SE457353B - Pertussistoxinantigen jaemte immunanalystestsats, vaccinkomposition och intradermal hudtestkomposition med naemnda antigen - Google Patents

Description

457 10 15 20 25 ao 35 353 2 fimbrial hemagglutinin as antigen. J. Infect. Dis. vol 146: 741-745), eller sonikerade B. pertussis bak- terier (se t ex Goodman, Y.E., Wort, A.J. och Jack- son, F.L. 1981. Epzyme-linked immunosorbent assay for detection of pertussis immunoglobulin A in naso- pharyngeal secretions as an indicator of recent in- fection- J. Clin. Microbiol. vol. 13: 286-292, och Viljanen, M. K., Ruuskanen, O., Granberg, C. och Salmi, T. T. 1982. Serological diagnosis of pertussis: IgM, IgA and IgG antibodies against Bordetella pertussis measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Scand.

J. Infect. Dis. 14: 112-117).

Såsom är välkänt pà detta omrâde är de vacciner vol. mot kikhosta som för närvarande används i USA och många andra länder baserade pá inaktiverade Bordetella pertussis bakterier. M. Pittman föreslog 1979 att kikhosta förmedlades av ett exotoxin (pertussistoxin) 1979. the harmful effects and prolonged immunity of whooping cough. A hypothesis. Rev. Infect. Dis. vol. l:401-412) (se Pittman, M. Pertussis toxin: The cause of och i Japan användes för närvarande acellulära vacciner som omfattar inaktiverat pertussistoxin.

Nyligen publicerades pertussistoxinets nukleo- tidsekvens (Locht, C. och Keith, J. M., l98§. Pertussis Toxin Gene: Nucledtide Sequence and Genetic Organiza~ tion, Science, vol. 232, p. 1258-1264). I denna arti- kel föreslår författarna bland annat att syntetiska 1 oligopeptider som inkluderar skyddande epitoper också kommer att vara användbara vid utveckling av en ny generation vacciner, men i artikeln varken beskrivs ebler föreslås sådana epitoper.

En annan nyligen publicerad artikel som avser pertussistoxingener är: Nicosia, A., Perugini, M., Franzini, C., Casagli, M.C., Borri, M.G., Antoni, G., Almoni, M., Neri, P., Ratti, G., och Rappuoli, R., 1986. Cloning and sequencing of the pertussis toxin genes: Operon structure and gene duplication. Proc. 10 15 20 25 30 35 457 353 3 Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, 4631-4635. publikation anges bland annat att “Manipulering av I denna toxingenen med hjälp av genteknik kunde vara ett sätt att framställa stora mängder detoxifierat protein".

Detta är endast ett förslag och ingen manipulerad toxingen har beskrivits.

Ytterligare en annan publikation på detta omrâde är: Engström, O., Rodmalm, K., Jörnvall, H., Lundquist, G., Kálmán, M., Simonscits, A., Bartfai, T., Löfdahl, S., och Askelöf, P., 1986. Characterization of the N-terminal structure of pertussis toxin subunit Sl and hybridization of oligodeoxyribonucleotide probes with Bordetella pertussis DNA fragment, FEMS Micro- biology Letters, vol. 36, 219-223. Även denna artikel presenterar förslag, nämligen "Genen kan också införas i andra organismer för produktion av toxin. Sekvensbe- stämning av genen skulle medge syntes av peptider som motsvarar toxinets antigenepitoper och följaktligen medge utveckling av ett syntetiskt pertussisvaccin." Pertussistoxinets antigenepitoper har emellertid inte identifierats, syntetiserats eller testats.

När det gäller intradermala hudtestkompositioner så har sådana kompositioner för testning av immuni- tet mot pertussis hittills inte beskrivits inom den kända tekniken. _ Beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning är baserad på en poly- peptid med 17 aminosyror, nämligen NH2-X1-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser- -Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X2-COY där X1 och X2 vardera representerar en eventuell kopp- lingsunderlättande aminosyrarest (i festen av beskriv- ningen angiven som aminosyra-kopplingsenhet), och Y representerar -OH eller -NH2.

Exempel på lämpliga aminosyra-kopplingsenheter är -Lys- och -Cys-. Dessa kopplingsenheter underlät- 457 353 10 l5 20 25 30 35 4 tar koppling av en bärare, såsom bovint serumalbumin, till polypeptiden.

