JPH03287069A - 測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に特異性を有する抗体
（以下、これを抗ＨＣＶ抗体と略称する）の測定試薬に
関する。

本発明によって提供される測定試薬は、血清または血漿
中の抗ＨＣＶ抗体を高感度および高度に特異的に検出す
る能力を有しており、抗ＨＣＶ抗体の測定に有用である
。

［従来の技術］ 肝疾患の大部分を占めるウィルス性肝炎の病因ウィルス
としては現在５［類が知られており、それぞれＡ型、Ｂ
型、Ｃ型、Ｄ型、Ｃ型肝炎ウィルスと呼ばれている。ウ
ィルス性肝炎のなかでもＡ型肝炎およびＣ型肝炎は経口
感染であり、一過性感染のみで慢性化することはないが
、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎は輸血によって感染し、さら
に持続１１１染により慢性化し、貰い確率で肝硬変また
は肝癌に移行するため、大きな問題となっている。Ａ型
肝炎。

Ｂ’８肝炎およびＤ型肝炎についてはそれらの原因ウィ
ルスが見い出され、現在では免疫学的な診断が可能とな
っている。Ｃ型肝炎ウィルスについても最近遺伝子が単
離されたとの報告がある。輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎（以下
、これをＰＴＮＡＮＢＨと略称する）の病因ウィルスに
ついては多くの研究者による研究にもかかわらず長い間
不明であったが、１９８８年にアメリカのカイロン社（
Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の研究グルー
プによって、　　ＰＴＮＡＮＢＨに感染させたチンパン
ジーの血漿からＰＴＮＡＮＢＨウィルスの遺伝子の単離
、同定がなされ［サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）、第２
４４巻、　　１１３５９頁（１９８８年）およびサイエ
ンス、第２４４巻、５１３６２頁（１９８８年ン参照〕
、Ｃ型肝炎ウィルスＣ以下、　これをＨＣＶと略称する
）と命名された。その遺伝子の塩基配列と推定されるも
のの一部はすでに明らかにされており［ヨーロッパ特許
口０３１８２１６号明細書参照コ、抗ＨＣＶ抗体の検出
ができるようになり、）ＩＣｖＩＢ染についての血清学
的診断が可能となっている。

また１本発明者らの１人を含む数人によってＰＴＮＡＮ
Ｂ）Ｉの原因となるウィルスの遺伝子と推定されるリボ
核酸がＰＴＮＡＮＢ）Ｉ患者の血清から単離され。

同定されたことが報告されている［ガストロエンテＤ　
ロシア−ジャポニカ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇ
ｉａＪａｐｏｎｉｃａ）、　３１２４巻、　ｊｌＳ号、
　　１１５４０頁　（１９８９年）；ガストロエンテロ
ロシア・ジャポニカ、第２４巻、第５号、　ｊｌ　５４
５頁（ＩＨ９年）および内科、　１！６４巻、第６号、
　第１０２２頁（１９８９年）参照コ。

これまでｃＤＮＡライブラリーからの必要なｃＤＮ＾の
スクリーニングの手段として、λファージを利用した抗
原抗体反応によって抗ＨＣ■抗体の陽性または陰性の判
定を行うことが一般的に行われてきたが、上記のイムノ
スクリーニング法は定量性がなく、大腸菌の発現産物中
の非特異な抗［成分との反応が起こる場合があり、現在
、）ＩＣＶの遺伝子をクローニングし、ファージに組み
込んで酵母を宿主として発現させた抗原蛋白を用いて行
う酵素免疫測定法による抗ＨＣＶ抗体の検査薬の開発が
検討されている［内科、第６４巻、１１６号、ｌ　１０
２７頁（１９８９年）参照コ、さらに、ウィルスまたは
その抗原成分によって感作されたゼラチン粒子が抗ウイ
ルス抗体存在下で凝集する性質を利用した粒子凝集法ま
たは酵素免疫側窓をウィルスまたはその抗ａｔ分をコー
ティングしたビーズを用いて行うビーズ法の開発が進め
られている。

