WO2023224100A1 - 糖タンパク質を検出するためのキット - Google Patents

糖タンパク質を検出するためのキット Download PDF

Info

Publication number
WO2023224100A1
WO2023224100A1 PCT/JP2023/018633 JP2023018633W WO2023224100A1 WO 2023224100 A1 WO2023224100 A1 WO 2023224100A1 JP 2023018633 W JP2023018633 W JP 2023018633W WO 2023224100 A1 WO2023224100 A1 WO 2023224100A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
concentration
sample
beads
antibody
modified
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/018633
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
琢也 飯田
志保 床波
裕美子 高木
生彦 中瀬
歩 田口
Original Assignee
公立大学法人大阪
愛知県
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人大阪, 愛知県 filed Critical 公立大学法人大阪
Publication of WO2023224100A1 publication Critical patent/WO2023224100A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
    • G01N21/53—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a kit for detecting glycoproteins.
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • Patent Document 1 discloses a detection device that detects a target substance that may be contained in a sample, which uses a host molecule that can specifically attach the target substance to the target substance. a plurality of metal nanoparticles, each of which has been modified; a first light source that emits polarized light for aggregating the plurality of metal nanoparticles; and the plurality of metal nanoparticles; a light receiver that receives light from the liquid; and a detector that detects the substance to be detected based on a signal from the light receiver.
  • a detection device for a detection target substance is disclosed.
  • Patent Document 2 a liquid sample containing a plurality of particles each modified with a host molecule that specifically binds to a target substance is transferred to a microchannel using a pump. a step of irradiating the liquid sample with non-resonant light that is light outside the wavelength range of electronic resonance of the plurality of fine particles; Disclosed is a method for detecting a substance to be detected, which includes the step of detecting the substance to be detected.
  • the present invention was made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a kit for rapidly and highly sensitively detecting trace amounts of glycoproteins contained in a sample using a photoconcentration system. do.
  • the present inventors have succeeded in optimizing the diluent for diluting the sample and using a photoconcentration system to collect trace amounts of glycoproteins contained in the sample.
  • the present invention has been completed based on the discovery that the present invention can be detected rapidly and with high sensitivity. That is, the present invention is as follows.
  • the kit according to the present invention is a kit for detecting glycoproteins contained in a sample using a photoconcentration system, fine particles with modified host molecules; a diluent for diluting the sample, the host molecule specifically binds to the glycoprotein;
  • the diluent includes a blocking agent and a buffer,
  • the pH of the diluted solution is higher than the isoelectric point of the glycoprotein,
  • the concentration of the blocking agent is lower than the concentration that suppresses non-specific adsorption of the host molecules to each other in an environment where no photo-induced force is acting on the host molecules,
  • the salt concentration of the diluted solution is such that the fine particles modified with the host molecules do not precipitate due to salting out.
  • the diluent is preferably neutral.
  • the salt concentration of the diluent is such that the fine particles modified with the host molecules do not precipitate due to salting out, and the thickness of the electric double layer in the fine particles is reduced.
  • it is a concentration.
  • the fine particles further contain an additive that increases electrostatic repulsion.
  • the fine particles preferably include two or more types of fine particles having different sizes.
  • the host molecule includes at least one selected from the group consisting of antibodies, Fab fragments, F(ab') 2 fragments, Fv fragments, and scFv. It is preferable.
  • the blocking agent preferably contains at least one selected from the group consisting of albumin, gelatin, casein, and goat serum.
  • the concentration of the blocking agent is preferably 0.000001% by mass or more and less than 0.001% by mass with respect to the diluent.
  • the buffer preferably contains at least one selected from the group consisting of a phosphoric acid compound, trishydroxymethylaminomethane, HEPES, and MES.
  • the kit further includes a dispersion liquid for dispersing the host molecule-modified microparticles,
  • the dispersion liquid includes the blocking agent and the buffering agent,
  • the concentration of the blocking agent is preferably 0.00000001% by mass or more and 0.001% by mass or less based on the dispersion.
  • the glycoprotein is preferably a cancer marker protein.
  • the cancer marker protein preferably contains at least one selected from the group consisting of carcinoembryonic antigen (CEA) and carbohydrate antigen (CA19-9, etc.).
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • CA19-9 carbohydrate antigen
  • the sample is a sample that is frozen after being collected or frozen after being refrigerated for a predetermined period of time
  • the glycoprotein contained in the sample preferably aggregates to form multimers or nanoparticles.
  • the kit preferably further includes a microchannel chip.
  • the diluent includes a buffer,
  • the dispersion includes a blocking agent and the buffer,
  • the pH of the diluted solution is higher than the isoelectric point of the glycoprotein,
  • concentration of the blocking agent is lower than the concentration that suppresses non-specific adsorption of the host molecules in an environment where no photo-induced force is acting on the host molecules,
  • the salt concentration of the diluted solution is such that the microparticles modified with the host molecules do not precipitate by salting out.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the mechanism of the optical concentration system.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of the microchannel chip 90 taken along line II-II in FIG.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the aggregation mechanism of latex beads (fine particles modified with host molecules) when a measurement sample is irradiated with laser light.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram for explaining the principle of detection of a certain glycoprotein.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram for explaining another principle of detecting glycoproteins.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining the aggregation mechanism of latex beads under defocus conditions.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the mechanism of the optical concentration system.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of the microchannel chip 90 taken along line II-II in FIG.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the aggregation mechanism of latex beads (fine particles modified with host molecules) when a measurement sample is irradiated with laser
  • FIG. 7 is a graph showing the correlation between the proportion of the multilayer portion (vertical axis) and the concentration of glycoprotein in the measurement sample (horizontal axis) when the measurement sample is measured using a photoconcentration system.
  • Figure 8 shows the total aggregated area, the aggregated area of multilayer parts, or the ratio of multilayer parts (vertical axis) and the concentration of glycoprotein in the measurement sample (horizontal axis) when measuring a measurement sample using a photoconcentration system.
  • Figure 9 shows the total aggregated area, the aggregated area of the multilayered portion, or the ratio of the multilayered portion (vertical axis) and the concentration of glycoprotein in the measured sample (horizontal axis) when measuring the sample using a photoconcentration system.
  • FIG. 10 is a photograph showing the vicinity of a laser spot when a measurement sample is measured using the optical concentrating system.
  • Figure 11A shows that the measurement sample was collected using a photoconcentration system when the BSA concentration in the antibody B-modified bead dispersion was 1.65 ⁇ 10 -8 % and the BSA concentration in the antibody A-modified bead dispersion was 2.16 ⁇ 10 -4 %.
  • Figure 11B shows the total aggregate area when the measurement sample was measured using a photoconcentration system when the BSA concentration in the antibody B-modified bead dispersion and the antibody A-modified bead dispersion was 3.6 ⁇ 10 -5 %.
  • FIG. 12 is a graph showing the correlation between the aggregate area of the multilayer portion or the ratio of the multilayer portion (vertical axis) and the concentration of glycoprotein in the measurement sample (horizontal axis).
  • FIG. 12 is a graph showing the correlation between the collective area of the multilayer portion (vertical axis) and the concentration of glycoprotein in the measurement sample (horizontal axis) when the measurement sample is measured using a photoconcentration system. .
  • FIG. 13 is a schematic diagram illustrating the state of glycoproteins in a measurement sample when the sample is stored frozen.
  • FIG. 14 is a graph showing the correlation between the light intensity (vertical axis) and the concentration of glycoprotein in the measurement sample (horizontal axis) when the measurement sample is measured using the ELISA method.
  • Figure 15 shows a graph (left) showing the collective area (vertical axis) of the multilayer portion when the measurement sample (plasma sample, horizontal axis) is measured using the photoconcentration system, and a graph (left) showing the aggregate area (vertical axis) of the multilayer part when the measurement sample (plasma sample, horizontal axis) is measured using the photoconcentration system.
  • FIG. 16 is a graph showing the collective area of the multilayer portion (vertical axis) when a measurement sample (plasma sample, horizontal axis) is measured using the photoconcentration system.
  • FIG. 17 is a graph showing the relationship between distance from the particle surface and potential.
  • Figure 18 shows the total aggregate area, the aggregate area of the multilayer portion, or the ratio of the multilayer portion (vertical axis) and the sugar content in the sample when measuring the sample using a photoconcentration system using fluorescent beads as probe particles. It is a graph showing pH dependence and antibody modification amount dependence of correlation with protein concentration (horizontal axis).
  • Figure 19 shows the total aggregate area, the aggregate area of the multilayer portion, or the ratio of the multilayer portion (vertical axis) and the sugar in the sample when measuring the sample using a photoconcentration system using fluorescent beads as probe particles. It is a graph showing the laser output dependence of the correlation with protein concentration (horizontal axis).
  • Figure 20 shows the total aggregate area, the aggregate area of the multilayer part, or the aggregate area of the multilayer part (vertical) when measuring a measurement sample (plasma sample, horizontal axis) using a photoconcentration system using fluorescent beads as probe particles. (laser irradiation time: 5 minutes).
  • Figure 21 shows the total aggregate area, the aggregate area of the multilayer part, or the aggregate area of the multilayer part (vertical) when measuring a measurement sample (plasma sample, horizontal axis) using a photoconcentration system using fluorescent beads as probe particles. (laser irradiation time: 4 minutes).
  • Figure 22 shows the total aggregated area, aggregated area of the multilayered portion, or the multilayered portion when measuring a measurement sample using a photoconcentration system using fluorescent beads as probe particles and adjusting the salt concentration in the diluent. It is a graph showing the correlation between the ratio (vertical axis) and the concentration of glycoprotein and sodium chloride concentration (horizontal axis) in the measurement sample.
  • FIG. 23 is a schematic diagram illustrating a blocking method within a microchannel.
  • Figure 24 shows the total aggregate area, the aggregate area of multilayer parts, or the ratio of multilayer parts (vertical axis) when a measurement sample is measured using a light concentration system in which fluorescent beads are used as probe particles and the microchannel is blocked. It is a graph showing the correlation between the concentration of glycoprotein and the concentration of glycoprotein in the measurement sample (horizontal axis).
  • FIG. 25 shows the total aggregate area when two types of fluorescent beads with a diameter of 2 ⁇ m and a diameter of 1 ⁇ m are mixed at a volume ratio of 1:0.05 to form a probe particle, and a measurement sample is measured using a photoconcentration system.
  • FIG. 26 It is a graph showing the correlation between the collective area of the multilayer portion or the ratio of the multilayer portion (vertical axis) and the concentration of glycoprotein in the measurement sample (horizontal axis).
  • Figure 26 shows a conceptual diagram of the mechanism of stabilizing the integrated structure and the ratio of multilayer parts
  • 2 is a graph showing the correlation between the concentration of glycoprotein in the measurement sample (vertical axis) and the concentration of glycoprotein in the measurement sample (horizontal axis).
  • this embodiment will be described in detail with reference to the drawings. However, this embodiment is not limited to this.
  • the same reference numerals are attached to the same or corresponding parts in the figures, and the description thereof will not be repeated.
  • the notation in the format "A to Z” means the upper and lower limits of the range (ie, from A to Z). When a unit is not described in A and only a unit is described in Z, the unit of A and the unit of Z are the same.
  • the kit according to this embodiment is a kit for detecting glycoproteins contained in a sample using a photoconcentration system, and includes: fine particles with modified host molecules; a diluent for diluting the sample, the host molecule specifically binds to the glycoprotein;
  • the diluent includes a blocking agent and a buffer,
  • the pH of the diluted solution is higher than the isoelectric point of the glycoprotein,
  • the concentration of the blocking agent is lower than the concentration that suppresses non-specific adsorption of the host molecules to each other in an environment where no photo-induced force is acting on the host molecules,
  • the salt concentration of the diluted solution is such that fine particles modified with host molecules do not precipitate due to salting out.
  • the "photoconcentration system” refers to a target substance that uses the effects of light on a substance, such as photoinduced force and photoinduced convection, and the effect of causing convection in a liquid due to the photothermal effect. Refers to a technique of concentrating or accumulating in an area.
  • the optical concentration system can concentrate the target substance in a predetermined region of the liquid (the region irradiated with light). It can also be interpreted as In this embodiment, the target substance may be a glycoprotein, a host molecule, or a microparticle that is a substance to be detected. This will be explained in detail below.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the mechanism of the optical concentration system.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of the microchannel chip 90 taken along line II-II in FIG.
  • a measurement sample SP is introduced into a microchannel 92 formed in a base material 91 of a microchannel chip 90.
  • the measurement sample SP is introduced from the inlet 921, passes through the microchannel 92, and is discharged from the outlet 922.
  • the flow direction of the sample SP in the microchannel 92 is defined as the x direction.
  • the measurement sample SP is, for example, a solution obtained by diluting the sample with the diluent.
  • the measurement sample SP includes fine particles in which host molecules are modified.
  • the measurement sample SP introduced into the microchannel 92 is irradiated with the laser beam L1 in a predetermined region.
  • the laser beam L1 captures fine particles in the measurement sample SP by generating a photo-induced force.
  • "light-induced force” is used as a general term for dissipative force, gradient force, and intermaterial light-induced force.
  • Dissipative force is a force generated when light momentum is imparted to a substance in a dissipative process such as light scattering or light absorption.
  • Gradient force is a force that moves a material with photoinduced polarization to a stable point of electromagnetic potential when it is placed in a nonuniform electromagnetic field.
  • the optically induced force between substances is the sum of the force due to the longitudinal electric field and the force due to the transverse electric field (radiation field) generated from induced polarization in a plurality of optically excited substances.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the aggregation mechanism of latex beads (fine particles modified with host molecules) when a measurement sample is irradiated with laser light.
  • the optically induced force (more specifically, the intermaterial optically induced force and gradient force) causes beads B1 and B2 to gather near the beam waist.
  • the density of beads B1 and B2 near the beam waist becomes locally higher than the density of beads B1 and B2 at other positions (positions sufficiently distant from the beam waist).
  • An antigen-antibody reaction occurs between the modified second antibody B21 (host molecule) and the substance to be detected X, and beads B1 and B2 are bonded via the substance to be detected X (see Figures 4 and 5). .
  • the antigen-antibody reaction will be described later.
  • new substances to be detected X are successively supplied around the beam waist. Therefore, antigen-antibody reactions occur more easily than in a stationary liquid. Aggregates of beads B1 and B2 are formed by repeating the antigen-antibody reaction.
  • a dissipation force acts on the beads B1 and B2 in the same direction as the irradiation direction of the laser beam L1.
  • the beads B1 and B2 are pressed against the bottom surface of the microchannel 92 by the action of a dissipation force from above to below (FIG. 3).
  • FIG. 4 is a conceptual diagram for explaining the principle of detection of a certain glycoprotein.
  • a glycoprotein which is a substance to be detected, is detected using a so-called latex agglutination method. More specifically, in the example shown in FIG. 4, two types of beads B1 and B2 are prepared.
  • Each of the beads B1 and B2 includes a common bead body B0.
  • the bead body B0 may be a fine particle described below.
  • the bead body B0 is, for example, a resin bead (latex bead) made of polystyrene.
  • the bead body B0 has a size on the micrometer order (typically a diameter of about 1 ⁇ m to 5 ⁇ m), like a general latex bead.
  • the material of the bead body B0 may be other resins such as acrylic, polyolefin, polyethylene, and polypropylene.
  • bead body B0 is modified with first antibody B11 (first host molecule).
  • Avidin B12 and biotin B13 are used to modify the first antibody B11.
  • Avidin B12 is immobilized on the surface of the bead body B0 due to the interaction between avidin B12 and the bead body B0.
  • Biotin B13 labels the first antibody B11 by binding to the first antibody B11.
  • the first antibody B11 is modified on the surface of the bead body B0 due to the strong affinity between avidin B12 and biotin B13.
  • bead body B0 is modified with second antibody B21 (second host molecule).
  • second antibody B21 second host molecule
  • the second antibody B21 is also modified on the surface of the bead body B0 with avidin B22 and biotin B23.
  • the substance to be detected X in the example shown in FIG. 4 is a glycoprotein.
  • the substance to be detected X can be a cancer marker protein such as CEA or CA19-9.
  • the substance to be detected X has a site that is specifically bound by the host molecule. When the host molecule is an antibody, the site is called an "epitope,” “antigenic determinant,” or “antibody recognition site.”
  • the substance to be detected X may be a glycoprotein having multiple epitopes. Examples of such glycoproteins include CEACAM-5 in [Examples] described below.
  • the substance to be detected X causes an antigen-antibody reaction with the first antibody B11, and also causes an antigen-antibody reaction with the second antibody B21. Therefore, in the presence of the substance to be detected X, the beads B1 and B2 are bonded via the substance to be detected.
  • FIG. 4 shows an example in which beads B1 are modified with only one first antibody B11. However, the actual bead B1 is modified with more first antibody B11. The same applies to beads B2. Therefore, when a plurality of beads B1 and B2 are introduced into a sample containing the substance to be detected X, an aggregate of beads B1 and B2 is formed by aggregation of the plurality of beads B1 and B2 due to an antigen-antibody reaction.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram for explaining another principle of detecting glycoproteins. Two types of beads are not necessarily required depending on the type of glycoprotein that is the substance to be detected. In the example shown in FIG. 5, only one type of bead B3 is prepared. Bead B3 includes a bead body B0 and an antibody B31 that modifies the bead body B0.