Denna polypeptid har biologiskt intressanta egen- skaper, bland annat dess förmåga att reagera med anti- kroppar från konvalescentserum från kikhostepatienter.

Polypeptiden har syntetiserats i enlighet med per se kända fastfastekniker.

Såsom är välkänt på detta område syntetiseras en peptid antingen i syraform (COOH) eller i amidform (CONH2) beroende på tillgänglig, hartsbunden utgångs- aminosyra. pI en aspekt av uppfinningen åstadkommes ett ar- tificiellt framställt pertussistoxinantigen, vilket reagerar med antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin och vilket omfattar minst en peptid- sekvens som valts från den grupp som består av polypeptiden NH2-X1-Gln-Thr-Arg~Ala-Asn-Pro-Asn~Pro-Tyr-Thr-Ser- -Arg-Arg-Ser~Val-Ala-Ser-X2-COY l där X och X2 vardera-representerar en eventuell ami- nosyra-kopplingsenhet, och Y representerar :OH eller p-NH2; samt peptidepitoper som ingår däri.

Eftersom polypeptiden har förmåga att reagera med antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin är den per se ett antigen, och följaktligen har den förmåga att inducera antikroppar, vilka reagerar med nativt toxin, i djur. Eftersom polypeptiden är ett antigen är det troligt att det däri ingår kortare peptidsekvenser som fungerar som epitoper. Pertussis- toxinantigenet, vilket reagerar med antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin, omfattar inte nödvändigtvis fler än en sådan peptidepítop tillsammans med en bärare, ehuru det företrädesvis omfattar flera sådana epitoper. 10 15 20 25 30 35 457 353 S Uttrycket "artificiellt framställt pertussis- toxinantigen", avses, såsom det användes i denna be- skrivning och tillhörande patentkrav, inbegripa pertus- sistoxinantigener som framställts på ett artificiellt sätt, dvs som åstadkommits genom human ansträngning och inte genom naturliga orsaker som är fristående från human medverkan. Ehuru polypeptiden som utgör eller utgör del av pertussistoxinantigenet enligt uppfinningen har kemiskt syntetiserats, kan polypepti- den och peptidepitoperna som ingår däri framställas med användning av någon annan teknik, t ex nedbrytning, kloning etc, och det avses att uttrycket "artificiellt framställt" skall täcka produkter som framställts genom vilken som helst sådan teknik.

Ordet "omfattar" i beskrivningen och patentkraven och uttrycket "i huvudsak består av" i patentkraven anger att någonting är inkluderat, men att detta någon- ting inte nödvändigtvis utgör det enda som inkluderats.

Särskilt bör det förstås att "antigener, vilka reagerar med antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin och vilka omfattar minst en peptidsekvens som valts från den grupp som består av polypeptiden och peptid- epitoper som ingår däri" avses omfatta antigener i vilka den valda peptidsekvensen som väsentligen består av polypeptiden är den enda komponenten; antigener i vilka minst polypeptiden ingår tillsammans med en eller flera bärare till vilken eller vilka den är kopplad; antigener i vilka minst en peptidepitop som ingår i polypeptiden är närvarande tillsammans med en eller flera bärare till vilken eller vilka den är kopplad; antígener i vilka polypeptiden ingår till- sammans med minst en peptidepitop som ingår i polypep- tiden och antigener i vilka minst polypeptiden samt minst en peptidepitop som ingår i polypeptiden är närvarande tillsammans med bäraren eller bärarna till vilka de är kopplade. 10 15 20 25 30 35 457 353 6 Ordet "bärare" bör tolkas vidsträckt, och bäraren kan vara vad som helst till vilken peptiden ifråga kan kopplas genom fysikalisk/kemisk interaktion, så- som kovalent bindning, jonbindning, vätebindning eller hydrofob bindning. Exempel pà sådana bärare är mine- ralbärare, t ex aluminiumhydroxid, kalciumfosfat, etc., plastytor t ex mikroplattor, kulor etc, lipi- der, liposomer, kolhydrater, aminosyror, peptider och proteiner.

