JPH0499799A - Ｃ型肝炎ウイルス抗体検出用ペプチド抗原及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＡ型肝炎でもＢ型肝炎でもない血清肝炎、特に
Ｃ型肝炎の原因ウィルス（ＨＣＶ）に関連するペプチド
抗原、及びＨ’ＣＶに対する抗体の検出用於断試薬に関
する。

ウィルス性肝炎の原因ウィルスについてはいくつかの種
類が明らかにされている。

Ａ型肝炎ウィルスは経口感染で流行を起こすピコルナウ
ィルス科の直径２７ｎ−のＲＮＡウィルスであり（Ｆｉ
ｎｅｓｔｏｎ、　Ｓ、Ｍ、　ｅｔ　＆＋、、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　１ｉ２：　ｐ。

１０２６．１９７３＞、Ｂ型肝炎ウィルスは主として血
液を介して感染するヘパドナウィルス科に属する直径４
２ｎｓのＤＮＡウィルスである（Ｄａｎｅ、　Ｏ，Ｓ、
、　ｅｔ　ｍｌ、、　Ｌａｎｅｅｔ、Ｔ：　ｐ、２４１
．１９７４）、　　これらのウィルスについては確定診
断法が確立され、その予防対応策もほぼ確立されている
。

上記の何れにも属さない肝炎ウィルスは非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルスと呼ばれた。最近になり、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルスにおいても２種類のウィルスの存在が明らかになっ
てきた。一つは、インド、ミャンマー、アフガニスタン
、化アフリカなどにおいて、経口感染で流行する直径２
７〜３２ｎ−のカリシウィルス様の肝炎ウィルスである
０ｌｕｒｏｏ、　Ｍ、Ｓ、’　Ａｍ、　１．　Ｗｅｄ、
　、　ｕ　：　ｐ、　８１Ｂ−８２４，ｔ９８Ｇ）、　
　このウィルスはｅｐｉｄｅｍｉｃあるいはｅｎｔｅｒ
ｉｃのＥをとってＨｅｐａｔｉｔｌｓ　Ｅ　ｖｉｒｕｓ
（ＲＥ　Ｖ　）と呼ばれている。

もう一方は輸血後肝炎の大部分の原因となっているウィ
ルスで、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ　
）と呼ばれているウィルスである。該ウィルスは古くか
らその有在が確認されていたが（Ｔムｂｏｒ、Ｅ、、ｅ
ｔ　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ、Ｉ　：ｐ、４６３．、１９
７８）、世界中の研究者の多くの努力にもかかわらず、
現在もそのウィルス本体は十分には解明されていない。

このような状況の中で１９８９年、米国のＣｈｏｏ、　
Ｑ、等はＨＣＶのｃＤＮＡのクローニングに成功し、そ
の一部の発現蛋白を用いて抗ＨＣＶ抗体の検出系を確立
したことを報告した（Ｃｈｏｏ、　Ｑ、　ｅｔ＾１．　
５ｃｉｅｎｃｅ、　１１４．　Ｐ、　　３５９−３６２
．１９８９；　Ｋｕｏ、　Ｇ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　２１４．　ｐ、３６２−３６４．１９８９）
、　　一方、本件発明者らは、日本人献血者のＧＰＴ高
値血漿を用いて独自にＨＣ■楕遺蛋白領域をコードする
ｃＤＮＡのクローニングに成功し、すでに特許出願を行
なっている（米国出願　４０８．４０５号）。

Ｋｕｏ、　Ｇ、等の作製した抗ＨＣＶ抗体検出ＥＬＩＳ
Ａ系（オルソ社製ＨＣＶ　　Ａｂ　ＥＬＩＳ＾キット）
は、　ウィルス遺伝子の非構造領域と省えられている部
分のＮＳ３からＮＳ４領域のＣ１００と呼ばれている部
分を、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘ
ｉｄｅ　ｄｉａｍｕｔａｓｅ：　５ＯＤ）との融合蛋白
として酵母菌に発現させたものを抗原として使用してい
る。この方法は世界中のＨＣＶ感染者の有するウィルス
抗体を特異的かつ鋭敏に検出できること、また、輸血後
のＣ型肝炎を伝播する輸血用血液のスクリーニングの判
定法として価値の高いものである。

