JP2505601B2

JP2505601B2 - 凝集反応用試薬

Info

Publication number: JP2505601B2
Application number: JP1337050A
Authority: JP
Inventors: 喬前原; 正則中川; 政好皆見
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1989-12-26
Filing date: 1989-12-26
Publication date: 1996-06-12
Anticipated expiration: 2011-06-12
Also published as: JPH03197867A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は凝集反応用試薬に関するものである。更に詳
しくは抗原又は抗体を感作させた担体の水性懸濁液より
なりデキストランを特定量含有することを特徴とする凝
集反応用試薬を提供する。

（従来技術及び問題点）近年、疾病の診断及び予後判定のために体液及び尿中
に分泌される生体成分を測定することが広く行われてい
る。例えば、肝炎、後天性免疫不全症（エイズ）、成人
Ｔ細胞白血病及び風疹等のウイルス感染症、慢性関節リ
ウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本病等の自己免疫
疾患、カンジダ、マイコプラズマ、溶連菌及び梅毒等の
細胞感染症、インスリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、
エストジエン等のホルモン検査、その他腫瘍マーカーの
検査等が挙げられる。

これらの疾病の診断は、検査対象の生体成分が微量で
あるために従来の化学分析による検査では困難で、一般
には抗原抗体反応を利用した免疫血清学的検査が利用さ
れてきた。この検査法の最大の特徴はきわめて高い感度
と特異性をもって体液及び尿中に分泌される生体成分を
測定できることである。

この免疫血清学的検査の１つに凝集反応法がある。こ
の凝集反応法とは動物の赤血球、ポリスチレンラテック
ス、ゼラチン等より成る粒子を担体として用い、これら
に抗原又は抗体を固定化（以下感作という）させたもの
と、検体（生体成分を含む体液や尿のこと）とを混合
し、抗原抗体複合体形成で生じる担体の凝集物（マイク
ロタイター用試薬の場合は管底凝集像と呼ぶ）の大きさ
又は凝集反応の強さの程度を測定することによって対象
となる生体成分を測定する方法である。この凝集反応法
は、放射性免疫測定法（以下RIAと略す）及び酵素免疫
測定法（以下EIAと略す）等の免疫血清学的検査の標識
法と異なり特別で高価な設備を必要とせず、操作が簡単
で、しかも迅速診断が可能という優れた特徴があり有用
性が高い。しかも近年の抗原及び抗体の精製法の改善、
感作法の改良及び判定法の工夫等により、凝集反応法の
感度は著しく向上し、RIA及びEIAの感度と匹敵するよう
になった。

上記凝集反応に用いる試薬は、抗原又は抗体を担体に
感作させた担体（以下、感作担体という）を水性溶液
（以下、粒子溶解液という）に分散させた水性懸濁液よ
りなる。

ところが、かかる凝集反応用試薬は保存において短期
間のうちに凝集が起こり性能が低下するという保存安定
性の問題があった。従来、このような問題を解決するた
めに、例えば該凝集反応用試薬にアルブミン、グルコー
ス、マルトース、サッカロース等の安定剤を添加する方
法が提案されている。

しかしながら、かかる凝集反応用試薬は、４℃では良
好な安定性を示すものの４℃以上の保存安定性に関して
はいまだ改良の余地が残されている。そこで、一たん凝
集反応用試薬を合成した後、これを凍結乾燥して長期保
存し、使用時に水性懸濁液として用いることも提案され
た。その際、安定剤としてアミノ酸類とデキストランと
をラテックス粒子１重量部に対し、それぞれ1.2〜4.0お
よび1.6〜6.0重量部併用することにより、試薬の凍結処
理の前後において性能の変化が防止し得ることも知られ
ている。

しかし、凝集反応用試薬は、やはり使用される水性懸
濁液として、運搬される事も多く、更に検査時等に常温
にさらされることがあり、常温近傍での保存安定性を向
上させることが必要である。従って、このような室温近
傍での長期間の保存安定性を有する凝集反応用試薬の開
発が望まれている。