I en annan aspekt av uppfinningen àstadkommes en diagnostisk immunoanalystestsats för bestämning av antikroppar i ett prov av biologiskt fluidum, vilka antikroppar inducerats av nativt pertussistoxin. Test- satsen omfattar som ett diagnostiskt antigen minst ett antigen som valts från de artificiellt framställda antigenerna, vilka reagerar med antikroppar som indu- cerats av nativt pertussistoxin. Beroende på den immu- noanalys som används för bestämning av antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin kan testsatsen omfatta andra lämpliga reagens, såsom en bärare till vilken det diagnostiska antigenet är kopplat, ett positivt standardserumprov, ett negativt standard- serumprov, ett enzymkonjugat, såsom alkaliskt fosfatas eller peroxidas, substrat för enzymkonjugatet, såsom paranitrofenylfosfat, agar- eller agarosgel, radioaktivt märkt antigen, buffertlösningar och/eller tvättlös- ningar. Valfritt är alla reagensen i testsatsen i separata, förseglade provrör eller flaskor som ära märkta med specifika etiketter.

Provet av biologiskt fluidum är företrädesvis ett nasofarynxsekretprov, salivprov, blodprov eller serumprov från ett djur, t ex en människa.

Exempel på immunoanalyser i vilka testsatsen enligt uppfinningen kan användas är ELISA (enzyme- -linked immunosorbent assay), Immunodiffusion, Radio- immunoanalys (RIA) och Immunoelektrofores (IE). 10 15 20 25 30 35 457 353 7 När ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) används omfattar testsatsen enligt uppfinningen a) ett diagnostiskt antigen enligt uppfinningen b) eventuellt en bärare för nämnda diagnostiska antigen c) eventuellt ett positivt standardserumprov d) eventuellt ett negativt standardserumprov e) ett enzymkonjugat f) eventuellt ett substrat för nämnda enzymkon- jugat g) eventuellt buffertlösning(ar), och h) eventuellt tvättlösning(ar).

När immunodiffusion eller immunoelektrofores (IE) används omfattar testsatsen enligt uppfinningen samma som för ELISA, med undantag för ingredienserna e) och f). Istället behövs en gel, såsom agar- eller agarosgel, men en sådan gel inkluderas vanligen inte i testsatsen, eftersom den är allmänt tillgänglig.

När radioimmunoanalys (RIA) används omfattar testsatsen enligt uppfinningen samma som för ELISA, med undantag för ingredienserna e) och f), vilka ersätts med radioaktivt märkt antigen. Eventuellt kan också en lösning för utfällning av radioaktivt märkt antigen, som är bundet till antikroppar, såsom triklorättiksyra, eller sekundära antikroppar inkluderas i testsatsen.

I en ytterligare aspekt av uppfinningen tillhan- dahålls en vaccinkomposition, vilken som en immuni~ serande komponent omfattar minst ett antigen som är valt från de artificiellt framställda pertussistoxin- antigenerna, vilka reagerar med antikroppar som in- dueerats av nativt pertussistoxin, företrädesvis i en mängd som är verksam för att skydda en individ mot sjukdomen kikhosta, och en nontoxisk, farmaceu- tiskt acceptabel bärare och/eller spädmedel. Bäraren är en bärare som ovan definierats, och spädmedlet kan vara ett konventionellt spädmedel som används på detta område, såsom fysiologisk saltlösning. Vaccin- 10 15 20 25 30 35 457 353 8 kompositionen enligt uppfinningen kan vidare omfatta ett antigenadjuvans i en mängd som tillsammans med mängden av nämnda antigen är verksam för att skydda en individ mot sjukdomen kikhosta. Exempel på all- mänt använda adjuvans i vacciner för människor är s k mineralbärare, t ex fosfat eller hydroxid av kalcium eller aluminium, på vilka antigenet ifråga är adsorbe- rat. Ett exempel på ett vaccinadjuvans som allmänt används inom veterinärmedicin är Freund's kompletta adjuvans. Vaccinkompositionen kan dessutom omfatta buffert(ar) och/eller ett eller flera konserveringsmedel efter behov, och lämpliga buffertar samt konserverings- medel har beskrivits i t ex US Farmakopén.