［発明が解決しようとするｉ１ｇ］ １（ＣＶ関連抗原を利用したこれまでの酵素免疫測定法
では、測定対象が臨床的にＰＴＮＡＮＢＨと診断された
場合においても、抗！（ＣＶ抗体陽性率は約７５％であ
り、抗ＨＣＶ抗体に陰性であるＰＴＮＡＮＢＨが約２５
％の割合で含まれている。またＨＣＶの遺伝子をクロニ
ングし、ファージに組み込んで酵母を宿主として発現さ
せた抗ＫＭ白は非特異な種々の抗原成分を含有している
ことから、その抗原蛋白を試薬として用いて抗ＨＣＶ抗
体の測定を行う場合には、その試薬が試料中の抗ＨＣｖ
抗体以外の他の非特異な抗体成分をも認識することにな
り、測定結果は必ずしも抗ＨＣＶ抗体の存在を正確に表
しているとは限らないことになる。このようにＨＣＶ関
連抗原を利用したこれまでの酵素免疫測定法によれば、
抗ＨＣＶ抗体の存在を正確に知ることができないのが現
状である。

しかして、本発明の目的は抗ＨＣＶ抗体と特異的に結合
する能力を有する合成抗原ペプチドを用いた抗）ＩＣＶ
抗体の測定試薬を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、　　ＰＴ？１ＡＮＤ）Ｉ関連遺伝子にコ
ードされるペプチドから選択されたペプチド断片の中が
ら、　　ＰＴＮＡＮＢＨ関連抗原に対して特異性を有す
る抗体と特異的に結合する能力を有する特定の合成ペプ
チドを抗原物質として用いた場合に抗ＨＣＶ抗体の検出
が高感度および特異的に行われることを見い出し、本発
明を完成するに至った。

本発明によれば、上記の目的は、式 ８式％ で示されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる抗Ｈ
ＣＶ抗体の測定試薬を提供することによって達成される
。

本明細書においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述
する。

＾１ａ：　　Ｌ−アラニン残基 Ａｒｇ：　　Ｌ−アルギニン残基 Ａｓｎ：　　Ｌ−アスパラギン残基 Ａｓｐ：　　Ｌ−アスパラギン残基残基Ｃｙｓ：　　Ｌ
−システィン残基 Ｇｉｎ：　　Ｌ−グルタミン残基 Ｇｌｕ：　　Ｌ−グルタミン酸残基 Ｇｌｙ：　　グリシン残基 Ｈｉｓ：　　Ｌ−ヒスチジン残基 ＩＩｓ：　　Ｌ−イソロイシン残基 Ｌｅｕ：　　Ｌ−ロイシンＷｔＪ１ｇ Ｌｙｓ：　　Ｌ−リシン残基 Ｍｅｔ：　　Ｌ−メチオニン残基 Ｐｈｅ：　　Ｌ−フェニルアラニン残基Ｐｒｏ：　　Ｌ
−プロリン残基 Ｓｅｒ：　　Ｌ−セリン残基 Ｔｈｒ：　　Ｌ−トレオニン残基 丁ｒｐ：Ｌ−）リプトファン残基 Ｔ、：　　Ｌ−チロシン残基 Ｖａｎ：　　Ｌ−バリン残基 また本明細書においては、常法に従ってアミノ酸配列を
Ｎ末端のアミノ酸残基が左釘に位置し、Ｃ末端のアミノ
酸残基が右銀に位置するように記述する。

本発明におけるペプチドの合成は、ペプチドの合成にお
いて通常用いられる方法、例えば、固相合成法または段
階的伸長法、フラグメント縮合法のような液相合成法に
より行われるが、固相合成法により行うのが操作上簡便
である［例えば、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・
ケミカル・ソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｅｈａ
　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ
）　、　　５１８５巻、　　Ｉ！　２１４９〜２１５４
頁　（１９６３年）；日本生化学全編「生化学実験講座
１タンパク質の化学■化学修飾とペプチド合成」　（昭
和５２年１１月１５日　株式会社東京化学同人発行）、
ｊＩ　２０７〜４９５頁；　日本生化学全編「続生化学
実験騨座２　タンパク質の化学（下）」（昭和６２年５
月２０日　株式会社東京化学同人発行）、ｊ［６４１〜
６９４頁など参照］、本発明におけるペプチドの固相合
成法による製造は、例えば、スチレン−ジビニルベンゼ
ン共重合体などの反応溶媒に不溶性である重合体に。

