JPH06500796A - 非ａ非ｂ肝炎のためのイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非Ａ非Ｂ肝炎のためのイムノア７セモ この出願は、１９９１年６月１３日出願された我々の特許出願書類番号ＰＡ〜４ １４８の一部継続である。

本主皿二宜景 非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）の原因因子の本態に関する大部分の証拠は、それが 単一のオーブン読み枠を含むゲノムを有するフラヴイウイルスまたはフラヴイ様 ウィルスであるとの結論に一致する。

このウィルスは仮に肝炎Ｃウィルス（ＨＣＶ）と命名されている。

このライｌレスのキャブシンド、マトリ・ンクスおよびエンベロープタンパクを コードする提案された構造遺伝子はゲノムの５°末端に組織され、そして提案さ れた調節非構造遺伝子は３°末端に所在するＥＰＯ３１８２１６（Ｈｏｕｇｈｔ ｏｎ）は、Ｂｒａｄｌｅｙｅｔ　ａｌ、、Ｓｅｍ１ｎａｒ　ｉｎ　Ｌｉｖｅｒ　 Ｄｉｓｉｅｓｅ、６：５６　（１９８６）に記載されているり、Ｂｒａｄｌｅｙ によって寄贈されたエンリンチされた血漿源からのＨＣＶウィルスゲノム部分の クローニングを開示する。ＥＰＯ３１８２１６に開示された配列のすべては該ゲ ノムの調ｗＪ（非構造）部分に属すらしい。

ＥＰＯ３８８２３２は該ゲノムの５′末端の構造遺伝子を表わすらしい追加のヌ クレオチドおよびポリペプチド′配列を開示して゛　２１６出願を補足した。

岡本ら、Ｊａｐａｎ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、６０　：　１６７　（１９９０） は最近キャブジッドタンパクと考えられる１１０番目がら１９０番目アミノ酸残 基を含んでいる構造タンパクに対応するＨＣＶウィルスゲノムの５゛アミノ酸配 を記載した。ＥＰＯ３８８２３２（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）に記載されたものに相当 するコア（キャブジッドとして知られる）およびエンベロープ領域の記載はＫａ ｔａｈｅｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１８：４６２６　（１９９０）に与えられている。前記特許出願のどれもＨＣＶ 構造配列のどの特定の部分が抗原決定子を形成するのが指摘していない、岡本ら 、Ｊａｐａｎ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、６０　：１６７　（１９９０）は、アミ ノ酸位置１〜１２ｏにわたる局所的親水性の少なくとも３区域を記載している。

これら区域の一つにおいて、岡本ら、Ｊａｐａｎ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、６０ ：２２３　（１９９０）は、合成ペプチドとして合成した時イムノアッセイに有 用性を有するアミノ酸配列（ａａ　＃３９−７４）を同定した非Ａ非Ｂ肝炎のた めの追加の配列はＥＰＯ３６３０２５（有馬）に述べられている。を馬のヌクレ オチドのコンピューター解析は、それらは特許出願または文献にこれまで記載さ れた他の配列と相同しないことを指示する。しかしながら、予想したアミノ酸配 列の比較は、有馬配列中の１１個のうち１０個のアミノ酸はヨーロッパ。

２３２出願および上に引用した論文中の対応する配列と−敗しそして相同する、 キャブジッド領域に対する短い配列マツプを明らかにする。出願人は以後この相 同領域を“共通配列”と呼ぶ。

主光亙ΩＩＩ 出願人は、ＨＣＶのオーブン読み枠の始めからアミノ酸３日までのアミノ酸配列 を囲み、そして“共通配列”を囲む合成ペプチドをつくった。この領域内に形成 される変動する長さのペプチドが、共通配列を含んでいる有馬の３４アミノ酸ポ リペプチドとイムノアッセイにおいて比較された。

本発明によれば、これまで発表されたｖＣｖゲノム配列の最初の１１４個の連続 したオープン読み枠５゛ヌクレオチドによってコードされる、予想したペプチド 配列を有するエピトープ基が同定された。このウィルスのキャブシフトタンパク 中に含まれるこれらのエピトープは、アミノ酸配列ＱＲＫＴＫＲＮＴＮＲＲもし くはＱＲＫＴＫＲ３ＴＮＲＲを有する第１のエピトープと、そして第１のエピト ープの３′末端において第１のエピトープへ隣接する、アミノ酸配列ＰＱＤＶＫ ＦＰＧＧＧまたはＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰを有する第２のエ ピトープを含んでいる。

前記ウィルスの最初の１１４個連続オープン読み枠５′ヌクレオチドによってコ ード、される予想したアミノ酸配列から得られる、前記エピトープ基を含む上で 定義したペプチド、またはその実質的均等物は、患者の血清の抗ＨＣＶ抗体の存 在の決定のためのイムノアッセイに便利に組込むことができる。そのようなアッ セイは、そのような抗体を含むサンプルを、前記ペプチドを固定化した固相基質 と接触させ、結合しない抗体を固相基質へ結合した抗体から分離し、そして固相 基質上の結合抗体の存在を検出することを含む。

本発明の他の面において、）ＩＣＶ特異性抗体を検出するための競合狙害アッセ イは、最初の２８個キャブジッドアミノ酸を含んでいるエピトープ基に対する特 異性を持っている抗体を含むサンプルと、前記エピトープ基含有ペプチドを固定 化した固相基質とを、実質上アミノ酸配列ＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧを有するペプチ ドの競合量の存在下接触させ、固相基質上に固定化された前記ペプチドへ結合し た抗体をそのように結合しなかった抗体から分離し、そして結合した抗体の量を 決定することを含む。

別の具体例において、前記ペプチドはフルオレセインのような発螢光団によって 標識することができる。標識した螢光団は抗体−ペプチド複合体を形成するよう にサンプルとインキュベートされ、増加した螢光分極が測定される。このように 分離ステップを回避する均質アッセイが提供される。