I ytterligare en annan aspekt av uppfinningen åstadkommas en intradermal hudtestkomposition, vilken omfattar minst ett antigen som valts från de artifi- ciellt framställda pertussistoxinantigenerna enligt uppfinningen, vilka reagerar med antikroppar som in- ducerats av nativt pertussistoxin, i en mängd som är verksam för att åstadkomma en immunologisk hud- reaktion vid en specifik antikroppstiter hos en individ, och en nontoxisk, farmaceutiskt acceptabel bärare och/eller spädmedel. Hudtestkompositionen enligt upp- finningen kan vidare omfatta buffert(ar) och/eller ett eller flera koñserveringsmedel, efter behov.

Användbara bärare, spädmedel, buffertar och konser- veringsmedel har ovan definierats.

SYNTES AV POLYPEPTIDEN Fastfassyntes (Merrifield) av polypeptiden har utförts på konventionellt sätt, genom koppling av aminosyrorna till varandra, varvid peptidbindningar bildas, börjande med en fast fas (harts) till vilken den första aminosyrans C-terminal är kopplad, varpå den följande aminosyrans C-terminal kopplas till den första aminosyrans N-terminal etc. Slutligen frigörs den uppbyggda peptiden från den fasta fasen. 10 15 20 25 30 35 457 353 9 Specifikt syntetiserades följande peptid: NH2-Lys-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn~Pro-Tyr-Thr-Ser- -Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-COOH Syntes av peptidfragmenten utfördes med användning av en Biosearch Sam Two (Biosearch, Inc¿ California USA) peptidsyntesmaskin, varvid version 2.38 av Bio- search's peptidsyntesautomatiseringsmjukvara för t-BOC- -aminosyror användes. Standardkopplingskonstanter (default) användes för 1 g utgàngsmaterial (substi- tutionsgrad = 0,33 mekv/g).

Hartset som användes för syntes av peptiden var ett standard Merrifield-harts. De lämpligt skyddade alTlinOSYfOIfla Val' 2 Boc-Ala-OH (Boc-L-Alanin) Boc-Arg(Tos)~0H (a-Boc-N-Tosyl-L~Arginin) Boc-G1n~OH Boc-L-Glutamin) Boc-Asn-OH (Boc-L-Asparagin) Boc-Lys(CL-Z)-OH (Boc-e-o-Kloro-Bensy1- Boc-Pro-OH (Boc-L-Prolin) oxikarbonyl-L-Lysinl Boc-Ser(Bzl)-OH Boc-Thr(Bzl)-OH (Boc-O~Bensyl-L-Serin) (Boc~O~Bensy1-L-Treonin) Boc-Val-OH (Boc-L-Valin) Boc-Tyr(Cl2-B21)-OH (Boé-o-z , s-Dikloro- bensy1~L-Tyrosin) När det gäller detaljer beträffande aminosyrakon- centration, lösningsmedelsvolymer, reaktionstider etc, följdes tillverkarens (Biosearch) rekommendationer. 457 553 10 Specifikt användes följande kemikalier som nedan uppräknas vid syntes, spjälkning och rening av de syntetiska peptiderna.

SUBSTANS Acetylimidazol Dimetylformamid Diisopropyletylamin Hydroxibensyltriazol Metylenklørid Ninhydrin Kaliumhydroxid t-Boc-aminosyror Vätefluorid Resorcinol Dimetylsulfid Hydroxibensyltriazol Trifluoroättiksyra Acetonitril Ättiksyra Díetyleter KVALITET p.a. p.a.

Dubbeldestillerat från 1 g/1 nin- hydrin, sedan 5 g/l KOH. Första 10% destillat kasserades. p.a.

HPLC p.a. p.a. p.a. (syntes) sequanal (HPLC) HPLC p.a.