目的とするペプチドのＣ末端に対応するア萼ノ駿または
そのアミドをそれらが有するα−ＣＯＯ１基またはα−
ＣＯＮ）１２基からそれぞれ水素原子を除いて得られる
α−ｃｏｏ−ｇ　＊たはα−ＣＯＮＩ＋−基を介して結
合させ１次いで該ア且ノ歎またはそのアミドに目的とす
るペプチドのＮ末端の方向に向って、対応するアミノ酸
またはペプチド断片を該アミノｉｌまたはペプチド断片
が有するα−ＣＯＯ１（基以外のα−アミノ基などの官
能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と、該
結合したアミノａまたはペプチド断片におけるな一アミ
ノ基などのペプチド結合を形成するアミノ基が有する保
護基を除去する操作を順次繰返すことによって、ペプチ
ド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応するペプチ
ド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を重合体から駅離さ
せ、かつ保護されている官能基から保護基を除去するこ
とにより目的とするペプチドを得、次いでこれを精製す
ることによって実施される。ここで、ペプチド鎖の重合
体からのａ離および保護基の除去は、フッ化水素を用い
て同時に行うのが副反応を抑刺するｆｌｔＡから好まし
い、また、得られたペプチドの１１１製は逆相液体クロ
マトグラフィーで行うのが効果的である。

本発明の測定試薬を利用した抗）ＩＣＶ抗体の測定は、
蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、受
身血球凝集法または粒子凝集法のいずれかによって行わ
れる。これらの方法はいずれも公知であるが、例えば酵
素免疫測定法を利用する場合について以下に説明する。

測定系全体の構成要素は担体１本発明の測定試薬、　ブ
ロッキング剤、被検試料、＊＊用抗体として用いられる
抗ヒト免疫グロブリン、＃素および基質からなる。担体
に抗原物質として本発明の測定試薬をコーティングし１
次いで酊定試薬コーティング担体にブロッキング剤を作
用させて担体上の非特異的な蛋白結合部位をブロックし
、測定試薬コーティング担体に被検試料を加えてインキ
ュベートし、続いて酵素＊＊抗体を接触させてインキュ
ベートし、次にこのように処理した担体に基質を加えて
インキュベートし、基質の分解量を吸光度計を用いて測
定する。担体としてはエンザイムイムノアッセイ用カッ
プ、ガラスもしくは樹脂製のチューブ、またはガラスも
しくは樹脂製のビーズを用いるのが好ましい、Ｓ定に先
立ち、測定試薬を０．０ＩＭ炭Ｉ！［緩衝液に溶解し、
その溶液を例えばポリスチレン製エンザイムイムノアシ
セイ用カップに加えたのち、４℃で一夜または室温で３
時間静置することにより、担体表面は測定試薬によって
コートされる。担体上の非特異的な蛋白結合部位をブロ
ックするためのブロッキング剤としては例えば、牛血清
アルブミン、カゼイン、ｍ脂粉乳、抗ヒト免疫グロブリ
ンを得るための免疫原動物の血清、ゼラチンなどが用い
られる。抗ヒト免疫グロブリンとしては例えば、抗ヒト
Ｉｍ、抗ヒ）　ＩｇＧ　（Ｆｅ）、抗ヒト１ｇＧ　（Ｆ
　（ａｂ’）　２）−抗ヒトＩＫＭ抗体などが用いられ
る。またそれらの抗ヒト免疫グロブリンを得るための免
疫原動物としては例えば、ヤギ、マウスなどが用いられ
る。酵素としては例えば、アルカリフォスファターゼ、
グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ベータガ
ラクトシダーゼなどが挙げられる。測定に先立ち、　ゲ
ルタールアルデヒドなどの２ｍ以上の官能基を有する化
合物を用いて、榎諏用抗体に酵素を結合せしめてコンジ
ュゲートとし、測定系全体の構成要素の一部として予め
準備しておくことが好ましい、基質は選択した酵素に応
じて適宜使用すればよい０例えば、酵素としてペルオキ
シダーゼを選択した場合には０−フェニレンジアミンな
どを使用することが好ましい。