また、前記の凝集反応用試薬は、懸濁状態に対する安
定効果はある程度あるが、抗原抗体反応の安定効果に関
してはほとんど効果がない。そのため、抗原抗体反応で
得られる凝集反応物が安定化しないという現象が生じ
る。この現象は凝集反応用試薬に凍結乾燥を施したとき
に特に顕著である。例えば、マイクロタイター法に用い
る凝集反応用試薬においては抗原抗体反応の安定性が非
常に乏しい場合、管底凝集像のうち陽性像に関しては崩
れが生じて陰性像と酷似するため偽陽性が多く生じ、判
定が困難となる（以下、凝集像の切れが悪いという）と
いった問題点を有する。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは上記問題点を解決すべく鋭意研究を重ね
た結果、凝集反応用試薬の感作担体に対して特定量のデ
キストランを添加することにより、凝集反応用試薬の室
温近傍での保存安定性が優れると共に、反応における凝
集像の切れを著しく改善し得ることを見出し、本発明を
完成するに至った。

（発明の要点）すなわち、本発明は抗原又は抗体を感作させた担体の
水性懸濁液よりなり、該担体の容積１cm³当り8g以上の
デキストランを含有することを特徴とする凝集反応用試
薬である。

本発明において用いられる担体は凝集反応法に使用可
能なものであれば、公知の担体が特に限定されず用いら
れる。例えば、ヒト、羊、ニワトリ等の動物赤血球、ポ
リカーボネート粒子、ポリスチレン粒子、ゼラチン粒子
等の有機担体、複合重合体粒子（以下、HDPという）、
ガラスビーズ、シラスポーラスガラス等の無機担体など
の人工担体が挙げられる。上記のHDPは、例えば、特開
昭62−286533に示されるように、無機化合物の核と染料
との存在下に金属又は半金属のアルコキサイトを中性又
はアルカリ性下で加水分解して製造される平均粒子径0.
1〜10.0μｍで、単粒子性が80％以上である免疫診断用
の無機担体である。本発明において、特にHDPは好適に
用いられる。

本発明において、上記担体に感作させる抗原又は抗体
は特に限定的されるものではなく、公知のものが用いら
れる。例えば、免疫グロブリン、アルブミン、フェブリ
ノーゲン（フィブリン及びそれらの分解物）、α−フェ
トプロテイン、Ｃ反応性タンパク、β−ミクログロブリ
ン、ミオグロビン、胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒ
ト絨毛性ゴンドロピン、ヒト胎児性ラクトーゲン、イン
スリン、ジゴキシン、プロテインＡ、プロテインＧ等の
抗原、それらの抗体及びこれら抗原又は抗体の変性物が
挙げられる。そのうち、上記抗原及び抗体の変性物を用
いた場合、後記するデキストランとの組合せにおいて、
凝集反応用試薬の保存時における凝集安定性、反応時に
おける凝集像の切れの改善効果が高く好適である。

かかる抗原又は抗体の変性物は、上記の抗原又は抗体
を公知の変性法で変性させることによって得ることがで
きる。

例えば、加熱、凍結、高圧、超音波、紫外線、Ｘ線、
攪拌、吸着、希釈等の物理的方法及び強酸・強アルカリ
性、有機溶媒、重金属塩、尿素、塩酸グアニジン等の化
学的方法等の抗原又は抗体を高次構造を変化させ得るた
めの方法が挙げられる。上記方法のうち特に加熱処理が
好ましい。

上記の抗原及び抗体を担体に感作する方法は公知の感
作法が採用できる。例えば、グルタルアルデヒド、ビス
ジアゾベンジジン、トリレンジイソシアネート、ジフロ
ロニトロベンゼン、カルボジイミド類、キノン類、塩化
クロム、タンニン酸等のいわゆるカップリング剤を用い
た化学的結合法あるいは上記抗原又は抗体と担体を水溶
性溶媒中（例えば、水、生理食塩水、各種緩衝液など）
で接触させる物理的吸着法等が挙げられる。

尚、上記感作方法において、抗原抗体反応に直接関与
しない疎水性のタンパクを介して抗原又は抗体を担体に
固定化することも可能である。

本発明において、水性懸濁液は、感作担体を粒子溶解
液に懸濁させて調製される。

上記粒子溶解液は公知の物が特に制限なく使用でき
る。例えば、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の水
溶液が好適である。また、水性懸濁液における感作担体
の濃度は、採用される凝集反応により異なり、一概に限
定されるものでないが、0.5〜50g/L程度が一般的であ
る。