しかしながら、前記抗体検出系におけるＣ１００抗体は
、Ｃ型肝炎発症後陽性となり、感染から通常３〜６ケ月
間は検出不可能で、この間Ｃ型肝炎の診断法としては利
用できないことが最大の問題点として挙げられる。また
、抗Ｃ１００抗体陰性の血液だけを輸血した症例におい
ても、Ｃ型肝炎ウィルスの発生がある程度観られること
から、この抗体検査だけでは輸血後肝炎の５０％程度し
か検出排除することができないと予想されており、新た
な抗体検査法が切望されている。さらに、組換えＤＮＡ
技術によって生産される融合蛋白ウィルス抗原を使用す
る検出系においてはなお、以下のような問題が残ってい
る。

ｌ）培養した組換え微生物由来のプロテアーゼによる所
望の発現蛋白質の分解のおそれがある。

２）培養した組換え型微生物、培養細胞の上清、菌体、
細胞より、　目的とする抗原蛋白を精製する場合は、そ
のＭ製出発材料中に１組、換え型微生物、培養細胞、用
いた培地由来の蛋白が多量に混入しており、Ｍ製は一般
に多くの段階を経る複雑な行程となる。

３）融合蛋白に起因する非特異反応、発現に用いた組換
え型微生物に起因する非特異反応を生じる可能性がある
。

４〉組換え型微生物の培養が不可欠であり、各ロット毎
のロット間の差異が生じ易い。

上述の市販ＨＣＶ抗体検出系は、従来達成することので
きなかったＣ型肝炎ウィルスに対する抗体を迅速にかつ
簡便に検出し得るという点で極めて′Ｍ、義あるもので
あるが、さらに検出率、非！！＊異反応の抑制という観
点から１００％正確な鈴断が望まれている。また、品質
管理の面からもなお、改善の余地がある。この目標を達
成するためにさらなる開発が展開されている。

本件発明者等は、融合蛋白に起因する非特異反応、発現
に用いた形質転換した微生物に起因する非特異反応や、
品質管理の困難さを避けるため、独自にクローニングさ
れたｃＤＮＡによってコードされる構造領域の合成ペプ
チドを調製して、これをいくつかの抗体検出法に利用し
た系の開発を進め、本発明を完成するに至った。

弦」ＬΩ」Ｌ豹 本発明は、ＨＣＶ感染検出診断において非常に優れた特
異・選択性でかつ高感度で使用できる、抗原性ＨＣＶタ
ンパクに対応する新規ペプチドを提供すること、また、
該新規ペプチド、あるいはその一部を直接使用する抗Ｈ
ＣＶ抗体検出方法を提供することを目的とする。

の詳細については本件発明者等による先の特許出Ｉｔ（
米国出Ｉｔ　４０Ｂ、４０５号）において記されている
。

本件発明者等はこれらのｃＤＮＡを、プラスミドに組み
込み、適当な宿主細胞に組み込んで発現させ、該発現産
物を精製し、抗ＨＣＶ抗体検出系を検討する一方で、該
ｃＤＮＡのシーフェンスをアミノ酸に読み替えてペプチ
ドを合成し、これを用いた抗ＨＣＶ抗体検出系の検討を
行なってきた。

先ず、本発明の第一の目的を達成するために、当該ｃＤ
ＮＡのシーフェンス情報よりペプチドシンセサイザーを
用いて、以下に示すペプチドを合成した（以下、Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ−０と称する）。

Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ−＾５ｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ＝Ｐｒｏ
−Ｇｌｎ日・ 本件発明者等は非Ａ非Ｂ型肝炎に感染していると考えら
れる日本人の肝機能値（ＧＯＴ、　ＧＰＴ）異常血漿よ
りＨＣＶのｃＤＮＡをクローニングした。そ本発明の第
二の目的は、１配のペプチドもしくは該ペプチドを含有
するペプチド、もしくは該ペプチドの一部からなる抗原
性ペプチドに、試料中に存在する抗ＨＣＶ抗体と前記ペ
プチドの間で免疫学的結合物が形成される条件下で、試
料を接触させ、前記免疫学的結合物の形成を測定して試
料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を確認する抗ＨＣＶ抗体検出
方法により達成される。

すなわち、本発明はＨＣＶ遺伝子でコードされたポリプ
ロティンの構造領域の核蛋白に対応す゛るペプチド抗原
を見いだしたことによりなされたもので、このペプチド
はＨＣＶ感染によるＨＣ患者の於断や、血液及び血液製
剤中のＨＣＶ被爆のスクリーニングについて高い信頼性
、高い特異性でかつ該った結果が極めて少なくなる方法
に用いられるものとして有用である。