  • the substance Y to be detected in this example is also a glycoprotein, and specifically, for example, an aggregate of CEACAM-5 in [Example] described below. Even when a plurality of beads B3 and the substance Y to be detected are combined, the plurality of beads B3 aggregate due to the antigen-antibody reaction with the substance Y to be detected, forming an aggregate of beads B3.
  • the substance to be detected ie, glycoprotein
  • the substance to be detected can be detected and quantified by forming bead aggregates using the principle described above and observing the aggregates.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining the aggregation mechanism of latex beads (beads B1 and B2) under defocus conditions. More specifically, the defocus condition is a condition when the beam waist of the laser beam L1 is located behind the microchannel 92 in the irradiation direction of the laser beam L1. In FIG. 6, the laser beam L1 (laser spot) on the bottom surface of the microchannel 92 is shown by a black circle.
  • the beads B1 and B2 irradiated with the laser beam L1 are pressed against the bottom surface of the microchannel 92 by the optically induced force (particularly the dissipation force) of the laser beam L1.
  • the beads B1 and B2 are arranged in a single layer on the bottom surface of the microchannel 92 (see the upper diagram in FIG. 6).
  • a multilayer structure of beads B1 and B2 is formed (see the middle diagram in FIG. 6).
  • the beads B1 and B2 that are not bound via the substance to be detected X are swept away in the flow direction of the measurement sample SP (see the lower diagram in FIG. 6).
  • the dark-colored area shown in FIG. 10 is considered to be an area where the multilayer structure of beads B1 and B2 is maintained as a result of the antigen-antibody reaction.
  • the dark region is a region that depends on the amount of beads B1 and B2 bound via the detection substance X.
  • the light-colored region is basically determined depending on the size of the laser spot, regardless of whether the beads B1 and B2 are bonded via the substance to be detected X. Therefore, under defocus conditions, by using the area of the dark-colored region as an evaluation target, it becomes possible to quantify the concentration of the detection substance X with high precision.
  • the area of the light-colored region and the area of the dark-colored region are both determined by automatically performing area measurement using image analysis software NIS Elements manufactured by Nikon Corporation.
  • a “sample” means a substance that contains a substance to be detected or a substance that may contain a substance to be detected.
  • the substance to be detected includes a glycoprotein. That is, the sample may contain glycoproteins.
  • the sample can be, for example, a biological sample from an animal (eg, human, cow, horse, pig, goat, chicken, rat, mouse, etc.).
  • Biological samples can include, for example, blood, tissues, cells, secretions, body fluids, and the like. Note that the "sample” may also include diluted or separated products (serum, plasma, etc.).
  • a “liquid sample” is a liquid containing a sample.
  • the sample is preferably a sample that is frozen after collection, or frozen for a predetermined period of time and then frozen.
  • the glycoproteins contained in the sample form multimers or nanoparticles, and the glycoproteins can be detected or quantified efficiently even when one type of host molecule is used.
  • the refrigerated storage period of the sample before freezing may be, for example, 1 day or more and 10 days or less.
  • glycoprotein refers to a substance in which sugar chains are bound to some of the amino acid residues constituting the protein.
  • glycoproteins include, but are not limited to, CEA, CA19-9, CD99, AFP, immunoglobulin, collagen, mucin, follicle-stimulating hormone, erythropoietin, transferrin, lectin, and the like.
  • the glycoprotein is preferably a cancer marker protein.
  • the cancer marker protein preferably contains at least one selected from the group consisting of CEA, CD99, AFP, and CA19-9.
  • fine particles refer to substances having a size from nanometer order to micrometer order.
  • the microparticles have modified host molecules, which will be described later.
  • the shape of the fine particles is not limited to a spherical shape, but may be an ellipsoidal shape, a rod shape, or the like.
  • the fine particles have an ellipsoidal shape, at least one of the length in the major axis direction and the length in the minor axis direction of the elliptical sphere may be within a range from the order of nanometers to the order of micrometers.
  • the fine particles are rod-shaped, at least one of the width and length of the rod may be within the range of nanometer order to micrometer order.
  • fine particles examples include metal nanoparticles, metal nanoparticle aggregates, metal nanoparticle integrated structures, semiconductor nanoparticles, organic nanoparticles, resin beads, magnetic beads, and particulate matter (PM). It will be done.
  • Metal nanoparticles are metal particles having a size on the order of nanometers.
  • a “metal nanoparticle aggregate” is an aggregate formed by aggregation of a plurality of metal nanoparticles.
  • a “metal nanoparticle integrated structure” is, for example, a structure in which multiple metal nanoparticles are fixed to the surface of a bead via an interaction site, and are arranged at intervals equal to or less than the diameter of the metal nanoparticles. It is a structure.
  • a “semiconductor nanoparticle” is a semiconductor particle having a size on the order of nanometers.
  • Organic nanoparticles are particles made of organic compounds having a size on the order of nanometers.
  • Resin beads are particles made of resin having a size from nanometer order to micrometer order. Examples of the resin beads include resin beads made of polystyrene.
  • Magnetic beads are magnetic particles (polymer fine particles in which magnetic material is dispersed or embedded) having a size ranging from nanometer order to micrometer order.
  • PM is particulate matter having a size on the order of micrometers.
  • the fine particles may further contain an additive that increases electrostatic repulsion.
  • additives that increase electrostatic repulsion include fluorescent dyes, surface modification reagents, and the like.
  • the functional group imparted by the surface modification reagent include a carboxyl group and an amino group.
  • the resin beads may contain a fluorescent dye.
  • resin beads containing a fluorescent dye hereinafter sometimes referred to as "fluorescent beads” have a strongly negative surface potential (zeta potential). Therefore, there is a tendency to suppress nonspecific adsorption of host molecules (eg, antibodies) modified on the microparticles, which in turn tends to improve measurement accuracy.
  • host molecules eg, antibodies
  • the term “from nanometer order to micrometer order” typically means a range of several nm to several hundred ⁇ m, preferably a range of 100 nm to 100 ⁇ m, and more preferably a range of 1 ⁇ m to several tens of ⁇ m. can mean a range of
  • the size of the fine particles is preferably 100 nm or more and 100 ⁇ m or less, more preferably 1 ⁇ m or more and 10 ⁇ m or less.
  • the wavelength of the laser light irradiated to the fine particles is 1064 nm, by setting the size of the fine particles within the above-mentioned range, Mie scattering tends to occur, which in turn tends to generate a strong photo-induced force.
  • the size of the fine particles can be measured, for example, by a dynamic light scattering method.
  • the fine particles may include two or more types of fine particles having different sizes, or may include two types of fine particles having different sizes.
  • a mixture of fluorescent beads with a size of 2 ⁇ m and fluorescent beads with a size of 1 ⁇ m may be used.
  • the mixing ratio for example, the ratio of the number of beads of 2 ⁇ m to beads of 1 ⁇ m is in the range of 1:8 to 1:0, preferably in the range of 1:1 to 1:0.01. By setting it in such a range, non-specific adsorption between beads is reduced, and it becomes possible to form a stable multilayer structure in the light concentration system.
  • host molecule refers to a substance that can specifically bind (or may be specifically attached to) a substance to be detected.
  • Combinations of host molecules and substances to be detected include, for example, antigen and antibody, sugar chain and protein, lipid and protein, low molecular compound (ligand) and protein, protein and protein, single-stranded DNA and single-stranded DNA, etc. can be mentioned.
  • the other can be used as the host molecule. That is, for example, when an antigen is the substance to be detected, an antibody can be used as the host molecule. Conversely, when an antibody is the substance to be detected, an antigen can be used as the host molecule.
  • the substance to be detected is the target DNA
  • the host molecule is the probe DNA.
  • anti-DNA antibodies that specifically bind to DNA may also be used as host molecules.
  • the antigen may include cancer marker proteins, allergens, microorganisms (bacteria, fungi, etc.), viruses, vesicles, and the like.
  • the type of antibody the type of cancer marker protein, allergen, microorganism, or virus that can be detected can also be changed.
  • the host molecule is immobilized (sometimes expressed as "modified") on the surface of the microparticle due to the interaction between the host molecule and the microparticle.
  • the type of interaction used to immobilize a host molecule on the surface of a fine particle is determined depending on the type of fine particle (for example, the material of the fine particle).
  • the above-mentioned interactions include, for example, covalent bonds, ionic bonds, metallic bonds, van der Waals forces, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, intermolecular forces (eg, hydrogen bonds), adsorption forces, and the like.
  • There are no particular limitations on the method for immobilizing host molecules on the surface of the microparticles and any known method can be used.
  • a host molecule When a host molecule is immobilized on the surface of a fine particle in a liquid, it is preferable to immobilize the host molecule in a liquid in which a blocking agent, which will be described later, is present, from the viewpoint of suppressing non-specific adsorption of the host molecule.
  • the host molecule specifically binds to the glycoprotein.
  • the host molecules include antibodies, Fab fragments, F(ab') 2 fragments, Fv fragments, scFv, and the like.
  • the host molecule preferably includes at least one selected from the group consisting of antibodies, Fab fragments, F(ab') 2 fragments, Fv fragments, and scFv.
  • the animal from which the above antibody is derived is not particularly limited, and examples thereof include mice, sheep, goats, camels, rats, rabbits, and the like.
  • Fab fragments, F(ab') 2 fragments, Fv fragments, and scFv can be produced by known methods (eg, methods using enzymes, methods using genetic engineering methods).
  • diluent means a liquid for diluting the sample.
  • the diluent includes a blocking agent and a buffer.
  • the solvent constituting the diluent is usually water such as ion-exchanged water or distilled water.
  • the method for producing the above-mentioned diluted liquid is not particularly limited and can be produced by a general method. For example, there is a method in which the blocking agent and the buffering agent are added to ion-exchanged water to a predetermined concentration and dissolved therein. The obtained diluted solution may then be subjected to post-treatment such as filter sterilization.
  • the pH of the diluted solution is higher than the isoelectric point of the glycoprotein. Further, it is preferable that the diluent is neutral. By doing so, it is possible to suppress non-specific adsorption of fine particles modified with host molecules to each other. As a result, the accuracy and sensitivity of glycoprotein detection and quantification using a photoconcentration system is improved.
  • the pH of the diluent is preferably 4.8 or more and 9 or less, more preferably 6 or more and 8 or less, and even more preferably 6 or more and 7.2 or less.
  • the pH of the diluted solution can be measured with a commonly used pH meter.
  • the pH of the diluent is preferably 4.7 or more and 7.0 or less, and 6.3 or more and 6.8 or less. It is more preferable that
  • the salt concentration of the diluted solution is such that fine particles modified with host molecules do not precipitate due to salting out.
  • the salt concentration of the diluent may be 0 ng/mL or more and 100 ng/mL or less, or 1 ng/mL or more and 10 ng/mL or less.
  • the sum of the concentrations of each salt is defined as the "salt concentration of the diluent".
  • the above salt concentration can be estimated, for example, from the fact that beads form during salting out due to photoconcentration, regardless of the concentration of the substance to be detected.
  • the salt concentration of the diluted solution is such that the microparticles modified with the host molecules do not precipitate due to salting out, and the concentration is such that the thickness of the electric double layer in the microparticles is reduced. preferable.
  • the concentration is expressed as the reciprocal of a parameter indicating the degree of attenuation of the surface potential called the Debye length.
  • the Debye length is closely correlated with the surface potential and zeta potential. Therefore, by measuring the zeta potential of the fine particles, it is possible to estimate the Debye length, and by extension, the thickness of the electric double layer.
  • the salt concentration of the diluent may be 80 ng/mL or more and 100 ng/mL, or 90 ng/mL or more and 100 ng/mL.
  • examples of the salt that may be included in the diluent include sodium chloride, potassium chloride, and the like.
  • the blocking agent is a substance for suppressing non-specific adsorption of the host molecules to each other in the sample.
  • the blocking agent examples include albumin (such as bovine serum albumin (BSA)), gelatin, casein, and goat serum.
  • the blocking agent preferably contains at least one selected from the group consisting of albumin, gelatin, casein, and goat serum. It goes without saying that the substance used as the blocking agent is different from the glycoprotein that is the substance to be detected.
  • the concentration of the blocking agent is lower than the concentration that suppresses non-specific adsorption of the host molecules to each other in an environment where no photo-induced force is acting on the host molecules. By doing so, it is possible to suppress non-specific adsorption of fine particles modified with host molecules to each other. As a result, the accuracy and sensitivity of glycoprotein detection and quantification using a photoconcentration system is improved.
  • the concentration of the blocking agent is preferably 0.000001% by mass or more and less than 0.001% by mass based on the diluted solution.
  • the concentration of the blocking agent can be determined by, for example, an ELISA method using an anti-BSA antibody or a photoconcentration system.
  • buffer refers to a substance that suppresses pH fluctuations in a target liquid (for example, in a diluent) due to changes in the environment within the liquid. Examples of changes in the environment in the liquid include changes in salt concentration, mixing with other liquids, and changes in temperature.
  • the buffering agent examples include phosphoric acid compounds, trishydroxymethylaminomethane, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), etc. .
  • the buffer preferably contains at least one selected from the group consisting of a phosphoric acid compound, trishydroxymethylaminomethane, HEPES, and MES.
  • the phosphoric acid compound include phosphoric acid, disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and the like.
  • the concentration of the buffer is not particularly limited, and may be, for example, 0.1 mM or more and 1000 mM or less, or 1 mM or more and 100 mM or less.
  • the diluent according to the present embodiment may further contain other components as long as the effects of the present invention are achieved.
  • the kit according to the present embodiment further includes a dispersion liquid for dispersing the fine particles modified with the host molecule.
  • the dispersion liquid preferably contains the blocking agent and the buffering agent.
  • the blocking agent contained in the dispersion may be the same component as the blocking agent contained in the diluent, or may be a different component. Specific examples of the blocking agent contained in the dispersion include those mentioned above.
  • the concentration of the blocking agent is preferably 0.00000001% by mass or more and 0.001% by mass or less based on the dispersion. By setting the concentration within such a range, it becomes possible to suppress non-specific adsorption of the fine particles.
  • the method for producing the above-mentioned dispersion liquid is not particularly limited, and can be produced by a general method. For example, there is a method in which the blocking agent and the buffering agent are added to ion-exchanged water to a predetermined concentration and dissolved therein. The resulting dispersion may then be subjected to post-treatments such as filter sterilization.
  • the buffer contained in the dispersion may be the same component as the buffer contained in the diluent, or may be a different component. Specific examples of the buffer contained in the dispersion include those mentioned above.
  • the concentration of the buffer is not particularly limited, and may be, for example, 0.1 mM or more and 1000 mM or less, or 1 mM or more and 100 mM or less.
  • the host molecule-modified microparticles and the dispersion liquid may be separately included in the kit. Further, the fine particles modified with the host molecule may be included in the kit in a state in which they are pre-dispersed in the dispersion liquid. That is, the dispersion liquid may contain fine particles in which the host molecules are modified.
  • the kit further includes a microchannel chip.
  • An example of the microchannel chip is the microchannel chip 90 shown in FIG. 1, for example.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of the microchannel chip 90 taken along line II-II in FIG.
  • the cross section of the microchannel 92 has, for example, a rectangular shape.
  • the width of the rectangle (channel width, length in the y direction) is 100 ⁇ m
  • the height (length in the z direction) of the rectangle is 100 ⁇ m.
  • the microchannel chip 90 is preferably made of a material that is transparent to the laser beam L1.
  • the material used for the microchannel chip 90 is preferably a material that does not exhibit anisotropy with respect to the polarized laser beam L1, such as glass or quartz.
  • the surface of the microchannel 92 in the microchannel chip 90 is preferably made of a material that does not nonspecifically adsorb a detection substance and host molecules.
  • the surface of the microchannel 92 in the microchannel chip 90 is preferably blocked with a blocking agent.
  • a blocking agent those listed above can be used.
  • the blocking method is not particularly limited and any known method can be used.
  • the surface of the microchannel 92 can be blocked by a method described in Examples described later.
  • the kit according to this embodiment may further include other configurations within the range where the effects of the present invention can be achieved.
  • Other components include, for example, an instruction manual describing how to use the kit, a microtube, the glycoprotein (positive control), and the like.
  • the kit according to this embodiment is used, for example, as follows. First, the diluent and the fine particles are added to the sample to prepare a measurement sample. At this time, the diluent may be added to the sample and then the fine particles may be added, or the fine particles may be added to the sample and then the diluent may be added. Further, the diluent and the fine particles may be added to the sample at the same time.
  • the "measurement sample” means a sample immediately before being subjected to measurement using the above-mentioned photoconcentration system.
  • the prepared measurement sample is measured using the above photoconcentration system to detect or quantify the glycoprotein contained in the measurement sample.
  • the measurement conditions at this time include, for example, the conditions described in [Example] described later.
  • the diluent includes a buffer,
  • the dispersion includes a blocking agent and the buffer,
  • the pH of the diluted solution is higher than the isoelectric point of the glycoprotein,
  • concentration of the blocking agent is lower than the concentration that suppresses non-specific adsorption of the host molecules in an environment where no photo-induced force is acting on the host molecules,
  • the salt concentration of the diluted solution is such that the fine particles modified with the host molecules do not precipitate due to salting out.
  • CEACAM-5" may be simply referred to as “CEA” below.
  • Antibody host molecule
  • Human CEACAM-5/CD66e DuoSet ELISA manufactured by R&D Systems, Cat. No. DY4128, ELISA kit
  • Biotinylated sheep anti-human CEACAM-5 antibody (antibody A): 36 ⁇ g/mL (dissolved in PBS containing 1% BSA, pH 7.2-7.4), the composition of the above PBS was 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1mM Na2HPO4 , 1.5mM KH2PO4 .
  • Mouse anti-human CEACAM-5 antibody (antibody B) 1 mg/mL (dissolved in PBS, pH 7.2 to 7.4), biotinylated by the method described below before use.
