JPH0720129A - 免疫学的凝集反応試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 高比重無機複合粒子等の不溶性担体にＣ型肝
炎ウイルス遺伝子由来の抗原タンパク及びカゼインを担
持してなるＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬及び該
試薬と、カゼイン及び緩衝液を含んでなる分散媒とから
構成されるＣ型肝炎診断用キット。さらには高比重無機
複合粒子等の不溶性担体に抗原または抗体とカゼイン、
正常ウサギ血清、或は牛血清アルブミン等のブロッキン
グ剤を担持してなる免疫学的凝集反応試薬と、該試薬に
担持されたブロッキング剤と同一の物質並びに緩衝液を
含んでなる分散媒とから構成される診断用キット。 【効果】 感作物質と非特異的凝集反応を起こす夾雑物
質、及びブロッキング剤と非特異的凝集反応を起こす夾
雑物質を吸収除去できる。その結果、非特異的凝集反応
を回避して且つ被検体中の測定目的物質の微量検出が可
能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は疾病の診断に用いられる
抗原−抗体反応を利用した免疫学的凝集反応試薬、特に
Ｃ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬、並びにこれらか
ら構成される診断用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原と抗体の特異的な反応を利用した免
疫学的測定方法は特異性が高く、測定感度が高いことか
ら臨床検査の分野で広く用いられている。

【０００３】臨床検査で用いられている免疫学的測定方
法には放射性物質を用いたラジオイムノアッセイ、酵素
標識抗体を用いた酵素免疫測定法、抗原抗体反応による
濁度の変化を利用した免疫比濁法、ラテックス粒子を利
用したラテックス凝集法、あるいは赤血球等に抗原ある
いは抗体を吸着し抗原抗体反応によりマイクロタイター
プレート上で管底凝集像を形成させるマイクロタイター
法等がある。これらのうち、ラテックス凝集法及びマイ
クロタイター法等の担体を用いた免疫学的凝集反応試薬
は簡便、迅速且つ正確に判定を行うことができるので臨
床検査で広く利用されている。該免疫学的凝集反応試薬
は担体粒子に固定化した抗原あるいは抗体（以下、担体
粒子上に固定化する抗原あるいは抗体を感作物質ともい
う）が、被検体に含まれる被測定抗体あるいは被測定抗
原（以下、検出しようとする抗原あるいは抗体を測定目
的物質ともいう）と抗原抗体反応をすることにより患者
の疾病の診断を行う診断薬である。

【０００４】免疫学的凝集試薬においては他の免疫診断
薬と同様に正確な早期診断を行うことが必須条件であ
る。すなわち、 １）抗原抗体反応によらない凝集反応（以下、非特異的
凝集反応ともいう）がないこと、 ２）被検体中の測定目的物質の微量検出が可能（以下、
高感度化ともいう）なこと、の２点を満足することが必
須である。

【０００５】免疫学的凝集反応試薬における非特異的凝
集反応の原因は以下のことが考えられる。すなわち、被
検体中の夾雑成分が担体粒子自体と抗原抗体反応によら
ない非特異的な結合をすることが一因である。このよう
な非特異的凝集反応は担体粒子上に感作物質を担持した
のちに該担体粒子上の間隙を免疫学的に不活性なブロッ
キング剤で担持する（以下、このような操作をブロッキ
ングともいう）ことにより低減できる。もう一つの非特
異的凝集反応の原因として、被検体中に測定目的物質以
外の夾雑物質が感作物質と非特異的な結合を起こすこと
が考えれる。そこで該夾雑物質を吸収除去する物質（以
下、吸収剤ともいう）を検体の希釈液として用いられる
分散媒中に添加することで非特異的凝集反応を低減する
ことができる。ブロッキング剤と分散媒中に添加する吸
収剤の検討が免疫学的凝集反応試薬の非特異的凝集反応
の防止の要因であると言える。

【０００６】非特異的凝集反応を回避できる免疫学的凝
集反応試薬を調製するための公知の手法として、感作物
質を担持した担体粒子（以下、感作物質を担持した担体
粒子を感作粒子ともいう）を牛血清アルブミン（以下、
ＢＳＡとも略記する）でブロッキングし、分散媒に吸収
剤として正常ウサギ血清を用いることが有効と考えら
れ、実際に使用されているが、未だ非特異的凝集反応の
回避の点で十分ではなかった。

【０００７】他方、免疫学的凝集反応試薬では疾病の早
期発見が重要であり、そのためには微量な測定目的物質
を検出できること、すなわち、高感度化が必要不可欠で
ある。例えばウイルス感染症のような疾病では感染初期
に測定目的物質の量が少なく、感染初期に診断を行うに
は高感度であることが重要である。免疫学的凝集反応試
薬を高感度化する方法として、できるだけ多くの感作物
質を担体粒子に担持させることが唯一の方法である。し
かしながら、感作物質を過剰に担体粒子に担持させると
感度が向上する一方、感作物質同士が相互的結合を起こ
して該感作物質のうち測定目的物質との抗原抗体反応に
有効な領域（以下、活性部位ともいう）が潰れて測定目
的物質の測定ができなくなるといった現象が生じる。従
って、免疫学的凝集反応試薬の調製するために不溶性担
体に担持できる感作物質の量には上限があり、ある一定
量以上の感作物質を担持して高感度化を図ることは不可
能であり、未だ高感度化の具体的方法は見い出されてい
ない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】非特異的凝集反応を防
止するために、ブロッキング剤や分散媒に添加する吸収
剤として多種多様な物質が検討されてきたが、未だ適切
なブロッキング剤、吸収剤は見い出されていない。さら
に高感度化を行う具体的な方法を検討してきたが、未だ
適切な方法は見い出されていない。そこで非特異的凝集
反応の少ない且つ測定目的物の微量検出の可能な免疫学
的凝集反応試薬並びに該試薬から構成される診断用キッ
トを調製するために適切な方法の開発が望まれていた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記技術課
題を解決すべく鋭意研究を行ってきた。その結果、ブロ
ッキング剤と分散媒に添加する吸収剤を同一の物質とす
ることで、更に又、抗原としてＣ型肝炎ウイルス遺伝子
由来の抗原タンパクを用いる場合にはブロッキング剤と
してカゼインを使用すれば、１）非特異的凝集反応の防
止、２）測定目標物質の微量検出可能という２つの要件
を満足する免疫学的凝集反応試薬並びに診断用キットと
なることを見い出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】即ち、本発明は、不溶性担体にＣ型肝炎ウ
イルス遺伝子由来の抗原タンパク及びカゼインを担持し
てなるＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬である。

【００１１】他の発明は、上記Ｃ型肝炎診断用免疫学的
凝集反応試薬と、カゼイン及び緩衝液を含んでなる分散
媒とから構成されるＣ型肝炎診断用キットである。さら
に他の発明は、不溶性担体に抗原または抗体とブロッキ
ング剤を担持してなる免疫学的凝集反応試薬と、該免疫
学的凝集反応試薬に担持されたブロッキング剤と同一の
物質並びに緩衝液を含んでなる分散媒とから構成される
診断用キットである。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】本発明における不溶性担体粒子としては公
知の免疫学的凝集反応法の診断試薬に用いることができ
る担体が制限なく使用できる。例えば、核部となる無機
質化合物に染料を被覆させた高比重複合粒子（特開昭６
２ー１１５３６６参照、以下、ＨＤＰとも略記する）、
羊赤血球、ポリスチレン粒子、ゼラチン粒子等が挙げら
れる。中でもＨＤＰ及び赤血球は抗原あるいは抗体の吸
着量が多く好適に用いられる。特に人工担体であるとこ
ろのＨＤＰは表面官能基を人工的に付加することがで
き、抗原あるいは抗体の種類に応じて表面状態を変化さ
せることができるので免疫学的凝集反応試薬の担体粒子
としてはさらに好適に用いることができる。