LEVERANTÖR Aldrich Fluka Aldrich Aldrich Fisons (UK) Aldrich Bachem AGA x Aldrich Aldrich Rathburn Merck Fluka Den fullbordade, hartsbundna peptiden avlägsna- des fràn synteskammaren och tvättades med metanol, samt torkades till konstant vikt under vakuum. 10 15 20 25 30 35 457 353 _ ll Spjälkning av peptiden från hartsbäraren Portioner (0,5 9) av den tvättade och torkade hartsbundna peptiden överfördes till en cylindrisk (PTFE) polytetrafluoroetenkammare som innehöll 1 g resorcinol, 6,5 ml dimetylsulfid och en PTFE-belagd magnet. Kammaren kyldes till -80°C i ett torris-eta- nolbad. Fluorvätesyra (HF) (slutlig volym 10 ml) släpp- tes sedan in i kammaren, vilken därefter hölls vid 0°C under 120 min på en magnetomrörare. Därefter av- lägsnades syran med användning av-en vattenaspira- tor. Kammaren kyldes återigen till -80°C och 10 ml HF släpptes in i kammaren, vilken placerades över en magnetomrörare vid 0°C under 45 min. Därefter av- lägsnades syran återigen med användning av en vatten- aspirator och den resterande blandningen överfördes till ett sintrat glasfilter. Harts/peptid-blandningen tvättades sedan med 100 ml 10 vol% ättiksyra och där- på med 50 ml dietyleter. Ättiksyratvättvätskan tvät- tades också med 50 ml dietyleter i en skiljetratt, och eterfasen avlägsnades från den vattenhaltiga fasen.

De sammanförda etertvättvätskorna och ättiksyratvätt- vätskan indunstades sedan respektive lyofiliserades, och peptidprodukten àtervanns. Peptiden àtervanns endast från den vattenhaltiga fasen. v Rening av den syntetiska peptiden Den råa syntesproduktens olika komponenter löstes upp genom att de applicerades på en högtryckskromato- grafikolonn med “reverse-phase" C-18 silika, med an- vändning av acetonitril/H20 (0,1 vol% trifluoroättik- syra (TFA)) som den mobila fasen. 20 pg- 100 mg av 20 (0,1% TFA), centrifugerades och injicerades i en l ml slinga den-ràa peptiden löstes i upp till l ml H på en Rheodyne (California, USA) HPLC-injektor. Lös- ningen pumpades genom en färdigpackad l0x500 mm Oligosil "reverse-phase" C-18 kolonn (Skandinaviska Genetec, Sverige) med användning av en 2152 gradientkontroller och tvà 2150 HPLC-pumpar (LKB, Sverige). Gradienten 457 353 10 15 20 25 30 35 12 var lineär från 0 till 100% acetonitril efter 60 min.

Flödeshastigheten var 2 ml/min. Elueringen av syn- tesprodukten övervakades vid 206-238 nm med användning av en LKB 2131 absorptionsmonitor med varíerbar våg- längd. Fraktioner uppsamlades för hand och renades på nytt om så behövdes genom lyofilisering av de rele- vanta fraktionerna, áterupplösning samt upprepande av_det kromatografiska förfarandet. Slutprodukten lyofíliserades och lagrades i glasrör vid -20°C.

FRAMSTÃLLNING AV PEPTIDANTIGEN FÖR IMMUNOANALYS Den ovan syntetiserade peptiden kopplades till en bärare, dvs bovint serumalbumin (BSA) på följande sätt för att bilda ett diagnostiskt antigen (belägg- ningsantigen), vilket användes i ELISA. 1 mg peptid och 3,6 mg BSA löses i 2,0 ml fosfat- buffrad fysiologisk saltlösning (PBS), pH 7,4.

Till denna lösning sattes 30 mikroliter av en 2,5% (vikt/vol) vattenhaltig glutardialdehydlösning.

Reaktionsblandningen inkuberades vid rumstempera- tur (20-25°C) under 1 h, stoppas genom tillsättning av 0,5 ml av en 5 M vattenhaltig etanolaminlösning och dialyserades sedan mot en liter PBS vid +4°C under 4 h, varvid dialysfluidumet utbytes efter 30 min och efter 2 h.

Därpå gelfiltreras dialyspåsens innehåll genom en kolonn (2,5x6O cm) som innehöll Sephacryl (DS-300 gel (Pharmacia, Uppsala, Sverige) som jämviktsinställts u med PBS. 3,0 ml fraktioner uppsamlas.

De fraktioner som innehöll kopplat material sam- manfördes och det sammanförda materialet användes i ELISA som beläggningsantigen och sattes direkt, utan någon föregående utspädning, till mikroplattan.

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAYS (ELISA) Nedan följer en allmänn beskrivning av ELISA.

Konjugatet och konjugatets utspädning, samt den tid 10 15 20 25 30 35 457 353 13 som förflöt innan mikroplattorna avlästes kan variera mellan de olika analyserna. Skillnaderna ges efter den allmänna beskrivningen. ëëê¥Ä§_ëE§§ElYElN§_êY_§Elêê UTRUSTNING: Mikrotiterplattor (Dynatech, mod. nr l29B).