測定系全体の構成要素のうち、被検試料は血漿または血
清として与えられ、例えば輸血用血液からのＪｔｈ漿ま
たは血清として提供される。被検試料をそのまま測定系
に加えてもよいが、測定に先立ち０．ＯＩＭリンｍ緩暫
生理食塩水（以下、　これをＰＢＳと略称する）によっ
て適当な濃度に希釈したのち測定系に加えてもよい。

［実施例］ 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが５本発
明はこれらの実施例により限定されるものではない。

参考例１ 式 ％式％ で示されるペプチドをペプチド自動合成装置Ｃ米国アプ
ライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｉｓ）社製、モデル４３１Ａ　（Ｍｏｄｅｌ　４
’３１Ａ）コを用いて固相合成法により合成した。

すなわち、４−［Ｎｏ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−
ＮＹ−（メシチレン−２−スルフォニル）−Ｌ−アルギ
ニンーフェニルアセトメチルコ基 を０．６４ミリモル／Ｋ（樹ｎ）の割合で有するスチレ
ン−ジビニルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベ
ンゼンの構成モル比二９９対１］からなる粒状樹脂［米
国アプライド・バイオシステムズ社襲、ＰＡ？Ｉ　　ア
ルギニン（＾ｒＨｉｎｉｎｅ）、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−＾ｒ
ｇ　（ＭＴＳ）コを７８１Ｂ用い、　これに３１１表に
示す一連の操作に従って、目的とするペプチドのＮ末端
方向に向って対応するＬ−アラニン、Ｌ−アルギニン、
Ｌ・グルタ電ン１１．　　Ｌ−リジン、Ｌ−トレオニン
、　Ｌ−チロシンを順次結合させた。縮合反応において
、上記のアミノ酸はそれぞれＮ−（ｔ−ブトキシカルボ
ニル）−し−アラニン無水物、Ｎｏ−（ｔ−ブトキシカ
ルボニル）−ＮＹ−（メシチレン−２−スルフォニル）
−Ｌ−アルキニン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニ
ル）−Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル、Ｎ”
−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ’−（２−クロロベ
ンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン無水物、Ｎ−（
ｔ−ブトキシカルボニル）−０−ベンジル−Ｌ４レオニ
ン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−０−（２−ブロ
モベンジルオキシカルボニル）　−Ｌ−チロシン無水物
として用い、それらの使用量は基質に対して約４倍モル
量とした。縮合反応は室温下で行った。全工程を含む反
応時間は１０５分間であった。全てのアミノ酸について
の反応操作が終了したのち、得られた樹脂をグラスフィ
ルター上でジクロロメタンおよびメタノールを用いて順
次洗浄し、次いで真空乾燥することによって１．４８ｇ
の乾ｔｌｋｆＭ脂を得た。