【００１４】また、不溶性担体の粒子径も、免疫学的凝
集反応法診断試薬として用いうる公知の範囲から特に制
限されなく採用されるが、担体粒子重量当りの比表面積
が上げることにより感作物質の吸着量を向上させること
ができるので、通常、粒子径０．０１μｍから３μｍま
でのものが好適に用いられる。

【００１５】不溶性担体の比重は１．０以上であればよ
いが、特に沈降反応を利用したマイクロタイター試薬用
担体粒子は比重が大きい程、沈降速度が速く判定時間が
短縮化できるので１．５以上のものが好適に用いられ
る。

【００１６】本発明で用いる抗原とは、被検体中の抗体
に対して抗原活性を有して抗原抗体反応による結合する
ものならば特に限定されない。例えば、ポリペプチド、
多糖類、脂質等である。中でもポリペプチドが該抗原と
しては好適に用いられる。該ポリペプチドの鎖長は抗体
が抗原抗体反応で認識できる長さであればよく、一般に
抗原抗体反応で抗体が抗原部位として認識できるとされ
ている３アミノ酸残基以上であればよい。さらに該ポリ
ペプチドは不溶性担体粒子に担持するので吸着効率を考
慮して３０００アミノ酸残基以下が好適に用いられる。
該抗原としてＣ型肝炎ウイルス遺伝子由来の抗原タンパ
クを用いた場合、本発明の効果は顕著に現れる。

【００１７】本発明でいうＣ型肝炎ウイルス遺伝子由来
の抗原タンパク（以下、ＨＣＶ抗原とも略記する）とは
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子によりコードされるタンパクの
ことである。該Ｃ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶとも略
記する）遺伝子とは特開平４−１４４６８６及び特開平
４ー１７９４８２に記載されている塩基配列を有する全
長約１０ｋｂ（約１万ヌクレオチド）のＲＮＡである。
ＨＣＶはＲＮＡウイルスであるが、ＨＣＶ由来のＲＮＡ
より逆転写酵素により作り出されたｃＤＮＡも該Ｃ型肝
炎ウイルス遺伝子に該当する。

【００１８】該Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子は、輸血後非Ａ
非Ｂ肝炎患者の血清からウイルス遺伝子を分離して作製
したｃＤＮＡライブラリーから得ることが出来る。例え
ば、まず患者血清から超遠心によりＣ型肝炎ウイルスを
分離し、次いでウイルスから遺伝子ＲＮＡを調製し、該
ＲＮＡに対して逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成
し、しかるのちに該ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクター
あるいはファージベクターに挿入して、ｃＤＮＡライブ
ラリーを調製する。次いで、該ｃＤＮＡライブラリー
を、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎患者の血清（抗ＨＣＶ抗体を含
有する血清）を用いイムノスクリーニングすることによ
り、目的の遺伝子を得ることが出来る。また公知のＨＣ
Ｖ遺伝子の塩基配列をもとにＤＮＡプローブを合成し
て、ｃＤＮＡライブラリーをＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダ
イゼーションによりスクリーニングしてもよい。また別
の方法としては Proceedings of the Japan Academy, V
ol.65, Ser.B, No.9, pp.219〜223(1989).に示される方
法、即ち逆転写酵素とＰＣＲ法とを組み合わせたＲＴ−
ＰＣＲ法により狙った領域を遺伝子増幅させて、その増
幅させた遺伝子断片をクローニングする方法も有効であ
る。

【００１９】該ＨＣＶ抗原は、通常知られている遺伝子
発現系、即ち、大腸菌のホスト・ベクター系、枯草菌の
ホスト・ベクター系、酵母のホスト・ベクター系、昆虫
細胞あるいは昆虫のホスト・ベクター系、動物細胞のホ
スト・ベクター系等を利用して発現が可能である。この
うち、大腸菌は好適に利用出来る。大腸菌を用いて該抗
原タンパクを発現するには、まず大腸菌で発現可能なベ
クターにＨＣＶの遺伝子を挿入し組換えベクターを作製
する。ベクターは特に限定されず、大腸菌のベクターと
して通常用いられるベクターならば如何なるベクターで
も利用できるが、特に遺伝子発現が高頻度で起こるベク
ターは好適に利用される。例えば、一連のｐＵＣベクタ
ー（宝酒造(株)製品）、一連のｐＴＶベクター（宝酒造
(株)製品）、一連のｐＴＺベクター（東洋紡績(株)製
品）、一連のｐＥＴ（Methods in enzymology,Vol.185
に示される）などが利用できる。また、一連のｐＵＥＸ
ベクター（アマシャム・ジャパン(株)製品）、一連のｐ
ＥＸベクター（ベーリンガー・マンハイム山之内(株)製
品）を利用すれば、抗原タンパクをβ−ガラクトシダー
ゼとの融合ポリペプチドとして発現させることができ
る。大腸菌で発現可能なベクターには、通常は大腸菌内
で働く遺伝子発現のためのプロモーターや、それをコン
トロールするオペレーターが附属している。このような
ベクターのプロモーターの下流にある適当な制限酵素部
位を利用してＨＣＶ遺伝子を挿入することにより、組換
えベクターが作製される。このようにして作製される組
換えベクターの中でも、特にｐＵＥＸベクターを用いて
作製される組換えベクターは、遺伝子発現によって得ら
れるポリペプチドの収率がよく、精製が容易であること
などから好適に選択される。組換えベクターにより大腸
菌を形質転換し、該形質転換大腸菌を培養し挿入された
遺伝子を発現させることにより抗原タンパクが生産され
る。

【００２０】組換えベクターで遺伝子発現を行う場合
は、ポリペプチドのＮ末端あるいはＣ末端にランダムな
配列のアミノ酸が複数個付加する場合がある。しかしな
がら、このようなＮ末端、あるいはＣ末端に付加された
複数個のアミノ酸はランダムなアミノ酸であるから、抗
原抗体反応には無関係であり、抗原抗体反応を用いた測
定には影響はない。

【００２１】該ＨＣＶ抗原は、上記形質転換大腸菌を培
養し得られた菌体を超音波処理などの方法で破砕し、こ
の菌体破砕物より公知の方法により分離される。該ＨＣ
Ｖ抗原の精製方法は公知の方法ならばいずれでもよく塩
析、イオン交換樹脂吸着、ゲル濾過等々である。好まし
くは上記方法の組合せが有効である。また、精製された
該ＨＣＶ抗原はどのような溶液に分散されていてもよい
が、好ましくは０．８７％塩化ナトリウム水溶液（以
下、生理食塩水とも略記する）あるいは０．８７％塩化
ナトリウム含有、２０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．２（以
下、ＰＢＳとも略記する）に分散されていることが望ま
しい。試薬感度は不溶性担体の単位表面積当りに担持さ
れる該ＨＣＶ抗原のエピトープ数に依存するため、不溶
性担体の単位表面積当りに担持される該ＨＣＶ抗原のエ
ピトープ数を増加させるために精製純度は高いほど望ま
しい。