本発明においてデキストランはグルコースがα−１→
６結合によって結合されたグルカン（グルコースより形
成される多糖類）である。かかるデキストランは乳酸菌
に属するLeuconostoc mesennteroidesなどによって生成
される。工業的にはスクロースを原料にデキストランス
スクラーゼにより酵素生産される。一般に上記デキスト
ランの用途としては血漿増量剤として利用されている。

本発明に用いるデキストランは特に限定的ではなく、
上記した公知の方法のより得られたものが用いられる。
そのうち、分子量30万以下、好ましくは分子量５万以下
の比較的低分子のものが好適に用いられる。即ち、分子
量30万以上のデキストランを用いたときは効果には格段
の変化はないが凝集反応試薬の粘性が上がり使用が困難
となる傾向がある。

本発明において、該デキストランは感作担体の容積１
cm³8g以上を感作担体の水性懸濁液に含有させることが
重要である。即ち、デキストランの量が感作担体の容積
１cm³当り8g未満である場合、室温近傍での保存時の凝
集安定性は低下し、特に6g未満では著しく低下する。更
にデキストランを感作担体の容積１cm³当り8g以上用い
ることにより、本発明のもう一つの作用効果である凝集
反応時における凝集像の切れの改善効果を発揮すること
ができない。

尚、本発明における感作担体の溶積（V:cm3）は、担
体の乾燥重量（W:g）と担体密度（ρ:g/cm3）より次式
で概算される。

Ｖ＝W/ρ（cm3）上記感作担体の乾燥重量は通常の方法で算出できる。
例えば、感作担体を含む水性懸濁液を遠心分離して洗浄
後、減圧乾燥して重量を求める。また、密度は一般的な
方法である重液を用いる方法で測定する。すなはち、任
意の密度勾配をもつ一連の重液に上記の乾燥した感作担
体を滴下し、その感作担体が沈降しなくなる重液の密度
を感作担体の密度とする。

本発明の凝集反応用試薬は、水性懸濁液の状態で使用
されるが、長期の保存においてはこれを凍結乾燥するこ
とが好ましい。本発明の凝集反応試薬は、かかる凍結乾
燥後、再び水性懸濁液としても前記した保存時の安定性
及び反応時の凝集像の切れが低下することなく、優れた
性能を示す。

上記凍結乾燥方法は限定的ではなく通常の方法で行え
ばよい。例えば感作赤血球の凍結乾燥法に採用される方
法及び条件が用いられる。好ましくは急速予備凍結し次
いで真空凍結乾燥する方法が採用される。該急速予備凍
結には液体窒素、ドライアイス−メタノール、ドライア
イス−アセトンあるいはフルオロカーボン等に、上記水
性懸濁液の入ったバイアル又はアンプル等の容器を浸漬
することにより達成される。

また、真空凍結乾燥方法は限定的されるものではない
が、一般には、上記感作担体の浮遊液の入ったバイアル
等を急速予備凍結したのち、予め−40〜−60℃に冷却し
た凍結乾燥機のチャンバー内に置き24〜72時間かけて徐
々に昇温し真空凍結乾燥する方法が好適である。この時
のチャンバー内の圧力50〜200μHg、最終乾燥温度は20
〜50℃が適当である。ついで真空状態、または不活化ガ
スを充填して封栓保存すればよい。

本発明の凝集反応用試薬はデキストランを前記の範囲
で含有するものであればよく、必要に応じて他の添加
物、例えば、血清アルブミン、カゼイン、γ−グロブリ
ン等のタンパク、グルコース、マルトース、サッカロー
ス等の糖類、アミノ酸等を添加することは、本発明の効
果を阻害しない範囲で行うことができる。

本発明の凝集反応用試薬は、通常診断に利用される凝
集反応法が何ら制限なく適用される。例えば、定性診断
の平板法、半定量診断のマイクロタイター法及び定量診
断の比濁法、粒子数計測法等である。そのうち、特にマ
イクロタイター法に適用する場合、本発明の効果が特に
顕著である。