次に、ポリトリフルオロモノクロロエチレン製の反応容
器（株式会社ペプチド研究所製、ＨＦ−反応装ｆＩ型）
中で、得られた乾燥樹脂１．０２をアニソール１．５鵬
１およびエチルメチルスルフィド０、２５ｍ１と混合し
、この混合物に一２０℃の温度でフッ化水素１０．０ｍ
ｌを加え、同温度で３０分間１次いで０℃の温度で３０
分間攪拌した。得られた反応混合物からフッ化水素、ア
ニソールおよびエチルメチルスルフィドを減圧下に除去
し、残留物をグラスフィルター上でジエチルエーテルお
よびジクロロメタンを用いて充分洗浄した。得られたそ
の残留物を２規定の酢酸水溶液で抽出し、抽出液を凍結
乾燥することによりペプチドの粗製物を５０（ｌｓｇ得
た。得られた粗製物を分取用逆相高速液体クロマトグラ
フィー［カラム：　オクタデシル化シリカゲル（粒径：
１５μｍ１）充填カラム（内径＝５０１１Ｌ、　　長さ
＝３００ｍｍ＋）　、　　日本ウォーターズ社製、　μ
ＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ１５μ　Ｃ１８−１００人；　
移動相：　トリプルオロ酢酸を０．０５容量％含有する
アセトニトリルと水との混合溶媒（アセトニトリルの濃
度は３０分間で２０容量％から３０容量％になるように
漸次変化させた）；　流速：　　５ｍｌ／分；　検出法
：　波長２１０ｎ＋ａにおける吸光度コで精製すること
によって、目的とするペプチドの１ｆ製物を２００璽【
得た。得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグ
ラフィー［カラム：　オクタデシル化シリカゲル（粒径
：　５μ璽）充填カラム（内径：４１Ｌ　　長さ：　　
１５０ｍｍ）、　　東ソー株式会社製、丁ＳＫ−ｇｅｌ
　ＯＤＳ−８０ＴＭ；　　移動相：　トリフルオロ！１
″酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水との
混合溶媒（アセトニトリルの濃度は３０分間で５容量％
から５０容量％になるように漸次変化させた）：　流速
：　　１ｍｌ／分；　検出法：　波長２１０ｎｍにおけ
る吸光度］に付したところ、２１．７分に単一の鋭いピ
ークが示された。高速原子質草法マススペクトルにより
求めた精製物の分子量は１４５３であった（理論値＝１
４５２．５９）。

以下余白 第１表 １　ｔ−ブトキン　　トリフルオロ酢酸カルボニル ０ ２洗浄 ジクロロメタン ４洗浄 Ｎ−メチルピロリドン ジイソプロピルエチルアミン ６洗浄 べ−メチルピロリドン ピロリトン溶液 ８洗浄 ジクロロメタン 以下金白 参今例２ 妖」４１し杉 ＧＰＴ＞　２００１Ｕ：　　ＨＢｓ）ｆｇ（−）血清　
：６５検体正常ヒト血清　　　　　　　：１０検体に 各血清検体について、下記の酵素免疫測定法により抗Ｈ
ＣＶ抗体の有無を検定した。

すなわち、本発明者らの１人を含む数人によって単離さ
れたリボ核酸からクローン化された＃８クローン、＃１
４クローンおよび＃１８クローンを持つファージλｇｔ
ｌｌを含む溶液１００μｍに大１１ＨＹ１０９０株（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＹＩ０９０）を支持
筒として混合したのち、３７℃で１５分間インキユヘー
ションし、ファージを大ｆｉｌ菌にｇｌさせた。続いて
、５０μｇ／ａｌのアンピシリンを含む寒天培地に上記
の混合液を植菌し、４３℃で３時間培養した０次に、１
０ａＭのｌ　ＰＴＧ水溶液に２時間浸漬したのち風乾し
て得られたニトロセルロース膜を、上記の寒天培地上に
載せ、３７℃で３時間インキュベーションした。

こうして得られたニトロセルロース膜をＮａＣ１を含む
１０ｍＭ　）リス塩１！　（ｐＨ７，５）　　（以下、
これをＴＳ　Ｂｕｆｆｅｒと略称する）で３回洗浄し、
次いで５００鳳Ｍ　ＮａＣ１および３％ゼラチンを含む
２０ｍＭ　）リス＠Ｍｌ　（ｐＨ７，５）中で室温で一
晩振盪して腰上の非特異的な蛋白結合部位をブロックし
た。続いて、ＴＳ　Ｂｕｆｆｅｒ中で２分間振盪して膜
を洗浄した。血清検体を１％ゼラチンを含むＴＳ　Ｂｕ
ｆｆｅｒで希釈して得られた溶液中に、上記で得られた
ニトロセルロース票を浸漬し、＊温で３時間振盪した。

こうして得られたニトロセルロース膜をＯ，ＯＳ％　丁
ｗｅｅｎ２０を含むＴＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　（以下、　こ
れを丁Ｓ−Ｔ　Ｂｕｆｆｅｒと略称する）中で室温で５
分間振盪し、この操作を５回繰り返した。読いて、ヤギ
抗ヒトＩｒＧ−ペルオキシダーゼコンジュゲート（１％
ゼラチンを含むＴＳＢｕｆｆｅｒで至適漠度に希釈した
もの）中にニトロセルロース膜を浸漬し、室温で１．５
時間振盪した。

こうして得られたニトロセルロース膜を丁５−ＴＢｕｆ
ｆｅｒ中で室温で５分間振盪し、この操作を５回繰り返
した。

次に、　　０．０５％ＨＲ１”ｃｏｌｏｒ　（バイオラ
ンド社製）、０．０５％Ｈ２Ｏ２，１７％メタノールを
含むＴＳ　Ｂｕｆｆｅｅｒてニトロセルロース膜を振盪
し、発色反応を行ったのち、蒸留水中で室温で５分間振
盪し、この操作を５回繰り返した。風乾後、発色の有無
により、用いた血清中の抗＋（ＣＶ抗体の有無を検定し
た６鯰（ 検定結果を第２表に示す、その結果より被検試料である
ＧＰＴ＞　２００１Ｕ；　　ＨＢｓ）ｌ、ｇ（−）血清
６５検体は３群に分類できることが判った。すなわち、
＃１４クローンおよび＃１８クローンの２つにおいて陽
性と判定された群Ａ、＃８クローン、＃１４クローンお
よび＃１８クローンの３つにおいて陽性と判定された群
Ｂならびに＃８クローン、＃１４クローンおよび＃１８
クローンのいずれにおいても陰性と判定された群Ｃの３
群である。

以下金白 第２表 以下金白 実施例１ ！＆Ａ１１ ＧＰＴ＞　２００１１１；　　ＨＢｓＡｚ（−）血清Ａ
：３０検体ＧＰＴ　＞２００Ｉυ；　　１（ＢｓＡ４（
−）血清Ｂ：１５検体ＧＰＴ　＞　２００Ｉ［］；　　
ＨＢｓＡに（−）血清Ｃ：２０検体正常ヒト血清　　　
　　　　Ｄ：１０検体゛に 各血清検体について、下記の酵素免疫測定法により吸光
度を測定し、抗）ＩＣＶ抗体の有無を検定した。

すなわち、抗原物質として参考例１で得られた合成ペプ
チドを０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解し、
得られたペプチド溶液をポリスチレン製エンザイムイム
ノアンセイ用カップ（ダイナチック社製）に各１００μ
ｍづつ加えたのち、４℃で１２時間静置することにより
、ペプチドによるコーティングを行った１次いで、それ
らのカップを０．０５容量％７ｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで３呵洗浄した。続いて、それらのカップに２０容ｔ
％のヤギ血清を含むＰＢＳ２００μｍを加えて室温で３
時間静置し、非特異的な蛋白結合部位をブロックした６
次いで、ブロッキングに用いたＰＢＳを除いたのち、各
アッセイ用カップを乾燥させた。

血清希釈用溶液として１０容量％の正常ヤギ血清を含む
ＰＢＳを上記の各アッセイ用カップに１００μｍづつ加
えたのち、各被検血清（ＧＰＴ＞　２００Ｉυ；ＨＢｓ
Ａｇ（−）血清Ａ　　３０検体、　ＧＰＴ＞　２００Ｉ
υ；　　ＨＢｓＡ（（−）血清Ｂ　　１５検体、ＧＰＴ
＞　２００ＩＵ；　　ＨＢｓＡｚ（−）血清Ｃ２０検体
および正常ヒト血清Ｄ　１０検体）を血清希釈用溶液と
被検血清の割合が２０対１（容量比）となるように加え
た。３７℃で１時間インキュベーション後、それらのカ
ップを０．０５容量％の丁ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで
３回洗浄した。