（実施ｉ様の概説） 本発明はＨＣＶ遺伝子のコードする蛋白領域の一部の蛋
白に対応する抗原性へプチドに関するものであって、構
造領域の核蛋白の一部に対応する１〜２０個のアミノ酸
からなるペプチドを提供するものである。これらの新規
ペプチドはＨＣＶ感染やウィルス被爆の有無の診断に有
用である０本発明に含有されるペプチドは、ＨＣＶ特興
特休抗体応する配列的（シー２エンシヤル）なエピトー
プを構成する配列を含むアミノ酸配列を有、するオリゴ
ペプチドからなる。

このように、本発明によって提供されるペプチドは、Ｈ
ＣＶに係る免疫反応性を有するペプチドであって、これ
らは公知の固相ペプチド合成方法により合成され得る。

基になる蛋白の配列にはない１〜２個のアミノ酸を本ペ
プチドのアミン末端、あるいはカルボキシル末端に付加
して合成してもよい、このようなアミノ酸の付加により
、キャリアー蛋白や支持体と本ペプチドとを結合するこ
とができる。こうした目的のために有用なアミノ酸には
、チロシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、
システィン及びこれらの誘導体がある。

さらに通常の蛋白質修飾法により、例えばアミノ末端の
アセチル化や、カルボキシル末端のアミド化などにより
、本ペプチドが他の蛋白やべ１チド分子あるいは支持体
と結合する手段を付加することも可能である。

合成された所望のペプチドはまた、通常の精製手段によ
り精製され、回収される０例えば、一般にはこれらの合
成ペプチドを合成ペプチド精製用カラムを用いた高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、回収して
凍結乾燥法により乾燥後、以下の測定方法に供する。

これらのペプチドはＨＣＶ抗原あるいはＨＣＶ会合・結
合抗原に対する抗体検出方法に用いることができる。試
料中のＨＣＶ特異抗体の存在を検出するために本ペプチ
ドを用いる方法では、本ペプチド抗原と試料中のＨＣＶ
抗体との間で免疫学的複合体（抗原抗体結合物）を形成
し得る条件下で、本ペプチドを試料と接触させるのが望
ましい、抗原抗体結合物がたとえ僅かでも形成されるも
のであれば、試料中にＨＣＶ抗体が存在することを意味
するものであり、適当な手段によってこれを検出し、測
定することができる。

このような方法として、酵素結合免疫測定方法（Ｅ　Ｌ
　Ｉ　Ｓ　Ａ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）、
ウェスタンブロット法、あるいは各種の担体凝集反応を
利用した方法等が挙げられる。これらのアッセイ法の中
で、特に患者血清や輸血用血液あるいは血液製剤等を迅
速に大規模に臨床、スクリーニングするにはＥＬＩＳＡ
が好適である。

以下、具体的な実施態様についてＥＬＩＳＡを例にとっ
て概説する。

上述の合成ペプチドを適当な緩衝液、例えばＰＢＳに溶
解し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各ウェルへ入れ、４℃
で一夜放置して該合成ペプチドをプレートへ結合させる
。　　０．０５％Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｔｗｅｅｎ　２０で洗浄
した後、　１％ＢＳＡを各ウェルへ入れ３７℃で１時間
放置してブロッキングを行なう、さらに０．０５％ＰＢ
Ｓ　Ｔｗｅｅｎ　２０などの洗浄液で洗浄し、被検サン
プルを希釈して各ウェルへ入れ、３７℃で一時間反応さ
せる。再び０．０５％　Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｔｗｅｅｎ　２０
で洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート液
を各ウェルへ入れ、３７℃で一時間反応させる。　　０
．０５％　ＰＢＳ　Ｔｗｅｅｎ　２０で洗浄後、○ＰＤ
基質液を入れ室温、暗所で発色させる。３０分後２Ｍの
硫酸を加え、反応を停正し、４９２ｎｍの吸光度を測定
する。

Ｐｅｐｔｉｄｅ−０の合成ペプチドを用いてＥＬＩＳＡ
の系を作製したところ、非Ａ非Ｂ型肝炎特異性が高く、
また、非Ａ非Ｂ型肝炎患者における抗体検出率が非常に
高いことが明らかになった。特にこのＥＬ　Ｉ　ＳＡ系
では、従来のオルソ社製ＨＣＶＡｂＥＬＩＳ＾キ・ｌト
では検出することのできなかった非Ａ非Ｂ型肝炎患者か
らも高率に抗体を検出することが可能になった。