Antigen för beläggning av mikroplattor (t ex peptider och proteiner).

Beläggningsbuffertz Fosfatbuffrad fysiologisk saltlös- ning (PBS) Inkubationsbuffert: PBS + 0,05 vol% Tween 20 Vattenhaltig tvättvätska: 0,9% NaCl + 0,05% Tween 20 Serum (t ex humana och animala referens- samt testsera) Konjugat (t ex alkaliskt fosfatas-konjugerat svin-anti- human IgG antikroppar (Orion Diagnostica) och get-anti- -kanin Ig-antikroppar (Sigma).

Enzymsubstrat: p-nitrofenylfosfattabletter (Sigma), 1 mg/ml substratbuffert (jfr nedan) Substratbuffert: lM vattenhaltig dietanolamin, pH 9,8, + 0,5 mM MgCl2 + 0,02% NaN Pipetter och provrör UTFÖRANDE: 1. Beläggning av mikroplattor. 3.

Mikroplattor inkuberades med 0,1 ml antigen i PBS vid rumstemperatur (20-25°C) över natten. 2. Inkubation med bovint serumalbumin (BSA) och serum.

Plattorna tvättades fyra gånger och inkuberades sedan med 0,1 ml av 1% (vikt/vol) BSA i PBS vid 37°C under 1 h. Efter tvättning sattes 0,1 ml serum som lämpligt utspätts i inkubationsbuffert till brunnarna och plattan (plattorna) inkuberades vid rumstemperatur under l h. 3. Inkubation med konjugat.

Efter tvättning sattes 0,1 ml konjugat som lämp- ligt utspätts i inkubationsbuffert till brunnarna och plattan (plattorna) inkuberades vid rums- temperatur under 2 h. 457 353 10 15 20 25 30 35 14 Efter tvättning sattes 0,1 ml av enzymsubstrat- lösningen till brunnarna. Plattorna hölls vid rumstemperatur och absorbansen vid 405 nm avlä- stes efter den tid som nedan anges.

SPECIFIK BESKRIVNING AV ELISA ENZYME~LINKED IMMUNOSORBENT ASSAYS: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) för mätning av reaktionen mellan den syntetiska pep- tiden och antikroppar som specifikt inducerats genom immunisering med nativt pertussistoxin (kanin), eller antikroppar efter naturlig sjuk- dom (human).

Varje analys utfördes i triplikat.

Den peptid som användes som beläggningsantigen i ELISA behandlades först såsom beskrivits under “Framställning av peptidantigen för immunoanalys".

Serumproverna var från en kanin som hyperimmu- niserats med högrenat pertussistoxin (Statens Bakteriologiska Laboratorium, Sverige), och från en konvalescent kikhostepatient (human), som erhållits från Statens Bakteriologiska Laboratorium (SBL) i Sverige. Det humana serumprovet är så utvalt och justerat att det i ELISA med nativt toxin som antigen ger en absorbans vid_405 nm av ca 1,0 efter 1 h inkubation.

Båda sera användes i en 1/500 utspädning. Det använda konjugatet var ett alkaliskt fosfatas- -get-anti-kanin Ig~konjugat (Sigma) utspätt l/500 eller ett alkaliskt fosfatas-svin-anti- -human-IgG-konjugat (Orion Diagnostica) utspätt l/100.

Plattorna avlästes vid de tidpunkter som nedan anges i en automatisk ELISA-avläsningsapparat (Titertek, Multiscan). 457 353 15 Följande resultat erhölls: , I plattor avlästa absorbans vidâ Serum É konjugat efter 405 nm kanin get-anti-kanin å 3 min 1,21 É ¿human 2 svin-anti-human É 20 min 1,11 Såsom framgår av de ovan angivna resultaten binder den syntetiska peptiden starkt till antikroppar som inducerats av nativt pertussis-toxin i konvalescent- serumprover från en kikhostepatient.

Sålunda fungerar den syntetiska peptiden som ett antigen.

Claims (10)

457 353 10 15 20 25 30 35 16 PATENTKRAV

1. l. Artíficiellt framställt pertussistoxinantigen, vilket reagerar med antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin, k ä n n e t e c k n a t därav, att det i huvudsak består av minst en peptidsekvens som valts från den grupp som består av polypeptiden -X1-Gln-Thr~Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser- NH2 -Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X2-COY där X1 och X2 vardera representerar en eventuell kopp- lingsunderlättande aminosyrarest, och Y representerar -OH eller -NH2; samt peptidepitoper som ingår däri.

2. Diagnostisk immunoanalystestsats för bestämning av antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin i ett prov av biologiskt fluidum, k ä n n e t e c k ~ n a d därav, att den omfattar som ett diagnostiskt antigen minst ett antigen som valts fràn artificiellt framställda antigener, vilka reagerar med antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin och vilka i huvudsak består_av minst en peptidsekvens'som valts från den grupp som består av polypeptiden NH2-X1-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser- -Arg-Arg-Ser-Val-Ala-Ser-X2-COY 1 och X2 vardera representerar en eventuell kopplings- där X underlättande aminosyrarest, och Y representerar -OH eller ~NH2; samt peptidepitoper som ingår däri.

3. Diagnostisk ímmunoanalystestsats enligt kra- vet 2, k ä n n e t e c k n a d därav, att den ytter- 10 15 20 25 30 35 457 353 17 ligare inbegriper en bärare till vilken det diagnostiska antige- net är kopplat, ett positivt standardserumprov, ett negativt standardserumprov, och eventuellt buffertlösning(ar) och/eller tvättlösning(ar).

4. Diagnostisk immunoanalystestsats enligt kra- vet 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att den ytter- ligare inbegriper agar- eller agarosgel, eller radio- aktivt märkt antigen, eller ett enzymkonjugat och eventuellt ett substrat för enzymkonjugatet.

5. Vaccinkomposition, k ä n n e t e c k n a d där- av, att den omfattar som en immuniserande komponent minst ett antigen som valts från artificiellt fram- ställda pertussistoxinantigener, vilka reagerar med antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin och vilka i huvudsak består av minst en peptidsekvens som valts från den grupp som består av polypeptiden NH2-X1-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser- -Arg-Arg-Ser-Val-A1a-Ser-X2-COY där X1 lingsunderlättande aminosyrarest, och Y representerar och X2 vardera representerar en eventuell kopp- -OH eller -NH2; samt peptidepitoper som ingår däri, tillsammans med en nontoxisk, farmaceutiskt accepta- bel bärare och/eller spädmedel.

6. Vaccinkomposition enligt kravet 5, k ä n n e - t e c k n a d sistoxinantigen(er) i en mängd som är verksam för därav, att den omfattar nämnda pertus- att skydda en individ mot sjukdomen kikhosta.

7. Vaccinkomposition enligt kravet 5, k ä n n e - t e c k n a d ett antigenadjuvans i en mängd som tillsammans med därav, att den ytterligare omfattar 457 353 10 15 20 25 30 35 18 mängden av nämnda pertussistoxinantigen(er) är verksam för att skydda en individ mot sjukdomen kikhosta.

8. Vaccinkompositíon enligt kravet 5, 6 eller 7, k ä n n e t e c k n a d därav, att den dessutom omfattar buffert(ar) och/eller ett eller flera kon- serveringsmedel.

9. Intradermal hudtestkomposition, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den i huvudsak består av minst ett antigen i en mängd som är verksam för att åstadkomma en immunologisk hudreaktion vid en specifik antikroppstiter hos en individ, varvid antigenet är valt från arterificiellt framställda pertussistoxin- antigener, vilka reagerar med antikroppar som inducerats av nativt pertussistoxin och vilka omfattar minst en peptidsekvens som valts från den grupp som består av polypeptiden NH2-X1-Gln-Thr-Arg-Ala-Asn-Pro-Asn-Pro-Tyr-Thr-Ser- -Arg-Arg-Ser-Va1-Ala-Ser-X2-COY där X1 och X2 vardera representerar en eventuell kopp- lingsunderlättande amínosyrarest, och Y representerar l -OH eller -NH2; samt peptidepitoper som ingår däri, tillsammans med en nontoxisk, farmaceutiskt acceptabel bärare och/eller spädmedel.

10. Intradermal hudtestkomposition enligt kravet 9,'k ä n n e t e c k n a d därav, att den dessutom omfattar buffert(ar) och/eller ett eller flera kon- serveringsmedel.