  • buffer 10mM phosphate buffer pH 6.7: 0.1 mol/L phosphate buffer pH 6.4 (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog No. 164-27135) was diluted 10 times with distilled water (DDW). It was prepared by 10mM phosphate buffer (pH 6.3): 0.1 mol/L phosphate buffer pH 6.0 ⁇ manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog No. 167-27125> was prepared by diluting it 10 times with DDW.
  • 10mM phosphate buffer (pH 7.0): 0.1 mol/L phosphate buffer pH 6.8 ⁇ manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog No. 161-27145> was prepared by diluting it 10 times with DDW.
  • Biotinylation of antibody B> Antibody B was biotinylated using EZ-Link TM Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh TM Format ⁇ Thermo Scientific TM / Cat.No. A39257> according to the following procedure. Biotinylation was performed by adding 13 ⁇ L of biotinylation reagent to 720 ⁇ L of antibody B dissolved at 1 mg/mL using 10 mM phosphate buffer pH 7.2 and leaving it on ice for 2 hours. After standing on ice, excess biotinylation reagent was removed using a desalting column (Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO) equilibrated with 10 mM phosphate buffer pH 6.7.
  • EZ-Link TM Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh TM Format ⁇ Thermo Scientific TM / Cat.No. A39257> according to the following procedure. Biotinylation was
  • 10 mM phosphate buffer pH 6.7
  • antibody A and antibody B were each diluted with 10 mM phosphate buffer (pH 6.7) to a final concentration of 20 ⁇ g/mL.
  • antibody A was diluted with 10 mM phosphate buffer (pH 6.7) so that the final concentration was 20 ⁇ g/mL.
  • Antibody B was diluted with PBS (pH 7.2 to 7.4) containing 1% BSA to a final concentration of 20 ⁇ g/mL.
  • a suspension containing streptavidin-modified beads and a solution containing antibody A or antibody B were mixed in equal amounts to form a mixed solution, and then allowed to stand at 42° C. for 1 hour.
  • the microtube containing the above mixture was placed in a centrifuge and centrifuged at 10,000 g for 5 minutes to sediment the antibody-modified beads at the bottom of the microtube. 83.3% by volume of the supernatant was removed from the microtube, and then the same amount of 10mM phosphate buffer (pH 6.7) was added to the microtube. This operation was repeated three times to wash the antibody-modified beads. Note that in the second and third washings, 10mM phosphate buffer (pH 6.3) was used instead of 10mM phosphate buffer (pH 6.7). By the above operations, antibody-modified beads were obtained. Based on the above-described operations, it is considered that the antibody-modified bead suspension contains 7.89 ng/mL of NaCl and 23.7 ng/mL of KCl.
  • phosphate buffers having different pHs were used as the diluted solution (pH: 7.2, 7.0, 6.7).
  • the above phosphate buffer was prepared by diluting a commercially available phosphate buffer (the above-mentioned phosphate buffer manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 times with DDW.
  • the three types of diluted solutions described above were used as they were as standard samples with a CEACAM-5 concentration of 0 pg/mL. That is, since four types of standard samples with different concentrations of CEACAM-5 were prepared for each phosphate buffer, 12 types of standard samples with different pHs and concentrations of CEACAM-5 were prepared.
  • the prepared measurement sample was injected into the microchannel of the microchannel chip in the optical concentration system, and the measurement sample was irradiated with light under the following conditions. Thereafter, the aggregate area of the beads, the aggregate area of the multilayer part, and the ratio of the multilayer part (hereinafter referred to as "multilayer ratio") in the measurement field of view were determined by the method described above. The results are shown in FIG. In FIG. 7, the vertical axis indicates the proportion of the multilayer portion, and the horizontal axis indicates the concentration of CEACAM-5 in the measurement sample.
  • Microchannel 100 ⁇ m x 100 ⁇ m Syringe: Inner diameter 2.3mm/Capacity 0.25mL Flow rate: 250 ⁇ L syringe setting, 0.05 ⁇ L/min Laser intensity: 265mW 5 minute irradiation x 40 Lens beam waist position: 45 ⁇ m below the bottom of the channel
  • the vertical axis indicates the aggregated area of beads, the aggregated area of the multilayered portion, or the ratio of the multilayered portion, and the horizontal axis indicates the concentration of CEACAM-5 in the liquid sample.
  • the final BSA concentration in the antibody-modified bead dispersion after washing was 2.16 x 10 -4 % for the bead suspension modified with antibody A, and 2.16 x 10 -4 % for the suspension of beads modified with antibody B. was 1.65 ⁇ 10 ⁇ 8 % in the suspension of modified beads.
  • BSA concentration is lower than the optimal concentration of BSA in the ELISA method described below (i.e., a concentration that suppresses nonspecific adsorption of host molecules to each other in an environment where no photo-induced force is acting on host molecules). concentration).
  • FIG. 10 is a photograph showing the vicinity of the laser spot when observing a sample with a BSA concentration of 0.0001%.
  • the concentration in the upper left indicates the concentration of CEACAM-5. From the results shown in FIG. 10, it was found that the dark colored area increased depending on the concentration of CEACAM-5.
  • Figure 11A shows the total aggregated area, aggregated area of the multilayered portion, or proportion of the multilayered portion (vertical axis) when observing a sample with a BSA concentration of 0.0001%, and the concentration of glycoprotein in the sample ( It is a graph showing the correlation with the horizontal axis).
  • the graph at the bottom right of Figure 11A shows a model function between the proportion of the multilayer portion (vertical axis) and the concentration of glycoprotein (CEACAM-5) in the sample (horizontal axis) using the least squares method based on the measured experimental data. This is the graph obtained.
  • the coefficient of determination (R 2 ) is 0.9728, suggesting that the concentration of glycoprotein in the sample (especially in the low concentration range of 0 to 15.6 pg/mL) can be determined with high accuracy based on the ratio of the multilayer portion. It was done.
  • the diluent is as low as possible in the neutral range
  • the pH of the diluent is higher than the isoelectric point of the glycoprotein
  • the concentration of the blocking agent is , the concentration is lower than the concentration that suppresses non-specific adsorption of host molecules in an environment where no photo-induced force is acting on the host molecules
  • the salt concentration of the diluted solution is the concentration that modifies the host molecules. It has been found that a concentration of fine particles that does not precipitate due to salting out is important for detecting trace amounts of glycoproteins contained in a sample quickly and with high sensitivity using a photoconcentration system.
  • a phosphate buffer containing 0.00001% BSA was used as a diluent so that the BSA concentration was similar to that in the antibody-modified bead dispersion described above, and antibody A was modified.
  • the experiment was carried out in the same manner as in Study 3 above, except that the suspension of beads modified with antibody B and the suspension of beads modified with antibody B were washed four times with a dispersion having the following composition.
  • the aggregate area of the beads, the aggregate area of the multilayer portion, and the ratio of the multilayer portion in the measurement field of view were determined using a predetermined method. The results are shown in Figure 11B. In FIG.
  • the vertical axis indicates the aggregate area of beads, the aggregate area of the multilayer portion, or the ratio of the multilayer portion, and the horizontal axis indicates the concentration of CEACAM-5 in the liquid sample.
  • Composition of dispersion used 10mM phosphate buffer (pH 6.3, free of NaCl and KCl) BSA concentration: 1.0 ⁇ 10 -5 %
  • plasma A plasma with a low concentration of CEACAM-5
  • plasma with a high concentration of CEACAM-5 will be referred to as "plasma D”.
  • Both plasma A and plasma D were stored refrigerated at 4°C for 1 to 4 hours after collection, and then stored at -80°C or lower. Note that plasma A and plasma D correspond to plasma A and plasma D in an experiment using a clinical sample described below.
  • plasma D was diluted 1000 times to 8000 times with a diluent having the following composition to prepare four types of measurement samples with different concentrations of CEACAM-5 (1.6 pg/mL, 3.2 pg/mL). mL, 6.6 pg/mL and 13.2 pg/mL).
  • a diluent having the following composition to prepare four types of measurement samples with different concentrations of CEACAM-5 (1.6 pg/mL, 3.2 pg/mL). mL, 6.6 pg/mL and 13.2 pg/mL).
  • the aggregated area of beads, aggregated area of multilayered parts, and ratio of multilayered parts in the measurement field of view were determined using a predetermined method. The results are shown in FIG. 12 (left side, calibration curve ⁇ ).
  • the vertical axis shows the collective area of the multilayer portion
  • the horizontal axis shows the concentration of CEACAM-5.
  • Composition of diluent 10mM phosphate buffer (p
  • samples containing glycoproteins are preferably samples that are frozen and stored for a predetermined period of time after collection.
  • Recombinant Human CEACAM-5 used in Study 1 above was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 6.3).
  • the prepared CEACAM-5 solution was diluted with 10 mM phosphate buffer (pH 6.3) in which BSA was dissolved to prepare a measurement sample (2-fold dilution series, CEACAM-5 concentration 3.9 pg/mL). ⁇ 250 pg/mL).
  • the concentration of BSA contained in the phosphate buffer was set to 0.001%, 0.0001%, or 0.00001%.
  • the experiment was conducted according to the manual attached to the ELISA kit, and the absorbance of each sample on the microplate was measured. The results are shown in FIG.
  • the optimal absorbance is considered to be 0.1 to 2.0. From the results in FIG. 14, it was found that in a range where the concentration of CEACAM-5 is 15.6 pg/mL or less, the absorbance is less than 0.1, and it is unsuitable to quantify this concentration range by ELISA.
  • plasma was collected using a prescribed method.
  • concentrations of CEACAM-5 in each of the obtained plasmas were determined by ELISA and were 2.4 ng/mL, 4.7 ng/mL, 6.3 ng/mL, and 13.2 ng/mL, respectively.
  • these four types of plasma will be referred to as "plasma A”, “plasma B”, “plasma C”, and “plasma D” in descending order of CEACAM-5 concentration.
  • the four types of plasma were refrigerated at 4°C for 1 to 4 hours, and then stored at -80°C or lower.
  • each of the obtained plasma samples was diluted 1000 times using a diluent (10mM phosphate buffer (pH 7.2)).
  • a diluent (10mM phosphate buffer (pH 7.2)).
  • An experiment was conducted in the same manner as above, and the proportion of multilayer parts in the measurement field of view was determined using a predetermined method. The results are shown in Figure 15 (left side).
  • Plasma A and plasma B described above were diluted with the diluent according to the present embodiment and then measured using a photoconcentration system. That is, the same procedure as in Study 3 above was carried out, except that each of the above plasma A and plasma B was diluted 1000 times with a diluent (10mM phosphate buffer, pH 6.3, 0.0001% BSA) and used as a measurement sample. An experiment was conducted using the method, and the proportion of the multilayer portion in the measurement field of view was determined using a predetermined method. The results are shown in FIG. 16 (upper right graph). The graph on the lower right of FIG.
  • FIG. 16 shows that the suspension of beads modified with antibody A and the suspension of beads modified with antibody B were prepared in the same manner using half the amounts used in Study 3 above. These are the results obtained when conducting an experiment. Further, the graph on the left side of FIG. 16 is an excerpt of the graph on the left side of FIG. 15.
  • a zeta potential/particle size/molecular weight measurement system ELSZneo product name, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.
  • the measurement conditions are as follows. The results are shown in Table 1. (Measurement conditions for zeta potential) Cell type: Zeta potential microdispo cell Solvent: Phosphate buffer (10mM, pH 6.7) Temperature: 25°C Applied voltage: -24.54 (V)
  • Recombinant Human CEACAM-5 (glycoprotein) (concentration 100 ng/mL) included in Human CEACAM-5/CD66e DuoSet ELISA (manufactured by R&D Systems, Cat. No. DY4128, ELISA kit) was diluted as described below.
  • a standard sample was prepared by diluting each sample with a solution to a final concentration of 7.8 pg/mL.
  • Three types of phosphate buffers having different pHs were used as the diluted solution (pH: 7.2, 6.7, 6.3).
  • the above phosphate buffer was prepared by diluting a commercially available phosphate buffer (the above-mentioned phosphate buffer manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 times with DDW.
  • the three types of diluted solutions described above were used as they were as standard samples with a CEACAM-5 concentration of 0 pg/mL. That is, since two types of standard samples with different concentrations of CEACAM-5 were prepared for each phosphate buffer, six types of standard samples with different pHs and concentrations of CEACAM-5 were prepared.
  • the prepared measurement sample was injected into the microchannel of the microchannel chip in the optical concentration system, and the measurement sample was irradiated with light under the following conditions. Thereafter, the aggregate area of the beads, the aggregate area of the multilayer part, and the ratio of the multilayer part (hereinafter referred to as "multilayer ratio") in the measurement field of view were determined by the method described above. The results are shown in FIG. In FIG. 18, the vertical axis shows the aggregate area of fluorescent beads, the aggregate area of the multilayer part, or the ratio of the multilayer part, and the horizontal axis shows the concentration of CEACAM-5 in the measurement sample.
  • Microchannel 100 ⁇ m x 100 ⁇ m Syringe: Inner diameter 2.3mm/Capacity 0.25mL Flow rate: 250 ⁇ L syringe setting, 0.1 ⁇ L/min Laser intensity: 265 mW Measured in 30 seconds after 5 minutes of irradiation x 40 lens beam waist position: 45 ⁇ m below the bottom of the channel
  • the aggregate area of the beads, the aggregate area of the multilayer portion, and the ratio of the multilayer portion in the measurement field of view were determined by the method described above.
  • the results are shown in FIG. In FIG. 19, the vertical axis shows the aggregate area of fluorescent beads, the aggregate area of the multilayer part, or the ratio of the multilayer part, and the horizontal axis shows the concentration of CEACAM-5 in the measurement sample.
  • Microchannel 100 ⁇ m x 100 ⁇ m Syringe: Inner diameter 1.03mm/capacity 50 ⁇ L Flow rate: 50 ⁇ L syringe setting, 0.1 ⁇ L/min Laser intensity: 265mW or 400mW Measured in 30 seconds after 5 minutes of irradiation x 40 lens beam waist position: 45 ⁇ m below the bottom of the channel
  • each of the obtained plasma samples was diluted 1000 times using a diluent (10mM phosphate buffer (pH 6.7, containing 0.00001% BSA)).
  • the experiment was carried out in the same manner as in the section ⁇ Study of calibration curve when using fluorescent beads'' above, except that the laser intensity was 400 mW and the laser irradiation time was 5 minutes or 4 minutes.
  • the aggregate area of the fluorescent beads, the aggregate area of the multilayer part, and the ratio of the multilayer part in the measurement field of view were determined using a predetermined method. The results are shown in Figures 20 and 21.In Figures 20 and 21, the vertical axis represents the concentration of the fluorescent beads. The aggregate area, the aggregate area of the multilayer portion, or the ratio of the multilayer portion is shown, and the horizontal axis shows the label of the plasma sample.
  • the aggregate area of the beads, the aggregate area of the multilayer portion, and the ratio of the multilayer portion in the measurement field of view were determined by the method described above.
  • the results are shown in FIG. 22.
  • the vertical axis indicates the aggregate area of fluorescent beads, the aggregate area of the multilayer portion, or the ratio of the multilayer portion, and the horizontal axis indicates the concentration of CEACAM-5 and sodium chloride concentration in the measurement sample.
  • a polytetrafluoroethylene tube that aspirates the measurement sample is filled with pre-coating buffer (10mM phosphate buffer, pH 6.7, 0.0001% BSA), and by discharging it, the inside of the PTFE tube is was blocked with BSA.
  • pre-coating buffer 10mM phosphate buffer, pH 6.7, 0.0001% BSA
  • the NaCl concentration in the diluted solution was 0.9 x 10 -5 % (w/v), and standard samples (5 types, 20 ⁇ L) with CEACAM-5 concentrations of 0 to 15.6 pg/mL were used.
  • a measurement sample was prepared in the same manner as in Experiment 2 in the above section (7. Effect of improving specificity due to salt concentration (ionic strength) of liquid sample) except for this.
  • the measurement sample (20 ⁇ L) was aspirated into the PTFE tube, and then the pre-coating buffer (20 ⁇ L) was continuously aspirated (see FIG. 23).
  • the PTFE tube was set in a syringe pump, injected into the microchannel, and the measurement sample was irradiated with light under the following conditions.
  • the aggregate area of the beads, the aggregate area of the multilayer portion, and the ratio of the multilayer portion in the measurement field of view were determined by the method described above.
  • the results are shown in FIG.
  • the vertical axis shows the aggregate area of fluorescent beads, the aggregate area of the multilayer part, or the ratio of the multilayer part, and the horizontal axis shows the concentration of CEACAM-5 in the measurement sample.
  • Microchannel 100 ⁇ m x 100 ⁇ m Syringe: Inner diameter 1.03mm/capacity 50 ⁇ L Flow rate: 50 ⁇ L syringe setting, 0.15 ⁇ L/min (However, when injecting the pre-coating buffer, the flow rate was 4 ⁇ L/min.)
  • Antibody modification to the fluorescent beads was performed according to the above-mentioned section of "Examination of the amount of antibody modification when using fluorescent beads.”
  • (suspension of fluorescent beads modified with antibodies) A1) Fluorescent beads modified with antibody A (size: 1 ⁇ m, antibody modification amount: half volume, density in suspension: 4.2 ⁇ 10 9 beads/mL)
  • B1 Fluorescent beads modified with antibody B (size: 1 ⁇ m, antibody modification amount: normal amount, density in suspension: 4.2 ⁇ 10 9 beads/mL)
  • the prepared measurement sample was injected into the microchannel of the microchannel chip in the optical concentration system, and the measurement sample was irradiated with light under the following conditions. Thereafter, the aggregate area of the beads, the aggregate area of the multilayer portion, and the ratio of the multilayer portion in the measurement field of view were determined by the method described above. The results are shown in FIG. 25.
  • the vertical axis indicates the aggregate area of fluorescent beads, the aggregate area of the multilayer portion, or the ratio of the multilayer portion, and the horizontal axis indicates the concentration of CEACAM-5 in the measurement sample.
  • Microchannel 100 ⁇ m x 100 ⁇ m Syringe: Inner diameter 1.03mm/capacity 50 ⁇ L Flow rate: 50 ⁇ L syringe setting, 0.1 ⁇ L/min Laser intensity: 400mW 5-minute irradiation x 40 beam waist position of lens: 45 ⁇ m below the bottom of the channel
  • the prepared measurement sample was injected into the microchannel of the microchannel chip in the optical concentration system, and the measurement sample was irradiated with light under the same conditions as in Experiment A. Thereafter, the aggregate area of the beads, the aggregate area of the multilayer portion, and the ratio of the multilayer portion in the measurement field of view were determined.
  • Standard samples (5 types) with CEACAM-5 concentrations ranging from 0 to 15.6 pg/mL were prepared using 10 mM phosphate buffer (pH 6.7, containing 0.00001% BSA) as a diluent. . Transfer 20 ⁇ L of each of the five standard samples to a microtube, and add the above suspension A1 (5 ⁇ L diluted 10 times), suspension A2 (5 ⁇ L), and suspension B1 (diluted 10 times) to it. 5 ⁇ L) and suspension B2 (5 ⁇ L) were added and mixed well. A measurement sample was prepared using the above procedure.
  • the number ratio of 2 ⁇ m beads to 1 ⁇ m beads was calculated to be approximately 1:0.8, and the volume ratio was calculated to be approximately 1:0.1.
  • the prepared measurement sample was injected into the microchannel of the microchannel chip in the optical concentration system, and the measurement sample was irradiated with light under the same conditions as in Experiment A. Thereafter, the aggregate area of the beads, the aggregate area of the multilayer portion, and the ratio of the multilayer portion in the measurement field of view were determined.
  • FIG. 26 shows the comparison results of the proportions of the multilayer portions obtained in Experiments A, B, and C.
  • the "mixing ratio of beads” is shown as a volume ratio. From the results in Figure 26, when the ratio of the number of 2 ⁇ m beads to 1 ⁇ m beads is approximately 1:0.4 (volume ratio: 1:0.05) (experiment A), non-specific adsorption of beads occurs. It was found that a stable multilayer structure was formed.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