なお、上述の実施態様は主として、化学的に合成したペ
プチドのみを使用した場合について記したが、これに限
定されるものではなく、さらに当該ペプチドを含有する
ペプチド、さらには当該ペプチドの任意の一部を用いた
場合でも好適な抗ＨＣ■抗体検出系を構築することが可
能である。

本発明のポリペプチドを用いたＥＬＩＳＡ系は、組換え
型微生物、培養細胞によって発現させた抗原を用いた従
来の市販のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法に比べ、次のような特長を
有している。

まず１発現用のプラスミドの構築、組換え型微生物の作
製、クローニング、発現実験の手間を必要としない、ま
た、組換え型微生物の培養を必要とせず、従って、各ロ
ット毎のロット間の差異が生じない、さらに、培養した
組換え型黛生物のプロテアーゼによる、発現蛋白の分解
の恐れも無い。

培養した組換え型機生物、培養細胞の上清、菌体、細胞
より、目的とする抗原蛋白を精製する場合は、その精製
出発材料中に、組換え型微生物、培ＩＪ！細胞、用いた
培地由来の蛋白が多量に混入しており、精製は一般に多
くの段階を経る複雑な行程となる。これに対し、合成ペ
プチドをペプチドシンセサイザーで合成する方法はほぼ
自動化されており、かつ、精製はＨＰＬＣを用いて容易
に行なうことができる。また、組換え型微生物、培養細
胞、培地由来の非特異反応の原因となる蛋白の混入や、
精製に伴う発現蛋白の変性、失活の恐れが無い、さらに
、培養や精製に伴うロンド間差が無いため、品質管理が
容易である。

また、本発明のＨＣＶ抗原ペプチドは、わが国でメジャ
ーなＨＣＶ株のｃＤＮＡを基に調製されているので、従
来の市販キットで検出できない部分を補完できるという
、大きな特長を有する。さらに、本発明の抗体検出系に
よれば従来の市販キットよりも早期に出現する抗体を検
出することができ、本発明の有用性をさらに支持するも
のである。

以下、本発明の特徴を明らかにするために、実施例に沿
って詳述するが、これらの実施例は本発明の種々の具体
例を説明するものであって、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。

夾ｉ医−１ 日本人の濃縮血漿より分離したＨＣＶｃＤＮＡのシーフ
ェンス情報（米国出願４０８，４０５号）より、Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ−０を合成した０合成には、Ａｐｐｌｉｅｄ　
Ｂｉ。

ｓｙｓｔｅｍｓ社の　４３０＾　Ｐｅｐｔｉｄｅ　　５
ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用い、精製は合成ペプチド精製
用ＨＰＬＣカラム（＾ｑｕａｐｏｒｅ　　Ｐｒｅｐ−１
０，Ｃ−８，３００＾　ｐｏｒｅ　　５ｉｚｅ、　　２
０ｕ−５ｐｈｅｒｉｃａｌ　　５ｉｌｉｃａ、　　１０
ｍｍ　　ＩＤ　　ｘ　　２５０ｍｍ、　　Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。精製した合
成ペプチドについて常法に従って組成分析を行なったと
ころ、所望のペプチドが合成されたことが確認できた。

Ｐｅｐｔｉｄｅ−０をＰ　Ｂ　Ｓ　（０，１Ｍ　Ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）へ溶
解し、　１μ９／−とし、　イ、ムノプレートの各ウェ
ルへ２００Δずつ加え、４℃で一夜反応させ、０．０１
％Ｔｗｅｅｎ　８０を含むＰ　Ｂ　Ｓ　（ＰＢＳ−Ｔ）
で洗浄し、０１％　Ｂ　　Ｓ　　Ａ　　（Ｂｏｖｉｎｅ
　　ｓｅｒｕｍ　　ａｌｂｕｍｉｎ）、　　ＰＢＳ　溶
液２５０Δ／ウエルでポストコーティングを行なった。

その後、０１％　ＢＳＡ　　ＰＢＳ−Ｔ　　を各ウェル
に２００Δ加え、これに血漿サンプル２０Δを入れ、プ
レートミキサーで軽く攪拌した後、３７℃で１時間反応
させた。

次にＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔで洗浄後、ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ　
ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートを２００ｄ　／ウェル加
え、３７℃で１時間反応させた。

Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔで洗浄後、Ｔ　Ｍ　Ｂ　Ｚ　（３，３，
５，５−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｌｄｉｎｅ塩
酸塩）基質溶液２００Δを各ウェルへ加え、３７℃で３
０分反応させた後、　２Ｍ硫酸を５０Δ／ウェル加えて
反応を停止した。これをＥｍａｘｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　
ｍ１ｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ　（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ社〉を用いて、４５０ｎｍ／６５
０ｎ■の２波長で測定を行なった。

本測定に用いた血漿サンプルは世界的に広く用いられて
いる市販のオルソ社製ＨＣＶ　　Ａｂ　ＥＬＩＳＡキッ
ト陽性サンプル（ｃｔｏｏ抗体陽性）、オルソ社製ＨＣ
Ｖ　　Ａｂ　ＥＬＩＳＡキット陰性サンプル（Ｃ１００
抗体陰性）さらに陰性対照としてＢ型肝炎つィルス抗体
陽性サンプル（ＨＢ　Ｖ　’）、及びＡ型肝炎つィルス
抗体陽性サンプル（ＨＡ　Ｖ　”）の４種類を用い、各
々１０検体ずつ測定した。

また、比較のために、本件発明者等により見いだされた
ＨＣＶｃＤＮＡをバキュロウィルスベクターを用いた発
現系に組み込み産生させたポリペプチド（ＨＣＶ−３Ｆ
９＞を使用したアッセイ系による測定を実施した。測定
結果を第１表に示す、数値はＥＬＩＳ＾におけるＯＤ値
を表す。

第１表 サンプル＋Ｃ１００抗体陽性 サンプル Ｃ１００抗体陰性 １（ＣＶ−３Ｆ９ ０．０８４ ０．６９４ ０．４１８ Ｐｅｐｔｉｄｅ−０ ０，８５７ ０，１２２ １，１６２ ０，２３０ ０，４９９ ＨＣＶ−５Ｆ９ ０．０１７ ０．２６７ ０．６５６ １．３５７ ０．３２１ ０．３６１ Ｐｅｐｔｉｄｅ−０ ０，９５７ １，１３７ １，５７３ ０，２７１ ０，９３３ ０，０７０ ０，７６７ ０，２１９ 以下余白 サンプル：ＨＢＶ・ ＨＣＶ−８Ｆ９ ０．０３６ ０．０２５ ０．０３３ ０．０８０ ０．０２１ ０．０７８ ０．０３０ ０．０５７ ０．０６６ Ｐｅｐｔｉｄｔ−０ ０，１７９ ０，０６７ ０ｌθ１ ０．１６０ ０．０６１ ０．０５７ ０．０９１ ０．０５６ ０．１４４ ０．１２５ サンプル：ＨＡＶ’ ＨＣＶ−５Ｆ９ ０．０８６ ０．０４２ ０．１０１ ０．０６５ ０．０８５ ０．０７４ ０．１０４ ０．７１２ ０．０７８ ０．０４９ Ｐｅｐｔｉｄｅ−０ ０，２７８ ０，０８１ ０，２０３ ０，１２２ ０，１８８ ０，１８７ ０，１８６ １，０２０ ０，１１４ ０，１０２ ＣＩＧＯ抗体陰性サンプすｌＯ例のうち８例を陽性と検
出し、市販のオルソＨＣＶ＾ｂ　ＥＬＩＳＡ系キットで
検出できない検体を捉えており、本発明の特長を明らか
に示している。これはＥＬＩＳＡ系に用いられた抗原ペ
プチドをコードする遺伝子領域の本質的な違いに起因す
るものと考えられる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記のアミノ酸配列によって規定されるペプチド
   、もしくは該ペプチドを含有するペプチド、もしくは該
   ペプチドの一部： Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐ
   ｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒ
   ｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
   −Ｇｌｎ（２）特許請求の範囲第（１）項記載の抗原性
   ペプチド、もしくは該ペプチドを含有するペプチド、も
   しくは該ペプチドの一部から構成される抗原性ペプチド
   に、試料中に存在する抗Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）抗
   体と前記ペプチドの間で免疫学的結合物が形成される条
   件下で試料を接触させ、前記免疫学的結合物の形成を測
   定して試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を確認する抗ＨＣＶ
   抗体検出方法。 （３）ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、ＲＩＡ（ラ
   ジオイムノアッセイ）、ウェスタンブロット法及び凝集
   法より選ばれる特許請求の範囲第（２）項記載の抗ＨＣ
   Ｖ抗体検出方法。