【００２２】該ＨＣＶ抗原は抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体
（以下、抗ＨＣＶ抗体とも略記する）に対する免疫学的
反応性を有するポリペプチドである。すなわち、被検体
中の抗体に対するエピトープ部位を有し、抗原抗体反応
により患者血清及び血漿中の抗体と特異的に結合する特
性を有する。

【００２３】該ＨＣＶ抗原のポリペプチド鎖の長さは抗
ＨＣＶ抗体が抗原抗体反応で認識できる長さであればよ
く、一般に抗原抗体反応で抗体が抗原部位として認識で
きるとされている３アミノ酸残基以上であればよい。さ
らに該ＨＣＶ抗原は不溶性担体粒子に担持するので担体
粒子への吸着効率を考慮すると３０００アミノ酸残基以
下が好適に用いられる。

【００２４】本発明で用いる抗体とは、被検体中の抗原
と抗原抗体反応による結合能を有する免疫グロブリンで
ある。該抗体は抗原分子の１箇所の抗原認識部位を有す
るモノクローナル抗体でも抗血清より得られるポリクロ
ーナル抗体でも好適に用いることができる。多種類の抗
原認識部位を検知することができるので数種のモノクロ
ーナル抗体の混合液かポリクローナル抗体がさらに好適
に用いられる。

【００２５】本発明で用いるブロッキング剤とは、感作
粒子上の感作物質の間隙を覆う為に用いる免疫的に不活
性な物質のことを言う。感作粒子を該ブロッキング剤で
覆う目的は１）夾雑物質の影響の回避、２）感作物質同
士の相互吸着の防止の２点にある。 該ブロッキング剤
としては、免疫的に不活性な物質が採用され、例えば、
ＢＳＡ、カゼイン等のタンパク、グリシン、セリン、ア
ラニン等のアミノ酸また両親媒性物質である界面活性剤
等が挙げられる。

【００２６】感作物質としてＣ型肝炎ウイルス遺伝子由
来の抗原タンパクを用いる場合は該ブロッキング剤とし
てカゼインが極めて有効である。ブロッキング剤として
カゼインを用いた場合、感作物質同士の非特異的な結合
が防止でき、より多くの感作物質を不溶性担体に担持す
ることができる。したがって高感度化を可能とするほ
か、他のブロッキング剤を用いたときと比較して被検体
中の夾雑物質の影響による非特異的凝集反応を防止でき
る。ブロッキング剤としてカゼイン以外の、例えばＢＳ
Ａを用いた場合、不溶性担体のＨＣＶ抗原同士が相互吸
着を起こして健常者検体、Ｃ型肝炎患者検体ともに非特
異的凝集反応を起こしてしまう。またブロッキング剤と
して正常ウサギ血清を用いた場合は被検体中の夾雑物質
の影響を受けやすく健常者検体に於ける測定で非特異的
な感度上昇を生じてしまうため適当でない。

【００２７】本発明におけるカゼインは公知のものなら
ば特に限定なく用いられる。該カゼインとしては乳タン
パク質の主体をなすもので乳に酸を加えてｐＨ４．６に
する等電点沈澱することにより調製される酸性カゼイン
が好適に用いられる。該酸性カゼインは一般に電気泳動
的にα、β、γの３成分に分離できるがα、β、γのい
ずれでもよくまた２種類以上の混合物として用いること
も可能である。さらに加熱、加圧等の物理的分解、酸・
アルカリ等での化学的分解、タンパク質分解酵素での酵
素的分解により低分子化したものも同様に用いることが
できる。

【００２８】本発明でいう担持とは、不溶性担体に感作
物質としての抗原及び抗体、ブロッキングのためのブロ
ッキング剤等（以下、不溶性担体に担持する物質を吸着
物質ともいう）を吸着させることである。

【００２９】感作物質及びブロッキング剤を不溶性担体
粒子に担持する順序は特に制限なく以下の方法の何れか
が採用される。

【００３０】１）不溶性担体に感作物質を担持したのち
ブロッキング剤を担持する方法、２）不溶性担体にブロ
ッキング剤を担持したのちに感作物質を担持する方法、
３）不溶性担体に感作物質とブロッキング剤を同時に担
持する方法である。いずれの方法でも本発明の効果は十
分に発揮されるが、感作物質を優先的に担持するために
１）の不溶性担体に感作物質を担持したのちブロッキン
グ剤を担持する方法が好適に用いられる。

【００３１】上記１）の担持工程を概説すれば、感作物
質を溶解した緩衝溶液中に不溶性担体を分散、混合して
感作物質を不溶性担体に担持した後余剰の感作物質を遠
心洗浄で除去し、次いでブロッキング剤を同様にして担
持する方法が挙げられる。

【００３２】不溶性担体に感作物質を担持する方法とし
ては疎水吸着法等の物理的吸着法、塩化クロム法等の化
学的吸着法等の公知の方法が採用されが、感作物質は不
溶性担体に担持されたのち被検体中の測定目的物質と抗
原抗体反応により結合をするため該感作物質はできるだ
け穏やかな条件で担持することが必要であり、そのため
疎水的吸着法が特に好適に用いられる。

【００３３】上記疎水的吸着法による担持は、緩衝作用
のある緩衝液中に不溶性担体と吸着物質を分散させた状
態で行う。該緩衝液は燐酸緩衝液、グリシン緩衝液、ト
リス緩衝液、酢酸緩衝液等など緩衝作用のあるものなら
ば制限なく用いることができる。緩衝液のｐＨについて
は担持させる吸着物質によりそれぞれ最適な範囲を選択
して採用するが、一般に中性領域ｐＨ６．０〜ｐＨ８．
０が望ましい。不溶性担体に吸着物質を担持させる時間
は吸着物質が均一的に不溶性担体表面に担持されるのに
十分な時間であればよいが、例えば該ＨＣＶ抗原をＨＤ
Ｐの疎水吸着法で行う場合は３０分間以上で十分であ
る。さらに温度に関しても担持する吸着物質が熱変性を
受けない範囲即ち１℃以上８０℃以下が採用される。担
持する際のの不溶性担体の濃度は、通常 〜
とし、感作物質の濃度は通常 〜
とする。

【００３４】続いての不溶性担体へのブロッキング剤の
担持も上述の感作物質の担持と同様の方法を採用するこ
とができる。

【００３５】例えば、Ｃ型肝炎診断用免疫学的凝集反応
試薬においては、ＨＣＶ抗原を担持した不溶性担体（以
下、ＨＣＶ抗原感作担体ともいう）を遠心洗浄で余剰の
ＨＣＶ抗原を除去した後、該ＨＣＶ抗原感作担体をブロ
ッキング剤であるカゼインを０．１〜５（ｗ／ｖｏｌ）
％となるように中性付近のｐＨ６．０〜ｐＨ８．０で緩
衝作用のある緩衝液に溶解した溶液中に感作粒子濃度
０．０００１〜３０（ｗ／ｗ）％となるように分散して
ブロッキング剤の担持を行う。

【００３６】本発明の免疫学的凝集反応試薬とは、上記
したとおりの被検体（血清、血漿、尿、便等）中に存在
する抗原あるいは抗体を免疫学的凝集反応で検出するた
めに不溶性担体に感作物質及び免疫学的に不活性なブロ
ッキング剤を担持した診断用試薬である。

【００３７】該免疫学的凝集反応試薬は通常診断に利用
される凝集反応法が何ら制限なく適用される。例えば、
定性診断の平板法、半定量診断のマイクロタイター法及
び定量診断のラテックス凝集法、粒子数計測法等であ
る。そのうち、特にマイクロタイタ−法に適用する場
合、本発明の効果が特に顕著である。