光濃縮システムを用いて、試料中に含まれる糖タンパク質を検出するためのキットであって、ホスト分子が修飾された微粒子と、上記試料を希釈するための希釈液と、を含み、上記ホスト分子は、上記糖タンパク質に特異的に結合し、上記希釈液は、ブロッキング剤と、緩衝剤とを含み、上記希釈液のｐＨは、上記糖タンパク質の等電点より高く、上記ブロッキング剤の濃度は、光誘起力が上記ホスト分子に作用していない環境における、上記ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度であり、上記希釈液の塩濃度は、上記ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度である、キット。

Description

糖タンパク質を検出するためのキット
　本発明は、糖タンパク質を検出するためのキットに関する。
　試料に含まれる可能性がある被検出物質を検出する様々な技術が実用化されている。被検出物質の例としては、アレルギー物質、がん細胞由来のタンパク質（例えば、がん細胞由来の糖タンパク質）、核酸及び小胞などが挙げられる。たとえばタンパク質の検出技術として、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked　Immuno　Sorbent　Assay）法またはＳＰＲ（Surface　Plasmon　Resonance）法などが知られている。ＥＬＩＳＡ法により検出可能な被検出物質の最低濃度（検出限界）は、０．３ｎｇ／ｍＬ程度とされている。ＳＰＲ法の検出限界は、１μｇ／ｍＬ程度とされている。また、いずれの手法によっても被検出物質の検出には数時間を要する。
国際公開第２０１４／１９２９３７号 国際公開第２０２１／０４００２１号
　近年、光誘起力等の光の作用を利用して被検出物質を検出する技術が注目されている。たとえば国際公開第２０１４／１９２９３７号（特許文献１）には、試料に含まれる可能性がある被検出物質を検出する検出装置であって、前記被検出物質を特異的に付着可能なホスト分子で各々が修飾された複数の金属ナノ粒子と、前記複数の金属ナノ粒子を集合させるための偏光を発する第１の光源と、前記偏光を集光して、集光された前記偏光を、前記試料と前記複数の金属ナノ粒子とを含む液体に導入する対物レンズと、前記液体からの光を受ける受光器と、前記受光器からの信号に基づいて、前記被検出物質を検出する検出器とを備える、被検出物質の検出装置、が開示されている。
　また、国際公開第２０２１／０４００２１号（特許文献２）には、被検出物質に特異的に結合するホスト分子で各々が修飾された複数の微粒子を含む液体試料をポンプを用いてマイクロ流路に流通させるステップと、前記複数の微粒子の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を前記液体試料に照射するステップと、前記液体試料からの光を受けた受光器からの信号に基づいて前記被検出物質を検出するステップとを含む、被検出物質の検出方法、が開示されている。
　被検出物質の検出感度を高めたり、被検出物質の検出時間を短縮したりする技術、言い換えれば、微量の被検出物質を迅速に検出可能な技術に対する要望が常に存在する。特にがんの早期診断技術、健康診断及び体外診断用医薬品（例えば、一般用検査薬、医療用検査薬等）の開発等の観点から、糖タンパク質を検出する技術において、検出時間の短縮及び検出感度の向上が求められている。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、試料中に含まれる微量の糖タンパク質を、光濃縮システムを用いて、迅速かつ高感度に検出するためのキットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を進めた結果、試料を希釈するための希釈液を最適化することによって、光濃縮システムを用いて、試料中に含まれる微量の糖タンパク質を迅速かつ高感度に検出することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
　［１］本発明に係るキットは、光濃縮システムを用いて、試料中に含まれる糖タンパク質を検出するためのキットであって、
　ホスト分子が修飾された微粒子と、
　上記試料を希釈するための希釈液と、を含み、
　上記ホスト分子は、上記糖タンパク質に特異的に結合し、
　上記希釈液は、ブロッキング剤と、緩衝剤とを含み、
　上記希釈液のｐＨは、上記糖タンパク質の等電点より高く、
　上記ブロッキング剤の濃度は、光誘起力が上記ホスト分子に作用していない環境における、上記ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度であり、
　上記希釈液の塩濃度は、上記ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度である。
　［２］上記［１］において、上記希釈液は、中性であることが好ましい。
　［３］上記［１］又は［２］において、上記希釈液の塩濃度は、上記ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度であり、かつ上記微粒子における電気二重層の厚みが減少する濃度であることが好ましい。
　［４］上記［１］から［３］のいずれかにおいて、上記微粒子は、静電反発力を高める添加剤を更に含むことが好ましい。
　［５］上記［１］から［４］のいずれかにおいて、上記微粒子は、サイズが異なる２種類以上の微粒子を含むことが好ましい。
　［６］上記［１］から［５］のいずれかにおいて、上記ホスト分子は、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、及びｓｃＦｖからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
　［７］上記［１］から［６］のいずれかにおいて、上記ブロッキング剤は、アルブミン、ゼラチン、カゼイン、及びヤギ血清からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
　［８］上記［１］から［７］のいずれかにおいて、上記ブロッキング剤の濃度は、上記希釈液に対して、０．０００００１質量％以上０．００１質量％未満であることが好ましい。
　［９］上記［１］から［８］のいずれかにおいて、上記緩衝剤は、リン酸化合物、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ＨＥＰＥＳ、及びＭＥＳからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
　［１０］上記［１］から［９］のいずれかにおいて、上記キットは、上記ホスト分子を修飾した微粒子を分散するための分散液を更に含み、
　上記分散液は、上記ブロッキング剤と、上記緩衝剤とを含み、
　上記ブロッキング剤の濃度は、上記分散液に対して、０．０００００００１質量％以上０．００１質量％以下であることが好ましい。
　［１１］上記［１］から［１０］のいずれかにおいて、上記糖タンパク質は、がんマーカータンパク質であることが好ましい。
　［１２］上記［１１］において、上記がんマーカータンパク質は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、及び炭水化物抗原（ＣＡ１９－９など）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
　［１３］上記［１］から［１２］のいずれかにおいて、上記試料は、採取後に冷凍、もしくは所定の期間で冷蔵後に冷凍保存された試料であって、
　上記試料中に含まれる上記糖タンパク質は、凝集して多量体又はナノ粒子を形成していることが好ましい。
　［１４］上記［１］から［１３］のいずれかにおいて、上記キットは、マイクロ流路チップを更に含むことが好ましい。
　［１５］本発明に係る他のキットは、光濃縮システムを用いて、試料中に含まれる糖タンパク質を検出するためのキットであって、
　ホスト分子が修飾された微粒子と、
　上記試料を希釈するための希釈液と、
　上記ホスト分子を修飾した微粒子を分散するための分散液と、を含み、
　上記ホスト分子は、上記糖タンパク質に特異的に結合し、
　上記希釈液は、緩衝剤とを含み、
　上記分散液は、ブロッキング剤と、上記緩衝剤とを含み、
　上記希釈液のｐＨは上記糖タンパク質の等電点より高く、
　上記ブロッキング剤の濃度は、光誘起力が前記ホスト分子に作用していない環境における、上記ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度であり、
　上記希釈液の塩濃度は、上記ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度である、キット。
　上記によれば、試料中に含まれる微量の糖タンパク質を、光濃縮システムを用いて、迅速かつ高感度に検出するためのキットを提供することが可能となる。
図１は、光濃縮システムのメカニズムを説明する模式図である。 図２は、図１のＩＩ－ＩＩ線に沿うマイクロ流路チップ９０の模式断面図である。 図３は、測定試料へレーザ光を照射した時におけるラテックスビーズ（ホスト分子が修飾された微粒子）の凝集メカニズムを説明するための図である。 図４は、ある糖タンパク質の検出原理を説明するための概念図である。 図５は、糖タンパク質の他の検出原理を説明するための概念図である。 図６は、デフォーカス条件下におけるラテックスビーズの凝集メカニズムを説明するための図である。 図７は、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、多層部分の割合（縦軸）と測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図８は、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と、測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図９は、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図１０は、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、レーザスポットの近傍を示す写真である。 図１１Ａは、抗体Ｂ修飾ビーズ分散液中のBSA濃度1.65×10-8％、抗体Ａ修飾ビーズ分散液中のBSA濃度2.16×10-4％の場合に、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と、測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図１１Ｂは、抗体Ｂ修飾ビーズ分散液中および抗体Ａ修飾ビーズ分散液中のBSA濃度3.6×10-5％の場合に、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と、測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図１２は、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、多層部分の集合面積（縦軸）と、測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図１３は、試料を冷凍保存したときにおける測定試料中の糖タンパク質の状態を説明する模式図である。 図１４は、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定試料を測定したときにおける、光強度（縦軸）と、測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図１５は、光濃縮システムを用いて測定試料（血漿サンプル、横軸）を測定したときにおける、多層部分の集合面積（縦軸）を示すグラフ（左）と、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定試料（血漿サンプル、横軸）を測定したときにおける、糖タンパク質の濃度（縦軸）を示すグラフ（右）である。 図１６は、光濃縮システムを用いて測定試料（血漿サンプル、横軸）を測定したときにおける、多層部分の集合面積（縦軸）を示すグラフである。 図１７は、粒子表面からの距離と電位との関係を示すグラフである。 図１８は、蛍光ビーズをプローブ粒子とし、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係のｐＨ依存性、抗体修飾量依存性を示すグラフである。 図１９は、蛍光ビーズをプローブ粒子とし、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係のレーザ出力依存性を示すグラフである。 図２０は、蛍光ビーズをプローブ粒子とし、光濃縮システムを用いて測定試料（血漿サンプル、横軸）を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の集合面積（縦軸）を示すグラフである（レーザ照射時間５分）。 図２１は、蛍光ビーズをプローブ粒子とし、光濃縮システムを用いて測定試料（血漿サンプル、横軸）を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の集合面積（縦軸）を示すグラフである（レーザ照射時間４分）。 図２２は、蛍光ビーズをプローブ粒子とし、希釈液中の塩濃度を調製して、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と測定試料中の糖タンパク質の濃度及び塩化ナトリウム濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図２３は、マイクロ流路内のブロッキング方法を説明する模式図である。 図２４は、蛍光ビーズをプローブ粒子とし、マイクロ流路をブロッキングした光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図２５は、直径２μｍと直径１μｍの２種類の蛍光ビーズを体積比１：０．０５で混合してプローブ粒子とし、光濃縮システムを用いて測定試料を測定したときにおける、全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。 図２６は、サイズが異なる２種類の蛍光ビーズの混合比率を変えて準備した測定試料を、光濃縮システムを用いて測定したときにおける集積構造安定化のメカニズムの概念図と、多層部分の割合（縦軸）と測定試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。
　以下、本発明の一実施形態（以下「本実施形態」と記すことがある。）について図面を参照しながら詳細に説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。なお、図中同一または相当部分には同一符号を付して、その説明は繰り返さない。本明細書において「Ａ～Ｚ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｚ以下）を意味する。Ａにおいて単位の記載がなく、Ｚにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＺの単位とは同じである。
　≪光濃縮システムを用いて、試料中に含まれる糖タンパク質を検出するためのキット≫
　本実施形態に係るキットは、光濃縮システムを用いて、試料中に含まれる糖タンパク質を検出するためのキットであって、
　ホスト分子が修飾された微粒子と、
　上記試料を希釈するための希釈液と、を含み、
　上記ホスト分子は、上記糖タンパク質に特異的に結合し、
　上記希釈液は、ブロッキング剤と、緩衝剤とを含み、
　上記希釈液のｐＨは、上記糖タンパク質の等電点より高く、
　上記ブロッキング剤の濃度は、光誘起力が上記ホスト分子に作用していない環境における、上記ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度であり、
　上記希釈液の塩濃度は、ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度である。
　＜光濃縮システム＞
　本実施形態において、「光濃縮システム」とは、光誘起力、光誘起対流等の光が物質にもたらす作用および光発熱効果により液体中に対流を引き起こす効果を利用して、対象物質を所定の領域に密集または集積させる技術を意味する。本実施形態の一側面において、上記対象物質が液体中に存在している場合、上記光濃縮システムは、上記液体の所定の領域（光が照射されている領域）において上記対象物質を濃縮できる、とも解釈できる。本実施形態において、当該対象物質は、被検出物質である糖タンパク質、ホスト分子及び微粒子でありうる。以下、詳細に説明する。
　図１は、光濃縮システムのメカニズムを説明する模式図である。図２は、図１のＩＩ－ＩＩ線に沿うマイクロ流路チップ９０の模式断面図である。図１では、マイクロ流路チップ９０の基材９１に形成されているマイクロ流路９２に、測定試料ＳＰが導入されている。図１に示す例では、測定試料ＳＰは、インレット９２１から導入されてマイクロ流路９２を通り、アウトレット９２２から排出される。なお、マイクロ流路９２におけるサンプルＳＰの流通方向をｘ方向としている。上記測定試料ＳＰは、例えば、上記試料を上記希釈液で希釈した溶液である。上記測定試料ＳＰは、ホスト分子が修飾された微粒子を含む。
　マイクロ流路９２内に導入された測定試料ＳＰは、所定の領域においてレーザ光Ｌ１が照射される。上記レーザ光Ｌ１は、光誘起力を発生させることで測定試料ＳＰ中の微粒子を捕捉する。ここで、「光誘起力」とは、散逸力、勾配力および物質間光誘起力の総称として用いられる。散逸力とは、光散乱又は光吸収といった散逸的過程において、光の運動量が物質に与えられることによって発生する力である。勾配力は、光誘起分極が生じた物質が不均一な電磁場の中に置かれた場合に、電磁気学的なポテンシャルの安定点に物質を移動させる力である。物質間光誘起力とは、光励起された複数の物質中の誘起分極から生じる縦電場による力と横電場（輻射場）による力との和である。
　図３は、測定試料へレーザ光を照射した時におけるラテックスビーズ（ホスト分子が修飾された微粒子）の凝集メカニズムを説明するための図である。レーザ光Ｌ１のビームウエストが測定試料ＳＰ中に位置するように調整した上でレーザ光Ｌ１をマイクロ流路チップ９０に照射することで、光誘起力（より詳細には物質間光誘起力および勾配力）によりビーズＢ１、Ｂ２がビームウエストの近傍に集まる。これにより、ビームウエスト近傍におけるビーズＢ１、Ｂ２の密度が他の位置（ビームウエストから十分に離れた位置）におけるビーズＢ１、Ｂ２の密度と比べて局所的に高くなる。
　被検出物質Ｘ（糖タンパク質）がビームウエストの周囲に存在する場合、ビーズＢ１の表面に修飾された第１抗体Ｂ１１（ホスト分子）と被検出物質Ｘとの間、および、ビーズＢ２の表面に修飾された第２抗体Ｂ２１（ホスト分子）と被検出物質Ｘとの間で抗原抗体反応が起こり、ビーズＢ１とビーズＢ２とが被検出物質Ｘを介して結合する（図４、図５参照）。抗原抗体反応については、後述する。測定試料ＳＰをインレット９２１から新たに導入することで新たな被検出物質Ｘがビームウエストの周囲に次々に供給される。そのため、静止した液体中と比べて、抗原抗体反応が起こり易い。抗原抗体反応が繰り返されることでビーズＢ１、Ｂ２の凝集体が形成される。
　ビーズＢ１、Ｂ２の凝集体のサイズが増大するに従って、凝集体の周囲に存在する被検出物質Ｘが凝集体に遭遇する確率が高まるので、抗原抗体反応が起こる頻度が増加する。言い換えると、測定試料ＳＰに対するレーザ光Ｌ１の照射によってビーズＢ１，Ｂ２の凝集を加速させる「光誘導加速」を実現できる。その結果、ビーズＢ１，Ｂ２が高密度に凝集した凝集体が短時間で形成される。そして、形成した凝集体を光学的に検出することで、測定試料ＳＰが被検出物質Ｘを含むと迅速に判定できる。
　ビーズＢ１，Ｂ２には、物質間光誘起力および勾配力に加えて、散逸力がレーザ光Ｌ１の照射方向と同方向に作用する。下方照射の場合、ビーズＢ１，Ｂ２は、上方から下方への散逸力が作用することでマイクロ流路９２の底面に押し付けられる（図３）。
　図４は、ある糖タンパク質の検出原理を説明するための概念図である。本実施形態では、いわゆるラテックス（Ｌａｔｅｘ）凝集法を用いて被検出物質である糖タンパク質が検出される。より詳細には、図４に示す例では、２種類のビーズＢ１、Ｂ２が準備される。
　ビーズＢ１、Ｂ２の各々は、共通のビーズ本体Ｂ０を含む。ビーズ本体Ｂ０は、後述する微粒子でありうる。ビーズ本体Ｂ０は、例えば、ポリスチレンからなる樹脂ビーズ（ラテックスビーズ）である。ビーズ本体Ｂ０は、一般的なラテックスビーズと同様に、マイクロメートルオーダーのサイズ（典型的には直径１μｍ～５μｍ程度のサイズ）を有する。ビーズ本体Ｂ０の材料は、アクリル、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の他の樹脂であってもよい。
　ビーズＢ１において、ビーズ本体Ｂ０は、第１抗体Ｂ１１（第１のホスト分子）により修飾されている。第１抗体Ｂ１１の修飾には、アビジンＢ１２とビオチンＢ１３とが用いられている。アビジンＢ１２は、アビジンＢ１２とビーズ本体Ｂ０との間の相互作用により、ビーズ本体Ｂ０の表面に固定されている。ビオチンＢ１３は、第１抗体Ｂ１１と結合することで第１抗体Ｂ１１を標識する。第１抗体Ｂ１１は、アビジンＢ１２とビオチンＢ１３との間の強い親和性により、ビーズ本体Ｂ０の表面に修飾されている。
　ビーズＢ２において、ビーズ本体Ｂ０は、第２抗体Ｂ２１（第２のホスト分子）により修飾されている。第２抗体Ｂ２１も第１抗体Ｂ１１と同様に、アビジンＢ２２とビオチンＢ２３とによってビーズ本体Ｂ０の表面に修飾されている。
　本実施形態において、図４に示す例における被検出物質Ｘは、糖タンパク質である。具体的には、ＣＥＡ、ＣＡ１９-９等のがんマーカータンパク質などを被検出物質Ｘとすることができる。被検出物質Ｘは、上記ホスト分子によって特異的に結合される部位を有する。上記ホスト分子が抗体である場合、当該部位は「エピトープ」、「抗原決定基」、又は「抗体認識部位」と呼ばれる。上記被検出物質Ｘは、複数のエピトープを有する糖タンパク質であってもよい。そのような糖タンパク質としては、例えば、後述する［実施例］におけるCEACAM-5等が挙げられる。
　被検出物質Ｘは、第１抗体Ｂ１１との間で抗原抗体反応を起こすとともに、第２抗体Ｂ２１との間で抗原抗体反応を起こす。そのため、被検出物質Ｘの存在下において、ビーズＢ１とビーズＢ２とは、被検出物質Ｘを介して結合する。図４では、ビーズＢ１が１つの第１抗体Ｂ１１のみで修飾されている例を示す。しかし、実際のビーズＢ１は、より多くの第１抗体Ｂ１１により修飾されている。ビーズＢ２についても同様である。そのため、被検出物質Ｘを含む試料に複数のビーズＢ１、Ｂ２が導入されると、複数のビーズＢ１、Ｂ２が抗原抗体反応により凝集することでビーズＢ１、Ｂ２の凝集体が形成される。
　図５は、糖タンパク質の他の検出原理を説明するための概念図である。被検出物質である糖タンパク質の種類によっては２種類のビーズは必ずしも必要ではない。図５に示す例では、１種類のビーズＢ３のみが準備される。ビーズＢ３は、ビーズ本体Ｂ０と、ビーズ本体Ｂ０を修飾する抗体Ｂ３１とを含む。
　この例における被検出物質Ｙも糖タンパク質であり、具体的には、たとえば後述する［実施例］におけるCEACAM-5の凝集体等である。複数のビーズＢ３と被検出物質Ｙとを組み合わせた場合にも、複数のビーズＢ３が被検出物質Ｙとの抗原抗体反応により凝集し、ビーズＢ３の凝集体が形成される。