（作用及び効果）以上の説明より理解されるように、本発明の凝集反応
用試薬は、室温近傍での保存における凝集安定性が優
れ、且つ反応時における凝集像の切れが極めて良好であ
る。また、凍結乾燥後においてもかかる性能が低下する
ことがない。

従って、凝集反応を利用した診断方法、特にマイクロ
タイター法による診断用試薬として有用である。

（実施例）以下、本発明を実施例により、更に具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。尚、実施例及び比較例において、保存時における凝
集安定性及び反応時における凝集像の切れは下記の方法
により測定した。

凝集安定性保存時の凝集安定性は、凝集反応用試薬を10℃で保存
し、保存開始より１ケ月目、６ケ月目の力価を測定し
た。尚、力価とは陽性血清の抗体価を陽性血清の希釈率
で示した値である。

凝集像の切れ患者血清のプール血清をPBSで20倍希釈したものを原
液とし順次２倍希釈を行い、患者血清希釈系列を調製し
た。抗原抗体反応を行うためにＶ型マイクロタイタープ
レートを用意し、患者血清希釈系列を各ウエル（１穴目
から12穴目まで）25μｌ加えた。凝集反応用試薬を各ウ
エルに25μｌずつ加え、ついで５分間マイクロタイター
プレートを振とうしたのち室温に静置した。ついで抗原
・抗体反応に基づく凝集反応管底凝集像を肉眼で観察
し、凝集反応試薬の凝集像の内、疑陽性を示す管数を示
した。

実施例１〜３比較例１〜２変性ウサギ−γ−グロブリンをPBSで50倍に希釈した
溶液1mlとHDPをPBSで１重量％に希釈した溶液1mlを室温
で攪拌しながら、２時間感作した。次いで、遠心分離に
より、上清中の熱変性ウサギ−γ−グロブリンを除い
た。

尚、上記変性ウサギ−γ−グロブリンは、ウサギ血清
より33％飽和硫酸アンモニウム塩析またはcohn分画によ
り調製したウサギ−γ−グロブリンを20mMリン酸緩衝液
−生理食塩水、pH7.2（以下、PBSという）に溶解したの
ち、60℃、10分間熱変性し、ついで遠心分離して、上清
中の熱変性ウサギ−γ−グロブリンを除いて得られたも
のである。また、HDPは、次の方法により製造したもの
である。即ち、攪拌機付きのガラス製フラスコ中にメタ
ノール2800ml、アンモニア水（25重量％）616ml、水酸
化ナトリウム水溶液（５モル/l）21mlを加え10℃に保っ
た後に、テトラエチルシリケートのタメノール溶液（22
重量％）256mlを滴々添加してシリカ粒子（平均粒子径
0.91μｍ）をつくり、このシリカ粒子を含む反応液中に
さらにテトラシリケートのメタノール溶液（33重量％）
624mlとダイアクリルレッドMS−Ｎ（以下、染料とい
う）のメタノール溶液（1.25重量％）625mlとを25.5ml/
hrの速度で滴々添加して染料で着色したシリカ粒子を合
成した。得られたシリカ粒子を、メタノールでデカンテ
ーションによる精製と洗浄を繰り返した。このようにし
て得られた２層構造からなるシリカ／染料複合体の性状
は平均粒子径1.62μｍ、粒子径の分散値5.2％、粒子分
散値94.3％であった。次いで得られた複合体粒子を10重
量％濃度にメタノール中に分散し、その分散液100mlに
表面処理剤フェニルトリエトキシシランを0.5重量％濃
度になるように添加し、10℃、16時間反応させて表面処
理を行ってHDPを製造した。

上記のようにして得た熱変性−γ−グロブリン感作−
HDPが、１重量％となるように表１に示すようなデキス
トランを含む粒子溶解液を加え、凍結乾燥用の5ml容バ
イアル瓶に1mlずつ分注して、凝集反応用試薬を得た。
次いで、この凝集反応用試薬を、予め−50℃に冷却して
おいた凍結乾燥機のチャンバー内に置き、100μHgの減
圧下で40℃の到達温度まで５℃/hr.の昇温速度で30時間
凍結乾燥を行った。この凍結乾燥した凝集反応用試薬試
薬の入った各バイアルに蒸留水を2ml加え再分散させ
た。

