaz para proteger um ser humano da tosse convulsa.
- 9. - Processo de acordo com a reivindicação 6, 7 ou 8, caracterizado pelo facto de se incorporar, adicionalmente, agente(s) tampão e/ou agente(s) conservante(s).
- 10, - Processo para a preparação de uma composição para um ensaio intradérmico, caracterizado pelo facto de se misturar pelo menos um antigênio em uma quantidade eficaz para produzir uma reacção imunológica cutânea para um título de um anticorpo específico, sendo o referido anticorpo escolhido de entre um conjunto de antigénios de toxina pertussis artificiais, que consistem principalmente em pelo menos uma sequência peptídica capaz de reagir com anticorpos induzidos por toxina pertussis natural, escolhida de entre um grupo constituído por:a) um polipeptido de fórmula qeral H-X^-Asp-Asp-Pro-Pro-Ala-Thr-Val-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Ser-Arg-Pro-Pro-Glu-Asp-X^-Y na qualX.j e representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NHn; e as suas fracções;b) um polipeptido de fórmula geralH-X^Ser-Glu-Tyr-Leu-Ala-His-Arg-Arg-Ile-Pro-Pro-Glu-Asn-Ile-Arg-Arg-Val-Thr-Arg-Val-X2-Y na qualX1 e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2? e as suas fracções,c) um polipeptido de fórmula geral qual representam, cada um, um resíduo de aminoácido eventuais acoplamentosY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções, d) um polipeptido de fórmula geralH-X^-Gly-Ile-Thr-Gly-Glu-Thr-Thr-Thr-Thr-Glu-Tyr-Ser-Asn-Ala-Arg-Tyr-Val-X2-Y na qualX^ e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou -NH2; e as suas fracções,e) um polipeptido de fórmula geralH-X^-Leu-Glu-His-Arc-Met-Gln-Glu-Ala-Val-Glu-Ala-Glu-Arg-Ala-Gly-Arg-Gly-Thr-Gly-His-Phe-Ile-X2-Y na qualX^ e X2 representam, cada um, um resíduo de aminoácido que facilita eventuais acoplamentos eY representa um grupo -OH ou NH^; e as suas fracções, com um veículo e/ou diluente não tóxicos, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.►
- 11.- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se incorporar ainda agente(s) tampão e/ou agente(s) conservante(s),
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