　本実施形態では上述したような原理を利用してビーズの凝集体を形成し、当該凝集体を観察することによって、被検出物質（すなわち、糖タンパク質）を検出、定量することができる。
　図６は、デフォーカス条件下におけるラテックスビーズ（ビーズＢ１、Ｂ２）の凝集メカニズムを説明するための図である。デフォーカス条件とは、より詳細には、レーザ光Ｌ１のビームウエストがマイクロ流路９２よりもレーザ光Ｌ１の照射方向後方に位置するときの条件である。図６では、マイクロ流路９２の底面におけるレーザ光Ｌ１（レーザスポット）を黒い円で示している。
　レーザ光Ｌ１の照射を受けたビーズＢ１，Ｂ２は、レーザ光Ｌ１の光誘起力（特に散逸力）によってマイクロ流路９２の底面に押し付けられる。これにより、マイクロ流路９２の底面上にビーズＢ１，Ｂ２が単層状に並ぶ（図６の上図参照）。その単層の上に他のビーズＢ１，Ｂ２がさらに押し付けられることで、ビーズＢ１，Ｂ２の多層構造が形成される（図６の中段の図参照）。ただし、被検出物質Ｘを介して結合されていないビーズＢ１，Ｂ２は、測定試料ＳＰの流通方向に押し流される（図６の下図参照）。このような、いわば「洗浄効果」の結果、被検出物質Ｘを介して結合したビーズＢ１，Ｂ２の多層構造が形成された領域が残る。例えば、図１０に示される濃色領域は、抗原抗体反応の結果、ビーズＢ１，Ｂ２の多層構造が維持された領域であると考えられる。
　このように、濃色領域は、被検出物質Ｘを介して結合したビーズＢ１，Ｂ２の量に依存する領域である。これに対し、薄色領域は、ビーズＢ１，Ｂ２が被検出物質Ｘを介して結合しているか否かにかかわらず、基本的にはレーザスポットの大きさに応じて定まる領域である。したがって、デフォーカス条件下では、濃色領域の面積を評価対象として用いることで、被検出物質Ｘの濃度を高精度に定量することが可能になる。
　本実施形態では便宜のため、濃色領域の面積を規格化する。具体的には、薄色領域の面積（画像の色が薄い輪郭内の全面積、以下単に「全面積」と記載することがある。）に対する濃色領域の面積の割合を「多層部分の割合」と定義する。
　多層部分の割合＝濃色領域の面積／全面積
　ここで、薄色領域の面積及び濃色領域の面積は、いずれも株式会社ニコン製の画像解析ソフトウェアNIS　Elementsを用いて面積測定を自動で行うことで求められる。
　＜試料＞
　本実施形態において、「試料」とは、被検出物質を含む物質または被検出物質を含む可能性がある物質を意味する。本実施形態において、被検出物質は、糖タンパク質を含む。すなわち、上記試料は、糖タンパク質を含みうる。上記試料は、たとえば動物（たとえばヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、ラット、マウスなど）からの生体試料であり得る。生体試料は、たとえば、血液、組織、細胞、分泌液、体液等を含み得る。なお、「試料」はそれらの希釈物または分離物（血清、血漿等）を含んでもよい。「液体試料」とは、試料を含有する液体である。
　本実施形態の一側面において、上記試料は、採取後に冷凍、もしくは所定の期間で冷蔵後に冷凍保存された試料であることが好ましい。このようにすることで、試料中に含まれる糖タンパク質が多量体またはナノ粒子を形成し、１種類のホスト分子を用いた場合でも効率よく上記糖タンパク質の検出または定量が可能になる。上記試料の冷凍前の冷蔵保存期間としては、例えば、１日以上１０日間以下であってもよい。
　（糖タンパク質）
　本実施形態において「糖タンパク質」とは、タンパク質を構成するアミノ酸残基の一部に糖鎖が結合した物質を意味する。上記糖タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、ＣＥＡ、ＣＡ１９－９、ＣＤ９９、ＡＦＰ、免疫グロブリン、コラーゲン、ムチン、濾胞刺激ホルモン、エリスロポエチン、トランスフェリン、レクチン等が挙げられる。本実施形態の一側面において、上記糖タンパク質は、がんマーカータンパク質であることが好ましい。上記がんマーカータンパク質は、ＣＥＡ、ＣＤ９９、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。
　＜微粒子＞
　本実施形態において「微粒子」とは、ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでのサイズを有する物質を意味する。本実施形態において、上記微粒子は、後述するホスト分子が修飾されている。微粒子の形状は、球形状に限定されるものではなく、楕円球形状またはロッド形状などであってもよい。微粒子が楕円球形状である場合、楕円球の長軸方向の長さおよび短軸方向の長さの少なくとも一方がナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでの範囲内であればよい。微粒子がロッド形状である場合、ロッドの幅および長さの少なくとも一方がナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでの範囲内であればよい。
　微粒子の例としては、金属ナノ粒子、金属ナノ粒子集合体、金属ナノ粒子集積構造体、半導体ナノ粒子、有機ナノ粒子、樹脂ビーズ、磁性ビーズ、微小粒子状物質（ＰＭ：Particulate　Matter）などが挙げられる。「金属ナノ粒子」とは、ナノメートルのオーダーのサイズを有する金属粒子である。「金属ナノ粒子集合体」とは、複数の金属ナノ粒子が凝集することによって形成された集合体である。「金属ナノ粒子集積構造体」とは、たとえば、複数の金属ナノ粒子が相互作用部位を介してビーズの表面に固定され、互いに隙間を設けて、金属ナノ粒子の直径以下の間隔で配置された構造体である。「半導体ナノ粒子」とは、ナノメートルのオーダーのサイズを有する半導体粒子である。「有機ナノ粒子」とは、ナノメートルオーダーのサイズを有する有機化合物からなる粒子である。「樹脂ビーズ」とは、ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでのサイズを有する樹脂からなる粒子である。樹脂ビーズとしては、例えば、ポリスチレンからなる樹脂ビーズが挙げられる。「磁性ビーズ」とは、ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでのサイズを有する磁性を帯びた粒子（磁性体を内部に分散または包埋したポリマー微粒子）である。「ＰＭ」とは、マイクロメートルオーダーのサイズを有する粒子状物質である。
　本実施形態の一側面において、上記微粒子は、静電反発力を高める添加剤を更に含んでいてもよい。ここで、「静電反発力を高める添加剤」としては、例えば、蛍光色素、及び表面修飾試薬等が挙げられる。上記表面修飾試薬によって付与される官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基等が挙げられる。上記微粒子が樹脂ビーズである場合、上記樹脂ビーズに蛍光色素が含まれていてもよい。後述する実施例において示すように、蛍光色素が含まれている樹脂ビーズ（以下、「蛍光ビーズ」と表記する場合がある。）は、表面電位（ゼータ電位）が強いネガティブになっている。そのため、微粒子に修飾されているホスト分子（例えば、抗体）同士の非特異的な吸着を抑制する傾向があり、ひいては測定精度が向上する傾向がある。蛍光ビーズ以外の他の「静電反発力を高める添加剤」を用いた場合も、同様のメカニズムが働くと本発明者らは考えている。
　本実施形態において、「ナノメートルオーダー」には、１ｎｍから１０００ｎｍ（＝１μｍ）までの範囲が含まれる。「マイクロメートルオーダー」には、１μｍから１０００μｍ（＝１ｍｍ）までの範囲が含まれる。したがって、「ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまで」には、１ｎｍから１０００μｍまでの範囲が含まれる。「ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまで」との用語は、典型的には数ｎｍ～数百μｍの範囲を意味し、好ましくは１００ｎｍ～１００μｍの範囲を意味し、より好ましくは１μｍ～数十μｍの範囲を意味し得る。
　本実施形態の一側面において、上記微粒子のサイズ（例えば、直径、長径、短径）は、１００ｎｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上１０μｍ以下であることがより好ましい。上記微粒子に照射するレーザ光の波長が１０６４ｎｍである場合、上記微粒子のサイズを上述のような範囲とすることによって、Ｍｉｅ散乱が発生しやすく、ひいては強い光誘起力が発生しやすい傾向がある。上記微粒子のサイズは、例えば動的光散乱法によって測定することが可能である。
　本実施形態の一側面において、上記微粒子は、サイズが異なる２種類以上の微粒子を含んでいてもよいし、サイズが異なる２種類の微粒子を含んでいてもよい。例えば、サイズが２μｍである蛍光ビーズと、サイズが１μｍである蛍光ビーズとを混合して用いてもよい。混合比率としては、例えば、２μｍのビーズと１μｍのビーズとの個数の比率が１：８～１：０の範囲が挙げられ、１：１～１：０．０１の範囲が好ましい。このような範囲とすることで、ビーズ同士の非特異的な吸着が少なく、かつ光濃縮システムにおいて安定した多層構造を形成することが可能になる。
　（ホスト分子）
　本実施形態において、「ホスト分子」とは、被検出物質に対して特異的に結合（特異的な付着であってもよい）することが可能な物質を意味する。ホスト分子と被検出物質との組み合わせとしては、たとえば、抗原と抗体、糖鎖とタンパク質、脂質とタンパク質、低分子化合物（リガンド）とタンパク質、タンパク質とタンパク質、一本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡなどが挙げられる。これらの特異的親和性を有する両者のうちのいずれか一方が被検出物質である場合に、他方をホスト分子として用いることができる。すなわち、たとえば抗原が被検出物質である場合には、抗体をホスト分子として用いることができる。逆に抗体が被検出物質である場合には、抗原をホスト分子として用いることができる。また、ＤＮＡのハイブリダイゼーションにおいては、被検出物質がターゲットＤＮＡであり、ホスト分子がプローブＤＮＡである。また、ＤＮＡと特異的に結合する抗ＤＮＡ抗体（たとえば、二重鎖ＤＮＡと特異的に結合する抗ｄｓＤＮＡ抗体、一本鎖ＤＮＡと特異的に結合する抗ｓｓＤＮＡ抗体など）もホスト分子として用いることができる。なお、抗原は、がんマーカータンパク質、アレルゲン、微生物（細菌、真菌など）、ウイルス、小胞などを含み得る。また、抗体の種類を変えることによって、検出可能ながんマーカータンパク質、アレルゲン、微生物またはウイルスの種類を変えることもできる。
　ホスト分子は、ホスト分子と微粒子との間の相互作用により微粒子の表面に固定される（「修飾される」と表現する場合がある。）。ホスト分子を微粒子の表面に固定するのに用いられる相互作用の種類は、微粒子の種類（例えば、微粒子の材質）に応じて定まる。上記相互作用は、例えば、共有結合、イオン結合、金属結合、ファンデルワールス力、静電的相互作用、疎水性相互作用、分子間力（たとえば水素結合）および吸着力などを含む。ホスト分子を微粒子の表面に固定する方法は、特に制限はなく公知の方法を採用することが可能である。液体中で、ホスト分子を微粒子の表面に固定する場合、ホスト分子の非特異的な吸着を抑制する観点から、後述するブロッキング剤が存在する液体中で行うことが好ましい。
　本実施形態において、上記ホスト分子は上記糖タンパク質に特異的に結合する。上記ホスト分子としては、例えば、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖなどが挙げられる。本実施形態の一側面において、上記ホスト分子は、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、及びｓｃＦｖからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。上記抗体の由来となる動物は特に制限されず、例えば、マウス、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラット、ウサギ等が挙げられる。Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片及びｓｃＦｖは、公知の手法（例えば、酵素を用いた方法、遺伝子工学的手法を用いた方法）によって製造することができる。
　＜希釈液＞
　本実施形態において「希釈液」とは、上記試料を希釈するための液体を意味する。上記希釈液は、ブロッキング剤と、緩衝剤とを含む。上記希釈液を構成する溶媒は、通常、イオン交換水、蒸留水等の水である。上記希釈液の製造方法は、特に制限無く、一般的な方法で製造可能である。例えば、イオン交換水に対して、上記ブロッキング剤及び上記緩衝剤を所定の濃度となるように加えて溶解させる方法が挙げられる。得られた希釈液は、その後フィルター滅菌等の後処理を行ってもよい。
　上記希釈液のｐＨは、上記糖タンパク質の等電点より高い。また、上記希釈液は中性であることが好ましい。このようにすることで、ホスト分子が修飾された微粒子同士の非特異的な吸着を抑制できる。その結果、光濃縮システムを用いた糖タンパク質の検出、定量の精度及び感度が向上する。具体的には、上記希釈液のｐＨは、４．８以上９以下であることが好ましく、６以上８以下であることがより好ましく、６以上７．２以下であることが更に好ましい。上記希釈液のｐＨは、一般的に用いられているｐＨメーターで測定できる。
　上記糖タンパク質が癌胎児性抗原（等電点：４．７）である場合、上記希釈液のｐＨは、４．７以上７．０以下であることが好ましく、６．３以上６．８以下であることがより好ましい。
　本実施形態において、上記希釈液の塩濃度は、ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度である。ホスト分子を修飾した微粒子の塩析を抑制することで、光濃縮システムを用いた糖タンパク質の検出、定量の精度及び感度が向上する。上記希釈液の塩濃度は、０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、１ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。ここで、上記希釈液中に含まれる塩が複数種類である場合、各塩の濃度の合計を「希釈液の塩濃度」とする。上記塩濃度は、例えば、光濃縮により塩析でビーズが被検出物質の濃度に依らず起こることから推定することが可能である。
　本実施形態の一側面において、上記希釈液の塩濃度は、上記ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度であり、かつ上記微粒子における電気二重層の厚みが減少する濃度であることが好ましい。このようにすることで、上記ホスト分子の上記糖タンパク質に対する結合特異性を更に向上させることができる。ここで、「上記微粒子における電気二重層の厚み」は、Ｄｅｂｙｅ長と呼ばれる表面電位の減衰の度合いを示すパラメータの逆数で表される。当該Ｄｅｂｙｅ長は、表面電位及びゼータ電位と密接に相関している。そのため、当該微粒子のゼータ電位を測定することでＤｅｂｙｅ長を見積もることが可能であり、ひいては上記電気二重層の厚みを見積もることができる。上記微粒子が蛍光ビーズである場合、上記希釈液の塩濃度は、８０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬであってもよいし、９０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
　本実施形態において、上記希釈液に含まれうる塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。
　（ブロッキング剤）
　本実施形態において、ブロッキング剤は、上記試料中において、上記ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制するための物質である。
　上記ブロッキング剤としては、例えば、アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等）、ゼラチン、カゼイン、ヤギ血清などが挙げられる。本実施形態の一側面において、上記ブロッキング剤は、アルブミン、ゼラチン、カゼイン、及びヤギ血清からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。なお、ブロッキング剤として用いられる物質は、被検出物質である糖タンパク質とは異なる物質であることは言うまでもない。
　本実施形態において、上記ブロッキング剤の濃度は、光誘起力が上記ホスト分子に作用していない環境における、上記ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度である。このようにすることで、ホスト分子が修飾された微粒子同士の非特異的な吸着を抑制できる。その結果、光濃縮システムを用いた糖タンパク質の検出、定量の精度及び感度が向上する。上記ブロッキング剤の濃度は、上記希釈液に対して、０．０００００１質量％以上０．００１質量％未満であることが好ましい。上記ブロッキング剤の濃度は、例えば、抗ＢＳＡ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法や光濃縮システムで求めることが可能である。
　（緩衝剤）
　本実施形態において「緩衝剤」とは、対象となる液体中（例えば、希釈液中）の環境が変化することによる、当該液体中のｐＨ変動を抑制する物質を意味する。上記液体中の環境の変化としては、例えば、塩濃度の変化、他の液体との混合、温度変化等が挙げられる。
　上記緩衝剤としては、例えば、リン酸化合物、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic　acid）、ＭＥＳ（2-(N-morpholino)ethanesulfonic　acid）などが挙げられる。本実施形態の一側面において、上記緩衝剤は、リン酸化合物、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ＨＥＰＥＳ、及びＭＥＳからなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。リン酸化合物としては、例えば、リン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。上記緩衝剤の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．１ｍＭ以上１０００ｍＭ以下であってもよいし、１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であってもよい。
　（その他の成分）
　本実施形態に係る希釈液は、本発明の効果が奏される範囲において、その他の成分を更に含んでもよい。
　＜分散液＞
　本実施形態に係るキットは、上記ホスト分子を修飾した微粒子を分散するための分散液を更に含むことが好ましい。上記分散液は、上記ブロッキング剤と、上記緩衝剤とを含むことが好ましい。上記分散液に含まれるブロッキング剤は、上記希釈液に含まれるブロッキング剤と同じ成分であってもよいし、異なる成分であってもよい。上記分散液に含まれるブロッキング剤の具体例は、上述したものが挙げられる。上記ブロッキング剤の濃度は、上記分散液に対して、０．０００００００１質量％以上０．００１質量％以下であることが好ましい。このような濃度範囲とすることで、上記微粒子の非特異的な吸着を抑制することが可能になる。上記分散液の製造方法は、特に制限無く、一般的な方法で製造可能である。例えば、イオン交換水に対して、上記ブロッキング剤及び上記緩衝剤を所定の濃度となるように加えて溶解させる方法が挙げられる。得られた分散液は、その後フィルター滅菌等の後処理を行ってもよい。
　上記分散液に含まれる緩衝剤は、上記希釈液に含まれる緩衝剤と同じ成分であってもよいし、異なる成分であってもよい。上記分散液に含まれる緩衝剤の具体例は、上述したものが挙げられる。上記緩衝剤の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．１ｍＭ以上１０００ｍＭ以下であってもよいし、１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であってもよい。
　本実施形態の一側面において、上記ホスト分子を修飾した微粒子と、上記分散液とは、別々に上記キットに含まれていてもよい。また、上記ホスト分子を修飾した微粒子は、上記分散液に予め分散している状態で上記キットに含まれていてもよい。すなわち、上記分散液は、上記ホスト分子を修飾した微粒子を含んでいてもよい。
　＜マイクロ流路チップ＞
　上記キットは、マイクロ流路チップを更に含むことが好ましい。上記マイクロ流路チップとしては、例えば、図１に示されるマイクロ流路チップ９０が挙げられる。図２は、図１のＩＩ－ＩＩ線に沿うマイクロ流路チップ９０の模式断面図である。図２に示すように、マイクロ流路９２の断面は、たとえば長方形形状を有する。一例として、長方形の横幅（流路幅、ｙ方向の長さ）は１００μｍであり、長方形の高さ（ｚ方向の長さ）は１００μｍである。
　マイクロ流路チップ９０は、レーザ光Ｌ１に対して透明な材料で構成されていることが好ましい。上記マイクロ流路チップ９０に用いられる材料は、たとえばガラスまたは石英のように、偏光であるレーザ光Ｌ１に対して異方性を示さない材料であることが好ましい。本実施形態の一側面において、マイクロ流路チップ９０におけるマイクロ流路９２の表面は、被検出物質及びホスト分子が非特異的に吸着しない材質で構成されていることが好ましい。
　本実施形態の一側面において、マイクロ流路チップ９０におけるマイクロ流路９２の表面は、ブロッキング剤でブロッキングされていることが好ましい。ブロッキング剤としては、上述で挙げられていたものを用いることができる。ブロッキングの方法としては、特に制限はなく公知の方法を用いることができる。例えば、後述する実施例に記載の方法でマイクロ流路９２の表面をブロッキングすることができる。
　＜その他の構成＞
　本実施形態に係るキットは、本発明の効果が奏される範囲において、その他の構成を更に含んでもよい。その他の構成としては、例えば、上記キットの使用方法が記載された説明書、マイクロチューブ、上記糖タンパク質（陽性対照）等が挙げられる。
　≪キットの使用方法≫
　本実施形態に係るキットは、例えば、以下のように用いられる。まず、上記試料に上記希釈液と上記微粒子とを加えて、測定試料を準備する。このとき、上記試料に上記希釈液を加えてから上記微粒子を加えてもよいし、上記試料に上記微粒子を加えてから上記希釈液を加えてもよい。また、上記希釈液と上記微粒子とを上記試料に同時に加えてもよい。ここで、「測定試料」とは、上記光濃縮システムを用いた測定に供する直前の試料を意味する。
　次に、準備した測定試料を上記光濃縮システムを用いて測定して、上記測定試料中に含まれる糖タンパク質を検出または定量する。このときの測定条件としては、例えば後述する［実施例］に記載の条件が挙げられる。
　以上、本実施形態に係るキットの詳細を説明した。従来から光濃縮システムを用いて微量の被検出物質を検出、定量することが期待されていたが、具体的にどのように測定試料を調製し、測定に供すればよいかは具体的に検討されていなかった。本実施形態では、試料の希釈に用いる希釈液を上述のような構成とすることによって、試料中に含まれる微量の糖タンパク質を、光濃縮システムを用いて、迅速かつ高感度に検出することが可能になった。より具体的には、従来から用いられているＥＬＩＳＡ法よりも１０～１００倍の感度向上が達成され、６０倍の迅速化が達成された。このような光濃縮システムを用いた迅速かつ高感度な検出技術は、がんの超早期診断の実現に寄与することが期待される。