上記方法で得られた、凍結乾燥後、蒸留水で再分散さ
せた凝集反応用試薬について凝集安定性と凝集像の切れ
を測定した。また、実施例３においては、凍結乾燥前の
凝集反応用試薬についても、凝集安定性と凝集像の切れ
を測定した。

尚、凝集安定性試験においては凝集反応用試薬は分散
後、５分後で滴下に供した。結果を表１に示す。

実施例４〜10 実施例１において、担体への感作物質、デキストラン
の添加量を表２に示すように変えた以外は実施例１と同
様にして凝集反応用試薬を作成した。得られた凝集反応
用試薬を実施例１と同様にして凍結乾燥した後、再分散
させた。上記凍結乾燥前（表２）と、凍結乾燥後（表
３）の凝集反応用試薬について、凝集安定性と凝集像の
切れの評価を行った。その結果を表２、及び表３に併せ
て示す。

実施例11、比較例３実施例１と同様にして得られた熱変性ウサギ−γ−グ
ロブリンをPBSで50倍となるように溶解した溶液1mlとポ
リスチレンラテックス（日本合成ゴム社製）をPBSで１
重量％に希釈した溶液1mlとを室温で攪拌しながら、３
時間感作した。次いで、遠心分離により、上清中の熱変
性ウサギ−γ−グロブリンを除いた。

以下、実施例１と同様な方法により、凝集反応用試薬
を得た。得られた凝集反応用試薬を実施例１と同様にし
て凍結乾燥した後、再分散させ、凝集安定性と凝集像の
切れについて性能評価を行った。その結果を表４に併せ
て示す。

実施例12〜18 実施例11において、担体への感作物質、デキストラン
の添加量を表５に示すように変えた以外は実施例１と同
様にして凝集反応用試薬を作成した。得られた凝集反応
用試薬を実施例１と同様にして凍結乾燥した後、再分散
させた。上記凍結乾燥前（表５）と、凍結乾燥後（表
６）の凝集反応用試薬について、凝集安定性と凝集像の
切れの評価を行った。その結果を表５、及び表６に併せ
て示す。

実施例19、比較例４羊赤血球100ml、オルセバ液100mlを混合してガーゼ濾
過し、血球濃度を測定後、生理食塩水で洗浄した。上記
血球についてホルマリン固定を行った（Methods in Imm
unology and Immunochemistory,vol.VI pp.33−34,1977
（Williams,C,Hase編Academic Press New York）によ
る）。即ち、洗浄済み赤血球に3v/v％ホルマリン−生理
食塩水液を加え10℃で24時間攪拌した後、さらに40v/v
％ホルマリン−生理食塩水液を追加して24時間攪拌し
た。次いで、該赤血球を生理食塩水で洗浄したのち、2.
5体積％となるように懸濁し、固定羊赤血球を得た。

この赤血球をPBSで１重量％に希釈した溶液1mlと実施
例１の熱変性ウサギ−γ−グロブリンをPBSで50倍とな
るように溶解した溶液1mlとをを37℃で攪拌しながら、
１時間感作した。次いで、遠心分離により、上清中の熱
変性ウサギ−γ−グロブリンを除いた。

以下、実施例１と同様な方法により、凝集反応用試薬
を得た。得られた凝集反応用試薬を実施例１と同様にし
て凍結乾燥した後、再分散させ、凝集安定性と凝集像の
切れについて性能評価を行った。その結果を表７に併せ
て示す。

実施例20〜26 実施例19において、担体への感作物質、デキストラン
の添加量を表８に示すように変えた以外は実施例１と同
様にして凝集反応用試薬を作成した。得られた凝集反応
用試薬を実施例１と同様にして凍結乾燥した後、再分散
させた。上記凍結乾燥前（表８）と、凍結乾燥後（表
９）の凝集反応用試薬について、凝集安定性と凝集像の
切れの評価を行った。その結果を表８、及び表９に併せ
て示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原又は抗体を感作させた担体の水性懸濁
液よりなり該担体の容積１cm³当り8g以上のデキストラ
ンを含有することを特徴とする凝集反応用試薬