【００３８】上記免疫学的凝集反応試薬は水性溶媒に懸
濁して使用されるが、長期に保存する場合はこれを凍結
乾燥することが好ましい。凍結乾燥方法は限定的ではな
く通常の方法で行えばよい。例えば感作赤血球の凍結乾
燥法に採用される方法及び条件が用いられる。好ましく
は上記該免疫学的凝集反応試薬を水性溶媒に懸濁状態で
バイアル瓶等に入れ、液体窒素等に浸漬して急速予備凍
結し次いで真空凍結乾燥する方法が採用される。

【００３９】真空凍結乾燥方法の条件は特に限定される
ものではないが、上記感作粒子の浮遊液の入ったバイア
ル等を急速予備凍結したのち、予め−４０〜−６０℃に
冷却した凍結乾燥機のチャンバ−内に置き２４〜７２時
間かけて徐々に昇温し真空凍結乾燥する方法が好適であ
る。この時のチャンバー内の圧力５０〜２００μｍＨ
ｇ、最終乾燥温度は２０〜５０℃が適当である。ついで
真空状態、または不活化ガスを充填して封栓して凍結乾
燥免疫学的凝集反応試薬（以下、凍結乾燥試薬ともい
う）とする。

【００４０】該凍結乾燥試薬は、吸収剤を含む緩衝液
（以下、粒子溶解液ともいう）に懸濁、分散した後測定
に供される。粒子溶解液中に懸濁、分散された凍結乾燥
試薬は凍結乾燥を施す前の免疫学的凝集反応試薬と何ら
変わりない性能を示す。なお、凍結乾燥を行わない場合
にも粒子溶解液に免疫学的凝集反応試薬を懸濁、分散し
て測定に供する。

【００４１】本発明の免疫学的凝集反応試薬を用いて実
際に被検体中の測定目的物質を検出するには、免疫学的
凝集反応試薬を分散させるための粒子溶解液の他に、被
検体を測定レンジ内の適当濃度まで希釈する検体希釈液
が必要である。該検体希釈液は粒子溶解液と同様に吸収
剤を含む緩衝液から構成される。これら粒子溶解液と検
体希釈液は、同様の組成物より構成されているので総称
して分散媒と呼ぶ。但し、粒子溶解液と検体希釈液の組
成の一部や組成濃度は場合によっては異なることもあ
る。

【００４２】本発明における分散媒とは、上述のように
免疫的凝集反応試薬を分散する粒子溶解液と被検体を測
定レンジ内に収めるために希釈する検体希釈液の２つを
併せて称するものである。

【００４３】該分散媒は吸収剤および緩衝液を主成分と
するものであるが、分散媒に含有されている吸収剤とし
て上記免疫学的凝集反応試薬のブロッキング剤として不
溶性担体に担持されている物質と同一のものを使用する
ことが必須である。

【００４４】免疫学的凝集反応試薬に担持されたブロッ
キング剤は、一般に感作物質同士の相互吸着の防止、被
検体中の夾雑物質の不溶性担体表面への吸着防止のため
に用いられるが、不溶性担体に担持した該ブロッキング
剤と被検体中の夾雑物質が非特異的吸着を起こすと新た
な非特異的凝集反応の原因となる。

【００４５】そこで分散媒のうち検体希釈液にブロッキ
ング剤と同一の物質を吸収剤として添加することによ
り、不溶性担体に担持した該ブロッキング剤と非特異的
吸着を起こす被検体中の夾雑物質を予め吸着除去する。
免疫学的凝集反応試薬に担持されているブロッキング剤
と異なる物質を検体希釈液の中に添加した場合、被検体
中に含まれる免疫学的凝集反応試薬担持されたブロッキ
ング剤と非特異的吸着を起こす夾雑物質は吸収除去され
ず、非特異的凝集反応を起こし易い。

【００４６】さらに、該分散媒のうち粒子溶解液中にも
同一の物質を添加することにより、不溶性担体に担持さ
れたブロッキング剤の脱離を防止することができる。仮
に、粒子溶解液中に不溶性担体に担持された該ブロッキ
ング剤と異なる物質を添加すると該不溶性担体に担持し
たブロッキング剤は交換反応で脱離してしまう可能性が
ある。このような不溶性担体のブロッキング剤の脱離は
被検体中の夾雑物質と不溶性担体表面とが非特異的結合
を起こして新たな非特異的凝集反応の原因となってしま
う。

【００４７】上記分散媒に用いる緩衝液は、公知の緩衝
液が特に限定されず用いられる。例えば、燐酸緩衝液、
トリス緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩
衝液等である。該緩衝液のｐＨは特に限定されないが、
不溶性担体自身が凝集を起こさないように中性から弱ア
ルカリ性域のｐＨ７〜ｐＨ１０が好適に用いられる。従
って中性から弱アルカリ性で緩衝作用のある燐酸緩衝
液、トリス緩衝液等が好適に用いられる。また、該緩衝
液の濃度も緩衝作用のある領域であれば任意のものを用
いることができ、５ｍＭ〜５００ｍＭが好適に用いられ
る。

【００４８】さらに該分散媒には塩が存在してもよい。
塩の種類、濃度については特に限定はされないが、抗原
抗体反応が好適に進行する条件、例えば、塩化ナトリウ
ム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等で濃度は１ｍ
Ｍから１Ｍ程度が好適に用いられる。また、腐敗を防止
するために０．１（ｗ／ｖｏｌ）％程度のアジ化ナトリ
ウム等を添加してもよい。

【００４９】調製された分散媒は１５℃以下の冷蔵保存
で通常２年間程度の保存が可能である。

【００５０】該分散媒の代表的な調製方法は、緩衝液に
免疫学的凝集反応試薬の調製に使用したブロッキング剤
と同一の物質を０．０００１〜３０（ｗ／ｖｏｌ）％と
なるように添加、溶解したのち、必要に応じて酸、また
はアルカリを加えて緩衝液のｐＨを微調整して分散媒と
する。さらに必要に応じて塩化ナトリウム、塩化マグネ
シウム、塩化カリウム等を添加、溶解する。

【００５１】該分散媒は粒子溶解液と検体希釈液とで同
一の組成でもよく、あるいは、緩衝液濃度、塩濃度、吸
収剤濃度が若干異なってもよいが、緩衝液及び吸収剤の
添加は必須である。粒子溶解液の場合には、他に管底凝
集像の安定化のために多糖類等を添加する場合がある。

【００５２】上記免疫学的凝集反応試薬と分散媒からな
る診断用キットをマイクロタイター試薬として使用する
ときは通常、マイクロタイタープレート上で反応を行
う。定性試験を行うときは、被検体を規定希釈倍率まで
検体希釈液で希釈したのち、粒子溶解液に懸濁した上記
免疫学的凝集反応試薬を滴下することによって測定を行
う。

【００５３】

【作用】不溶性担体に感作物質及びブロッキング剤を担
持させることで被検体中の夾雑物質の不溶性担体表面へ
の吸着防止が可能となる。しかしながら、不溶性担体に
担持した該ブロッキング剤と被検体中の夾雑物質が非特
異的吸着を起こすと新たな非特異的凝集反応が生じる可
能性がある。そこで分散媒のうち検体希釈液にブロッキ
ング剤と同一の物質を添加することにより、不溶性担体
に担持した該ブロッキング剤と非特異的吸着を起こす被
検体中の夾雑物質を吸着除去し、上記非特異的凝集反応
を防止する。さらに、該分散媒のうち粒子溶解液中にも
ブロッキング剤と同一の物質を添加することにより、不
溶性担体に担持されたブロッキング剤の脱離を防止する
ことができ、不溶性担体のブロッキング剤の脱離による
被検体中の夾雑物質と不溶性担体表面の非特異的結合に
よる新たな非特異的凝集反応をも阻止する。