得られた各アッセイ用カップに、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ペ
ルオキシダーゼコンジュゲート（１０容量％の正常ヤギ
血清を含むＰＢＳで至適濃度に希釈したもの）１００μ
ｍを加えた。３７℃で３０分間インキュベーション後、
それらのカップを０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳで３回洗浄した。続いて、得られた各アッセイ
用カップに基質（０−）二二レンジアミンを０．３重量
％となるように０．０２容量％の過酸化　素を含む０．
１Ｍクエン酸−リン＊ｍ＊液（ｐｉｆ５．５’＋　ｈ、
７溶解したもの）１００μｍを加えた。室温で１５分間
静置したのち、２Ｎｉｌ　ｍ！　１００μｍを加えて反
応を停止し、反応液の４９２ｎｍの吸光度０Ｄｔｅｚ値
を測定した。

超二炙 測定結果を１３表に示す、１３表は参考例１で得られた
合成ペプチドを用いた酵素免疫抗体法で血清Ａ、血清Ｂ
、血清Ｃおよび血清りを測定した場合のそれぞれの測定
結果を示す、さらに正常ヒト血清ＤＩＯ検体のＯＤｎｅ
２Ｍよりカントオフ値を設定し、抗１１ｃＶ抗体陽性・
陰性の判定を行った。カットオフ値は、 （（正常ヒト血清の０Ｄａｅ２４１１の平均値）＋２Ｓ
Ｄ）の計算式により求めた。上記のカットオフ値に基づ
いて算出した陽性率は、血清Ａ、血清Ｂ、血清Ｃおよび
正常ヒト血清りではそれぞれ３０．０％（９／　３０）
　、８６．７％（１３／　１５）　、　　１０．０％（
２／　２０）　。

０．０％（０／　１０）であり、この合成ペプチドを抗
原合成ペプチドを抗原物質として用いた酵素免疫測定法
は、血ｆｆ１Ｂ群において高い陽性率を示すことが判っ
た６以上の結果より、参考例１で得られた合成ペプチド
を用いることによって、血清Ｂｌ！に代表される抗ＨＣ
Ｖ抗体保持者のスクリーニングに有効であることが示さ
れた。

以下余自 以下余白 実施例２ 虻養盈圭 第４表に用いた血清検体が由来する疾患名と検体数を示
した。

第４表 第４表に示した各血清検体について、下記の酵素免疫Ｗ
Ｊ定法により吸光度を測定し、抗ＨＣｖ抗体の有無を検
定した。

すなわち、実施例１におｔすると同様な方法で抗原物質
として参考例１で得られた合成ペプチドをアッセイ用マ
イクロカップにコーティングし、第５表に示した各血清
検体との反応を行い、反応液の４９２ｏ＋ｍの吸光度０
０−９２値を測定した。

緩ｌ 測定結果をｊ１５表に示す５　第５表は参考例１で得ら
れた合成ペプチドを用いた酵素免疫抗体法により第４表
に示した各血清検体を検定した場合のそれぞれの測定結
果を示す、さらに正常者血清１０検体のＯＤａ＊ｚ［よ
りカットオフ値を設定し、抗１（ＣＶ抗体陽性・陰性の
判定を行った。カットオフ値は。

（（正常者血清の０Ｄｊｓｚ値の平均値）＋２ｓＤ）の
計算式により求めた。第５表の正常者血清検体の測定値
に基づいて計算したカットオフ値により。

陽性または陰性の区別を判定した結果を［５表中に示し
た。第５表より、参考例１で得られた合成ペプチドによ
る酵素免疫測定法を実施した場合、非Ａ非Ｂ型肝炎急性
期および回復期の一部の患者で陽性と判定された。さら
に正常者血清では抗ＨＣＶ抗体は陰性と判定された０以
上のことがら、参考例１で得られた合成ペプチドを用い
た酵素免疫測定法はＣ型肝炎の早期詑断が可能であるこ
とが判った０以上の結果より、参考例１で得られた合成
ペプチドを抗原物質として用いることによって。

有効な抗）ＩＣＶ抗体の有無の判定がなされることが示
された。

以下余白 以下余白 ［発明の効果］ 本発明によれば、抗）ＩＣＶ抗体と特異的に結合する能
力を有するペプチドを抗原物質として用いた抗１（ＣＶ
抗体の測定試薬を提供することが可能となった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式 【遺伝子配列が有ります】 で示されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる非Ａ
   非Ｂ型肝炎関連抗原に特異性を有する抗体の測定試薬。