　≪他の実施態様≫
　本実施形態に係る他のキットは、光濃縮システムを用いて、試料中に含まれる糖タンパク質を検出するためのキットであって、
　ホスト分子が修飾された微粒子と、
　上記試料を希釈するための希釈液と、
　上記ホスト分子を修飾した微粒子を分散するための分散液と、を含み、
　上記ホスト分子は、上記糖タンパク質に特異的に結合し、
　上記希釈液は、緩衝剤とを含み、
　上記分散液は、ブロッキング剤と、上記緩衝剤とを含み、
　上記希釈液のｐＨは上記糖タンパク質の等電点より高く、
　上記ブロッキング剤の濃度は、光誘起力が前記ホスト分子に作用していない環境における、上記ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度であり、
　上記希釈液の塩濃度は、上記ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度である。
　以下、本発明に係る実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下において「CEACAM-5」を単に「CEA」と表記する場合がある。
　≪１．抗体が修飾されたビーズの作製≫
　＜試薬の準備＞
　抗体が修飾されたビーズ（ホスト分子が修飾された微粒子）を作製するために、以下の試薬を準備した。
（ビーズ（微粒子））
　Streptavidin　Coated　Microsphere（ストレプトアビジンが修飾された樹脂ビーズ）：２μｍ　Plain（Polysciences社製、Cat.No.　24160、材質：ポリスチレン）：当該ビーズは、０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファーに１．２５％の濃度で懸濁している。当該リン酸ナトリウムバッファーには、ＮａＣｌ（８ｍｇ／ｍＬ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１０ｍｇ／ｍＬ）、アジ化ナトリウム（０．１％），及びグリセロール（５％）が含まれている。
（抗体（ホスト分子））
　Human　CEACAM-5/CD66e　DuoSet　ELISA（R&D　Systems社製、　Cat.No.　DY4128、ELISA用キット）に同梱されている以下の2種類の抗体を用いた。
　ビオチン化ヒツジ抗ヒトCEACAM-5抗体（抗体Ａ）：　３６μｇ／ｍＬ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳに溶解、ｐＨ７．２～７．４）、上記ＰＢＳの組成は、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、８．１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４である。
　マウス抗ヒトCEACAM-5抗体（抗体Ｂ）：１ｍｇ／ｍＬ（ＰＢＳに溶解、ｐＨ７．２～７．４）、後述する方法でビオチン化してから用いた。
（バッファー）
　１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７）：０．１ｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液ｐＨ６．４（富士フイルム和光純薬株式会社製、カタログＮｏ．１６４－２７１３５）を蒸留水（ＤＤＷ）にて１０倍希釈することで調製した。
　１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．３）：０．１ｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液ｐＨ６．０＜富士フイルム和光純薬株式会社製、カタログＮｏ．１６７－２７１２５＞をＤＤＷにて１０倍希釈することで調製した。
　１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．２）：０．１ｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液ｐＨ７．０＜富士フイルム和光純薬株式会社製、カタログＮｏ．１６８－２７１５５＞をＤＤＷにて１０倍希釈することで調製した。
　１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．０）：０．１ｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液ｐＨ６．８＜富士フイルム和光純薬株式会社製、カタログＮｏ．１６１－２７１４５＞をＤＤＷにて１０倍希釈することで調製した。
　＜抗体Ｂのビオチン化＞
　以下の手順にて、EZ-LinkTM　Sulfo-NHS-LC-Biotin,　No-WeighTMFormat　＜Thermo　ScientificTM/　Cat.No.　A39257＞を用いて抗体Ｂをビオチン化した。
　１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．２を用いて１ｍｇ／ｍＬに溶解した抗体Ｂ７２０μＬに、１３μＬのビオチン化試薬を添加し、氷上で２時間静置することでビオチン化を行った。氷上で静置後、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．７で平衡化した脱塩カラム（Zeba　Spin　Desalting　Columns　７Ｋ　ＭＷＣＯ）を用い、過剰ビオチン化試薬を除去した。
　以上の手順で、ビオチン化した抗体Ｂを得た。以降の記載では特に断りがない限り、「抗体Ｂ」の表記はビオチン化した抗体Ｂを意味する。
　＜ビーズへの抗体修飾＞
　ストレプトアビジン修飾ビーズの懸濁液から１８μＬ採取し、マイクロチューブに移した。上記マイクロチューブに１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７）を９０μＬ添加した。その後、上記マイクロチューブを遠心分離機にセットして、１００００ｇ×５分間の条件で遠心分離を行い、当該ビーズをマイクロチューブの底に沈降させた。上記マイクロチューブから上清を体積比で８３.３％除去し、その後１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７）を同量、上記マイクロチューブに添加した。この操作を５回繰り返して行うことで、ストレプトアビジン修飾ビーズを洗浄した。
　洗浄後のストレプトアビジン修飾ビーズを含む懸濁液に対して３倍希釈となるように、１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７）を上記マイクロチューブに添加した。
　後述する検討１～検討４の実験においては、抗体Ａ及び抗体Ｂは、それぞれ終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように、１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７）で希釈した。
　後述する検討５の実験においては、抗体Ａは、終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように、１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７）で希釈した。抗体Ｂは、終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２～７．４）で希釈した。
　ストレプトアビジン修飾ビーズを含む懸濁液と、抗体Ａ又は抗体Ｂを含む溶液とを等量で混合して混合液とした後、４２℃、１時間の条件で静置した。
　その後、上記混合液が含まれるマイクロチューブを遠心分離機にセットして、１００００ｇ×５分間の条件で遠心分離を行い、抗体が修飾されたビーズをマイクロチューブの底に沈降させた。上記マイクロチューブから上清を体積比で８３.３％除去し、その後１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７）を同量、上記マイクロチューブに添加した。この操作を３回繰り返して行うことで、抗体が修飾されたビーズを洗浄した。なお、２回目及び３回目の洗浄では、１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７）の代わりに１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．３）を用いて洗浄操作を行った。以上の操作により、抗体が修飾されたビーズを得た。上述の操作を踏まえると、抗体が修飾されたビーズの懸濁液には、７．８９ｎｇ／ｍＬのＮａＣｌと、２３．７ｎｇ／ｍＬのＫＣｌが含まれていると考えられる。
　≪２．光濃縮システムを用いた糖タンパク質の検出条件の検討≫
　＜検討１：液体試料のｐＨ依存性＞
　（液体試料の準備）
　Human　CEACAM-5/CD66e　DuoSet　ELISA（R&D　Systems社製、　Cat.No.　DY4128、ELISA用キット）に同梱されているRecombinant　Human　CEACAM-5（糖タンパク質）（濃度１００ｎｇ／ｍＬ）を、後述する希釈液で終濃度がそれぞれ７．８ｐｇ／ｍＬ、１５．６ｐｇ／ｍＬ及び３１．２ｐｇ／ｍＬとなるように希釈して、３種類の標準試料を準備した。上記希釈液は、ｐＨが異なる３種類のリン酸バッファーを用いた（ｐＨ：７．２、７．０、６．７）。上記リン酸バッファーは、市販されているリン酸バッファー（上述の富士フイルム和光純薬株式会社製のリン酸バッファー）をＤＤＷで１０倍希釈することで調製した。また、CEACAM-5の濃度が０ｐｇ／ｍＬの標準試料として、上述の３種類の希釈液をそのまま用いた。すなわち、各リン酸バッファーでCEACAM-5の濃度が異なる４種類の標準試料を準備しているため、ｐＨとCEACAM-5の濃度とが異なる１２種類の標準試料を準備したことになる。
　１２種類の標準試料２０μＬをそれぞれマイクロチューブに移し、そこに上述の「１．抗体が修飾されたビーズの作製」における抗体Ａが修飾されたビーズの懸濁液を２０μＬ加えて、よく混合した。以上の手順で１２種類の測定試料（ｐＨ６．７～７．２、CEACAM-5の濃度０～１５．６ｐｇ／ｍＬ）を準備した。
　（光濃縮システムによる検出）
　準備した測定試料を光濃縮システムにおけるマイクロ流路チップのマイクロ流路に注入し、以下の条件で上記測定試料に光を照射した。その後、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合（以下、「多層割合」）を上述の方法で求めた。結果を図７に示す。図７において、縦軸は多層部分の割合を示し、横軸は測定試料中のCEACAM-5の濃度を示す。
　光照射の条件
マイクロ流路：１００μｍ×１００μｍ
シリンジ：内径２．３ｍｍ／容量０．２５ｍＬ
流速：２５０μＬシリンジ設定、０．０５μＬ／ｍｉｎ
レーザ強度：　２６５ｍＷ　５分照射
ｘ４０レンズのビームウエストの位置：流路の底から４５μｍ下方
　図７の結果から、ｐＨを小さくすることでCEACAM-5の濃度０ｐｇ／ｍＬにおける多層部分の割合を低く抑えられることが分かった。このような結果が得られたのは、測定試料中のｐＨが６．７の場合に、水素イオンによる正電荷が付与され静電反発により、抗体修飾ビーズ同士の非特異的な吸着が抑制されたためであると考えられる。なお、希釈液のｐＨは、CEACAM-5の等電点（４．７）よりも高いことが分かった。
　＜検討２：ビームウエストの位置の検討＞
　希釈液として、以下の２種類のリン酸バッファーＡ又はＢを用いたこと、及び、測定時のビームウエストの位置を流路の底から６５μｍ下方に設定したこと以外は、上記検討１と同様の方法で実験を行い、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を所定の方法で求めた。結果を図８に示す。図８において、縦軸はビーズの集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合を示し、横軸は液体試料中のCEACAM-5の濃度を示す。
　用いた希釈液
　リン酸バッファーＡ（ｐＨ６．７、ＮａＣｌ及びＫＣｌを含まない）
　リン酸バッファーＢ（ｐＨ６．７～６．８、ＮａＣｌ及びＫＣｌを含まない）
　図８の結果から、測定時のビームウエストの位置を流路の底から６５μｍ下方に設定することで、ビームウエストの位置を流路の底から４５μｍ下方であるとき（図７参照）と比較して、感度と測定精度が向上することが分かった。
　＜検討３：ブロッキング剤の濃度の依存性＞
　希釈液として、以下のＢＳＡの濃度が異なる４種類のリン酸バッファーを用いたこと、及び、ビーズの懸濁液として、抗体Ａが修飾されたビーズの懸濁液と抗体Ｂが修飾されたビーズの懸濁液とをそれぞれ１０μＬ用いたこと、流速を０．１μｍ／ｍｉｎに変更したこと以外は、上記検討１と同様の方法で実験を行い、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を所定の方法で求めた。結果を図９に示す。図９において、縦軸はビーズの集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合を示し、横軸は液体試料中のCEACAM-5の濃度を示す。なお、修飾後、Wash（３回）により最終的な抗体修飾ビーズ分散液中のBSA濃度は、抗体Ａが修飾されたビーズの懸濁液では２．１６×１０－４％であり、抗体Ｂが修飾されたビーズの懸濁液では１．６５×１０－８％であった。
　用いた希釈液の基本組成
　１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．３、ＮａＣｌ及びＫＣｌを含まない）
　用いた希釈液のＢＳＡ濃度
　０．００００１％、０．０００１％、０．００１％又は０．０１％
　図９の結果から、ＢＳＡ濃度が０．０００１％である場合、CEACAM-5の濃度０ｐｇ／ｍＬにおける多層部分の集積を低く抑えられることが分かった。このＢＳＡ濃度はＥＬＩＳＡにおけるブロッキング剤としての濃度の最適値(０．００１％、図１４参照)より１桁低く、このような結果が得られたのは、ＢＳＡも光濃縮により濃縮されたことで抗体修飾ビーズ表面に効率良く吸着してブロッキング効果を発現したためと考えられる。なお、上記ＢＳＡ濃度は、後述するＥＬＩＳＡ法におけるＢＳＡの最適濃度より低い濃度（すなわち、光誘起力がホスト分子に作用していない環境における、ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度）であった。
　図１０は、ＢＳＡ濃度が０．０００１％であるときの試料を観察したときのレーザスポットの近傍を示す写真である。図１０において、左上の濃度は、CEACAM-5の濃度を示す。図１０の結果から、CEACAM-5の濃度に依存して濃色領域が増加していることが分かった。
　図１１Ａは、ＢＳＡ濃度が０．０００１％であるときの試料を観察したときの全体の集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合（縦軸）と、試料中の糖タンパク質の濃度（横軸）との相関関係を示すグラフである。図１１Ａの右下のグラフは、測定された実験データに基づき最小二乗法によって多層部分の割合（縦軸）と、試料中の糖タンパク質（CEACAM-5）の濃度（横軸）とのモデル関数を求めたグラフである。決定係数（Ｒ２）が０．９７２８であり、上記多層部分の割合に基づいて試料中の糖タンパク質の濃度（特に０～１５．６ｐｇ／ｍＬの低濃度範囲）を精度よく求められることが示唆された。
　＜検討４：液体試料の塩濃度依存性（イオン強度依存性）＞
　希釈液として、ＰＢＳを用いたこと以外は、上記検討１と同様の方法で実験を行い、測定視野におけるビーズの集合の様子を観察した。
　実験を行った結果、希釈液としてＰＢＳを用いた場合、ビーズの塩析が、被検出物質（CEACAM-5）の濃度によらず起こることが確認された。一方、上記検討１～３のようにリン酸バッファーを用いた場合は、ビーズの塩析は確認されなかった。この結果から、測定試料中の塩濃度（イオン強度）を小さくすることで、塩析でビーズが沈降することを抑制しうることが示唆された。
　以上、検討１、検討３及び検討４の結果から、希釈液は中性の範囲でなるべく低く、希釈液のｐＨは糖タンパク質の等電点より高い方が適していること、ブロッキング剤の濃度は、光誘起力がホスト分子に作用していない環境における、ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度であること、及び希釈液の塩濃度は、ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度であることが、試料中に含まれる微量の糖タンパク質を、光濃縮システムを用いて、迅速かつ高感度に検出するために重要であることが分かった。
　＜検討５：分散液中のブロッキング剤の濃度の検討＞
　検討５の実験においては、抗体Ａは、終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように、１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７）で希釈した。抗体Ｂは、終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように、０．５７％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２～７．４）で希釈した。このように調製することで、抗体Ａを含む溶液及び抗体Ｂを含む溶液は、ともにＢＳＡが終濃度０．５６％で含まれる溶液となった。さらに、修飾後、Wash（4回）により最終的な抗体修飾ビーズ分散液中のBSA濃度は(1/6)4倍となる事から0.28×(1/6)5＝3.6×10-5％となった。
　その後の操作については、上記の抗体修飾ビーズ分散液中のBSA濃度と同程度のBSA濃度となるように、希釈液として０．００００１％ＢＳＡを含むリン酸バッファーを用いたこと、抗体Ａが修飾されたビーズの懸濁液と抗体Ｂが修飾されたビーズの懸濁液とをそれぞれ、以下の組成の分散液で４回洗浄した後に用いたこと以外は、上記検討３と同様の方法で実験を行い、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を所定の方法で求めた。結果を図１１Ｂに示す。図１１Ｂにおいて、縦軸はビーズの集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合を示し、横軸は液体試料中のCEACAM-5の濃度を示す。
　用いた分散液の組成
　１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．３、ＮａＣｌ及びＫＣｌを含まない）
　ＢＳＡ濃度：１．０×１０－５％
　図１１Ｂの結果から、所定の濃度のＢＳＡを含む分散液を用いて、抗体Ａ又は抗体Ｂが修飾されたビーズの懸濁液を調製した方が、直線性に優れる検量線を得ることができた。
　≪３．糖タンパク質を含む試料の保存方法≫
　糖タンパク質を含む試料の保存方法が、光濃縮システムを用いた糖タンパク質の定量に影響するかどうか、以下の実験で検証した。
　まず大腸癌の患者２名から採血を行い、所定の方法で血漿を回収した。得られた血漿それぞれについて、ＥＬＩＳＡでCEACAM-5（マーカータンパク質）の濃度を求めたところ、それぞれ２．４ｎｇ／ｍＬ、１３．２ｎｇ／ｍＬであった。以降、CEACAM-5の濃度が低い血漿を「血漿Ａ」と記載し、CEACAM-5の濃度が高い血漿を「血漿Ｄ」と記載する。血漿Ａ及び血漿Ｄは共に採取後４℃で１～４時間冷蔵保存後、－８０℃以下で保存した。なお、血漿Ａ及び血漿Ｄは、後述する臨床サンプルを用いた実験における、血漿Ａ及び血漿Ｄに対応する。
　次に、血漿Ｄを下記の組成を有する希釈液で１０００倍～８０００倍に希釈して、CEACAM-5の濃度が異なる４種類の測定試料を準備した（１．６ｐｇ／ｍＬ、３．２ｐｇ／ｍＬ、６．６ｐｇ／ｍＬ及び１３．２ｐｇ／ｍＬ）。準備した４種類の測定試料について、上記検討１と同様の方法で実験を行い、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を所定の方法で求めた。結果を図１２に示す（左側、検量線α）。図１２において、縦軸は多層部分の集合面積を示し、横軸はCEACAM-5の濃度を示す。
　希釈液の組成：１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．２）
　一方、血漿Ａについては、上記希釈液で１０００倍に希釈した後に、上記検討１で用いたRecombinant　Human　CEACAM-5を添加することで、CEACAM-5の濃度が異なる５種類の測定試料を準備した（２．４ｐｇ／ｍＬ、４．８ｐｇ／ｍＬ、７．２ｐｇ／ｍＬ、９．６ｐｇ／ｍＬ及び１２．０ｐｇ／ｍＬ）。準備した５種類の測定試料について、上記検討１と同様の方法で実験を行い、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を所定の方法で求めた。結果を図１２に示す（右側、検量線β）。
　図１２の結果から、血漿Ｄを用いた実験ではCEACAM-5の濃度に依存して多層部分の集合面積が増加していることが分かった。一方血漿Ａを用いた実験ではCEACAM-5の濃度と、多層部分の集合面積との間に相関性は見られなかった。本実験では、抗体Ａが修飾されたビーズのみを用いているにも関わらず、血漿Ｄから準備した測定試料では、ビーズが効率よく集合していた。抗体Ａに対するCEACAM-5のエピトープが１つであることを踏まえると、血漿を冷凍保存することでCEACAM-5が多量体を形成し、ビーズの集合に寄与していると考えられる（図１３の左上側の図）。一方、血漿Ａから準備した測定試料では、冷凍保存を行っていないRecombinant　Human　CEACAM-5を後から添加している。添加されたCEACAM-5は、モノマー（単量体）であると考えられ、ビーズが効率よく集合できなかったと考えられる（図１３の右上の図）。以上の結果から、糖タンパク質を含む試料は、採取後に所定の期間で冷凍保存された試料であることが好ましいと考えられた。
　≪４．比較例：ＥＬＩＳＡ法による定量（低濃度領域）≫
　従来法であるＥＬＩＳＡ法において、１５．６ｐｇ／ｍＬ以下の濃度の定量が可能かどうか検証した。使用したＥＬＩＳＡキットは以下のものを用いた。
　（ＥＬＩＳＡキット）
　Human　CEACAM-5/CD66e　DuoSet　ELISA　(R&D　Systems)
　Duo　Set　Ancillary　Reagent　Kit2　(R&D　Systems)
　上記検討１で用いたRecombinant　Human　CEACAM-5を、１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．３）に溶解した。次に、調製したCEACAM-5の溶液を、ＢＳＡが溶解した１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．３）で希釈して測定用試料とした（２倍希釈系列、CEACAM-5の濃度３．９ｐｇ／ｍＬ～２５０ｐｇ／ｍＬ）。このとき、上記リン酸バッファーに含まれるＢＳＡの濃度を０．００１％、０．０００１％又は０．００００１％とした。ＥＬＩＳＡキットに添付のマニュアルにしたがって、実験を行いマイクロプレート上の各サンプルの吸光度を測定した。結果を図１４に示す。
　ＥＬＩＳＡ法で対象タンパク質を定量する場合、最適な吸光度は、０．１～２．０と考えられている。図１４の結果からCEACAM-5の濃度が１５．６ｐｇ／ｍＬ以下の範囲では、吸光度が０．１を下回っており、この濃度範囲をＥＬＩＳＡ法で定量するのは不向きであることが分かった。
　≪５．臨床サンプルを用いた実験≫
　＜光濃縮システムと従来法（ＥＬＩＳＡ法）との比較検討＞
　臨床で得られた血漿サンプルを試料として用いた場合でも光濃縮システムを用いた糖タンパク質の定量が可能であるかどうか、以下の実験で検証した。
　まず大腸癌の患者４名から採血を行い、所定の方法で血漿を回収した。得られた血漿それぞれについて、ＥＬＩＳＡでCEACAM-5の濃度を求めたところ、それぞれ２．４ｎｇ／ｍＬ、４．７ｎｇ／ｍＬ、６．３ｎｇ／ｍＬ及び１３．２ｎｇ／ｍＬであった。以降、これら4種類の血漿をCEACAM-5の濃度が低い順に、「血漿Ａ」、「血漿Ｂ」、「血漿Ｃ」及び「血漿Ｄ」と記載する。4種類の血漿は、共に採取後４℃で１～４時間冷蔵保存後、－８０℃以下で保存した。
　光濃縮システムを用いた測定では、得られた血漿サンプルそれぞれを、希釈液（１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．２））を用いて１０００倍に希釈して用いたことを除いては、上記検討１と同様の方法で実験を行い、測定視野における多層部分の割合を所定の方法で求めた。結果を図１５に示す（左側）。
　比較実験として従来法であるＥＬＩＳＡ法でも同様の測定を行った。ＥＬＩＳＡ法では、得られた血漿サンプルそれぞれを、希釈液（１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．２））を用いて１０倍に希釈して用いたことを除いては、上記「４．比較例：ＥＬＩＳＡ法による定量（低濃度領域）」と同様の方法で実験を行い、血漿サンプル中におけるCEACAM-5の濃度を求めた。結果を図１５に示す（右側）。これらの実験結果から、光濃縮システムを用いた測定は、従来法と比較して１００倍の高感度化が可能となり、複数の血漿サンプル間におけるCEACAM-5濃度の大小の相関も確認できることが分かった。
　＜本実施形態に係るキットを用いた、臨床サンプルの測定＞
　上述の血漿Ａ及び血漿Ｂについて、本実施形態に係る希釈液で希釈してから光濃縮システムによる測定を行った。すなわち、上記血漿Ａ及び血漿Ｂそれぞれを、希釈液（１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．３、０．０００１％ＢＳＡ）で１０００倍に希釈して測定試料としたこと以外は、上記検討３と同様の方法で実験を行い、測定視野における多層部分の割合を所定の方法で求めた。結果を図１６に示す（右上のグラフ）。なお、図１６の右下のグラフは、抗体Ａが修飾されたビーズの懸濁液及び抗体Ｂが修飾されたビーズの懸濁液それぞれを、上記検討３で用いた量の半分の量で同様の実験を行ったときの結果である。また、図１６の左側のグラフは、図１５の左側のグラフを抜粋したグラフである。
　図１６の実験結果から、用いる希釈液のｐＨを低くして、添加するＢＳＡを最適化することによって、検出シグナル（多層部分の割合）が３倍以上に増大して、検出感度の向上につながることが分かった。
　≪６．ビーズの表面電位による非特異的な吸着の抑制効果≫
　ビーズの表面電位が、当該ビーズに修飾された抗体の非特異的な吸着にどのような影響を及ぼしているか検討するため、以下の実験を行った。
　＜ビーズのゼータ電位の測定＞
　まず予備実験としてビーズのゼータ電位を測定するため、以下の２種類のビーズを準備した（図１７に示すようにゼータ電位は、固定層と拡散層から成る電気二重層の厚みや表面電位の強さを表す指標となる。）。なお、非蛍光ビーズは、上述の「１．抗体が修飾されたビーズの作製」～「３．糖タンパク質を含む試料の保存方法」及び「５．臨床サンプルを用いた実験」の項において用いられているビーズである。
（ビーズ（微粒子））
　非蛍光ビーズ：　Streptavidin　Coated　Microsphere　２μｍ　Plain（Polysciences社製、Cat.No.　24160、材質：ポリスチレン）
　蛍光ビーズ：　Streptavidin　Fluoresbrite　YG　Coated　Microsphere　２μｍ（Polysciences社製、Cat.No.　24159、材質：ポリスチレン）
　測定装置は、ゼータ電位・粒子径・分子量測定システムＥＬＳＺｎｅｏ（製品名、大塚電子株式会社製）を用いた。測定条件は以下の通りである。結果を表１に示す。
　（ゼータ電位の測定条件）
セルタイプ：ゼータ電位微量ディスポセル
溶媒：リン酸バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．７）
温度：２５℃
印加電圧：－２４．５４（Ｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、非蛍光ビーズはゼータ電位がネガティブであり、蛍光ビーズはゼータ電位が強いネガティブでありビーズ間の静電反発が強いことが分かった。
　＜蛍光ビーズを用いたときの抗体修飾量の検討＞
　蛍光ビーズは非蛍光ビーズとは表面電位（ゼータ電位）が異なるため、抗体の修飾量を変化させたとき、ビーズの集合面積、多層部分の集合面積等がどのように影響されるか検討した（図１８）。蛍光ビーズへの抗体修飾は、上述の「１．抗体が修飾されたビーズの作製」の項に準じて行った。このとき、抗体Ａを含む溶液及び抗体Ｂを含む溶液は、各抗体の終濃度がそれぞれ１０μｇ／ｍＬ（半量）、２０μｇ／ｍＬ（通常量）、４０μｇ／ｍＬ（２倍量）となるように、１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７、０．００００１％のＢＳＡを含む）で希釈することで準備した。この方法により、抗体修飾量が「半量」、「通常量」又は「２倍量」のビーズの懸濁液を準備した。
　（液体試料の準備）
　Human　CEACAM-5/CD66e　DuoSet　ELISA（R&D　Systems社製、　Cat.No.　DY4128、ELISA用キット）に同梱されているRecombinant　Human　CEACAM-5（糖タンパク質）（濃度１００ｎｇ／ｍＬ）を、後述する希釈液で終濃度がそれぞれ７．８ｐｇ／ｍＬとなるように希釈して、標準試料を準備した。上記希釈液は、ｐＨが異なる３種類のリン酸バッファーを用いた（ｐＨ：７．２、６．７、６．３）。上記リン酸バッファーは、市販されているリン酸バッファー（上述の富士フイルム和光純薬株式会社製のリン酸バッファー）をＤＤＷで１０倍希釈することで調製した。また、CEACAM-5の濃度が０ｐｇ／ｍＬの標準試料として、上述の３種類の希釈液をそのまま用いた。すなわち、各リン酸バッファーでCEACAM-5の濃度が異なる２種類の標準試料を準備しているため、ｐＨとCEACAM-5の濃度とが異なる６種類の標準試料を準備したことになる。
　６種類の標準試料２０μＬをそれぞれマイクロチューブに移し、そこに上述の抗体Ａが修飾された蛍光ビーズの懸濁液（１０μＬ）及び抗体Ｂが修飾された蛍光ビーズの懸濁液（１０μＬ）を加えて、よく混合した。以上の手順で１８種類の測定試料（ｐＨ６．３～７．２、CEACAM-5の濃度０ｐｇ／ｍＬ又は７．８ｐｇ／ｍＬ、抗体修飾量「半量」、「通常量」、「２倍量」）を準備した。
　（光濃縮システムによる検出）
　準備した測定試料を光濃縮システムにおけるマイクロ流路チップのマイクロ流路に注入し、以下の条件で上記測定試料に光を照射した。その後、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合（以下、「多層割合」）を上述の方法で求めた。結果を図１８に示す。図１８において、縦軸は蛍光ビーズの集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合を示し、横軸は測定試料中のCEACAM-5の濃度を示す。
　光照射の条件
マイクロ流路：１００μｍ×１００μｍ
シリンジ：内径２．３ｍｍ／容量０．２５ｍＬ
流速：２５０μＬシリンジ設定、０．１μＬ／ｍｉｎ
レーザ強度：　２６５ｍＷ　５分照射後、３０秒で計測
ｘ４０レンズのビームウエストの位置：流路の底から４５μｍ下方
　図１８の結果から、蛍光ビーズでは、ｐＨ６．７で、抗体修飾量が半量であるとき、CEACAM-5の濃度０ｐｇ／ｍＬにおける多層部分の割合をもっとも低く抑えられることが分かった。この結果は、蛍光ビーズ同士の非特異的な吸着が十分に抑制できていることを示している。
　＜蛍光ビーズを用いたときの検量線の検討＞
　希釈液として、ｐＨ６．７のリン酸バッファー（１０ｍＭ）を用いたこと、蛍光ビーズの懸濁液として、抗体Ａ及び抗体Ｂともに抗体修飾量「半量」のものを用いたこと、CEACAM-5の濃度が０～１５．６ｐｇ／ｍＬである標準試料（５種類）を用いたこと、以外は上記＜蛍光ビーズを用いたときの抗体修飾量の検討＞における（液体試料の準備）の欄と同様の方法で測定試料を準備した。準備した測定試料を光濃縮システムにおけるマイクロ流路チップのマイクロ流路に注入し、以下の条件で上記測定試料に光を照射した。その後、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を上述の方法で求めた。結果を図１９に示す。図１９において、縦軸は蛍光ビーズの集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合を示し、横軸は測定試料中のCEACAM-5の濃度を示す。
　光照射の条件
マイクロ流路：１００μｍ×１００μｍ
シリンジ：内径１．０３ｍｍ／容量５０μＬ
流速：５０μＬシリンジ設定、０．１μＬ／ｍｉｎ
レーザ強度：　２６５ｍＷ又は４００ｍＷ　５分照射後、３０秒で計測
ｘ４０レンズのビームウエストの位置：流路の底から４５μｍ下方
　図１１Ａや図１１Ｂ（非蛍光ビーズを用いた実験結果）ではＣＥＡＣＡＭ－５の濃度が１５．６ｐｇ／ｍＬのときに多層部分の割合が０．４程度であったが、図１９ではＣＥＡＣＡＭ－５の濃度が７．８ｐｇ／ｍＬのときに多層部分の割合が０．４まで到達していた。これらの結果から、蛍光ビーズを用いることでより低濃度での検出が可能になることが分かった。また、レーザ強度を、２６５ｍＷから４００ｍＷに上げることで、光誘起力が増強して効率よく流路底面に押し付けられるため全集合面積、多層部分の面積、多層部分の割合が増大して低濃度領域で傾きの大きな検量線が得られることが分かった。
　＜糖タンパク質としてヒトＣＡ１９－９を用いた実験＞
　糖タンパク質としてヒトＣＡ１９－９を用いた場合も光濃縮システムを用いた糖タンパク質の定量が可能であるかどうか、以下の実験で検討した。抗体Ａとしてビオチン化抗ヒトＣＡ１９－９抗体を用いたこと、抗体Ａを修飾した蛍光ビーズは修飾量「２倍量」のものを用いたこと、糖タンパク質としてヒトＣＡ１９－９を用いたこと、及びレーザ強度を４００ｍＷとしたこと以外は、上記＜蛍光ビーズを用いたときの検量線の検討＞と同様の条件で実験を行った。なお、ビオチン化抗ヒトＣＡ１９－９抗体及びヒトＣＡ１９－９は、CA19-9 ELISA Kit, Human, RayBio (1x96well strip plate)　（RayBiothch社製、Cat.No.ELH-CA19-91）に同梱されているものを用いた。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、糖タンパク質としてヒトＣＡ１９－９を用いた場合も糖タンパク質の濃度と、多層部分の面積及び多層部分の割合との間に正の相関関係があることが分かった。すなわち、糖タンパク質としてヒトＣＡ１９－９を用いた場合も光濃縮システムを用いた糖タンパク質の定量が可能であることが示された。
　＜臨床サンプルを用いた実験＞
　蛍光ビーズを用いた光濃縮システムにおいても、臨床で得られた血漿サンプル中の糖タンパク質を定量できるかどうか以下の実験で検証した（図２０及び２１）。血漿サンプルは、上記「５．臨床サンプルを用いた実験」の項で用いた「血漿Ａ」、「血漿Ｂ」、「血漿Ｃ」及び「血漿Ｄ」を用いた。
　光濃縮システムを用いた測定では、得られた血漿サンプルそれぞれを、希釈液（１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．７、０．００００１％のＢＳＡを含む）を用いて１０００倍に希釈して用いたこと、レーザ強度を４００ｍＷとしたこと、レーザの照射時間を５分又は４分としたことを除いては、上記「蛍光ビーズを用いたときの検量線の検討」の項と同様の方法で実験を行い、測定視野における蛍光ビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を所定の方法で求めた。結果を図２０及び２１に示す。図２０及び２１において、縦軸は蛍光ビーズの集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合を示し、横軸は血漿サンプルのラベルを示す。
　図２０及び２１の結果から、蛍光ビーズを用いた場合でも、血漿サンプル中のＣＥＡ濃度と、多層部分との割合との相関関係が見られた。特にレーザ照射時間を４分とした場合に当該相関関係がより明瞭となっていた。
　≪７．液体試料の塩濃度（イオン強度）による特異性の向上効果≫
　上記検討４において、液体試料の塩濃度が高すぎるとビーズが塩析することが確認されている。本実験では、ビーズの塩析が起きない程度の塩濃度で、光濃縮システムを用いた測定に最適な塩濃度があるのか、さらに詳細に検討した（図２２）。
　＜実験１＞
　希釈液として、以下のＮａＣｌ濃度が異なる２種類のリン酸バッファーを用いたこと、蛍光ビーズの懸濁液として、抗体Ａは抗体修飾量「半量」のもの、抗体Ｂは抗体修飾量「通常量」のものを用いたこと、CEACAM-5の濃度が０～１５．６ｐｇ／ｍＬである標準試料（３種類、１０μＬ）を用いたこと、以外は上記＜蛍光ビーズを用いたときの抗体修飾量の検討＞における（液体試料の準備）の欄と同様の方法で測定試料を準備した。準備した測定試料を光濃縮システムにおけるマイクロ流路チップのマイクロ流路に注入し、以下の条件で上記測定試料に光を照射した。その後、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を上述の方法で求めた。結果を図２２に示す。図２２において、縦軸は蛍光ビーズの集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合を示し、横軸は測定試料中のCEACAM-5の濃度及び塩化ナトリウム濃度を示す。
　用いた希釈液の基本組成
　１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．７、０．００００１％のＢＳＡを含む）
　用いた希釈液のＮａＣｌ濃度
　０．９×１０－３％（ｗ／ｖ）又は０．９×１０－４％（ｗ／ｖ）
　光照射の条件
マイクロ流路：１００μｍ×１００μｍ
シリンジ：内径１．０３ｍｍ／容量５０μＬ
流速：５０μＬシリンジ設定、０．１μＬ／ｍｉｎ
レーザ強度：　４００ｍＷ　５分照射
ｘ４０レンズのビームウエストの位置：流路の底から４５μｍ下方
　＜実験２＞
　希釈液中のＮａＣｌ濃度を０．９×１０－４％（ｗ／ｖ）又は０．９×１０－５％（ｗ／ｖ）としたこと、抗体Ｂが修飾された蛍光ビーズの懸濁液を上記実験１とは異なるロットを用いたこと、光照射の条件における「流速」を状況に応じて、０．１μＬ／ｍｉｎ、０．１５μＬ／ｍｉｎ又は０．２μＬ／ｍｉｎに変更したこと以外は、上記実験１と同様の方法で実験を行い、測定視野における蛍光ビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を所定の方法で求めた。結果を図２２に示す。
　図２２の結果から、希釈液中のＮａＣｌ濃度が０．９×１０－５％（ｗ／ｖ）である場合、CEACAM-5の濃度が０ｐｇ／ｍＬであるときにおける蛍光ビーズの非特異的な吸着が少なく、CEACAM-5の濃度に相関して多層部分の面積、多層部分の割合が増加していた（図２２の実験２の結果）。より具体的には、図１９ではＣＥＡ濃度７．８ｐｇ／ｍＬ以上において多層部分の割合が０．４で飽和しているのに対し、図２２のＮａＣｌ濃度０．９×１０－５％（ｗ／ｖ）では多層部分の割合が１５．６ｐｇ／ｍＬにおいても０．６まで増加した。これはＮａＣｌを塩析が起こらない程度に添加することでゼータ電位の絶対値が小さくなり（図１７における電気二重層の厚みも小さくなる）、ＣＥＡと抗体が接近し易くなり抗原抗体反応を効率良く起こせるようになることを示している。
　≪８．マイクロ流路内のブロッキング≫
　マイクロ流路内をＢＳＡ等でブロッキング（プレコーティング）することで、測定精度が向上するか検討した（図２３、図２４）。具体的な手順は以下の通りである。
　まず、測定試料を吸引するポリテトラフルオロエチレンチューブ（ＰＴＦＥチューブ）内に、プレコーティングバッファー（１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．７、０．０００１％ＢＳＡ）を満たし、吐出することで、ＰＴＦＥチューブの内部をＢＳＡでブロッキングした。
　希釈液中のＮａＣｌ濃度を０．９×１０－５％（ｗ／ｖ）としたこと、CEACAM-5の濃度が０～１５．６ｐｇ／ｍＬである標準試料（５種類、２０μＬ）を用いたこと、以外は上記（７．液体試料の塩濃度（イオン強度）による特異性の向上効果）の欄における実験２と同様の方法で測定試料を準備した。次に、上記ＰＴＦＥチューブに、上記測定試料（２０μＬ）を吸引し、その後連続して上記プレコーティングバッファー（２０μＬ）を吸引した（図２３参照）。当該ＰＴＦＥチューブをシリンジポンプにセットして、マイクロ流路に注入し、以下の条件で上記測定試料に光を照射した。その後、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を上述の方法で求めた。結果を図２４に示す。図２４において、縦軸は蛍光ビーズの集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合を示し、横軸は測定試料中のCEACAM-5の濃度を示す。
　光照射の条件
マイクロ流路：１００μｍ×１００μｍ
シリンジ：内径１．０３ｍｍ／容量５０μＬ
流速：５０μＬシリンジ設定、０．１５μＬ／ｍｉｎ（ただし、プレコーティングバッファーを注入時は、４μＬ／ｍｉｎとした。）
レーザ強度：　４００ｍＷ　５分照射
ｘ４０レンズのビームウエストの位置：流路の底から４５μｍ下方
　図２４の結果から、測定前に予めマイクロ流路内のブロッキングすることによって、測定試料を注入する際の流速がより安定となり、誤差の小さい検量線を作成できることが分かった。
　≪９．サイズが異なるビーズを混合することによる多層構造の安定化≫
　＜抗体が修飾された蛍光ビーズの懸濁液の準備＞
　サイズが異なるビーズを混合することによって多層構造が安定化するか以下の実験で検討した（図２５、図２６）。まず抗体が修飾された蛍光ビーズとして以下の４種類のビーズの懸濁液Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２を準備した。蛍光ビーズへの抗体修飾は、上述の「蛍光ビーズを用いたときの抗体修飾量の検討」の項に準じて行った。
（抗体が修飾された蛍光ビーズの懸濁液）
（Ａ１）抗体Ａが修飾された蛍光ビーズ（サイズ：１μｍ、抗体修飾量：半量、懸濁液中の密度：４．２×１０9個／ｍＬ）
（Ａ２）抗体Ａが修飾された蛍光ビーズ（サイズ：２μｍ、抗体修飾量：半量、懸濁液中の密度：５．３×１０8個／ｍＬ）
（Ｂ１）抗体Ｂが修飾された蛍光ビーズ（サイズ：１μｍ、抗体修飾量：通常量、懸濁液中の密度：４．２×１０9個／ｍＬ）
（Ｂ２）抗体Ｂが修飾された蛍光ビーズ（サイズ：２μｍ、抗体修飾量：４倍量、懸濁液中の密度：５．３×１０8個／ｍＬ）
　＜実験Ａ＞
　希釈液として、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．７、０．００００１％のＢＳＡを含む）を用いて、CEACAM-5の濃度が０～１５．６ｐｇ／ｍＬである標準試料（５種類）を準備した。５種類の標準試料２０μＬをそれぞれマイクロチューブに移し、そこに上述の懸濁液Ａ１（２０倍希釈したものを５μＬ）、懸濁液Ａ２（５μＬ）、懸濁液Ｂ１（２０倍希釈したものを５μＬ）、懸濁液Ｂ２（５μＬ）を加えて、よく混合した。以上の手順で測定試料を準備した。実験Ａで準備した測定試料は、２μｍのビーズと１μｍのビーズとの個数の比率が約１：０．４と計算され、体積比が約１：０．０５と計算された。
　準備した測定試料を光濃縮システムにおけるマイクロ流路チップのマイクロ流路に注入し、以下の条件で上記測定試料に光を照射した。その後、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を上述の方法で求めた。結果を図２５に示す。図２５において、縦軸は蛍光ビーズの集合面積、多層部分の集合面積又は多層部分の割合を示し、横軸は測定試料中のCEACAM-5の濃度を示す。
　光照射の条件
マイクロ流路：１００μｍ×１００μｍ
シリンジ：内径１．０３ｍｍ／容量５０μＬ
流速：５０μＬシリンジ設定、０．１μＬ／ｍｉｎ
レーザ強度：　４００ｍＷ　５分照射
ｘ４０レンズのビームウエストの位置：流路の底から４５μｍ下方
　＜実験Ｂ＞
　希釈液として、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．７、０．００００１％のＢＳＡを含む）を用いて、CEACAM-5の濃度が０～１５．６ｐｇ／ｍＬである標準試料（５種類）を準備した。５種類の標準試料２０μＬをそれぞれマイクロチューブに移し、そこに上述の懸濁液Ａ２（１０μＬ）、懸濁液Ｂ２（１０μＬ）を加えて、よく混合した。実験Ｂでは、懸濁液Ａ１及び懸濁液Ｂ１は用いなかった。すなわち、実験Ｂで準備した測定試料は、２μｍのビーズと１μｍのビーズとの個数の比率が１：０（体積比も１：０）であった。以上の手順で測定試料を準備した。準備した測定試料を光濃縮システムにおけるマイクロ流路チップのマイクロ流路に注入し、実験Ａと同様の条件で上記測定試料に光を照射した。その後、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を求めた。
　＜実験Ｃ＞
　希釈液として、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．７、０．００００１％のＢＳＡを含む）を用いて、CEACAM-5の濃度が０～１５．６ｐｇ／ｍＬである標準試料（５種類）を準備した。５種類の標準試料２０μＬをそれぞれマイクロチューブに移し、そこに上述の懸濁液Ａ１（１０倍希釈したものを５μＬ）、懸濁液Ａ２（５μＬ）、懸濁液Ｂ１（１０倍希釈したものを５μＬ）、懸濁液Ｂ２（５μＬ）を加えて、よく混合した。以上の手順で測定試料を準備した。実験Ｃで準備した測定試料は、２μｍのビーズと１μｍのビーズとの個数の比率が約１：０．８と計算され、体積比が約１：０．１と計算された。準備した測定試料を光濃縮システムにおけるマイクロ流路チップのマイクロ流路に注入し、実験Ａと同様の条件で上記測定試料に光を照射した。その後、測定視野におけるビーズの集合面積、多層部分の集合面積及び多層部分の割合を求めた。
　実験Ａ、Ｂ及びＣにおいて求められた多層部分の割合の比較結果を図２６に示す。図２６において、「ビーズの混合比」は、体積比として示している。図２６の結果から、２μｍのビーズと１μｍのビーズとの個数の比率が約１：０．４（体積比で１：０．０５）であるとき（実験Ａ）、ビーズの非特異的な吸着が少なく、かつ安定した多層構造を形成していることがわかった。
　今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３　ビーズ、Ｘ、Ｙ　被検出物質、Ｂ０　ビーズ本体、Ｂ１１　第１抗体、Ｂ２１　第２抗体、Ｂ１２、Ｂ２２　アビジン、Ｂ１３、Ｂ２３　ビオチン、Ｂ３１　抗体、９０　マイクロ流路チップ、９１　基材、９２　マイクロ流路、９２１　インレット、９２２　アウトレット。

Claims (15)

  1. 　光濃縮システムを用いて、試料中に含まれる糖タンパク質を検出するためのキットであって、
    　ホスト分子が修飾された微粒子と、
    　前記試料を希釈するための希釈液と、を含み、
    　前記ホスト分子は、前記糖タンパク質に特異的に結合し、
    　前記希釈液は、ブロッキング剤と、緩衝剤とを含み、
    　前記希釈液のｐＨは前記糖タンパク質の等電点より高く、
    　前記ブロッキング剤の濃度は、光誘起力が前記ホスト分子に作用していない環境における、前記ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度であり、
    　前記希釈液の塩濃度は、前記ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度である、キット。
  2. 　前記希釈液は、中性である、請求項１に記載のキット。
  3. 　前記希釈液の塩濃度は、前記ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度であり、かつ前記微粒子における電気二重層の厚みが減少する濃度である、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  4. 　前記微粒子は、静電反発力を高める添加剤を更に含む、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  5. 　前記微粒子は、サイズが異なる２種類以上の微粒子を含む、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  6. 　前記ホスト分子は、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、及びｓｃＦｖからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  7. 　前記ブロッキング剤は、アルブミン、ゼラチン、カゼイン、及びヤギ血清からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  8. 　前記ブロッキング剤の濃度は、前記希釈液に対して、０．０００００１質量％以上０．００１質量％未満である、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  9. 　前記緩衝剤は、リン酸化合物、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ＨＥＰＥＳ、及びＭＥＳからなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  10. 　前記ホスト分子を修飾した微粒子を分散するための分散液を更に含み、
    　前記分散液は、前記ブロッキング剤と、前記緩衝剤とを含み、
    　前記ブロッキング剤の濃度は、前記分散液に対して、０．０００００００１質量％以上０．００１質量％以下である、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  11. 　前記糖タンパク質は、がんマーカータンパク質である、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  12. 　前記がんマーカータンパク質は、癌胎児性抗原、及び炭水化物抗原からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１１に記載のキット。
  13. 　前記試料は、採取後に冷凍、もしくは所定の期間で冷蔵後に冷凍保存された試料であって、
    　前記試料中に含まれる前記糖タンパク質は、凝集して多量体又はナノ粒子を形成している、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  14. 　マイクロ流路チップを更に含む、請求項１又は請求項２に記載のキット。
  15. 　光濃縮システムを用いて、試料中に含まれる糖タンパク質を検出するためのキットであって、
    　ホスト分子が修飾された微粒子と、
    　前記試料を希釈するための希釈液と、
    　前記ホスト分子を修飾した微粒子を分散するための分散液と、を含み、
    　前記ホスト分子は、前記糖タンパク質に特異的に結合し、
    　前記希釈液は、緩衝剤とを含み、
    　前記分散液は、ブロッキング剤と、前記緩衝剤とを含み、
    　前記希釈液のｐＨは前記糖タンパク質の等電点より高く、
    　前記ブロッキング剤の濃度は、光誘起力が前記ホスト分子に作用していない環境における、前記ホスト分子同士が非特異的に吸着することを抑制する濃度より低い濃度であり、
    　前記希釈液の塩濃度は、前記ホスト分子を修飾した微粒子が塩析で沈降しない濃度である、キット。
PCT/JP2023/018633 2022-05-18 2023-05-18 糖タンパク質を検出するためのキット WO2023224100A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-081826 2022-05-18
JP2022081826 2022-05-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023224100A1 true WO2023224100A1 (ja) 2023-11-23

Family

ID=88835315

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/018633 WO2023224100A1 (ja) 2022-05-18 2023-05-18 糖タンパク質を検出するためのキット

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023224100A1 (ja)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0720129A (ja) * 1993-07-02 1995-01-24 Tokuyama Corp 免疫学的凝集反応試薬
JP2006242597A (ja) * 2005-02-28 2006-09-14 Fuji Photo Film Co Ltd 磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法、磁性体ナノ粒子の捕集方法及び磁性体ナノ粒子含有液の処理方法
WO2006129796A1 (ja) * 2005-06-03 2006-12-07 Tokyo University Of Agriculture And Technology 磁性粒子保持担体、およびその調製方法
WO2012077756A1 (ja) * 2010-12-08 2012-06-14 公立大学法人大阪府立大学 金属ナノ粒子集積構造体を利用した被検出物質の検出装置および方法
WO2014192937A1 (ja) * 2013-05-30 2014-12-04 公立大学法人大阪府立大学 被検出物質の検出装置および方法
US20170297036A1 (en) * 2016-04-19 2017-10-19 Chang Gung University Method and apparatus for performing contactless optically-induced dielectrophoresis for separation of circulating tumor cells
JP2018194550A (ja) * 2017-05-12 2018-12-06 公立大学法人大阪府立大学 被検出物質の検出キットおよびそれを備えた検出システム、ならびに、被検出物質の検出キットの製造方法
JP2020509349A (ja) * 2017-01-30 2020-03-26 アバクシス， インコーポレイテッド 溶液ベースのプラズモン特異的結合パートナーアッセイおよび金属ナノ構造体
WO2021040021A1 (ja) * 2019-08-30 2021-03-04 公立大学法人大阪 被検出物質の検出方法および被検出物質の検出システム

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0720129A (ja) * 1993-07-02 1995-01-24 Tokuyama Corp 免疫学的凝集反応試薬
JP2006242597A (ja) * 2005-02-28 2006-09-14 Fuji Photo Film Co Ltd 磁性体ナノ粒子の凝集・分散制御方法、磁性体ナノ粒子の捕集方法及び磁性体ナノ粒子含有液の処理方法
WO2006129796A1 (ja) * 2005-06-03 2006-12-07 Tokyo University Of Agriculture And Technology 磁性粒子保持担体、およびその調製方法
WO2012077756A1 (ja) * 2010-12-08 2012-06-14 公立大学法人大阪府立大学 金属ナノ粒子集積構造体を利用した被検出物質の検出装置および方法
WO2014192937A1 (ja) * 2013-05-30 2014-12-04 公立大学法人大阪府立大学 被検出物質の検出装置および方法
US20170297036A1 (en) * 2016-04-19 2017-10-19 Chang Gung University Method and apparatus for performing contactless optically-induced dielectrophoresis for separation of circulating tumor cells
JP2020509349A (ja) * 2017-01-30 2020-03-26 アバクシス， インコーポレイテッド 溶液ベースのプラズモン特異的結合パートナーアッセイおよび金属ナノ構造体
JP2018194550A (ja) * 2017-05-12 2018-12-06 公立大学法人大阪府立大学 被検出物質の検出キットおよびそれを備えた検出システム、ならびに、被検出物質の検出キットの製造方法
WO2021040021A1 (ja) * 2019-08-30 2021-03-04 公立大学法人大阪 被検出物質の検出方法および被検出物質の検出システム

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "Development of Optical Condensation-Based Methods for Super-Early Cancer Diagnosis: Towards the Creation of Innovative Technologies for Detecting Trace Biomarkers", OSAKA PREFECTURE UNIVERSITY, RESEARCH INSTITUTE FOR LIGHT-INDUCED ACCELERATION SYSTEM), NON-OFFICIAL TRANSLATION, 20 April 2021 (2021-04-20), XP093108195, Retrieved from the Internet <URL:https://www.osakafu-u.ac.jp/omu-content/uploads/sites/1162/pr20210420_1.pdf> [retrieved on 20231203] *
FUJIWARA KANA, TAKAGI YUMIKO, TAMURA MAMORU, NAKASE IKUHIKO, TOKONAMI SHIHO, IIDA TAKUYA: "Selective Light-induced Assembly of Biological Nanoparticles in a Micro Narrow Space", PROCEEDINGS OF THE 82ND JSAP AUTUMN MEETING, vol. 82, 26 August 2021 (2021-08-26), pages 12p - N107, XP093108194 *
IIDA, TAKUYA: "Development of Bioanalytical Method with Light-induced Acceleration System (LAC-SYS) and Cooperatve Effect of Localized Surface Plasmon", 16TH PLASMONICS SYMPOSIUM; JUNE 7-8, 2019, SPECTROSCOPIC SOCIETY OF JAPAN, CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN, JP, vol. 16, 1 January 2019 (2019-01-01) - 8 June 2019 (2019-06-08), JP, pages 12, XP009550563 *
IIDA, TAKUYA: "Development of Minimally Invasive High-Throughput Optical Condensation Systems", RESEARCH AND DEVELOPMENT ANNUAL REPORT, LAC-SYS RESEARCH INSTITUTE, JP, JP, pages 1 - 3, XP009550643, Retrieved from the Internet <URL:https://projectdb.jst.go.jp/file/JST-PROJECT-21460217/JST_1150122_21460217_2021_%E9%A3%AF%E7%94%B0_PYR.pdf> *
KANODA MASATOSHI, HAYASHI KOTA, TAKAGI YUMIKO, TAMURA MAMORU, TOKONAMI SHIHO, IIDA TAKUYA: "Development of Two-step Optical Condensation Method by Self-assembled Nano-bowl Substrate", PROCEEDINGS OF THE JSAP AUTUMN MEETING, vol. 83, 26 August 2022 (2022-08-26), pages 20a - P05, XP093108197 *
TAKUYA IIDA: "Applications of Light-Based Molecular Recognition Control and High-Sensitivity Biosensors", ANNUAL REPORT OF THE NAKATANI FOUNDATION, 1 January 2016 (2016-01-01), XP093108196, Retrieved from the Internet <URL:https://database.nakatani-foundation.jp/reports/%E5%85%89%E3%81%AB%E3%82%88%E3%82%8B%E5%88%86%E5%AD%90%E8%AA%8D%E8%AD%98%E5%88%B6%E5%BE%A1%E3%81%A8%E9%AB%98%E6%84%9F%E5%BA%A6%E3%83%90%E3%82%A4%E3%82%AA%E3%82%BB%E3%83%B3%E3%82%B5%E5%BF%9C%E7%94%A8/> [retrieved on 20231203] *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11709161B2 (en) Assays for detecting analytes in samples and kits and compositions related thereto
JP5994890B2 (ja) アナライト検出プローブ
Kabe et al. Application of high-performance magnetic nanobeads to biological sensing devices
US20150177239A1 (en) Long rigid spacers to enhance binding kinetics in immunoassays
US10203326B2 (en) Method of detecting target substance
JP5428322B2 (ja) プラズモン励起センサを用いたアッセイ法
EP3054297A1 (en) Fluorescence-labeled particle
JP5416263B2 (ja) 蛍光粒子を用いたコルチゾール免疫アッセイ
US20090311800A1 (en) Ultrasound method
JP7026203B2 (ja) 試薬キット、測定キットおよび測定方法
WO2023224100A1 (ja) 糖タンパク質を検出するためのキット
JP4331073B2 (ja) 抗原の測定方法及びそのための試薬
JP6119607B2 (ja) 検体希釈用液、それを用いたキットおよび蛍光測定方法
JP7022198B2 (ja) 試薬キット、測定キットおよび測定方法
Wang et al. Aspects of recent development of immunosensors
JP5465758B2 (ja) 蛍光粒子を用いたサイロキシン免疫アッセイ
JP2012047621A (ja) プラズモン励起センサチップおよびこれを用いたアッセイ法
JP2013029369A (ja) イオン性官能基で修飾された局在場光センサーチップおよびリガンド担持荷電微粒子を使用するアナライトの検出方法
CN113125703B (zh) 一种肌红蛋白的均相检测试剂盒及其应用
CN113125730B (zh) 一种白介素6的均相检测试剂盒及其应用
CN113125705B (zh) 一种肌红蛋白的均相检测试剂盒及其应用
CN113125732B (zh) 一种白介素6的均相检测试剂盒及其应用
JP2013029370A (ja) リガンドを高密度に配置した局在場光センサーチップ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23807701

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1