【００５４】他方、不溶性担体に感作物質及びブロッキ
ング剤を担持することにより感作物質同士の相互的結合
を起こさず、過剰の感作物質を不溶性担体に担持でき
る。従って、感作物質同士の相互作用を防止でき、より
多くの活性部位を効率的に担体粒子表面に露出させるこ
とで高感度化が可能となるが、さらに、検体希釈液中に
上記ブロッキング剤と同一の物質を添加することにより
被検体に含まれる夾雑物質を予め吸着除去することで夾
雑物質と感作物質による非特異的凝集反応の防止ができ
るため、感作物質と測定目的物質との真の免疫学的凝集
反応のみが起こり、結局免疫学的凝集反応試薬の高感度
化が可能となる。

【００５５】

【発明の効果】不溶性担体に感作物質及びブロッキング
剤を担持し、さらに分散媒に上記ブロッキング剤と同一
の物質を用いることで、感作物質と非特異的凝集反応を
起こす夾雑物質、及びブロッキング剤と非特異的凝集反
応を起こす夾雑物質を共に吸収除去できた。その結果、
非特異的凝集反応を回避し且つ被検体中の測定目的物質
の微量検出、即ち高感度化を可能となった。

【００５６】特に抗原としてＣ型肝炎ウイルス遺伝子由
来の抗原タンパクを用いた時は、ブロッキング剤として
カゼインを用いた場合に非特異的凝集反応を回避して且
つ被検体中の測定目的物質の微量検出が可能な免疫学的
凝集反応試薬を調製することが可能となった。さらに分
散媒に上記カゼインを含有した場合に非特異的凝集反応
を回避し且つ被検体中の測定目的物質の微量検出、高感
度化を一層向上させることができた。

【００５７】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。ただし、これらの実施例により本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。

【００５８】参考例 Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子由来の抗
原タンパクの調製 Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子由来の抗原タンパクとしてはＣ
ｏｒｅ抗原、ＮＳ−３抗原、ＮＳ−４抗原、ＮＳ−５抗
原の４種類を用いた。以下のようにして４種類の抗原タ
ンパクを調製した。遺伝子操作実験の手法は、サムブロ
ックらの方法［Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniat
is, T., Molecular Cloning, 2nd ed.,Cold Spring Har
bor Laboratory Press, New York (1989).］に従って行
った。なお、制限酵素は宝酒造（株）製品を使用した。 （Ｃｏｒｅ抗原の調製）ＨＣＶのＣｏｒｅ領域遺伝子
（Ｎ末端から1番目から168番目のアミノ酸配列をコード
する塩基配列）をpUEX2（Amersham社製）に挿入したpHC
X01を持つ組換え大腸菌HB101［pHCX01］（特願平4-1988
06、微工研菌寄第13056号）をＬＢ＋Ａｍｐ培地［Bacto
tryptone 1.0%, Yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%, アンヒ
゜シリン(Amp)50μg／ml］で30℃で一晩培養し、最終濃度が
15％となるようにグリセリンを添加して−80℃で凍結保
存した。

【００５９】組換え大腸菌HB101［pHCX01］を培養し遺
伝子発現を行うことにより、Ｃｏｒｅ抗原はβ−ガラク
トシダーゼとの融合ポリペプチドとして生産される。組
換え大腸菌HB101［pHCX01］の凍結保存菌体１mlを、１リ
ットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地に接種し30℃にて一晩培養し
た。続いてこの培養物を、20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地に
植菌し30℃でＯＤ₅₄₀が1.5となるまで培養し、培養温度
を42℃に上昇させて引き続き３時間培養した。培養後、
遠心分離により集菌し57gの湿菌体を得た。菌体を２リット
ルの、0.6M尿素を含むTNE緩衝液（50mM Tris・HCl(pH8.
3), 100mM NaCl, 1mM EDTA）に懸濁し、超音波処理によ
り破砕した。この菌体破砕物を10,000g、20分間の遠心
分離により、Ｃｏｒｅ抗原を含む不溶性顆粒を沈澱画分
に回収した。この沈澱を、再び２リットルの0.6M尿素を含む
TNE緩衝液に懸濁して不溶性顆粒を洗浄し、遠心分離す
ることにより沈澱を回収した。更にこの沈澱を、２リットル
の3M尿素を含むTNE緩衝液に懸濁し、室温で30分間攪は
んすることにより不溶性顆粒を十分洗浄した後、遠心分
離することにより不溶性顆粒を沈澱画分に回収した。こ
の不溶性顆粒の沈澱に、200mlの8M尿素を含むTNE緩衝液
を加え沈澱を可溶化した。これを16,000g、20分間の遠
心分離により上清を分取し、TNE緩衝液に対して透析し
た。透析後、16,000g、20分間の遠心分離により上清を
分取しＣｏｒｅ抗原を得た。20リットルの培養液からＣｏｒ
ｅ抗原を980mg得た。

【００６０】（ＮＳ−３抗原の調製）ＮＳ−３領域遺伝
子（Ｎ末端から1323番目から1533番目のアミノ酸配列を
コードする塩基配列）を含むプラスミドpHCV07を持つ組
換え大腸菌E. coli HCV7（特開平4-179482、微工研菌寄
第11831号）からpHCV07を単離してEcoRIとStuIで消化
し、ｃＤＮＡの５’側の338bp断片を得た。この338bp断
片はさらにHinfIで部分消化後、ＤＮＡポリメラーゼＩ
Klenow fragmentにより末端を平滑化し、263bp断片を得
た。またpHCV7をStuIで消化し、CIP処理した後、PstI消
化し、ｃＤＮＡの３’側の400bp断片を得た。一方pUEX1
をSmaIとPstIで消化し、CIP処理した。このpUEX1とｃＤ
ＮＡの５’側の263bp断片、ｃＤＮＡの３’側の400bp断
片のライゲーション反応を行い、組換えベクターpCI07
を得た。この組換えベクターpCI07には、ＨＣＶのＮ末
端から数えて、1323番目から1533番目のアミノ酸配列を
コードする塩基配列が含まれる。次に、組換えベクター
pCI07で宿主大腸菌HB101を形質転換し、組換え大腸菌HB
101［pCI07］を得た。組換え大腸菌HB101［pCI07］をＬ
Ｂ＋Ａｍｐ培地で30℃で一晩培養し、最終濃度が15％と
なるようにグリセリンを添加して−80℃で凍結保存し
た。

【００６１】組換え大腸菌HB101［pCI07］を培養し遺伝
子発現を行うことにより、ＮＳ−３抗原はβ−ガラクト
シダーゼとの融合ポリペプチドとして生産される。Ｃｏ
ｒｅ抗原の製造と同様にして、組換え大腸菌HB101［pCI
07］の培養、菌体の破砕、融合ポリペプチドの分離精製
を行った。20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地にて培養し、ＮＳ
−３抗原を1,000mg得た。