しい　の−　な腎 タンパクのエピトープを含んでいる、好ましくは合成化学技術によって製造され たペプチドは、イムノアッセイにおいて全体のタンパク自体よりも望ましいであ ろう、標的抗原がその上に吸着される固体基質を利用するアッセイにおいては、 吸着表面積がアッセイの制限パラメータである。このため、吸着部位を占領する 大きなタンパクの未反応部分よりも、単位表面積あたり決め手となるエビ）　− プを含むペプチド分子をより多く吸着するのがもっと効率的である本発明におい ては、ＶＣＶキャブジッドタンパクのアミノ末端の選定は以下のベースで行われ た。有馬配列とＨｏｕｇｈｔｏｎ出願に開示された配列の間に核酸相同性の完全 欠落は、１２種の完全に異なるウィルスがＮＡＮＢＨに関与し得ることを示唆し た。しかしながら、説明不能であるが同じ血清パネルを有する両方のソースのク ローンから発現された抗原に対し高度の反応性が存在する。

残基８から１８を含む１１個アミノ酸セグメント（ＨＣＶ、Ｈ。

ｕｇｈｔｏｎ）について、ポリペプチドレベルにおいて有馬と５”Ｈｏｕｇｈｔ ｏｎ配列の間に１０個のアミノ酸相同が存在するとの発見は、該ウィルスのある 種の相関性を示唆した。該発見はまた、共通配列は共通のエピトープを形成する ことを示唆した。前記共通配列をコードするペプチドおよび有馬およびＨｏｕｇ ｈｔｏｎの種々の長さのフランキング配列を含むペプチドに対するＨＣＶ陽性血 清パネルの免疫反応性の解析は、該共通配列内にエピトープの存在を確認した。

図ＩＡは有馬クローン１４配列から得られた多数のペプチドの配列を示す。この シリーズ随１〜８において、共通配列がＨｏｕｇｈｔｏｎへ精密に相当するよう にセリンをアスパラギンへ置き換えであるにの図において、有馬のアミノ酸配列 は多数の垂直行に水平に並べである。それらの間の点線は個々の合成ペプチドの 対応する範囲を示している。このため例えば行魔１において、該ペプチドはアミ ノ酸残基２５から３４まで延びることを意図する。図ＩＡ、Ｎ１９は有馬によっ て記載されたように位置２０にセリンを有する有馬配列である。ペプチドＮ１１ ｌｌおよび１２は、Ｎ１１ｌｌでは位置２０にセリンをそしてＮ１１１２におい ては位置２０にアスパラギンを有する共通配列である。

図ＩＢは種々の長さのＨｏｕｇｈｔｏｎ　（および岡本）配列を含んでいる合成 ペプチドを示す。図ＩＣは位置２０において種々のアミノ酸！換した共通配列で ある。図ＩＣに示したアミノ酸は図ＩＢの配列と一致する。アミノ酸位置ｌにあ るグルタミン残基の環化を防止するためグリシンが共通配列の５゛末端へ追加さ れた。図ＩＤはＥＰＯ３１８２１６に開示された非構造ＨＣＶ配列であり、そし てＣ−１００タンパク内に配置される。図ＩＥは、アミノ酸残基番号３９から７ ４全部まで延びる、開本らによって選定されたキャブジッドフラグメントのため の配列を与える。加えて、２種の構造ペプチドに対応する配列（ａａ１０９−１ ３３および１３３−１６９）が提出されている９図ＩＦはアミノ酸１−３８をカ バーするＨＣＶペプチド配列と、その二つの追加のカルボキシ末端ペプチドフラ グメントを示す。

これらの種々のペプチドを固定基質へ固定化し、そしてＨＣＶに対する抗体を含 んでいる血清のパネルに対するイムノアッセイにおいてテストした実験の結果が 実施例に詳細に述べられている。一般に、アミノ酸１ないし３８をカバーする開 本配列の完全ペプチドが最良の信号対バンクグラウンド比を与えた。共通配列は ある程度の免疫反応性を発揮したが、しかしながらもしカルボキシ末端配列が存 在したならば免疫反応性は有意義に改善された。これは恐らくエピトープの正し い配座提供に対する立体障害を防止するためにいくらかのスペーシングが必要な ためである。

前記結果はまた、残基１から８までのそして残基２８ないし３８へ延びるＨＣＶ キャブジッドペプチドは、有馬クローン１４ペプチドよりも多数のＨＣＶ反応性 血清を正しく同定することを指示する。反対に有馬ペプチドは、指示したＨＣＶ キャブジッド１−２８または１−３８によって同定されなかった追加の陽性血清 を同定しない。このことは、ＰＱＤＶＫＦＰＣ；ＣＧを含むカルボキシ−フラン キング配列は共通配列に含まれる第１のエピトープの３°末端へ続いている第２ のエピトープを形成することを意味する。すべてのペプチドフラグメントは、フ ルニレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）アミノ保護戦略および１，３−ジイ ソプロピルカルボジイミドカソプリング化学を用いる、Ｍｉｌｌｇｅｎ−Ｂｉｏ ｓｅａｒｅｈ９６００モデルペプチドシンセサイザー上でアミド形に合成された 。配列のアミド形は、遊離酸形よりも生物学的に活性な類縁体をもっと密接に真 似することが期待できたので採用された。活性化されたアミノ酸は２．４−ジメ トキシベンズヒドリルアミン樹脂へ連結された。ペプチド合成は、イサチンテス トが実施されたプロリンを除くすべてのアミノ酸に対してニンヒドリン分析によ ってモニターされた０合成されたペプチドは、トリフルオロ酢酸、チオアニソー ル、エタンジチオールおよびアニソールを９０：５：３：２の体積比で含んでい る試薬Ｒにより樹脂から開裂した。

樹脂から開裂したペプチドは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精 製され、そして正確な配列を確かめるためにＰｏｒｔｏｎ　ＰＩ　２０　９０Ｅ 集積マイクロ配列決定システムによって特徴化された。純度はトリフルオロ酢酸 中アセトニトリル５％から４０％までの直味勾配を使用して３５分にわたって逆 相カラム上のＨＰＬＣによって確かめられた。吸光度は２３０ｎｍにおいて追跡 された。

代わりに、当業者が普通に利用し得る、クローニング技術、プロモーターの操作 、リポソーム結合、はん訳を使用することにより、組換えペプチドを生物学的に 製造することができる。

本発明のペプチドは、タンパク標的を使用するどんなアツセイ系においても好都 合に使用することができる。好ましい具体例におし）ては、標的ペプチドフラグ メントが常磁性微粒子上へ受動的もしくは共有結合被覆方法によって被覆される 。抗ＨＣＶ抗体の存在下インキュベーションステップの後、結合した抗体ペプチ ド複合体が磁気分離によって未結合抗体から分離され、抗体ペプチド複合体中の 抗体の量が決定される。

好都合には、複合化した抗ＨＣＶ抗体の検出は該複合体を酵素結合抗ヒト抗血清 とさらに反応させることによって実施し得る。磁気分離および洗浄による、常磁 性微粒子上の標識した複合体を分離したとき、螢光発生基質が添加される。測定 した螢光の量はこのためサンプル中に存在する抗ＮＡＮＢＨ抗体の量に正比例す る。

代替具体例においては、本発明のペプチドは古典的な酵素結合免疫吸着体アッセ イ（ＥＬＩＳＡ）のマイクロタイタープレート上へ被覆し、サンプルとインキュ ベートし、吸引し、そして結合した抗ヒト抗血清を加えることができる。円形分 配クロマトグラフィー計画において固体基質としてガラス繊維フィルターを使用 してもよい。検出は適切な基質および／クロモゲンを加え、そして生成する生成 物を測定することによって慣用的に実施される。ＥＬＩＳＡの一般的ＩＩ論につ いては、Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｍｍｕｎｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 、Ｐａｒｔ　Ｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ、Ｐ、８４（１９８２）を見よ。

本発明のペプチドに適用し得る他のアッセイ成績は、ウェスタンプロット、Ｔｏ ｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７６：４３ ５０　（１９７９）；ラジオイムノアッセイ　（ＲＩＡ）、Ｗａｌｓｈ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃ（Ｄｉｓ、、２１：５５０　（１９７０）；競合アッセ イ、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ、Ｃ１ｉｎ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２１　：１３９　（ １９８日）；非競合アッセイ、Ｃｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、、４６：２９　（１９８０）；イムノブレシピテーション、Ｔｏｊ ｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、３４：２４２３　（１９８８）および トンドブロット、Ｊａｈｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８１　：１６８４　（１９８４） ｉＰｃＦＩＡ、Ｊｏｌｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、 ６７：２１　（１９８４）を含む。

配列中の重要でない変更、例えばアミノ酸置換、追加または除去はエピトープが 有意義に変化しないためアッセイ成績に認知できるほど影響しないことを強調す べきである。このため構造中そのような重要でない変更はもとのポリペプチドの 配列へ厳密な相同性を有するペプチドの均等物であると考えられる。

困皿塁皿垂呈に更 図１： Ａ、有馬クローン１４ペプチド（ＮＣＬ９）の全長アミノ酸配列およびそのフラ グメントが記載されている。加えてアミノ酸位置２０において修飾したクローン １４ペプチドの配列（ペプチドＮ［１８）およびそのフラグメントが記載されて いる。点線は実際に合成されたペプチドを表す。

Ｂ、最初の２８アミノ酸をカバーするＨＣＶキャプシ・ンドのアミノ酸配列が記 載されている。点線は実際に合成されたペプチドを表すＣ，ＨＣＶキャブジッド のアミノ酸８−１８　（またはクローン１４アミノ酸１４−２４）を表す３種の ペプチドのアミノ酸配列が提示されている。すべてのペプチドに対し、Ｎ末端ヘ ゲリシンが付加された。ペプチドｋ１６および随１８はＨＣＶキャブジッドアミ ノ酸位置１４（または図ＩＣ内のアミノ酸位置７）においてアミノ酸置換を含ん でいた。点線は合成されたペプチドを表す。

Ｄ、ＨＣＶ非構造領域４（Ｃ−１００タンパク）内のある領域に相当するペプチ ドのアミノ酸配列が提示されている。このペプチドはＨｏｕｇｈｔｏｎによって 記載されたＨＣＶアミノ酸１６９３−１７３５に相当する。

Ｅ、三つの異なるＨＣＶキャブシンドペプチドのアミノ酸配列が提示されている 。ペプチド随２０はアミノ酸３９−７４をカバーし、ペプチドＮｆ１２１はアミ ノ酸１０９−１３３をカバーし、ペプチドＮα２２はアミノ酸１３３−１６９を カバーする。

Ｆ、ＨＣＶキャブジッドアミノ酸１−３８を表すペプチドのアミノ酸配列がペプ チド石２５として提供されている。アミノ酸２９−３８（ペプチド胤２６）およ びアミノ＃１１９−３８　（ペプチドＮ１１２４）を表す二つの他のペプチドも 記載されている０点線は合成されたペプチドを表す。

実施例１ 図ＩＡないしＩＬに示した配列に相当するペプチドが上で示したようにつくられ た。ペプチドは以下の操作に従って常磁性ポリスチレン微粒子（径４ミクロン、 ハクスター、ダイアグノスチンクス、インコーホレイテンド、バンデックス部門 ）へ受動的にコートされた。５％ｗ　／　ｖ常磁性粒子２５０μ２がマイクロ遠 心機中で５００Ｏｒｐｍにおいて５分間ペレット化された。上滑を除去し、粒子 ペレットを７０％エタノール５００μ２で１５分間再懸濁した。粒子をその後上 記と同じようにペレット化し、上清を除去した０粒子を０、ＬＭ　ＣＡＰＳ１１ ｋ衝液〔（３−シクロへキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）、ｐＨ＝１ １．０の５００μ！中に再懸濁した。粒子を以前と同様にペレット化し、上清を 除去した。

凍結乾燥したペプチドを秤取し、無菌濾過（０，２２μｍ）した水中にペプチド 濃度１０■／　ｍ　Ｌになるように再懸濁し、室温において３０分間溶液に溶解 するのを許容した。溶解したペプチドは室温で２０分間安定化するのを許容した 。このペプチド溶液２５０μ２を洗った粒子へ移した。粒子を再懸濁し、室温で １２ないし１６時間振とうした。

次に受動的に吸着されたペプチド粒子を５００Ｏｒｐｍで３．５分間ペレット化 し、上清を除去し、そして粒子を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えた等張緩衝食 塩水中に再懸濁した。次に粒子を０゜０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加等張緩衝食塩水 で１回、そして５０００ｒｐｍにおける遠心（３，５分）を用いて等張緩樹液で ３回洗った。被覆した粒子は次に０．０２５％ｗ　／　ｖの最終粒子濃度で等張 緩衝食塩水中に再懸濁した。

実施例２ 図１に記載したペプチドフラグメントをコートした粒子を用いて常磁性粒子アッ セイは以下のように実施された。

ヒト血清もしくは血漿をウェル緩衝液（０，１０３Ｍ１−リスーＨＣ１，ｐＨ７ ，４，１，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．３３％ＮＰ−４０，０，０９％アジ化ナ トリウム、および１５％新生子ウシ血清）中に１７１００希釈した。希釈したサ ンプル５０μ２を黒色プラスチックマイクロタイタープレートの各ウェルへ加え た。サンプルは少なくとも２回の反復でテストされた。実施例１に記載したペプ チドでコートした常磁性粒子を各ウェルへ加えた（２０μｆｆ１）。プレートを その後３７°Ｃ〜４２°Ｃで３０分間放１した。

インキュベーションの終了時、ウェル中の粒子を１００１ＩＥのＰＢＳおよびＴ ｗｅｅｎ２０　（ＬＬあたり二塩基性リン酸ナトリウム２．０６ｇ、−塩基性リ ン酸ナトリウム０．３１８ｇ、Ｔｗｅｅｎ２００．５ｇＭ、塩化ナトリウム８． ７６ｇ、アジ化ナトリウム１゜０ｇ、ｐＨ７，４）で洗った。洗浄ステップの間 、常磁性粒子はプレートの底へ磁場を通用することによりマイクロタンタープレ ートウェル中に保持された。粒子をこのｔｑｍで５回洗った。

各ウェル中の粒子を３０〃！の粒子再懸Ｓ緩衝液（ＩＬあたり二塩基性リン酸ナ トリウム４．３４６ｇ、−塩基性リン酸ナトリウム０．５２４ｇ、塩化ナトリウ ム８．７６ｇ、アジ化ナトリウム１ｇ、ｐＨ７，４）再懸濁した。次にβ−ガラ クトシダーゼを接合したヤギ抗ヒトＩ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）を接合体希釈緩衝液（ ０，１Ｍ！−リスーＭＣＩ　ｐＨ７，５，０，５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ア ジ化ナトリウム、２０％新生子ウシ血液）中１：ｌ、０００へ希釈した２０μＥ を次にウェルへ加えた。

粒子へ結合したどんなヒトＩｇＧまたはＩｇＭも接合体により認識され、そして 関連していた。接合体溶液は最大の液体安定性および反応性を与えるように設計 された。特に、新生子ウシ血清は子ウシ血清より好ましい。接合体と３７°Ｃ〜 ４２℃において１５分間インキュベーション後、ウェル中の粒子は実質上すべて の結合しなかった接合体を除去するため上に３己載したＰＢＳおよびＴｗｅｅｎ ２０で５回洗った。洗液中のＴｗｅｅｎ２０は洗浄プロセスを促進し、非特異的 に結合した接合体を除去した。

最後に、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧ）の基質 溶液５０μ２を各ウェルへ加えた（ＩＬあたり、４−メチルウンペリフエリルー β−Ｄ−ガラクトシド０．１７８ｇ。

トリシン３．５８ｇ、ジメチルスルホキシド５．　Ｌｄ、メチルアルコール３０ ｄ、　アジ化ナトリウム０．２０ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０　０．５ａｆ、ｐＨ８，５ ）、ウェル中のβ−ガラクトシダーゼ（すなわち接合体）の存在はＭＵＧの開裂 を引き金し、螢光性クマリン生成物を発生させた。螢光（励起波長３６５ｎｍ／ 発光波長４５０ｎｍ）をＭＵＧ添加後２時間長（すなわち２分および１４分）に おいて測定した。このプレートは螢光測定の間３７°Ｃ〜４２°Ｃでインキュベ ートした。二つの値開の差は螢光性生成物発生の動的測定であり、そして粒子へ 結合した接合体およびヒトＩｇＧ／ＩｇＭの直接測定であった。動的螢光値は、 標準曲線を確立するためクマリン自体の種々の濃度およびその生成螢光を用いて ｎＭクマリン値に変換された。結果は１２分間にわたって生成したｎＭクマリン として計算された。５０００以上の動的値は以後の実施例において５０００とし て提示される０反応についてのカットオフは３００のランダムドナーＥＤＴＡ血 漿標本およびＨＣＶキャブジッド血清変換標本をテストすることにより、２００ 　ｎＭクマリンであると決定された。

実施例３ クローン１４ペプチドフラグメントの免疫反応性を以下のように決定した０図Ｉ Ａに示したペプチドフラグメント１〜６を実施例１に従って常磁性粒子上にコー トした。得られたペプチドは、３種のＨＣＶキャプシンド反応性血清および３種 のＨＣＶ非反応性血清を用いて実施例２に記載したアッセイにおいて評価された 。ペプチド長さを長さ中のアミノ酸を１０から１９へ（すなわちｌないし４）段 階的に増したとき、陽性信号が観察された（表１）。長さが１９アミノ酸より短 いフラグメントは反応性を示さなかった。２３アミノ酸を加えるペプチド長さの 増加はそれ以上信号を増加しなかった、このようにこのアッセイ計画において、 ペプチドの免疫反応性は大体アミノ酸位１１２と１９の間に存在する。陰性サン プルはペプチド長さを増しても非反応性に留まり、それ故陽性／陰性サンプル信 号で測定した最適アッセイ成績は、アミノ酸位置１０−３４にわたるフラグメン ト阻４〜６で観察された。

（以下余白） ＨＣＶ陽性２ ＫＣ３１０１１１２２３３３８９３４４ＨＣＶ陰性２ Ｌ５２　１７　１９　１８　１８　１６　１８Ｌ３３　８　９　１０　９　９　 ７ ＬＳ８　４　９　１０　Ｂ　７　７ 平均陰性ゴ ＨＣＶ陽性／ＨＣＶ陰性平均４ ＫＣ３０，９０，９０，９１９３５３１５３９７、０，６０，６０，６４１４７ ３１１、結果はｎＭクマリンとして提示される。

２、ＨＣＶキャブジッド抗原に対して陽性もしくは非反応性のサンプル。

３．３種のＨＣＶ陰性サンプルについてのｎＭクマリンの平均値。

４、値はｎＭクマリンＨＣＶ陽性サすプル／ｎＭクマリンＨＣＶ陰性平均を表す 。

実施例４ クローン１４ペプチドフラグメント（図１）免疫反応性を実施例２に記載した常 磁性微粒子アッセイを用いて４種のＨＣＶキャプシンド反応性および２種のＨＣ Ｖ陰性血清でさらに評価した。表２に見られるように、ペプチド顯６はペプチド に１０より強い反応性を示す。両方のペプチドはクローン１４アミノ酸１０−３ ４を含み、ペプチドＮα６においてアミノ酸位置２０をセリンからアスパラギン に変えたこと以外は同一である。この単一アミノ酸置換は陰性信号の増加なしに 陽性信号反応性を増大した。

ペプチドＮα１８はクローン１４および開本により最初記載されたＨＣＶキャブ ジッド配列によって占められる共通アミノ酸配列を含んでいた。ペプチドＮα１ ６およびＮ１１１７は、位置７におけるＮα１８のセリンがＮ１１Ｌ６およびｋ １７においてそれぞれグルタミンおよびアスパラギンで置換されたことを除き、 魔１８と同一である（図工Ｃ）。表２に提示したように、これら共通配列は単独 でいくらかの反応性を示すが、それらは共通配列を含むより長い長さのペプチド （すなわちに６およびＮ［１１０）はど免疫反応性でない。加えて、グルタミン による位置２０の修飾は修飾しないクローン１４フラグメントに比較して免疫反 応性を有意義に減少させる。三つの共通ペプチド（Ｎ１１１６−１８）はグルタ ミン酸環化を防止するためＮ末端にグリシンを持つように合成された。このため 低い観察された免疫反応性はグルタミン酸環化のためではなかった。

（以下余白） ＪＬＬ− ＨＣＶ陽性および陰性血清とのペプチドフラグメント徹６．１０．１６−１８の 反応性１ サンプル　ペプチド随 ｉ　刊　１７　１８　用 ＨＣＶ陽性 ＨＣＶ陰性 ＬＳ２　２８　２４　２５　２６　２５ＬＳ８　１４　１２　１７　１６　１９ １、結果はｎＭクマリンとして提示される。

実施例５ 開本によって記載され、そして図２Ｂに図示したＨＣＶキャブジッドの最初の２ ８アミノ酸に対応する３種のフラグメント（ＮＣＬ１３−１５）を実施例２に従 ってＨＣＶキャブジット′反応性についてテストした。免疫反応性は、アミノ酸 位置１９−２８に相当し、そしてクローン１４が持つ共同配列の外側にあるフラ グメント１３に存在することがわかった（表３）。しかしながらペプチド鎖長を クローンエイ共通配列を含むように増加した時、免疫反応性は大きく増大した。

さらにペプチド鎖長のａａ１位置までの増加（ペプチド胤１５）は最大の反応性 および最適のアッセイ成績を与えた。免疫反応性はこれら３種のペプチドのどれ によっても示されたが、陽性／陰性信号によって測定した最良成績はアミノ酸位 置１−２８をカバーするペプチドＮ［Ｌｉ２によって得られた。

（以下余白） −Ｊｂし− ＨＣＶ陽性および陰性血清とのペプチド１３−１５の反応性５３９７（１：６） ６７　１２７２　３９２７　２　５３　１６４２４５０（ｂ４）　３９　６９８ 　２４２０　２　２９　１０１２４５３（１：４）　２５　１１９　３６２　１ 　５　１５５４０２（１：８）　１０８４　１６８７　５０００　４５　７０　 ２０８５３８０（１：１６００　１１７　１５５　０　５　６２３６３（１：１ ６）６７　６６　２７０　３　３　１１５４０２（１：３２）８４　１６５　１ １７１　４　７　５１ＡＲ８３４１４７７２８８５２２０１２５平均陰性　２４ 　２４　２３ １、結果をペプチド１３．１４および１５で得られたｎＭクマリンとして提示さ れる。

２、信号／ノイズ−ペプチド１３．１４および１５についてｎＭクマリンＨＣＶ 反応性サすプル／　ｎ　ＭクマリンＨＣＶ陰性１０サンプル平均を表わす。

実施例６ ＨＣＶキャブジッドの最初の２８アミノ酸の免疫反応領域をさらに同定するため 、阻害実験のシリーズを実施した。ＨＣＶキャブジッドａａｌ−２８に相当する ペプチド随１５（図ＩＢ）を実施例１に記載したように常磁性粒子に被覆し、次 にＨＣＶキャブジッド反応性血清を用いて以下に記載する修飾したイムノアッセ イにおいてテストした。実施例２のイムノアッセイは、最初希釈したサンプル（ １：　１００希釈）を潜在的に競合するペプチド（１００μｇ／ｌｌ）と３０分 間インキュベートすることにより修飾された。潜在的に競合するペプチドを含ん でいる希釈したサンプル５０μｌをプラスチックプレートへ加え、次にペプチド 阻１５被覆粒子を加えた。この修飾を除き、アッセイは実施例２に記載したよう に正確に実施された。サンプルはペプチド添加または添加なしでテストされ、そ して結果は潜在的に競合するペプチドの存在下残っている％活性を決定するため に計算された。このように１００％は競合が起こらなかったこと、およびテスト したペプチドはペプチド１５と共通の免疫反応性を持っていないことを意味し、 一方６％は強い競合および共通免疫性の例外的に高いレベルを指示する。

表４に提示するように、ペプチド１５へのいくつかのサンプルの結合は、クロー ン１４フラグメントおよび共通のクローン１４／ＨＣＶキヤブジツドフラグメン トによって強くまたは完全に阻害できる。この阻害はクローン１４のアミノ酸位 置２０がセリンからアスパラギン置換により修飾された時でさえも生起する。そ れ故、いくつかのサンプルは共通配列へだけ局在化されたペプチド１５に対する 免疫反応性を示す。他方表４．５および６に示すように、いくつかのサンプルは 共通配列フラグメントを含んでいるペプチドにより全くまたは部分的にしか阻害 されず、ペプチド１５中の免疫反応性は共通配列外でも生起することを示す。共 通配列のＮ末端ヘゲリシンの付加はペプチド阻害を増強しない（ペプチドＮｃｔ ｌ　６−１８）ことに注目すべきである。このように表６に示すペプチド１２に 対する阻害の欠如はＮ末端グルタミン酸の環化によるものではなかったクローン １４／キヤブジツド共通配列外のペプチド１５に対する阻害性はペプチド１５の フラグメントを使用してさらに検討された。表７に提示するように、キャブジッ ドのフラグメントｋ１３（ａａ−１９２８）は４種のキャブジッド反応性サンプ ルのペプチド１５への結合を完全に阻止した。このフラグメントの長さの位置７ −２８にわたる延長は同じ観察を与えた。このように、いくつかのサンプルはペ プチド１５の１０個アミノ酸フラグメントに対してのみ免疫反応性を持っている 。

この１０個アミノ酸フラグメント（ペプチドフラグメント１３）阻害の本体をさ らに同定するため、１８のＨＣＶキャブジッド反応性サンプルをフラグメント１ ３を用いてペプチド１５への結合阻害についてテストした０表８に提示した結果 は、フラグメント１３がすべてのサンプルのペプチド１５への結合を完全に阻害 したことを示す。この発見は、これらサンプルのうちいくつかはフラグメント１ ３以外のペプチド１５領域へ免疫反応性を有することを示したので予期されなか った。例えば、サンプルＡ８３は表４において共通配列によって完全に阻害され ることを示したが、この実験ではそれは共通配列とは別個の１０ａａ配列によっ て完全に阻害された。

Ｃ以下余白） −ＪしＬ− ＡＲ８３（１９７４）１００Ｘ　６％　３％　６２　６２　ＬＸＡ　Ｒ２２５（ ４９３）１００χ　６３χ　６７χ　５９χ　６５χ　７χＬ　９　（８００） １００χ　２２１　２３χ　２３Ｘ　２５Ｘ　６％Ｂ　Ｂ　１７　（３１８８） １００χ　６３χ　６７χ　６３χ　６６χ　２χＡＲ２２２（８２６）１００ ％　８６ｍ　９７２　９６％　９５！　６＄１、結果は示したペプチドフラグメ ントのプレ吸着の後残ってし）る対照（添加なし）カラムにおいてはｎＭクマリ ン値を力・ンコ内に示す。

一表」− ＨＣＶ陽性サンプルのペプチドＮｃｔ１５への結合を阻害するためのペプチドセ グメントの使用１ サンプル　ペプチド ーオＪじ（は−　」　川　」　旦　Ｕ ＡＲ５４（８８０）１００％　８５２　７８２　９０％　７５２　３ｍＡＲ１９ １（５０００）１００χ　１００χ　１００χ　１００χ　１００χ　４χＡＲ ２２２（８３０）１００％　１００Ｘ　６３Ｘ　１０２χ　１１１％　６ＫＡＲ ２２５（４９２）１００Ｘ　１０８％　５７％　６１２　５８２　６％１、結果 は示したペプチドフラグメントのプレ吸着の後残っている対照（ペプチド添加な し）サンプル反応性の％として提示される。

対照（添加なし）カラムにおいてはｎＭクマリン値をカッコ内に示す。

（以下余白） 一麦」− ＨＣＶ陽性サンプルのペプチド毘１５への結合を阻害するためのペプチドセグメ ントの使用１ サンプル　ペプチド −箪皿星旦−圧　Ｈ川　■　■ ＡＲ８９（５０００）１００Ｘ　１００％　１００Ｘ　１００２　１００＄　Ｌ ＸＡ　Ｒ４４（５０００）　１００χ　１００χ　１００χ　１００χ　１００ χ　１χ１、結果は示したペプチドフラグメントのプレ吸着の後残っている対照 （ペプチド添加なし）サンプル反応性の％として提示される。

対照（添加なし）カラムにおいてはｎＭクマリン値をカッコ内に示す。

（以下余白） 一表」− 一塁皿星互−１３１４川　理 ＡＲ８９（１７６９ＨＯＯＸ　３Ｘ　２２　２２　７６２ＡＲ４４（３５８２） １００！　ＬＸ　ＬＸ　１２　１１０ＸＡＲＩ　９１　（３３２９）１００Ｚ　 ３２　２２　３χ　１０３２ＡＲ１４１（３１０６）１００Ｘ　６Ｘ　６Ｘ　６ ２　７４Ｘ１、結果は示したペプチドフラグメントのプレ吸着の後残っている対 照（ペプチド′添加なし）サンプル反応性の％として提示される。

対照（添加なし）カラムにおいてはｎＭクマリン値をカッコ内に示す。

（以下余白） −ＪＵＬ− ＨＣＶ陽性サンプルのペプチドＮ１１１３への結合を阻害するためのペプチドぬ １３の使用 １　５０００　−７’３　９９％ ２　５０００　３５　９９％ ３　７２２　１３　９８％ ４　５０００　１７４　９７％ ５　２９２　１８　９４％ ６　３３７６　３３　９９％ ８　５０００　７０　９９％ ９　５０００　７５　９８％ １０　６８５　１５　９８％ １１　１５４　２３　８５％ １２　５０００　２６７　９５％ １３　５０００　１９　９９％ １４　２３４４　２１　９９％ １６　５０００　２３　９９％ １８　５０００　４４　９９％ １９　８３６　６８　９２％ Ａ２４０　１４５１　９１　９４％ Ａ８３　１８２４　３４　９８％ １、結果はフラグメント懇１３の不存在下および存在下に生成したｎＭクマリン として提示される。

実施例７ クローン１４の免疫反応性領域をさらに同時定するため、競合実験のシリーズを 実施した。これら実験は、クローン１４（図ＩＡ。

ペプチド９）、クローン１４フラグメント（ペプチド６および８）、ＨＣ■キャ ブジッド１−２８（ペプチド１５）、またはＨＣＶタンパクＣ−１００（ペプチ ド１９）、図ＩＡ、１ＢおよびＩＤを常磁性粒子へ結合し、そして阻害の標的と して使用したことを除き、実施例６に記載したように実施した。

実験の最初のシリーズにおいて、クローン１４全長に相当するペプチド９を標的 として使用した。表９に提示するように、１１アミノ酸クロ一ン１４／キヤブジ ツド共通配列（図ＩＡ、ペプチド１１）は８種のＨＣＶキャブジッド反応性サン プルの免疫反応性を強力に阻害することができた。同じ知見はこの共通配列を含 むより長いペプチド（ペプチド９．ＩＯおよび１５）でも観察された。ＨＣＶキ ャブジッドに相当する１−２８アミノ酸ペプチド（ペプチド１５）でさえ同じ効 果を与えた。しかしながら、クローン１４のＣ末端１３アミノ酸よりなるヘプチ ド２は少ししか反応性を示さなかった。ペプチド２はその配列中にクローン１４ ／キヤブシ・ンド共通配列のＣ末端アミノ酸３個を含み、そしてそれは限られた 阻害を示すだけであるため、これら８サンプルの反応性は図ＩＡに示した共通配 列のおよそａａ１４−２１（ペプチド１１）に対してであるらしいクローン１４ に対する反応性の大部分はこの共通配列のためであるとの結論をさらにサポート するため、ペプチド６を阻害実験において固相標的として使用した０表１０に示 すように、共通配列に相当するペフ゛チド（１２，１６，１７および１８）はペ プチド６へのＨＣＶサンプル結合を完全いに阻害した。この阻害はアミノ酸２０ がセリン、アスパラギンまたはグルタミンであっても完全であったペプチド１５ のＣ末４１０アミノ酸に相当するペプチドフラグメント（すなわちペプチド１３ １図ＩＢ）は実施例６において予期に反して反応することを示したので、そのク ローン１４に対する阻害反応性の可能性について評価した。表１１は、このペプ チドは９種の異なるＨＣＶサンプルのペプチドＮα９（クローン１４）、Ｎｏ、 ８（位置２０においてクローン１４をセリンをアスパラギン置換）およびＮ１１ １５　（ＨＣＶキャブジッドアミノ酸１−２８）への結合を完全に阻害した。こ の阻害は、キャブジッド領域外に位置するＨＣＶペプチド（すなわちＨＣＶ非構 造タンパクＣ−１００のＮｌｌ　９．図ＩＤ）は阻害されなかったので非特異性 ではなかった。これらの結果を実施例６の結果と合わせると、ペプチド１３はク ローン１４／ＨＣｖキヤブジツド共通配列へ結合するサンプル反応性を強力に阻 害するができ、そして競合ＨＣＶ抗体イムノアッセイに使用できることを指示す る。

（以下余白） −Ｊ目し− 一棗皿星旦−Ｕ　刊　９　１１　１５ ＡＲ１４８（１４０８）１００Ｘ　７８２　１２　２２　３２　３ＸＢＢ１７　 （３３５０）１００％　１０８％　１％　２％　２％　２％Ｌ　２０　（４０４ ）１００ズ　８３χ　６χ　１０χ　１２χ　２６χＬ　９　（２４０６）１０ ０＄　７４χ　１！　１％　１１　１２ＡＲ８３（５０００）１００％　１００ Ｘ　１％　ＬＸ　１％　１１ＡＲ１４１（５０００）１００χ　１００χ　３χ 　４χ　４χ　４χＡＲ１９１（４５１）１００２　８７２　１７Ｘ　２３２　 ２８２　２４２ＡＲ２２５（４５９）１００２　９０％　４２　４１　７Ｘ　７ ％１、結果は示したペプチドフラグメント吸着の後残っている対照（ペプチド添 加なし）サンプル反応性の％として提示される。対照（添加なし）カラムにおい てはｎＭクマリン値をカッコ内に示す。

（以下余白） ｊＬＬＬ− 一垂■星旦−川　Ｕ　旦　Ｕ　」 ＡＲ８９（５０００）１００χ　１χ　１χ　ｌχ　１χ　１χＡ　Ｒ４４（５ ０００）１００Ｘ　１χ　１％　１！　［１！１、結果は示したペプチドフラグ メント吸着の後残っている対照（ペプチド添加なし）サンプル反応性の％として 提示される。対照（添加なし）カラムにおいてはｎＭクマリン値をカッコ内に示 す。

（以下余白） 一ノ目、１− 二一二　二〇二 １　９　５０００　４０　９９！ｔ ３　９　５２０　１７　９７象 ４　９　３８２６　２４　９９毛 １　８　５０００　コ９　９９ｔ ２　８　５０００　コ８　９９− ４　８　５０００　２７　９９ｔ ５　Ｂ　５９１．　２６　９６４ ７　８　５０００　コ５　９９ｔ ８　８　５０００　４５　９９暫 ９　８　５０００　４コ　９９ｋ ｌ　１５　５０００　９１４　８２４ ２　１５　５ｏｏｏ　３２　９９七 ３　１５　７９５　２９　９６％ ８　１５　５０００　６８　９９象 ９　１５　５０００　６７　９９七 ｌ　１９　５０００５０００　０１ ２　１９　５０００、．５ＱＯＯ０４ コ１９５０００５００００＆ ４　１９　５０００５０００　０を 表１１（続き） ５　１９　１３７２１５４２　０！ ７　．１９　２５２２５コ　Ｏｔ Ｂ　１９　５０００５０００　０士 ９　１９　５０００５０００　０士 １、結果はフラグメントＮα１３の不存在下（−）および存在下（＋）において 生成したｎ？ｖ１クマリンとして提示される。

（以下余白） 実施例８ ＨＣＶキャブジッドの配列に相当し、そして図ＩＢおよびＩＥに図示した４種の ペプチド（Ｎａ１５，２０，２］および２２）を実施例２に従って免疫反応性に ついてテストした。表１２に示すように、ＨＣＶ陽性血清との免疫反応性はＨＣ Ｖキャブジッドの最初の２８アミノ酸に相当するペプチドｋ１５が最も強かった 。ペプチドＮα２０（アミノ酸３９−７４）はこれら標本といくらかの反応性を 示したが、ペプチドｌ１ｈ１５よりも小さかったウペプチド阻２１および２２は 同じＩ（ＣＶ陽性サンプルと少ししか免疫反応性を示さなかった。アッセイ成績 は陰性信号で割った陽性信号として測定される。

表１２に見られるように、ペプチド１５はすべてのサンプルに対して最大値を提 供する。このためＨＣＶ陽性とＨＣＶ陰性の判別において最大のアッセイ有用性 はペプチド１５で得られた。ペプチド１５および２０を使用する同様な実験が公 に得られるＨＣＶ反応性血清を使用して実施された。表１３および１４は混合し た）（ＣＶおよびＢｓｔｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、Ｉｎｃ（マサチューセッツ 州ボストン）から得られる低タイターパネルを使用したこれら結果を示す。これ らパネルについて得られた結果は実施例９において詳細に説明される。

（以下余白） ５′−１上主− ＬＬ２Ｊｌ　ム　二 ２コロ３　２５ｇ０　３Ｂ２５　３７　１８５３７８　５０００　Ｌ２Ｂコ　１ ０９　コ０９１１Ａ　２５９　１０７　９０　！７９ＬＩＨ、３１６５２ユｌ　 ４４　ｍＢ２５６３　５０００５０００１２工　２３２３６７　５口００　５０ ００　６Ｂ　２４５コア０　５６１　３６４　７４　ユ９２３フ４　２４２　３ ０　４７　２０ ５４０２　．５０００　５０００　７６　．２１上Ｓ昌ｆｆｉ 平均　２１　コア　４９　９１ −１」ｊ−口ｔｔｈ ！二　・ペプチド ｆｆ　２ｍ　２１　２２゜ ２コロ３１２４１０５ユ。

２４５０　２４１　１コフ　１　０ ＳコアＥｌ　２４１　コ５２　０ ９１１Ａ　１２　３　２　０ ９１ユＨ１５２６ユ。

２５６コ　２４ユ　１コア２　０ ２３６７　２４１　Ｎ３７　１　０ ２コロ８　２４１’　１３フ　１　。

５３７０　２フ　ユ。　１　０ ２コア４　’　１２　１　１　０ ５４０２　２４ｉ　１３７　２　０ ２４５３　、　２４１　ユコ７　工　。

１４コ９ｉ−４４ユロ５　４０　１　０ｒｐ工９５５８　２４１　４　ユ　。

１４９４７−４４　２４１　１３７　２　、Ｑユ０５１９−０４６　２Ｑ　エコ フ　３　、ＯＳコ９７　’　４４　１　２　工 ２１９０−９２８８Ｂ　２４ユ　２　ＮＤ　４２０８０３０−９［１Ｂ８　２５ 　１　ＮＤ　１１、結果はｎＭクマリンとして提示される。

２、ＨＣＶキャブジッド抗原に対し反応性または非反応性のサンプル。

３、ＮＤ−テストしなかったサンプル。

４、陽性／陰性＝ＨＣＶ陽性／陰性５サンプルがらのＨＣＶ陽性平均 実施例９ ＨＣＶキャブジッドペプチド、アミノ酸位置１−２８（Ｎ１１１５図ＩＢ）、２ ９−３８　（阻２３２図ＩＦ）、１９−３８　（石２４２図ＩＦ）、１−３８　 （阻２５２図ＩＦ）、および３９−７４（ＮＣＮ２０、図４）にわたるペプチド を実施例２記戦の常磁性微粒子アッセイにおいて評価した。ペプチド粒子結合物 は、公然入手可能なそして良く特徴化された３種の異なるＮＡＮＢＨおよびＨＣ Ｖパネルでテストされた。最初の二つのパネルはＢｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉ ｃａ　Ｉｎｃ、から得られ、そして低い混合タイターＨＣＶパネルであった。各 パネルと共に、この製造者は組換えキャブジッドｃ２２に対する各サンプルの反 応性を提供した。この反応は０ｒｔｈ。

Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　にュージャージー州ラリタン）によって販売されてい るＲＩＢＡ２　ＨＣＶ補足テストシステムを使用して得られ、そして全長さキャ ブシントタンバクに対する標本反応性の測定である０表１３およびＩ４に揚出さ れているように、ペプチド１５および２５はＢｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ によって０２２キャブジッド反応性である指示されているすべての標本と反応性 であり、そして残りの標本とは非反応性であった。アミノ酸１−３８をカバーす るペプチド毘２５で見られた反応性は、アミノ酸１−２８よりなるペプチド石１ ５で見られた反応性よりも一般に強かった。実際ペプチド１５と緩和に反応性で あったいくつかの標本（例えば低タイターパネル標本１２および混合タイターパ ネル２２および１８）はペプチド２５と強く反応性であった。それらのアミノ酸 配列はペプチドＨＱ２５中に存在するけれども、ペプチド２３および２４では少 ししか反応性が得られなかったことに注目することが重要である。加えて、Ｂｏ ｓｔｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａパネルでは、ペプチド阻１５および２５は免疫反 応性信号強さにおいてペプチド胤２０を著しく上廻った。さらに二つのパネルか らの１０種の組換えＨＣＶキャブジッド反応性サンプルは、ペプチドＮ１１２０ と非反応性であったがしかしペプチド胤１５および２５とは反応性であった。ペ プチドＮ［Ｎ２０と反応性でそしてペプチドＮｌ１１５または２５と非反応性の サンプルはなかった。これら４ペプチドはＨａｒｖｅｙ　Ａｌｔｅｒ’　ｓ　Ｎ ＡＮＢＨ性能パネル（Ｎ　Ｉ　Ｈ，メリーランド州ベセスダ）を使用してテスト され、Ｂｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａパネルについて上に記載した知見に類 似の知見が得られた。特にペプチド２５は最良のアッセイ成績を与え（陽性信号 強度によって測定）、そしてペプチド１５は２番目に良かった。例えば標本Ｊお よびＷについて、ペプチド１５は２００ｎＭクマリンのカットオフ値の約２倍の 信号を与えたが、ペプチド２５はカットオフ値よりも２５倍大きかった。このサ ンプルはＮＡＮＢＨの伝播の疑いあるある血液ドナーからのものであるが、それ はペプチド２０．２３および２４と非反応性であった。陰性対照標本についての 値は両方の標本についてのものと類似であり、それ故ペプチド２５で観察された 増大した信号強度は陽性および陰性標本信号間の信号距離の有意義な増大をもた らすことに注目することが重要である。

（以下余白） −表」」− ■　二　二　ム　二 ８　コ８５７　１４４　２７　、２７　５００ＯＲ１３”１５１６　６２　２９ 　４０１３２ＯＲ１、結果はｎＭクマリンとして提示される。２００より大きい 値が反応性。

２、Ｂｏｓｔｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ　