JPH03127799A - ペプチドおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はペプチドおよびその用途に関する。

本発明によって提供されるペプチドは新規であリ、成人
ＴＩＲ胞白血病関連抗原（以下、これをＡＴＬＡと略称
する）に特異性を有する抗体（以下、これを抗ＡＴＬＡ
抗体と略称する）と特異的に結合する能力を有する。本
発明のペプチドは抗ＡＴＬＡ抗体の測定、抗ＡＴＬＡ抗
体の精製および成人Ｔ細胞白血病ウィルス保有者の体内
からの抗ＡＴＬＡ抗体の吸着除去に有用な吸着剤として
利用できる。

本発明によって提供される抗ＡＴＬＡ抗体の測定試薬お
よび抗ＡＴＬＡ抗体吸着剤は、血清または血漿中の抗Ａ
ＴＬＡ抗体を高感度で検出する能力、および血液中また
は血漿中の抗ＡＴＬＡ抗体を高度に特異的に吸着する能
力を有しており、抗ＡＴＬ＾抗体の測定、抗ＡＴＬＡ抗
体の１１製および成人Ｔ細胞白血病ウィルス感染症の治
療において有用である。

［従来の技術］ 成人Ｔ細胞白血病ウィルス（以下、これをＡＴＬＶと略
称する）は成人Ｔ細胞白血病（以下、これをＡＴＬと略
称する）患者から単離され、免疫細胞に感染してＡＴＬ
をはじめ様々な免疫異常や免疫能の低下を引き起こすウ
ィルスとして知られている［プロシーデインゲス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデξ−・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・エナイテッド・ステイソ・オブ・アメリカ （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ　　ｏｆ
　　ｔｈｅ　　Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　　ｏｆ
　　Ａｍｅｒｉｃａ）、第７８巻、第６４７６頁（１９
８１年）参照コ。その遺伝子配列はすでに明らかにされ
ており［プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステイソ・オブ・アメリカ、第８０巻、第３６１８
頁（１９８３年）参照］、抗ＡＴＬＡ抗体検出やワクチ
ン取得などのための、遺伝子工学的技術によるＡＴＬＶ
関連抗原の組換え蛋白作成の試み［特開昭６３−１２４
９６３号公報；　ジーン（Ｇｅｎｅ）　、　　第３８巻
、　第５７頁　（１９８５年）；プロシーデインゲス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデ主−・オブ・サイエンス
・オブ・ザ・、ユナイテッド・ステイソ・オブ・アメリ
カ、第８１巻、第６２０２頁（１９８４年）参照コ、ペ
プチド合成技術によるＡＴＬＶ抗原関連合或ペ合成ド作
成の試み［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆＩｍＩｌｌｕｎｏｌｏｇｙ）、　第１３６
巻、　第７号、　第２３９３頁　（１９８６年）；　ヴ
イロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１３６巻、第３３
８頁（１９８４年）；　特開昭６３−３０１８９６号公
報；　特開昭６１−３０６００号公報；　リューケミア
　リサーチ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
、　第９巻、　第９号、　　第１１１１頁（１９８５年
）参照］などがなされている。

また、ＡＴＬＶの関与する病態としては直接的にはＡＴ
Ｌの他、ＨＴＬＶ−１関連を髄症、間接的には慢性肺疾
患、肺日和見感染症、Ｍ蛋白症、慢性腎不全、非特異的
皮膚真菌症などの免疫不全状態が知られている。現在、
ＡＴＬの治療としては、　自覚症状の無い′病型または
慢性に経過する病型では対症療法が主として行われ、進
行性の病態を示すＡＴＬでは抗腫瘍剤を中心とした多剤
併用化学療法が行われているが、それらの治療効果は明
確ではない。より確実に治療できる方法が望まれている
のが現状である。

［発明が解決しようとする課題］ 現在、抗ＡＴＬＡ抗体の検出は、ＡＴＬＶ感染細胞をス
ライド上にコーティングし、蛍光色素標識抗体を用いて
検出する間接蛍光抗体法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
、　第２９４巻、第７７０頁（１９８１年）参照コ、Ａ
ＴＬＶＩ：たはその抗原成分を感作したゼラチン粒子が
抗ＡＴＬＡ抗体存在下で凝集する性質を利用した粒子凝
集法［ガン（Ｇａｎｎ）、第７巻、第８４５頁（１９８
４年）参照］、ＡＴＬＶ感染細胞より抽出した抗原成分
をコーティングしたマイクロカップによる放射免疫測定
法［ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル”メデイス
ン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｍｅｄｉａｉｎｓ）、　第１５９巻、　第１１１７頁＜
１９８４年）参照コまたは酵素免疫測定法［ガン、第７
４巻、第１８５頁（１９８３年）参照］を用いて行われ
ている。しかしながら、ＡＴＬＶ感染細胞およびそれか
ら部分Ｎ製して得られた抗原成分は非特異な種々の抗原
成分を含有していることから、これらを試薬として利用
して抗＾ＴＬ＾抗体の測定を行った場合には、該試薬は
対象とする抗ＡＴＬＡ抗体以外の試料中の他の非特異な
抗体成分、例えば抗核抗体または抗Ｔ細胞膜抗体をも認
識することになり、測定結果は必ずしも抗ＡＴＬＡ抗体
の存在を正確に表しているとは限らないことになる。こ
の問題点の解決の手段として、組換え蛋白や合成ペプチ
ドを用いた放射免疫測定法や酵素免疫測定法に関する研
究が多くみられる。

例えば、組換え蛋白の使用例としては、抗原性の高い部
分とされているｅｎｖ蛋白を用いる方法［サイエンス（
５ｃｉｅｎｓｅ）、第２２６巻、第１０９４頁（１９８
４年）；　プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・スティソ・オブ・アメリカ、第８１巻、第６２０
２頁（１９８４年）；　特開昭６０−１６６６２４号公
報；　特開昭８０−１６６６９９号公報参照］またはｇ
ａｇ蛋白を用いる方法［ジーン、第３８巻、第５７頁（
１９８５年）；　特開昭６０−６１５３４号公報；　特
開昭６３−１２４９８３号公報参照］が知られている。

合成ペプチドの使用例としては、ＡｉＴＬＶのｇａｇ蛋
白領域またはｅｎｖ蛋白領域から選択された親水性領域
と判断されるいくつかのアミノ酸配列をペプチド合成機
によって合成したペプチドを用いた放射免疫測定法［ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー、第１３６巻、第７巻、
第２３９３頁（１９８６年）；　ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー、第１４２巻、第３巻、第９７１頁（１９８
９年）；　プロシーデインゲス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・スティソ・オブ・アメリカ、第８４巻、第２４７
９頁（１９８７年）参照コなどが報告されている。

しかしながら、これまでの方法では前述のような非特異
成分が含有されていない組換え蛋白または合成ペプチド
を使用しているにもかかわらず、該組換え蛋白および該
合成ペプチドは抗ＡＴＬ＾抗体に対して低い特異性しか
示さず、また放射性物質を用いなければならない場合が
ある。従って、放射性物質を用いない簡便な、かつ抗Ａ
ＴＬＡ抗体に対して高い特異性を有する抗原ポリペプチ
ドを用いることによる抗ＡＴＬＡ抗体の測定方法の開発
が望まれているのが現状である。

しかして、本発明の１つの目的は抗ＡＴＬＡ抗体と特異
的に結合する能力を有するペプチドを提供することにあ
る。本発明の他の１つの目的は抗ＡＴＬＡ抗体の測定試
薬を提供することにある。本発明のさらに他の１つの目
的は抗ＡＴＬＡ抗体を有効に吸着する能力を有する吸着
剤を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明によれば、上記の目的は、 ■　一般式 ％式％（） ［式中、Ａは６〜５０個のアミノ酸が結合してなるペプ
チド断片を表し、Ｘは１〜１０個のＬｙｓがペプチド結
合してなるペプチド断片を表し、Ｙは水酸基またはア主
ノ基を表す］で示される、或へＴ細胞白血病関連抗原に
特異性を有する抗体と特異的に結合する能力を有するペ
プチド、 ■　一般式（Ｉ）で示されるペプチドからなる抗ＡＴＬ
Ａ抗体の測定試薬、および ■　一般式（１）で示されるペプチドを担体上に固定化
してなる抗ＡＴＬＡ抗体の吸着剤を提供することによっ
て遠戚される。

本明細書においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述
する。

Ａｌａ：　　Ｌ−アラニン残基 Ａｒｇ：　　Ｌ−アルギニン残基 ９− Ａ５ｎ：　　Ｌ−アスパラギン残基 Ａｓｐ：　　Ｌ−アスパラギン酸残基 Ｃｙｓ：　　Ｌ−システィン残基 Ｇｌｎ：　　Ｌ−グルタ電ン残基 Ｇｌｕ：、　　Ｌ−グルタ呆ン酸残基 Ｇｌｙ：　　グリシン残基 Ｈｉｓ：　　Ｌ−ヒスチジン残基 １１ｅ：　　Ｌ−インロイシン残基 Ｌｅｕ：　　Ｌ−ロイシン残基 Ｌｙｓ：　　Ｌ−リシン残基 Ｎｅｔ：　　Ｌ−メチオニン残基 Ｐｈｅ：　　Ｌ−フェニルアラニン残基Ｐｒｏ：　　Ｌ
−プロリン残基 Ｓｅｒ：　　Ｌ−セリン残基 Ｔｈｒ：　　Ｌ−）レオニン残基 Ｔｒｐ：　　Ｌ−）リプトファン残基 Ｔｙｒ：　　Ｌ−チロシン残基 Ｖａｌ：　　Ｌ−バリン残基 また本明細書においては、常法に従ってアミノ酸配列を
Ｎ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ１０− 末端のアミノ酸残基が右側に位置するように記述する。

一般式（１）においてＡが表すペプチド断片としては、
ＡＴＬＶの遺伝子にコードされる抗原ポリペプチドから
選択された６〜５０個のアミノ酸が結合してなるペプチ
ド断片が好ましく、なかでも、ｔａｘ遺伝子にコードさ
れる式 ％式％ で示されるペプチド断片、およびｅｎｖ遺伝子によりコ
ードされる式 ％式％ および式 −Ｐｈｅ−Ｌｅｕ　−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ　−Ｐｒ
ｏ−３ｅｒ−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒ。

−Ｔｈｒ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ　−Ｌｅ
ｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−＾５ｐ
−Ｈｉｓ−１１ｅ− で示されるペプチド断片が特に好ましい。５個以下のア
ミノ酸が結合してなるペプチド断片は１１− 抗ＡＴＬＡ抗体に対して特異的な抗原性を示さない。

また、所望の抗ＡＴＬＡ抗体に対する特異的な抗原性を
有する５１個以上のアミノ酸が結合してなるペプチド断
片を合成することは難しい。

一般式（Ｉ）においてＸが表すペプチド断片としては、
式−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−で示されるペプチド断片、式−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−で示されるペプチド断片などが
好ましい。一般式（Ｉ）においてＸが１１個以上のＬｙ
ｓがペプチド結合してなるペプチド断片であるペプチド
は、所望の抗ＡＴＬＡ抗体に対する特異的な抗原性を有
しない場合がある。また、一般式（Ｉ）においてＸがＬ
ｙｓ以外のアミノ酸残基を含むペプチド断片であるペプ
チドは、抗ＡＴＬ＾抗体と特異的に結合する能力を有し
ない場合があり、また担体上に効率よくコーティングま
たは固定化されない場合がある。

一般式（Ｉ）で示されるペプチドの合成は、ペプチドの
合成において通常用いられる方法、例えば、固相合成法
または段階的伸長法、フラグメント縮合法のような液相
合成法により行われるが、１２− 固相合成法により行うのが二・！、作土簡便である［例
えば、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケくカル・
ソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）、　　第
８５巻、　第２１４９〜２１５４頁（１９６３年）；　
日本生化学全編「生化学実験講座１タンパク質の化学■
　化学修飾とベプチ１τ合成」（昭和５２年１１月１５
日　株式会社東京化学同人発行）、第２０７〜４９５頁
；−日本生花学会トｌ″（［続生化学実験講座２　タン
パク質の化学（下）ｊ　（昭和６２年５月２０日　株式
会社東京化学同人発行）、第６４１〜６９４頁など参照
］。

一般式（Ｉ）で示されるペプチドの固相合成法による製
造は、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体な
どの反応溶媒に不溶性である重合体に目的とするペプチ
ドのＣ末端に対応するアミノ酸またはそのアミドをそれ
らが有するα−ＧＯＯＨ基またはα−ＣＯＮＨ２基から
それぞれ水素原子を除いて得られるα−ＣＯ〇−基また
はα−〇〇ＮＨ−基を介して結合させ、次いで該アよノ
酸またはそのアミドに目的とするペプチドのＮ末端の方
向に向って、対１３− 応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸または
ペプチド断片が有するα−Ｃｏｏ）ｌ基以外のα−アく
ノ基などの官能基を保護したうえで縮合させて結合させ
る操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片にお
けるα−ア主ノ基などのペプチド結合を形成するア多ノ
基が有する保護基を除去する操作を順次繰返すことによ
って、ペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対
応するペプチド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を重合
体から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基
を除去することにより目的とするペプチドを得、次いで
これを精製することによって実施される。

ここで、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の
除去は、フッ化水素を用いて同時に行うのが副反応を抑
制する観点から好ましい。また、得られたペプチドの精
製は逆相液体クロマトグラフィーで行うのが効果的であ
る。

一般式（１）で示されるペプチドは特異的に抗ＡＴＬＡ
抗体を結合する能力を有するので、ＡＴＬＶ感染により
出現する抗ＡＴＬＡ抗体の検出のための測定試１４− 薬として有効である。

一般式（Ｉ）で示されるペプチドを利用した抗ＡＴＬＡ
抗体の測定は、蛍光免疫測定法、受身血球凝集法、放射
免疫測定法、酵素免疫測定法のいずれかを利用すること
によって行われる。これらの方法はいずれも公知である
が、例えば酵素免疫測定法を利用する場合について以下
に説明する。

測定系全体の構成要素は担体、測定試薬としての一般式
（１）で示されるペプチド、ブロッキング剤、被検試料
、標識用抗体、酵素および基質からなる。担体に一般式
（Ｉ）で示されるペプチドをコーティングし、次いでペ
プチドコーティング担体にブロッキング剤を作用させて
担体上の非特異的な蛋白結合部位をブロックし、ペプチ
ドコーティング担体に被検試料を加えてインキュベート
し、続いて酵素標識抗体を接触させてインキュベートし
、次にこのように処理した担体に基質を加えてインキュ
ベートし、基質の分解量を吸光度計を用いて測定する。

なお、コーティングに用いられる一般式（１）で示され
るペプチドは１種類で１５− も２種類以上でもよい。担体としてはエンザイムイムノ
゛アッセイ用カップ、またはガラスもしくは樹ｎ製のビ
ーズを用いるのが好ましい。測定に先立ち、一般式（Ｉ
）で示されるペプチドを０．０１Ｍ炭酸緩衝液に溶解し
、その溶液を例えばポリスチレン製エンザイムイムノア
ッセイ用カップに加えたのち、４℃で一夜または室温で
３時間静置することにより、担体表面は一般式（Ｉ）で
示されるペプチドによってコートされる。担体上の非特
異的な蛋白結合部位をブロックするためのブロッキング
剤としては例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、脱脂
粉乳、標識用抗体である抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒト
ＩｇＭ抗体を得るための免疫原動物の血清、ゼラチンな
どが用いられる。標識用抗体としては例えば、抗ヒトＩ
ｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体などが用いられる。また酵
素としては例えば、アルカリフォスファターゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ベータガラクト
シダーゼなどが挙げられる。測定に先立ち、ゲルタール
アルデヒドなどの２個以上の官能基を有する化合物を用
１６− いて、標識用抗体に酵素を結合せしめてコンジュゲート
とし、測定系全体の構成要素の一部として予め準備して
おくことが好ましい。基質は選択した酵素に応じて適宜
使用すればよい。例えば、酵素としてペルオキシダーゼ
を選択した場合には０−フ二二レンジアミンなどを使用
することが好ましい。

また、一般式（１）で示されるペプチドは、担体に固定
化されて抗ＡＴＬ＾抗体の吸着剤として使用される。な
お、固定化に用いられる一般式（Ｉ）で示されるペプチ
ドは１種類でも２種類以上でもよい。

一般式（Ｉ）で示されるペプチドを固定化する際に使用
する担体としては、親水性の表面を有し、かつペプチド
との間で共有結合を形成させるために利用しうるアミノ
基、カルボキシル基、水酸基などの反応性の官能基を有
するものが好ましい。

また一般式（Ｉ）で示されるペプチドをＡＴＬＶが関与
する疾病患者の体液中の抗＾ＴＬＡ抗体を吸着させるた
めの吸着剤として使用する場合には、上記の１７− 担体はさらに体液に不溶性であるものが好ましい。

担体は球状、粒状、膜状、中空糸状、糸状などの任意の
形状であることができる。球状、粒状などの粒子状の担
体は、膜状、中空糸状、糸状の担体と比較して、同一容
積のカラムに満たした場合に。

吸着すべき対象である抗ＡＴＬ＾抗体と接触する面積が
大きくなり、抗ＡＴＬ＾抗体を吸着できる効率が良好で
あるなどの点から好ましい。担体が粒子状である場合、
その粒子径が５０〜２０００μｍの範囲にあるものがよ
り好ましい結果を与える。粒子径が５０μｍより小さい
楊・台には、粒子と粒子の間隔が小さく、体液中の細胞
が詰まり易くなり、また２０００μｍより大きい場合に
は、細胞は詰まりにくいが、抗ＡＴＬＡ抗体と接触する
面積は小となり、いずれの場合も好ましくない。かかる
担体としては、例えば、ＣＭセルロファインＣＬ（生化
学工業株式会社販売）などのセルロース系担体；　ＴＳ
Ｋ−ｇｅｌ　ＣＭ−）ヨパール６５０Ｇ　（東ソー株式
会社製）などのポリビニルアルコール系担体；　セファ
ロース４Ｂ、　　ＣＩ’ｌセファロースＣＬ−６Ｂ　［
スウェーデン国ファルマシアーＬＫＢ１８− （Ｐｈａｒｉ＋ａｃｉａ−ＬＫＢ）社製コなどのアガロ
ース系担体などの有機質担体、およびＣＰＧ、−１０−
１０００ｍ米国エレクトロ一二ュークレオニクス（Ｅｌ
ｅｃｔｒｏ−ｎｕｅｌｅｏｎｉｃｓ）社製コなどの多孔
性ガラスなどの無機質担体が挙げられる。

一般式（１）で示されるペプチドの担体上への固定化は
、一般にペプチドまたはタンパク質を担体上に固定化す
る場合に採用される方法に従って行われる。その固、走
化方法としては例えば、担体が有するカルボキシル基を
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イ多ドと反応させることによっ
てスクシンイミドオキシカルボニル基に変換し、これに
一般式（Ｉ）で示されるペプチドをアミノ基の部分で反
応させる方法（活性エステル法）、担体が有するアミノ
基またはカルボキシル基に１．ジシクロへキシルカルボ
シイくドなどの縮合試薬の存在下で一般式（Ｉ）で示さ
れるペプチドをカルボキシル基またはアミノ基の部分で
縮合反応させる方法（縮合法）、担体と一般式（１）で
示されるペプチドとをグルタルアルデヒドなどの２個以
上の官能基１９− を有する化合物を用いて架橋する方法（担体架橋法）な
どが挙げられる。一般式（１）で示されるペプチドを活
性エステル法で担体上に固定化して得られる吸着剤が最
も高い抗ＡＴＬＡ抗体の吸着能を有する。一般式（Ｉ）
で示されるペプチドの担体上への固定化量は、得られる
吸着剤が抗ＡＴＬＡ抗体の有意量を吸着しうるためには
通常的ｌＸｌ０−’モル／ｇ（担体）以上が必要であり
、担体上に固定化された一般式（１）で示されるペプチ
ドが抗ＡＴＬＡ抗体の吸着に有効に利用されるためには
約ｌＸｌ０−’〜５Ｘ　１０−’モル／ｇ（担体）の範
囲内であるのが好ましい。

抗ＡＴＬＡ抗体の除去は、一般式（Ｉ）で示されるペプ
チドを担体に固定化して得られる吸着剤を抗Ａ、ＴＬＡ
抗体を含有する血液、リンパ液、を髄液などの体液と接
触させて、吸着剤に抗ＡＴＬ＾抗体を吸着させることに
よって行われる。吸着剤は、例えば、カラムに充填して
使用する。この目的で使用するカラムは、血液回路と容
易に接続し得る形状の入口部と出口部を有し、かつ入口
部と吸着剤層の間２０− および出口部と吸着剤層の間にそれぞれポリエステルな
どの材質のフィルターを備えていることが望ましい。カ
ラムの材質としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリカーボネート、ポリエステル、ポリメチルメタクリ
レートなどが例示される。

これらのうち、ポリプロピレンおよびポリカーボネート
が、オートクレーブ滅菌、γ−線滅菌などの滅菌に付す
ることかできる点において特に好適に使用される。

上記の吸着剤が充填されたカラムを使用することによる
患者の体液からの抗ＡＴＬＡ抗体の除去は例えば、患者
の血管から取り出した血液または血漿を吸着剤が充填さ
れたカラムに送り、そこで血液または血漿から抗ＡＴＬ
＾抗体を吸着により除去し、次いでカラムを通過した血
液または血漿を患者の血管に循環する体外血液′Ｍａ環
系で行われる。

［実施例］ 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されるものではない。

２１一 実施例エ 一般式（Ｉ）におけるＸが−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式
Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ　
−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ａｓｐ　−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌ　ｎ　−ＩＩｓ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
４ｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ｖａｉ　−ｅｕ−ＯＮ で示されるペプチドをペプチド自動合成装置［米国アプ
ライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）社製、モデル４３０Ａ　（Ｍｏｄｅｌ　４
３０Ａ）　］を用いて固相合成法により合成した。

すなわち、４−　［Ｎ”　（’ｔ−ブトキシカルボニル
）−り一ロイシルフェニルアセトメチル基（ＣＨ３）　
２ Ｃ）Ｉ を０．６５ミリモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチレ
ン−ジビニルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベ
ンゼンの構成モル比：９９対１コからなる粒状樹脂［米
国アプライド・バイオシステムズ社２２− 製、ＰＡＮロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、ｔ−Ｂｏｃ−
Ｌ４ｅｕ］を１５４ｍ　ｇ用い、これに第１表に示す一
連の操作に従って目的とするペプチドのＮ末端の方向に
向って対応するＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ
−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ
−イソロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリ
ン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンを順次
結合させた。縮合反応において、上記のアミノ酸はそれ
ぞれＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アラニン無
水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル＞　−０−ベンジ
ル−Ｌ−アスパラギン酸無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカ
ルボニル）−Ｌ−グルタミン−（１−ベンゾトリアゾリ
ル）エステル、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−〇−
ベンジルーし一グルタミン散無水物、Ｎα−（ｔ−ブト
キシカルボニル）−Ｎｌ−ジニトロフェニル−Ｌ−ヒス
チジン−（１−ベンゾトリアゾリル）エステル、Ｎ−（
ｔ−ブトキシカルボニル）　−Ｌ−イソロイシン無水物
、ＮｃＬ−（ｔ−））　キシカルミニ−）Ｌｔ）　−Ｎ
’　−２−’７　口Ｏヘンシルオキシカルボニル−Ｌ−
リシン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−
プロリン無水物、Ｎ−２３− （１−ブトキシカルボニル）−〇−ベンジルーＬ−セリ
ン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−〇−ベン
ジルーＬ−）レオニン無水物、Ｎα−（ｔ−ブトキシカ
ルボニル）−〇−ブロモベンジルオキシカルボニル−し
−チロシン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）　
−Ｌ−バリン無水物として用い、それらの使用量は基質
に対して約１０倍モル量とした。縮合反応は室温下で行
った。反応時間は縮合させるアミノ酸の種類によって異
なるが１０〜２０分間の範囲内であった。

全てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち、得
られた樹脂をグラスフィルター上でジエチルエーテル、
ジクロロメタンおよびメタノールを用いて順次洗浄し、
次いで真空乾燥することによって０．２５ｇの乾燥樹脂
を得た。ガラス製のフラスコ中で乾燥樹脂０．２５ｇを
チオフェノール２ｍｌおよびＮ、　　Ｎ−ジメチルホル
ムア主ド４８ｍ１と混合し、室温で３０分間スターラー
により攪拌した。上滑を除去し、再び同じ操作を３回繰
り返した。残液をジクロロメタンとメタノールで洗浄し
たのち、減圧下に乾燥し、０．２ｇの樹脂を得た。ポリ
トリフ２４− ルオロモノクロロエチレン製の反応容器（株式会社ペプ
チド研究所製、ＨＦ−反応装置Ｉ型）中で、得られた乾
燥樹脂０．２ｇをアニソール０．３ｍ　ｌおよびエチル
メチルスルフィド０．０５ｍ　ｌと混合し、この混合物
に一２０℃の温度でフン化水素１０ｍ１を加え、同温度
で３０分間、次いで０℃の温度で３０分間攪拌した。得
られた反応混合物からフッ化水素。

アニソールおよびエチルメチルスルフィドを減圧下に除
去し、残留物をグラスフィルター上でジエチルエーテル
を用いて充分洗浄した。得られたその残留物を２規定の
酢酸水溶液で抽出し、抽出液を凍結乾燥することにより
ペプチドの粗製物を１２０ｍ　ｇ得た。得られた粗製物
を分取用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：　
オクタデシル化シリカゲル（粒径：１５μｍ）充填カラ
ム（内径：５０ｍｍ、長さ：　　３００ｍ　ｒｎ　）、
０不つォーターズ社製、μＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ　　
１５μ　Ｃ１８４００人；　移動相ニトリフルオロ′＃
酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水との混
合溶媒（アセトニトリルの濃度は１８分間で２４容量％
から３０容量％になるように２５− 漸次変化させた）］で精製することによって、目的とす
るペプチドの精製物を５０ｍ　ｇ得た。得られた精製物
を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：　
オクタデシル化シリカゲル（粒径：５μｍ）充填カラム
（内径：４ｍｍ、長さ：１５０ｍ　ｍ　）　、　　東ソ
ー株式会社製、ＴＳＫ−ｇｅｌ　　ＯＤＳ−８０ＴＭ；
移動相：　トリフルオロＢｆ、酸を０．０５容量％含有
するアセトニトリルと水との混合溶媒（アセトニトリル
の濃度は３０分間で５容量％から５０容量％になるよう
に漸次変化させた）；　流速：１ｍｌ／分；検出法：　
波長２１０ｎｍにおける吸光度］に付したところ、１８
．０分に単一の鋭いピークが示された。

高速原子衝撃法（以下、これをＦＡＢ法と略称する）マ
ススペクトルにより求められた精製物の分子量は３５２
７であった（理論（＋１！：　　３５２６．８８）。

以下余白 ２６− 第１表 基の除去 ２洗浄 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド ０ ４洗浄 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド ０ ６洗浄 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド ０ ２７− 実施例２ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、−数式（１）におけるＸが
−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−である式Ｈ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅｔ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ　−Ｓｅｒ　−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌ　ｎ　−１１ｅ−ｒｏ−ＯＲ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、１８．２分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチドの分
子量は２３６３であった（理論値：　２３６２．５６）
。

実施例３ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、−数式％式％ る式 Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌａｕ−ＯＨ２８− で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、１９．３分に単一の鋭いピークが示された。

ＰＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチドの分
子量は２２３９であった（理論値：　２２３８．７２）
。

実施例４ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、−数式（Ｉ）におけるＸが
−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−である式Ｈ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ｈｊｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ
−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ　−Ａｌａ　−１
１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ　−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｇ
ｉｎ　−＾１ａ−Ｏｆｌ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、１９．８分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチドの分
子量は３８１４であった（理論値：　３８１３．４０）
。

２９一 実施例５ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、−数式（Ｉ）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式）１−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ
−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｓｎ−
Ａｌａ−＾５ｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、１８．２分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチドの分
子量は３５１２であった（理論値：　３５１２．０３）
。

実施例６ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よびｖ製を行うことにより、−数式（Ｉ）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式 ％式％ ５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、１６．５分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチドの分
子量は２９３３であった（理論値：　２９３２．４８）
。

実施例７ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（Ｉ）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｃｙｓ
−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ
−Ｖａｌ　−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ
　−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−ＯＨ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、２１．５分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求め３１− られたペプチドの分子量は３３５９であった（理論値：
　３３５８．７７）。

実施例８ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（Ｉ）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ａｒｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　
−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−３ｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅ
ｒ　−Ａｓｐ　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−０■で示され
るペプチドを得た。得られたペプチドを分析用逆相高速
液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付したところ
、１６．８分に単一の鋭いピークが示された。ＦＡＢ法
マススペクトルにより求められたペプチドの分子量は３
３５５であった（理論値：　３３５４．７８）。

実施例９ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（１）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ
−Ｐｒｏ−３ｅｔ−３２− Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−３ｅ
ｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−１１ｅ−ＯＲで
示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用逆
相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付した
ところ、２０．３分に単一の鋭いピークが示された。Ｆ
ＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチドの分子
量は３２６１であった（理論値：　３２６１．７４）。

実施例１０ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（Ｉ）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式Ｈ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
　−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ　−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ　
−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓ　ｐ
−Ｐｒｏ　−Ｇｌ　ｎ　−１１ｅ−Ｇｌｎ−ＯＨ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、２１．３分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求め３３− られたペプチドの分子量は３９４４であった（理論値：
　３９４４．６０）。

実施例１１ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（１）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式）１−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｌｅ
ｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−５ｅ
ｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−３ｅｒ　−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ａｒ
ｚ　−Ａｒｚ−Ａｌａ　−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−
１ａ−ＯＨ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、１９．８分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチドの分
子量は３４２６であった（理論値：　３４２６．０４）
。

実施例１２ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（Ｉ）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式３４− Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
−Ａｓｐ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｎ　−Ａｌａ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ　
−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌ　
ａ−Ｇｌｎ　−Ａｓｎ　−Ａｒｚ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＯＨで示され
るペプチドを得た。得られたペプチドを分析用逆相高速
液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付したところ
、１９．４分に単一の鋭いピークが示された。ＦＡＢ法
マススペクトルにより求められたペプチドの分子量は４
２６ｏであった（理論値：　　４２６１．４１）。

実施例１３ 実施例１におｌすると同様な方法でペプチドの固相合成
および精製を行うことにより、−数式％式％ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と一３５＝ 同じ）に付したところ、２０．３分に単一の鋭いピーク
が示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求められた
ペプチドの分子量は３７１４であった（理論値：　３７
１４．２７）。

実施例１４ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よびｌｉＦ製を行うことにより、−数式（１）における
Ｘが−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式Ｈ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃ
ｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｚ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ　−Ａ
ｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ　−Ａｒｚ　−
Ｖａｌ　−Ａｒｚ　−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ
−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
−３ｅｒ　−３ｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、　　１７．１分に単一の鋭いピークが示され
た。ＦＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチド
の分子量は３９８６であった（理論値、　３９８５．７
８）。

実施例１５ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固３６− 和合成および精製を行うことにより、−数式（Ｉ）にお
けるＸが−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌａｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌｙ
−Ｌｅｕ　−０）１ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、２１．６分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求められた精製物の分子
量は２４６４であった。　（理論値：　２４６３．７８
）。

実施例１６ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よびＮ製を行うことにより、−数式（１）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式Ｈ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ−Ｈｉｓ　−１１ｅ−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ　−Ｓｅｒ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−３
ｅｒ　−Ｌｙｓ−ＯＨ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と３７− 向じ）に付したところ、１７．６分に単一の鋭いピーク
が示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求められた
精製物の分子量は２５８１であった。　（理論価：　２
５８１．００）。

実施例１７ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、−数式（Ｉ）におけるＸが
−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−である式Ｈ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｚ−Ａｒｚ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌ　ｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、１９．８分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求められた精製物の分子
量は２７２０であった。　（理論値：　２７２０．１２
）。

実施例１８ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、−数式（Ｉ）におけるＸが
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−である式 ％式％ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付し
たところ、１８．０分に単一の鋭いピークが示された。

ＦＡＢ法マススペクトルにより求められた精製物の分子
量は２９７７であった。　（理論値：　２９７６．４６
）。

参考例１ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（１）においてＸを
欠くペプチドに相当する式Ｈ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−３ｅｒ−３ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−
Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　−Ａｓｐ　−５ｅｒ−Ａｓｐ
−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＯＨで示されるペ
プチドを得た。得られたペプチドを分析用逆相高速液体
クロマトグラフィー（前記と３９− 同じ）に付したところ、１９．３分に単一の鋭いピーク
が示された。　　ＦＡＢ法マススペクトルにより求めら
れたペプチドの分子量は３２７１であった（理論値：　
３２７０．５４）。

参考例２ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（１）においてＸを
欠くペプチドに相当する式Ｈ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＡｓｐＨ１ｓ−１
１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−１１ｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−ＯＢで示される
ペプチドを得た。得られたペプチドを分析用逆相高速液
体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付したところ、
１９．４分に単一の鋭いピークが示された。ＦＡＢ法マ
ススペクトルにより求められた精製物の分子量は２２８
９であった。　（理論値：　２２８９．００）。

参考例３ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（Ｉ）においてＸを
欠くペプチドに相当する式４Ｏ− Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ａｒｚ
−Ａｒｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−ＯＨで示されるペプチドを得た。得られたペプチ
ドを分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同
じ）に付したところ、２３．３分に単一の鋭いピークが
示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求められたペ
プチドの分子量は２２０８であった（理論値：　２２０
７．４４）。

参考例４ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、一般式（Ｉ）においてＸを
欠くペプチドに相当する式Ｈ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｈｉ　５−５ｅｒ−Ａｓ
ｎ　−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−１１ｅ−ＯＨで示され
るペプチドを得た。得られたペプチドを分析用逆相高速
液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付したところ
、１５．６分に単一の鋭いピークが示された。ＦＡＢ法
マススペクトルにより求められたペプチドの分子量は２
８２４であった（理論値４１− ：　　２ｇ２３．７４）。

実施例１９ 東喪舊１ ＡＴＬＶキャリアー血清　： 正常ヒト血清 ２０検体 １０検体 各血清検体について、下記の酵素免疫測定法により吸光
度を測定し、抗ＡＴＬＡ抗体の有無を検定した。

すなわち、実施例１で得られたペプチドまたは参考例工
で得られたペプチドをそれぞれ０．０１Ｍ炭酸緩衝液（
ｐＨ９，５）に溶解し、得られたペプチド溶液をポリス
チレン製エンザイムイムノアッセイ用カップ（ダイナチ
ック社製）に各１００μｍづつ加えたのち、３７℃で３
時間静置することにより、ペプチドによるコーティング
を行った。次いで、そｈら（１）力ｙプを０．０５容量
％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸１衝生理食塩
水（以下、これをＰＢＳと略称する）で４回洗浄した。

続いて、それらのカップに２０容量％のヤギ血清を含む
ＰＢＳ１５０μｍを加え−４２＝ て室温で３時間静置し、非特異的な蛋白結合部位をブロ
ックした。次いで、それらのカップを０．ｏ５容量％の
Ｔ％Ｊｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。

血清希釈用溶液として１０容量％の正常ヤギ血清を含む
ＰＢＳを上記の各アッセイ用カップに１００μｍづつ加
えたのち、各被検血清（ＡＴＬＶキャリアー血清２０検
１体および正常ヒト血清１０検体）を血清希釈用溶液と
被検血清の割合が８対１（容量比）となるように加えた
。３７℃で１時間インキュベーション後、それらのカッ
プを０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４
回洗浄した。

得られた各アッセイ用カップに、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体
−ペルオキシダーゼコンジュゲート（１０容量％の正常
ヤギ血清を含むＰＢＳで至適濃度に希釈したもの）１０
０μｌを加えた。３７℃で３０分間インキュベーション
後、それらのカップを０．０５容量％のＴｖｅｅｎ２０
を含むＰＢＳで４回洗浄した。続いて、得られた各アッ
セイ用カップに基質（０−フェニレンシアミンを０．３
重量％となるように０．０２容量％の過酸化水素を含む
０．１Ｍクエン酸−リン酸１ｍｇ１ｉ４３− 液ｐＨ５，６に溶解したもの）１００μｍを加えた。室
温で１５分間静置したのち、ＩＮ硫酸１００μｌを加え
て反応を停止し、反応液の４９２ｎ　ｍの吸光度０Ｄａ
９２値を測定した。

鉱玉 測定結果を第２ａ表および第２ｂ表に示す。第２ａ表は
実施例１で得られたペプチドを用いた場合の測定結果を
示し、第２ｂ表は参考例１で得られたペプチドを用いた
場合の測定結果を示す。第２ａ表および第２ｂ表におけ
るそれぞれの０Ｄａ９２値の分布を第１ａ図１よび第１
ｂ図に示す。なお、これらの図において、・ＡＴＬＶキ
ャリアー血渭が与えた０Ｄ４９２（［Ｉ！を・記号で示
し、正常ヒト血清が与えたＯＤ４＠２（ｌＩＩをＯ記号
で示す。正常ヒト血清１０検体のＯＤｊ＊２値よりカッ
トオフ値を設定し、抗ＡＴＬＡ抗体陽性・陰性の判定を
行った。カットオフ値は、（（正常ヒト血清の０ＤＪ９
２（１１！の平均値）＋２ＳＩ））の計算式により求め
た。このカットオフ値により、各血清検体の抗ＡＴＬＡ
抗体の有無の検定を行った場合、ＡＴＬＶキャリアー血
清はいずれも陽性と判定さ４４− れ、正常ヒト血清はいずれも陰性と判定された。

また第２ａ表、第２ｂ表、第１ａ図および第１ｂ図より
、検体が正常ヒト血清である場合、反応液の４９２ｎ　
ｍの吸光度は、実施例１で得られたペプチドを用いた場
合が、参考例１で得られたペプチドを用いた場合よりも
平均して低いことが判明した。このことは、実施例１で
得られたペプチドをコーティングした担体を用いた場合
には、抗ＡＴＬＡ抗体とは無関係な血清中のヒトＩｇＧ
抗体なとを非特異的に吸着するためにおこる反応が生じ
ないことを意味している。

以下余白 ５− 第２ａ表 ４６− 第２ｂ表 −４７− 実施例２０ 史腹且１ ＡＴＬＶキャリアー血清　：　　５検体正常ヒト血清　
　　　：　　２検体 る ＡＴＬＶキャリアーで実施例１９において陽性と判定さ
れた１０検体から任意に選択した５検体と、正常ヒト血
清で実施例１９において陰性と判定された１０検体から
任意に選択した２検体について、下記の酵素免疫測定法
により吸光度を測定し、抗ＡＴＬＡ抗体の有無を判定で
きるペプチドによる至適コーテイング量を検定した。

すなわち、実施例１で得られたペプチドまたは参考例１
で得られたペプチドをそれぞれ０．０１Ｍ炭酸緩衝液（
ＰＨ９，５）で０〜３２０μｇ　／　ｍ　１の濃度に希
釈し、得られたペプチド溶液をポリスチレン製エンザイ
ムイムノアッセイ用カップ（前記と同じ）に各１００μ
ｍづつ加えたのち、４℃で一夜静置することにより、ペ
プチドによるコーティングを行った。次いで、それらの
カップを０．０５容量％４８− Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、Ｔｗｅｅｎ
２０を含まないＰＢＳで１回洗浄した。続いて、それら
のカップに２０容量％のヤギ血清を含むＰＢＳ１５０μ
ｌを加えて室温で３時間静置し、非特異的な蛋白結合部
位をブロックした。次いで、それらのカップを０．０５
容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳで１回洗浄した。

血清希釈用溶液として１０容量％の正常ヤギ血清を含む
ＰＢＳを上記の各アッセイ用カップに１００μｌづつ加
えたのち、各被検血清（＾ＴＬＶキャリアー血清５検体
および正常ヒト血清２検体；　以下、これらを血清Ｎｏ
、１〜Ｎｏ、７と略称することがある）を血清希釈用溶
液と被検血清の割合が８対１（容量比）となるように加
えた。３７℃で１時間インキュベーション後、それらの
カップを０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
で３回洗浄後、Ｔｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳで１回
洗浄した９ 得られた各アッセイ用カップに、ヤギ抗ヒトＩ［Ｇ抗体
−ペルオキシダーゼコンジュゲート（１０容量％の正常
ヤギ血清を含むＰＢＳで至適濃度に希４９− 釈したもの）１００μｌを加えた。３７℃で３０分間イ
ンキュベーション後、それらのカップを０．０５容量％
のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含まないＰＢＳで１回洗浄した。続いて、得ら
れた各アッセイ用カップに基質（０−フェニレンジアミ
ンを０．３重量％となるように０．０２容量％の過酸化
水素を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液ＰＨ５，８
に溶解したもの）１００μｌを加えた。室温で２０分間
静置したのち、２Ｎ硫酸１００μｌを加えて反応を停止
し、反応液の４９２ｎ　ｍの吸光度ＯＤａ　ｅ　２値を
測定した。

紋型 血清Ｎｏ、１〜Ｎｏ、７についての測定結果を第２ａ図
、第２ｂ図、第２ｃ図、第２ｄ図、第２ｅ図、第２ｆ図
および第２ｇ図に示す。これらの図はペプチドによるコ
ーテイング量に対する各血清検体が与えるＯＤａ＊２値
の変化を示している。なお、これらの図において、実施
例１で得られたペプチドを用いた場合の各血清検体が与
えた０Ｄａｅ２値の変化を・記号で示し、参考例１で得
られたペプチドを用いた場合の各血清検体が与えた０Ｄ
Ｊ９２値の変化を５０− Ｏ記号で示す。実施例１９で陽性と判定された５検体（
血清Ｎｏ、１〜Ｎｏ、５）についての実施例１で得られ
たペプチドを用いた酵素免疫測定法では、用いたペプチ
ド量が０．２ｎ　ｇ／ｗｅ　１１以上で陽性と判定でき
る０Ｄａｅ２４ｆｌを示し、ｌｎｇ／ｗｅｌｌで０Ｄ４
９２値が最大値に達した。同じ血清検体についての参考
例１で得られたペプチドを用いた酵素免疫測定法では、
陽性と判定するためにはｌｎｇ／ｗｅｌ１以上のペプチ
ドが必要であり、最大の０Ｄａｅ２値に達するためには
用いるペプチド量が１０Ｈｇ　／　ｗ　ｅ　ｌ　１以上
必要であった。また、実施例１９で陰性と判定された２
検体（血清Ｎｏ、６〜Ｎｏ、７）についてはどちらのペ
プチドを用いた場合にも、ペプチドによる任意のコーテ
イング量で陰性と判定される０ＤＡ１１２値を示した。

このことは、−数式（Ｉ）においてＡで示されるウィル
スの抗原ポリペプチド部分にＸで示されるペプチド断片
を付加することにより、該ポリペプチド断片を用いる酵
素免疫測定法の感度が１０倍以上上昇したことを示す。

５１− 実施例２１ 艷菓盈１ ＡＴＬＶキャリアー血清　： ＡＴＬＶ偽陽性血清 正常ヒト血清 ５検体 ５検体 ５検体 各血清検体について、下記の酵素免疫測定法により吸光
度を測定し、抗ＡＴＬ＾抗体の有無を検定した。

すなわち、実施例１で得られたペプチドを０．０１Ｍ炭
酸緩衝液（ｐ）１９．５）で希釈し、得られたペプチド
溶液をポリスチレン製エンザイムイムノアッセイ用カッ
プ（前記と同じ）に各１００μｌづつ加えたのち、室温
で３時間静置し、ペプチドによるコーティングを行った
。次いで、それらのカップ中のペプチド溶液を除去した
のち、２ｏ容量％のヤギ血清を含むＰＢＳ２００μｍを
加えて室温で３時間静置し、担体上の非特異的な蛋白結
合部位をブロックした。その後、得られたアッセイ用カ
ップの一部については直ちに酵素免疫測定に供した。ま
た５２− 他の一部についてはブロッキングに要したブロッキング
溶液を保持させた状態でシールし、４℃で保存した。ま
た、他の一部についてはブロッキングに要したブロッキ
ング溶液を除去し、室温で放置乾燥後、同様にシールし
、４℃で保存した。

酵素免疫測定を以下の方法に従って行った。ブロッキン
グ後直ちに測定に用いるアッセイ用カップ、またはブロ
ッキング溶液を保持させた状態で４℃で保存されていた
アッセイ用カップについては、ブロッキング溶液を除去
後、０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３
回洗浄後、Ｔｗｅｅｎ　２０を含まないＰＢＳで１回洗
浄し、以下の各被検血清との反応を開始させた。ブロッ
キング溶液を除去後乾燥させ、４℃で保存されていたア
ッセイ用カップについては、洗浄せずに直接以下の方法
に従って各被検血清との反応を開始した。

すなわち、血清希釈用溶液として１０容量％の正常ヤギ
血清を含むＰＢＳを各アッセイ用カップに１００μｍづ
つ加えたのち、各被検血清（ＡＴＬｖキャリアー血清５
検体、Ａ　Ｔ　Ｌ　Ｖ偽陽性血清５検体および正常ヒ５
３− ト血清５検体）を前者対後者の割合が２０対１（容量比
）となるように加えた。３７℃で１時間インキュベーシ
ョン後、それらのカップを０．０５容量％のＴｗｅｅｎ
２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、Ｔｗｅｅｎ２０を含ま
ないＰＢＳで１回洗浄した。得られた各アッセイ用カッ
プに、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体−ペルオキシダーゼコンジ
ュゲート（１０容量％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳで至
適濃度に希釈したもの）１００μｍを加えた。

３７℃で３０分間インキュベーション後、それらのカッ
プを０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３
回洗浄後、Ｔｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳで１回洗浄
した。続いて、得られた各アッセイ用カップに基質（０
−フェニレンシア主ンを０．３重量％となるように０．
０２容量％の通数化水素を含む０．１Ｍクエン蒙−リン
酸°緩衝液ＰＨ５，８に溶解したもの）１００μｍを加
えた。

室温で２０分間静置したのち、ＩＮ硫酸１００μｌを加
えて反応を停止し、反応液の４９２ｎ　ｍの吸光度０Ｄ
４９２値を測定した。

絋（ 測定結果の分布を第３ａ図、第３ｂ図および第５４− ３０図に示す。第３ａ図は実施例１で得られたペプチド
をコーテイング後、ブロッキング操作した直後のアッセ
イ用カップを用いた場合の測定結果の分布を示す。第３
ｂ図はペプチドをコーテイング後、ブロッキング剤を保
持させた状態で４℃で保存したアッセイ用カップを用い
た場合の測定結果の分布を示す。第３ｃ図はペプチドを
コーテイング後、ブロッキング剤を除去、乾燥後、４℃
で保存したアッセイ用カップを用いた場合の測定結果の
分布を示す。なお、これらの図においてＡＴＬＶキャリ
アー血清が与えた０Ｄａｓ２値を・記号で示し、ＡＴＬ
Ｖ偽陽性血清が与えたＯＤａ＊２（１を○記号で示し、
また正常ヒト血清が与えた０Ｄａｏ２値を×記号で示す
。正常ヒト血清５検体のＯＤａ　ｓ　２値よりカットオ
フ値を設定し、抗ＡＴＬＡ抗体陽性・陰性の判定を行っ
た。カットオフ値は、 （（正常ヒト血清のＯＤａ　ｏ　２僅の平均値）＋２Ｓ
Ｄ）の計算式により求めた。このカットオフ値により、
各血清検体の抗ＡＴＬＡ抗体の有無の検定を行った場合
、ＡＴＬＶキャリアー血清はいずれも陽性と判定さ５５
− れ、ＡＴＬＶ偽陽性血清および正常ヒト血清はいずれも
陰性と判定された。これらの測定結果より、本発明のペ
プチドを用いた酵素免疫測定法は、現在、抗ＡＴＬＡ抗
体の有無の確認試験で最知確実な方法として広く用いら
れている間接蛍光抗体法と１００％の相関があることが
判明した。

実施例２２ Ｌ４藍１ ＡＴＬＶキャリアー血清　：２０検体 正常ヒト血清　　　　：１０検体 各血清検体について、下記の酵素免疫測定法により吸光
度を測定し、抗ＡＴＬ＾抗体の有無を検定した。

すなわち、実施例１５で得られたペプチドまたは実施例
１６で得られたペプチドをそれぞれ０．０１Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ９，５）で希釈し、得られたペプチド溶液をポ
リスチレン製エンザイムイムノアッセイ用カップ（前記
と同じ）に各１００μｍづつ加えたのち、４℃で一夜静
置し、ペプチドによるコ５６− −テイングを行った。次いで、それらのカップを０．０
５％容量のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した
。

続いて、それらのカップに２０容量％のヤギ血清を含む
ＰＢＳ２００μｌを加え、室温で３時間静置し、担体上
の非特異的な蛋白結合部位をブロックした。

次いで、それらのカッ・プを０．０５容量％のＴｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。その後、実施例１
９におけると同様の操作を行ったのち、上記の各血清検
体が与える０Ｄａｏ２値を測定した。

絋（ 測定結果を第３ａ表および第３ｂ表に示す。第３ａ表は
実施例１５で得られたペプチドを用いた場合の測定結果
を示し、第３ｂ表は実施例１６で得られたペプチドを用
いた場合の測定結果を示す。

第３ａ表および第３ｂ表におけるそれぞれの０Ｄａ９２
値の分布を第４ａ図および第４ｂ図に示す。

なお、これらの図において、ＡＴＬＶキャリアー血清が
与えた０Ｄ４９２値を・記号で示し、正常ヒト血清が与
えたＯＤＪ　ｓ　２値をＯ記号で示す。正常ヒト血清１
０検体の０Ｄ４９２（１！よりカットオフ値を設定し、
＝５７− 抗ＡＴＬ＾抗体陽性・陰性の判定を行った。カットオフ
値は、 （（正常ヒト血清のＯＤａ　ｅ　２値ノ平均値）＋２３
Ｄ）の計算式により求めた。このカットオフ値により、
各血清検体の抗ＡＴＬ＾抗体の有無の検定を行った場合
、ＡＴＬＶキャリアー血清はいずれも陽性と判定され、
正常ヒト血清はいずれも陰性と判定された。

また第３ａ表、第３ｂ表、第４ａ図および第４ｂ図より
、本発明の実施例１５で得られたペプチドまたは実施例
１６で得られたペプチドを用いた抗ＡＴＬＡ抗体の酵素
免疫測定法では、非特異反応を抑えることができ、高感
度で陽性、陰性の判定が可能であることが判明した。

以下余白 ５８− ＭＢａ表 −５９− 第３ｂ表 ＝６０一 実施例２３ 艷旌盈圭 ＡＴＬＶキャリアー血清　： 正常ヒト血清　　　　。

２２検体 ２検体 に　　　る 各血清検体について、下記の酵素免疫測定法により吸光
度を測定し、抗ＡＴＬＡ抗体の有無を検定した。

すなわち、実施例１で得られたペプチドまたは実施例１
５で得られたペプチドを０．ＯＩＭ炭酸ｖｉ衝液（ｐＨ
９，５）に溶解し、それぞれ単独のペプチド溶液を調製
した。さらに２つのペプチド溶液を前者対後者の割合が
１対１０（２１度比）になるように混合したペプチド溶
液を１１Ｉ製した。得られたペプチド溶液をポリスチレ
ン製エンザイムイムノアッセイ用カップ（前記と同じ）
に各１００μｌづつ加え、４℃で一夜静置することによ
り、ペプチドによるコーティングを行った。次いで、そ
れらのカップ中のペプチド溶液を除去したのち、各アッ
セイ用カップに２０％のヤギ血清を含むＰＢＳを２００
μｍ６１− づつ加えて室温で３時間静置することにより非特異的な
蛋白結合部位をブロックした。次いで、それらのカップ
を０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回
洗浄したのち、Ｔｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳで１回
洗浄した。

血清希釈用溶液として１０容量％の正常ヤギ血清および
０．０５％のＴｗａｅｎ２０を含むＰＢＳを用い、血清
希釈用溶液と各被検血清（ＡＴＬＶキャリアー血清２２
検体および正常ヒト血清２検体）の割合が２０対１（容
量比）となるように混合したのち、得られた希釈血清を
上記のアッセイ用カップに各１００μｌづつ加えた。３
７℃で１時間インキュベーション後、それらのカップを
０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗
浄したのち、Ｔｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳで１回洗
浄した。

得られた各アッセイ用カップに、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体
−ペルオキシダーゼコンジュゲート（１０容量％の正常
ヤギ血清および０．２容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで至適濃度に希釈したもの）１００μｍを加えた。

３７℃で３０分間インキュベーション後、それ６２− らのカップを０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで３回洗浄したのち、Ｔｗｅｅｎ２０を含まないＰ
ＢＳで１回洗浄した。続いて、得られた各アッセイ用カ
ップに基質（０−フェニレンシア冨ンを０．３重量％と
なるように０．０２容量％の過酸化水素を含む０．１Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５，８に溶解したもの）１
００μｍを加えた。室温で１５分間静置したのち、２Ｎ
硫酸１００μｍを加えて反応を停止し、反応液の４９２
ｎｍの吸光度００４　ｅ　２値を測定した。

測定結果を第４表に示す。正常ヒト血清２検体のＯＤ４
　ｅ　２値よりカットオフ値を設定し、抗ＡＴＬＡ抗体
陽性・陰性の判定を行った。カットオフ値は、（（正常
ヒト血清の０Ｄ４９２値の平均値）＋２ＳＤ）の計算式
により求めた。このカットオフ値により、各血清検体の
抗ＡＴＬＡ抗体の有無の検定を行った揚台、ＡＴＬＶキ
ャリアー血清はいずれも陽性と判定された。また第４表
より、低い抗ＡＴＬＡ抗体価を示す血清検体について酵
素免疫測定法により吸光度を測定し、該抗ＡＴＬＡ抗体
の有無を検定する際には、６３− 実施例工で得られたペプチドと実施例１５で得られたペ
プチドとの混合物を用いる場合がそれぞれのペプチドを
単独で用いる場合より−も吸光度を上げることができる
こと、これにより偽陰性の判定を排除することができる
ことが判明した。

以下余白 ６４− ６５− □０“ 実施例２４ Ｌ隻薮杢 ＡＴＬＶキャリアー血清　： 正常ヒト血清　　　　・ １５検体 １５検体 よる 各血清検体について、下記の１＃幸免疫測定法により吸
光度を測定し、抗＾ＴＬＡ抗体の有無を検定した。

すなわち、実施例１で得られたペプチドまたは実施例９
で得られたペプチドをＯ，０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，
５）に溶解し、それぞれ単独のペプチド溶液を調製した
。さらに２つのペプチド溶液を前者対後者の割合が１対
１（濃度比）になるように混合したペプチド溶液を調製
した。得られたペプチド溶液をポリスチレン製エンザイ
ムイムノアッセイ用カップ（前記と同じ）に各１００μ
ｌづつ加え、４℃で一夜静置することにより、ペプチド
によるコーティングを行った。次いで、それらのカップ
中のペプチド溶液を除去したのち、各アッセイ用カップ
に２０％のヤギ血清を含むＰＢＳを２００μｍづつ加６
６− えて室温で３時間静置することにより非特異的な蛋白結
合部位をブロックした。次いで、それらのカップ中のブ
ロッキング用溶液を除去したのち、乾燥させ、４°Ｃで
保存した。

血清希釈用溶液として１０容量％の正常ヤギ血清および
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用い、血清
希釈用溶液と各被検血清の割合が２０対１（容量比）と
なるように混合したのち、得られた希釈血清を上記のア
ッセイ用カップに各１００μｍづつ加えた。

３７℃で１時間インキュベーション後、それらのカップ
を０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回
洗浄したのち、Ｔψｅｅｎ２０を含まないＰＢＳで１回
洗浄した。

得られた各アッセイ用カップに、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体
−ペルオキシダーゼコンジュゲート（１０容量％の正常
ヤギ血清および０．２％のＴｗｅｅｎ２’Ｏを含むＰＢ
Ｓで至適濃度に希釈したもの）１００μｍを加えた。

３７℃で３０分間インキュベーション後、それらのカッ
プを０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３
回洗浄したのち、丁ｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳで１
回洗浄した。

続いて、得られた各アッセイ用カップに基質（ｏ−６フ
ー フェニレンジアミンを０．３重量％となるように０．０
２容量％の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リす酸緩
衝液ｐｉ（５，６に溶解したもの）１００μｍを加えた
。室温で１５分間静置したのち、２Ｎ硫酸１００μｌを
加えて反応を停止し、反応液の４９２ｎ　ｍの吸光度０
Ｄ４ｓ２値を測定した。

緩速 測定結果を第５表に示す。正常ヒト血清１５検体の０Ｄ
４９２（ｌ！よりカットオフ値を設定し、抗ＡＴＬＡ抗
体陽性・陰性の判定を行った。カットオフ値は、（（正
常ヒト血清の０１１＋９２（Ｌ［の平均値）＋２３Ｄ）
の計算式により求めた。このカットオフ値により、各血
清検体の抗ＡＴＬＡ抗体の有無の検定を行った場合、Ａ
ＴＬＶキャリアー血清はいずれも陽性と判定され、正常
ヒト血清はいずれも陰性と判定された。

また第５表より、実施例１で得られたペプチドまたは実
施例９で得られたペプチドの一方のペプチドを用いて酵
素免疫測定を行った場合には陰性と判定される検体が、
他方のペプチドに対しては陽性の反応を示している場合
においても、これら２６８− 種類のペプチドの混合物を用いて酵素免疫測定を行えば
、該検体が陽性であることが高感度で判定できることが
判明した。

以下余白 ６９− ７０ 実施例２５ シアン化ブロマイドによって活性化し、かつ０．１Ｍ　
）リス緩衝液（ｐ）１７．４）によって緩衝化されたア
ガロース粒子（ファルマシア社製、セファロース４Ｂ）
　１０ｍ　ｌに実施例１で得られたペプチド１００ｍ　
ｇを加え、４℃で一夜攪拌しながら反応させることによ
って、実施例１で得られたペプチドが固相化された吸着
剤を約１０ｍ１得た。

実施例２６ シアン化ブロマイドによって活性化し、かつ０．１Ｍ　
）リス緩衝液（ＰＨ７，４）によって緩衝化されたアガ
ロース粒子（前記と同じ）　１０ｍ　ｌに実施例１５で
得られたペプチドＬｏｏｍ　ｇを加え、４℃で一夜攪拌
しながら反応させることによって、実施例１５で得られ
たペプチドが固定化された吸着剤を約１０ｍ１得た。

実施例２７ シアン化ブロマイドによって活性化し、かつ０．１Ｍ　
）リス緩衝液（ｐＨ７，４）によってｌＩｌ賃化された
アガロース粒子（前記と同じ）　１０ｍ　ｌに実施例７
１− １６で得られたペプチド１００ｍｇを加え、４℃で一夜
攪拌しながら反応させることによって、実施例１６で得
られたペプチドが固定化された吸着剤を約１０ｍ　ｌ得
た。

実施例２８ 無水ジオキサン（市販のジオキサンを金属ナトリウムの
存在下で蒸留したもの）　５０ｍ　ｌ中にセルロース粒
子（生化学工業株式会社販売、ＣＭセルロファインＣＬ
）　１０ｇを懸濁させ、得られた懸濁液にＮ−ヒドロキ
シコハク酸イ主ド０．５ｇおよびジシクロへキシルカル
ボシイミド１．０ｇを加え、混合物を室温で一夜振盪攪
拌した。得られた粒子を、実施例１で得られたペプチド
２０ｍ　ｇを含有する０、０２Ｍのリン酸塩ｍ漬液（ｐ
Ｈ７，４）　２０ｍ　ｌと混合し、この混合物を４℃で
一夜攪拌した。得られた混合物を吸引濾過した。濾液を
分析用逆相高速クロマトグラフィー（前記と同じ）に付
したが、残存する未反応のペプチドは認められなかった
（担体上のペプチドの固定化率：　約１００％）。この
ようにして実施例１で得られたペプチド２０ｍ　ｇが固
定化７２− された吸着剤を約１０ｇ得た。

実施例２９〜３９ 実施例４〜１４でそれぞれ得られたペプチド２０ｍｇを
用いて実施例２８におけると同様の方法により、これら
のペプチドの２０ｍ　ｇが固定化された吸着剤をそれぞ
れ約Ｌｏｇ得た（担体上のそれぞれのペプチドの固定化
率：　約１００％）。

実施例４０ 実施例２８においてセルロース粒子１０ｇの代わりにポ
リビニルアルコール粒子（東ソー株式会社製、ＴＳＫ−
ｇｅｌ　ＣＭ−トヨパール６５０Ｃ）　１０ｇを用いる
以外は同様の方法により、実施例１で得られたペプチド
２０ｍ　ｇが固定化されたポリビニルアルコール粒子を
約Ｌｏｇ得た（担体上のペプチドの固定化率：　約９３
％）。

実施例４１〜５１ 実施例４〜１４でそれぞれ得られたペプチド２０ｍｇを
用いて実施例４０におけると同様の方法により、これら
のペプチド２０ｍｇが固定化された吸着剤をそれぞれ約
ｌｏｇ得た。得られた吸着剤にお３− ける担体上へのペプチドのそれぞれの固定化率の結果を
第６表に示した。

第６表 １ ３ １ ４ ０ ７４− 実施例５２ 多孔性ガラス粒子（米国エレクトロー二ュータレオニク
ス社製、ＣＰＧ−１０−１０００）　Ｌｏｇ　’ｋ、　
γ−アミノプロピルトリエトキシシランを５ｍｌ含有す
るトルエン溶′ｔｉ１００ｍｌ中で２４時間加熱還流下
に反応させた。得られた混合物を無水ジオキサンで洗浄
し、吸引濾過した。得られた粒子を無水ジオキサン１０
０ｍ　ｌ中に懸濁させ、得られた懸濁液に無ホコハク酸
３ｇを加え、混合物を室温で一夜攪拌した。

得られた混合物を無水ジオキサンで洗浄し、吸引濾過し
た。得られた粒子を無水ジオキサン５０ｍ　ｌ中に懸濁
させ、得られた懸濁液にＮ−ヒドロキシコハク酸イくド
０．５ｇおよびジシクロへキシルカルボジイミド１．０
ｇを加え、混合物を室温で一夜攪拌した。得られた混合
物を０．０２Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）で洗浄
し、吸引濾過した。得られた粒子を、実施例１で得られ
たペプチド２０ｍ　ｇを含有する０、０２Ｍのリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）　２０ｍ　ｌと混合し、この混合物
を４℃の温度で一夜攪拌した。

得られた混合物を吸引濾過し、実施例１で得られ７５− たペプチド２０ｍｇが固定化された吸着剤を約１０ｇ得
た（担体上のペプチドの固定化率：　約１００％）６実
施例５３ 実施例１５で得られたペプチド２０ｍ　ｇを用いて実施
例５２のおけると同様の方法により、このペプチド２０
ｍ　ｇが固定化された吸着剤を約１０ｇ得た（担体上の
ペプチドの固定化率：　約１００％）。

試験例１ 実施例２５で得られた吸着剤をカラム（アξコン社製、
１０ｍ　ｍφｘ　１５０ｍ　ｍ　）に充填し、　アフィ
ニティクロマトグラフィ用のカラムを作製した。

このカラムを０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ
トリス緩衝液（ｐｔ（８，５）　オヨび０．５Ｍ　）　
！Ｊ　ス１ｍｍ液で順次洗浄したのち、０．１Ｍ　）リ
ス緩衝液で平衡化した。抗ＡＴＬＡ抗体陽性血清１０ｍ
１を、０．１Ｍ）リス緩衝液で一夜透析したのち、平衡
化されたカラムに流した。０．１Ｍ　）リス緩衝液で洗
浄したのち、セファロース４Ｂ上に固定化されたペプチ
ドと結合している抗ＡＴＬＡ抗体を０．５Ｍ　）リス緩
衝液で溶出させた。実施例２１におけると同様の方法に
７６− より各両分について抗ＡＴＬＡ抗体の有無を検定した。

血清中の抗ＡＴＬＡ抗体の約１００％が溶出画分から検
出され、素通り画分の抗ＡＴＬＡ抗体は検出限界以下で
あった。

試験例２ 実施例２６で得られた吸着剤を試験例１におけると同様
の方法によりカラム（前記と同じ）に充填し、アフィニ
ティクロマトグラフィ用のカラムを作製した。このカラ
ムに０．１Ｍ　）リス緩衝液で一夜透析した抗ＡＴＬＡ
抗体陽性血清１０ｍ　ｌを流して、血清中の抗ＡＴＬＡ
抗体を回収し、実施例２１におけると同様の方法により
各画分について抗ＡＴＬＡ抗体の有無を検定した。血清
中の抗ＡＴＬＡ抗体の約１００％が溶出画分から検出さ
れ、素通り画分の抗ＡＴＬＡ抗体は検出限界以下であっ
た。

試験例３ 実施例２７で得られた吸着剤を試験例１におけると同様
の方法によりカラム（前記と同じ）に充填し、アフイニ
デイクロマトグラフイ用のカラムを作製した。このカラ
ムに０．１Ｍ　トリス緩衝液で−７７〜 一夜透析した抗ＡＴＬＡ抗体陽性血清１０ｍ１を流して
、血清中の抗ＡＴＬＡ抗体を回収し、実施例２１におけ
ると同様の方法により各面分について抗ＡＴＬＡ抗体の
有無を検定した。血清中の抗ＡＴＬＡ抗体の約１００％
が溶出画分から検出され、素通り画分の抗ＡＴＬＡ抗体
は検出限界以下であった。

試験例４ 抗ＡＴＬＡ抗体陽性血清１０ｍ１を０．１５Ｍの塩化ナ
トリウムを含む０．０１Ｍリン酸１１を側波（ｐＨ７，
２）で４°Ｃで一夜透析した。この血清１ｍｌに実施例
２８で得られた吸着剤１ｍｌを加え、３７℃で１時ｇ振
盪したのち、上記のリン酸緩衝液３０ｍ１で洗浄した。

透析後の血清中の抗ＡＴＬＡ抗体量と洗浄液中の抗ＡＴ
ＬＡ抗体量を実施例２１におけると同様の方法でそれぞ
れの０Ｄｊ９２値を測定することによって求め、それに
よって吸着剤に吸着した抗ＡＴＬＡ抗体の割合を求めた
。その結果、血清中の抗ＡＴＬＡ抗体の約１００％が吸
着剤に吸着されていた。

試験例５〜９ 実施例２９〜３３で得られた吸着剤を用いて試８− 験例４におけると口様な方法により血清中の抗ＡＴＬＡ
抗体の吸着実験を行った。透析後の血清中の抗ＡＴＬＡ
抗体量と洗浄液中の抗ＡＴＬＡ抗体量を実施例２１にお
けると同様の方法でそれぞれの０Ｄａｏ２値を測定する
ことによって求め、それによって吸着剤に吸着した抗Ａ
ＴＬＡ抗体の割合を求めた。その結果、血清中の抗ＡＴ
ＬＡ抗体の約１００％が吸着剤に吸着されていた。

試験例１０ 抗ＡＴＬＡ抗体陽性血清１０ｍ　ｌを試験例４における
と同様にして透析し、実施例４０で得られた吸着剤を加
え、血清中の抗ＡＴＬＡ抗体の吸着試験を行った。その
結果、血清中の抗ＡＴＬＡ抗体の約１００％が吸着剤に
吸着されていた。

試験例１１ 抗ＡＴＬＡ抗体陽性血清１０ｍ１を試験例４におけると
同様にして透析し、実施例３８で得られた吸着剤を加え
、血清中の抗ＡＴＬＡ抗体の吸着試験を行った。その結
果、血清中の抗ＡＴＬＡ抗体の約１００％が吸着剤に吸
着されていた。

＝７９− ［発明の効果コ 本発明によれば、抗ＡＴＬＡ抗体と特異的に結合する能
力を有する一般式（Ｉ）で示されるペプチドが提供され
る。該−数式（１）で示されるペプチドにより抗ＡＴＬ
Ａ抗体測定試薬および抗ＡＴＬＡ抗体を有効に吸着する
能力を有する吸着剤を提供することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図および第１ｂ図は実施例１で得られたペプチド
または参考例１で得られたペプチドを用いてそれぞれ実
施例１９に記載された方法により測定した各血清検体が
与えた０Ｄ４９２（＋１！の分布図である。第１ａ図お
よび第１ｂ図において各記号は次のことを示す。 ・：　　ＡＴＬＶキャリアー血清が与えた０Ｄ４ｓ２値
Ｏ：　正常ヒト血清が与えた０Ｄａｅ２４１１第２ａ図
、第２ｂ図、第２ｃ図、第２ｄ図、第２ｅ図、第２ｆ図
および第２ｇ図は実施例１で得られたペプチドまたは参
考例１で得られたペプチドを用いてそれぞれ実施例２０
に記載された方法８０− により、各血清検体が与えたペプチドのコーテイング量
に対するＯＤＪ　９　ｅ値の変化を測定した結果を示す
。　第２ａ図、　第２　ｂ図、　第２　ｃ図、　第２ｄ
図、第２ｅ図、第２ｆ図および第２ｇ図において各記号
は次のことを示す。 −・−：　実施例１で得られたペプチドを用いた場合の
各血清検体が与えた ０Ｄｊｏ２僅の変化 一〇−：　　参考例１で得られたペプチドを用いた場合
の各血清検体が与えた ０Ｄａｓ２値の変化 第３ａ図、第３ｂ図および第３ｃ図は実施例１で得られ
たペプチドをコーティングした３種類のアッセイ用カッ
プを用いてそれぞれ実施例２工に記載された方法により
測定した、各血清検体が与えた０Ｄ４ｓ＋２値の分布図
である。第３ａ図、第３ｂ図および第３ｃ図において各
記号はそれぞれ次のことを示す。 ・　：　　　ＡＴＬＶキャリアー血清が与えた０Ｄａｅ
２値○　：　　　ＡＴＬＶ偽陽性血清が与えた０Ｄａｅ
２値８１− Ｘ　：　　正常ヒト血清が与えた０Ｄ４ｅ　２値第４ａ
図および第４ｂ図は実施例１５で得られたペプチドまた
は実施例１６で得られたペプチドを用いてそれぞれ実施
例２２に記載された方法により測定した、各血清検体が
与えたＯＤｔ＊２値の分布図である。第４ａ図および第
４ｂ図において各記号は次のことを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 Ｈ−Ｘ−Ａ−Ｙ ［式中、Ａは６〜５０個のアミノ酸が結合してなるペプ
   チド断片を表し、Ｘは１〜１０個のＬｙｓがペプチド結
   合してなるペプチド断片を表し、Ｙは水酸基またはアミ
   ノ基を表す］で示される、成人Ｔ細胞白血病関連抗原に
   特異性を有する抗体と特異的に結合する能力を有するペ
   プチド。 ２、Ａが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるペプチド断片である請求項１記載のペプチド
   。 ３、Ａが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるペプチド断片である請求項１記載のペプチド
   。 ４、Ａが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるペプチド断片である請求項１記載のペプチド
   。 ５、請求項１記載のペプチドからなる成人Ｔ細胞白血病
   関連抗原に特異性を有する抗体の測定試薬。 ６、請求項１記載のペプチドを担体上に固定化してなる
   成人Ｔ細胞白血病関連抗原に特異性を有する抗体の吸着
   剤。