【００６２】（ＮＳ−４抗原の調製）ＮＳ−４領域遺伝
子（Ｎ末端から1605番目から1798番目のアミノ酸配列を
コードする塩基配列）を含むプラスミドpHCV10を持つ組
換え大腸菌E. coli HCV10（特開平4-179482、微工研菌
寄第11834号）からpHCV10を単離してAvaIIで消化後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ Klenow fragmentにより末端を平滑
化し、さらにBamHIで消化して583bp断片を単離した。一
方pUEX3をSmaIで消化し、CIP処理し、さらにBamHIで消
化した。その後、電気泳動を行い目的の断片を分離し
た。これらをライゲーションし、組換えベクターpCI10
を作製した。この組換えベクターpCI10には、ＨＣＶの
Ｎ末端から数えて、1605番目から1798番目のアミノ酸配
列をコードする塩基配列が含まれる。次に、組換えベク
ターpCI10で宿主大腸菌HB101を形質転換し、組換え大腸
菌HB101［pCI10］を得た。組換え大腸菌HB101［pCI10］
をＬＢ＋Ａｍｐ培地で30℃で一晩培養し、最終濃度が15
％となるようにグリセリンを添加して−80℃で凍結保存
した。

【００６３】組換え大腸菌HB101［pCI10］を培養し遺伝
子発現を行うことにより、ＮＳ−４抗原はβ−ガラクト
シダーゼとの融合ポリペプチドとして生産される。Ｃｏ
ｒｅ抗原の製造と同様にして、組換え大腸菌HB101［pCI
10］の培養、菌体の破砕、融合ポリペプチドの分離精製
を行った。20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地にて培養し、ＮＳ
−４抗原を720mg得た。

【００６４】（ＮＳ−５抗原の調製）ＮＳ−５領域遺伝
子（Ｎ末端から2111番目から2270番目のアミノ酸配列を
コードする塩基配列）を含むプラスミドpHCV14を持つ組
換え大腸菌E. coli HCV14（特願平4-179482、微工研菌
寄第11838号）からpHCV14を単離してPstI及びXbaIで消
化後、blunting kitにより末端を平滑化し、484bpを含
む断片を単離した。一方pUEX2をSmaIで消化し、CIP処理
した。その後、電気泳動を行い目的の断片を分離した。
これらをライゲーションし、組換えベクターpCI14を作
製した。この組換えベクターpCI14には、ＨＣＶのＮ末
端から数えて、2111番目から2270番目のアミノ酸配列を
コードする塩基配列が含まれる。次に、組換えベクター
pCI14で宿主大腸菌HB101を形質転換し、組換え大腸菌HB
101［pCI14］を得た。組換え大腸菌HB101［pCI14］をＬ
Ｂ＋Ａｍｐ培地で30℃で一晩培養し、最終濃度が15％と
なるようにグリセリンを添加して−80℃で凍結保存し
た。

【００６５】組換え大腸菌HB101［pCI14］を培養し遺伝
子発現を行うことにより、ＮＳ−５抗原はβ−ガラクト
シダーゼとの融合ポリペプチドとして生産される。Ｃｏ
ｒｅ抗原の製造と同様にして、組換え大腸菌HB101［pCI
14］の培養、菌体の破砕、融合ポリペプチドの分離精製
を行った。20リットルのＬＢ＋Ａｍｐ培地にて培養し、ＮＳ
−５抗原を750mg得た。

【００６６】実施例１ カゼインをブロッキング剤とし
て用いたＣ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬の調製 （感作）直径１．８μｍのＨＤＰ（徳山曹達(株)製品）
をＰＢＳで５（ｗ／ｗ）％になるように懸濁し、ＨＤＰ
懸濁液とした。上記参考例で調製した４種類のＨＣＶ抗
原タンパクを各５０、１００、２００μｇ／ｍｌで混合
して混合抗原溶液とした。上記ＨＤＰ懸濁液１ｍｌと混
合抗原溶液１ｍｌを試験管内で混合して室温で１時間放
置してＨＤＰ表面に疎水的に担持させた（以下、この吸
着操作を感作ともいう）。

【００６７】（洗浄操作）その後、余剰のＨＣＶ抗原タ
ンパクを除去するために、上記混合液に２，５００ｒｐ
ｍ、５分間遠心分離を施し、遠心上清を除去した。その
遠心沈澱物に洗浄のため、ＰＢＳ２ｍｌを添加、懸濁後
２，５００ｒｐｍ、５分間遠心後上清を除去した。上記
ＨＣＶ抗原タンパクを吸着させたＨＤＰをＨＣＶ抗原感
作粒子とした。

【００６８】（ブロッキング操作）該ＨＣＶ抗原感作粒
子（５０ｍｇ）に１％カゼイン、５ｍｌを添加して３７
℃で３時間ブロッキングを行った。ブロッキング後、上
記懸濁液に２、５００ｒｐｍ、５分間遠心分離を施し、
遠心上清を除去した。上記操作でブロッキング操作を完
了し、Ｃ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬（以下、Ｃ
型肝炎診断試薬ともいう）を調製した。このＣ型肝炎診
断試薬を３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％正常ウサギ血清含有Ｐ
ＢＳ（以下、Ａ液とも略記する）に０．５（ｗ／ｖｏ
ｌ）％になるように懸濁して以下の測定操作に供した。

【００６９】（測定操作）一方、検査に用いる検体をＡ
液で２倍より順次倍数希釈した。次に、検体の希釈液を
９６穴マイクロタイタープレートに各々２５μｌずつ１
穴から１８穴まで滴下した。ついで、上記でＣ型肝炎診
断試薬懸濁液をを各穴２５μｌを滴下した。滴下後、プ
レートミキサーで振とうして３０分間静置したのち、管
底凝集像を観察した。

【００７０】（結果）上記のように調製したＣ型肝炎診
断試薬の性能評価を健常者検体５検体、Ｃ型肝炎患者検
体５検体を用いて行った。結果を表１に示した。健常者
検体はいずれも８倍希釈までしか、陽性像が検出されな
かったのに対してＣ型肝炎患者検体ではいずれも感作濃
度２００μｇ／ｍｌで３２，７６８倍希釈以上でも陽性
像が検出できた。健常者検体で非特異的凝集反応起こら
ず、Ｃ型肝炎患者検体に対して高感度である良好なＣ型
肝炎診断試薬が調製できることがわかった。

【００７１】

【表１】

【００７２】実施例２ カゼインをブロッキング剤とし
て用いたＣ型肝炎診断試薬とカゼインを添加した分散媒
からなるＣ型肝炎診断用キット （感作）実施例１と同様である。

【００７３】（洗浄操作）実施例１と同様である。

【００７４】（ブロッキング操作）該ＨＣＶ抗原感作粒
子に１％カゼイン、５ｍｌを添加して３７℃で３時間ブ
ロッキングを行った。ブロッキング後、上記懸濁液に
２、５００ｒｐｍ、５分間遠心分離を施し、遠心上清を
除去した。上記操作でブロッキング操作を完了し、Ｃ型
肝炎診断試薬を調製した。１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％カゼ
イン含有ＰＢＳ（以下、Ｂ液とも略記する）に０．５
（ｗ／ｖｏｌ）％になるように懸濁して以下の測定操作
に供した。

【００７５】（測定操作）一方、検査に用いる検体をＢ
液で２倍より順次倍数希釈した。次に、検体の希釈液を
９６穴マイクロタイタープレートに各々２５μｌずつ１
穴から１８穴まで滴下した。ついで、上記Ｃ型肝炎診断
試薬懸濁液を各穴２５μｌを滴下した。滴下後、プレー
トミキサーで振とうして３０分間静置したのち、管底凝
集像を観察した。試薬感度は力価で表示する。 （結果）上記のように調製したＣ型肝炎診断試薬の性能
評価を健常者検体５検体、Ｃ型肝炎患者検体５検体を用
いて行った。結果を表２に示した。健常者検体はいずれ
も４倍希釈までしか、陽性像が検出されなかったのに対
してＣ型肝炎患者検体では感作濃度２００μｇ／ｍｌで
３２，７６８倍希釈以上でも陽性像が検出できた。健常
者検体を実施例１と比較するとさらに非特異的凝集反応
を低減できることがわかり分散媒への添加成分としての
カゼインの効果が確認された。

【００７６】

【表２】

【００７７】比較例１ カゼインによるブロッキングを
行わないＣ型肝炎診断試薬 （感作）実施例１と同様に行った。

【００７８】（洗浄操作）実施例１と同様に行った。

【００７９】（ブロッキング操作）実施例１で行ったブ
ロッキング操作は比較例１では省略した。感作、洗浄操
作で調製したＣ型肝炎診断試薬を３％正常ウサギ血清を
含有するＡ液に０．５（ｗ／ｖｏｌ）％になるように懸
濁して以下の測定操作に供した。

【００８０】（測定操作）検査に用いる検体をＡ液で２
倍より順次倍数希釈した。次に、検体の希釈液を９６穴
マイクロタイタープレートに各々２５μｌずつ１穴から
１８穴まで滴下した。ついで、上記Ｃ型肝炎診断試薬懸
濁液を各穴２５μｌを滴下した。滴下後、プレートミキ
サーで振とうして３０分間静置したのち、管底凝集像を
観察した。試薬感度は力価で表示する。 （結果）上記のように調製したＣ型肝炎診断試薬の性能
評価を実施例１と同様に健常者検体５検体、Ｃ型肝炎患
者検体５検体を用いて行った。結果を表３に示した。カ
ゼインブロッキングを行った場合は健常者検体、Ｃ型肝
炎患者検体いずれも非特異的凝集反応が起こらなかった
２００μｇ／ｍｌ感作で非特異的凝集反応を起こしてし
まった。このことよりカゼインブロッキングを行うこと
でより多くの抗原を感作することができ、免疫学的凝集
反応試薬の高感度化が可能であるが証明された。また、
健常者検体ではブロッキングを行うことにより非特異的
感度上昇の防止が可能となる。

【００８１】

【表３】

【００８２】比較例２ カゼインによるブロッキングを
行わないＣ型肝炎診断試薬とカゼインを添加した分散媒
からなるＣ型肝炎診断用キット （感作）比較例１と同様に行った。

【００８３】（洗浄操作）比較例１と同様に行った。

【００８４】（ブロッキング操作）比較例２でも実施例
１で行ったブロッキング操作は省略した。感作、洗浄操
作で調製したＣ型肝炎診断試薬を１％カゼインを含有す
るＢ液に０．５（ｗ／ｖｏｌ）％になるように懸濁して
以下の測定に供した。

【００８５】（測定操作）検査に用いる検体を１％カゼ
イン含有したＢ液で２倍より順次倍数希釈した。次に、
検体の希釈液を９６穴マイクロタイタープレートに各々
２５μｌずつ１穴から１８穴まで滴下した。ついで、上
記Ｃ型肝炎診断試薬懸濁液を各穴２５μｌを滴下した。
滴下後、プレートミキサーで振とうして３０分間静置し
たのち、管底凝集像を観察した。試薬感度は力価で表示
する。 （結果）上記のように調製したＣ型肝炎診断試薬の性能
評価を実施例１と同様に健常者検体５検体、Ｃ型肝炎患
者検体５検体を用いて行った。結果を表４に示した。カ
ゼインブロッキングを行った場合は健常者検体、Ｃ型肝
炎患者検体いずれも非特異的凝集反応が起こらなかった
２００μｇ／ｍｌ感作で非特異的凝集反応を生じてしま
った。このことより分散媒の添加成分としてのカゼイン
はブロッキング剤としてカゼインと使用することによっ
てはじめて効果を発揮すること判明した。

【００８６】

【表４】

【００８７】比較例３〜５ カゼイン以外のブロッキン
グ剤（ＢＳＡ、正常ウサギ血清、グリシン）を用いたＣ
型肝炎診断試薬とカゼインを添加した分散媒からなるＣ
型肝炎診断用キット （感作）実施例１と同様である。ただし、感作するＨＣ
Ｖ抗原濃度は２００μｇ／ｍｌのみで行った。

【００８８】（洗浄操作）実施例１と同様である。

【００８９】（ブロッキング操作）該Ｃ型肝炎診断用感
作粒子（５０ｍｇ）に１％ＢＳＡ、１％正常ウサギ血清
又は１％グリシンをそれぞれ５ｍｌ添加して３７℃で３
時間ブロッキングを行った。ブロッキング後、上記懸濁
液に２、５００ｒｐｍ、５分間遠心分離を施し、遠心上
清を除去した。上記操作でブロッキング操作を完了し、
３種類のＣ型肝炎診断試薬を調製した。各々のＣ型肝炎
診断試薬を１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％カゼイン含有ＰＢＳ
である液に０．５（ｗ／ｖｏｌ）％になるように懸濁
し、それぞれのＣ型肝炎診断試薬を調製して以下の測定
操作に供した。

【００９０】（測定操作）一方、検査に用いる検体をＢ
液で２倍より順次倍数希釈した。次に、検体の希釈液を
９６穴マイクロタイタープレートに各々２５μｌずつ１
穴から１８穴まで滴下した。ついで、３種類の上記Ｃ型
肝炎診断試薬懸濁液を各穴２５μｌを滴下した。滴下
後、プレートミキサーで振とうして３０分間静置したの
ち、管底凝集像を観察した。試薬感度は力価で表示す
る。 （結果）上記のように調製したＣ型肝炎診断試薬の性能
評価を健常者検体５検体、Ｃ型肝炎患者検体５検体を用
いて行った。結果を表５に示した。ブロッキング剤とし
てＢＳＡ又はグリシンを用いた場合はすべて非特異的凝
集反応を示し、正常ウサギ血清については健常者検体が
非特異的な感度上昇が見られた。従って、Ｃ型肝炎診断
試薬のブロッキング剤としてのカゼインの有効性が確認
された。

【００９１】

【表５】

【００９２】実施例３ ブロッキング剤として正常ウサ
ギ血清を用いたＢ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬と
正常ウサギ血清を含有する分散媒とからなるＢ型肝炎診
断用キット （感作）直径１．８μｍのＨＤＰ（徳山曹達(株)製品）
をＰＢＳで５（ｗ／ｗ）％になるように懸濁し、ＨＤＰ
懸濁液とした。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対するモノ
クローナル抗体を２５０μｇ／ｍｌにＰＢＳ懸濁して抗
体溶液とした。上記ＨＤＰ懸濁液１ｍｌと抗体溶液１ｍ
ｌを試験管内で混合して３７℃で１時間放置してＨＤＰ
表面に感作した。

【００９３】（洗浄操作）その後、余剰の該Ｂ型肝炎ウ
イルス表面抗原に対するモノクローナル抗体を除去する
ために、上記混合液に２，５００ｒｐｍ、５分間遠心分
離を施し、遠心上清を除去した。その遠心沈澱物に洗浄
のため、ＰＢＳ２ｍｌを添加、懸濁後２，５００ｒｐ
ｍ、５分間遠心後上清を除去した。上記、ＨＣＶ抗原タ
ンパクを吸着させてＨＢＶ抗体感作粒子とした。

【００９４】（ブロッキング操作）該ＨＢＶ抗体感作粒
子に１０％正常ウサギ血清、５ｍｌを添加して３７℃で
１時間ブロッキングを行った。ブロッキング後、上記懸
濁液に２、５００ｒｐｍ、５分間遠心分離を施し、遠心
上清を除去した。上記操作でブロッキング操作を完了し
であるＢ型肝炎診断用免疫学的凝集反応試薬（以下、Ｂ
型肝炎診断試薬とも略記する）を調製した。上記Ｂ型肝
炎診断試薬を３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％正常ウサギ血清含
有ＰＢＳである液に０．５（ｗ／ｖｏｌ）％になるよう
に懸濁して以下の測定操作に供した。

【００９５】（測定操作）一方、検査に用いる検体をＡ
液で２倍より順次倍数希釈した。次に、検体の希釈液を
９６穴マイクロタイタープレートに各々２５μｌずつ１
穴から１８穴まで滴下した。ついで、上記Ｂ型肝炎診断
試薬懸濁液を各穴２５μｌを滴下した。滴下後、プレー
トミキサーで振とうして３０分間静置したのち、管底凝
集像を観察した。

【００９６】（結果）上記のように調製したＢ型肝炎診
断試薬の性能評価を健常者検体１検体、Ｂ型肝炎患者検
体１検体を用いて行った。結果を表６に示した。健常者
検体は４倍希釈までしか、陽性像が検出されなかったの
に対してＢ型肝炎患者検体では１２８倍希釈まで陽性像
が検出できた。

【００９７】比較例６ 正常ウサギ血清でのブロッキン
グを行わないＢ型肝炎診断試薬の調製 （感作）実施例３と同様に行った。

【００９８】（洗浄操作）実施例３と同様に行った。

【００９９】（ブロッキング操作）実施例３で行ったブ
ロッキング操作は比較例６では省略した。感作、洗浄操
作で調製したＢ型肝炎診断試薬をそのままＢ型肝炎診断
試薬３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％正常ウサギ血清を含有する
Ａ液に０．５（ｗ／ｖｏｌ）％になるように懸濁して以
下の測定に供した。

【０１００】（測定操作）実施例３と同様の方法で調製
したＢ型肝炎診断試薬の性能を評価した。

【０１０１】（結果）上記のように調製したＢ型肝炎診
断試薬の性能評価を実施例３と同様に健常者検体１検
体、Ｂ型肝炎患者検体１検体を用いて行った。結果を表
６に示した。正常ウサギ血清ブロッキングを行った場合
は健常者検体、Ｂ型肝炎患者検体いずれも非特異的凝集
反応が起こらなかった２５０μｇ／ｍｌ感作で、非特異
的凝集反応を起こしてしまった。このことより正常ウサ
ギ血清ブロッキングを行うことでより非特異的凝集反応
を起こすことなく多くの抗体を感作することができ、免
疫学的凝集反応試薬の高感度化が可能である。また、健
常者検体ではブロッキングを行うことにより非特異的感
度上昇の防止が可能となる。

【０１０２】比較例７ 正常ウサギ血清をブロッキング
剤として使用したＢ型肝炎診断試薬とカゼインを添加し
た分散媒からなるＢ型肝炎診断用キット （感作）実施例３と同様である。

【０１０３】（洗浄操作）実施例３と同様である。

【０１０４】（ブロッキング操作）実施例３と同様にＢ
型肝炎診断試薬を１０％正常ウサギ血清、５ｍｌを添加
して３７℃で３時間ブロッキングを行った。ブロッキン
グ後、上記懸濁液に２、５００ｒｐｍ、５分間遠心分離
を施し、遠心上清を除去した。上記操作でブロッキング
操作を完了し、Ｂ型肝炎診断試薬とした。上記Ｂ型肝炎
診断試薬を１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％カゼイン含有ＰＢＳ
である液に０．５（ｗ／ｖｏｌ）％になるように懸濁し
て以下の測定に供した。

【０１０５】（測定操作）一方、検査に用いる検体をＢ
液で２倍より順次倍数希釈した。次に、検体の希釈液を
９６穴マイクロタイタープレートに各々２５μｌずつ１
穴から１８穴まで滴下した。ついで、上記Ｂ型肝炎診断
試薬懸濁液を各穴２５μｌを滴下した。滴下後、プレー
トミキサーで振とうして３０分間静置したのち、管底凝
集像を観察した。

【０１０６】（結果）上記のように調製したＢ型肝炎診
断試薬の性能評価を実施例３と同様に健常者検体１検
体、Ｂ型肝炎患者検体１検体を用いて行った。結果を表
６に示した。健常者検体で非特異的に感度が上昇してい
た。分散媒に添加する吸収剤と同一のタンパク成分をブ
ロッキング剤に用いることが有効であることが分かる。

【０１０７】比較例８ ブロッキング剤としてカゼイン
を用いたＢ型肝炎診断試薬と正常ウサギ血清を添加した
分散媒からなるＢ型肝炎診断用キット （感作）実施例３と同様で行った。

【０１０８】（洗浄操作）実施例３と同様に行った。

【０１０９】（ブロッキング操作）Ｂ型肝炎診断試薬に
１％カゼイン、５ｍｌを添加して３７℃で１時間ブロッ
キングを行った。ブロッキング後、上記懸濁液に２、５
００ｒｐｍ、５分間遠心分離を施し、遠心上清を除去し
た。上記操作でブロッキング操作を完了し、Ｂ型肝炎診
断試薬を調製した。上記Ｂ型肝炎診断試薬を３（ｖｏｌ
／ｖｏｌ）％正常ウサギ血清含有ＰＢＳである液に０．
５（ｗ／ｖｏｌ）％になるように懸濁して以下の測定に
供した。

【０１１０】（測定操作）一方、検査に用いる検体をＡ
液で２倍より順次倍数希釈した。次に、検体の希釈液を
９６穴マイクロタイタープレートに各々２５μｌずつ１
穴から１８穴まで滴下した。ついで、上記Ｂ型肝炎診断
試薬懸濁液を各穴２５μｌを滴下した。滴下後、プレー
トミキサーで振とうして３０分間静置したのち、管底凝
集像を観察した。

【０１１１】（結果）上記のように調製したＢ型肝炎診
断試薬の性能評価を健常者検体１検体、Ｂ型肝炎患者検
体１検体を用いて行った。結果を表６に示した。健常者
検体は８倍希釈まで陽性像が検出されたのに対してＢ型
肝炎患者検体では１２８倍希釈まで陽性像が検出でき
た。実施例３と比較すると健常者検体に非特異的に感度
の上昇が見られた。従ってブロッキング剤と同一の物質
を分散媒に添加することで非特異的凝集反応が抑制され
ることが分かる。

【０１１２】

【表６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５８１ Ｊ 9217−2Ｊ Ｕ 9217−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不溶性担体にＣ型肝炎ウイルス遺伝子由
   来の抗原タンパク及びカゼインを担持してなるＣ型肝炎
   診断用免疫学的凝集反応試薬。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＣ型肝炎診断用免疫学的
   凝集反応試薬と、カゼイン及び緩衝液を含んでなる分散
   媒とから構成されるＣ型肝炎診断用キット。
3. 【請求項３】 不溶性担体に抗原または抗体とブロッキ
   ング剤を担持してなる免疫学的凝集反応試薬と、該免疫
   学的凝集反応試薬に担持されたブロッキング剤と同一の
   物質並びに緩衝液を含んでなる分散媒とから構成される
   診断用キット。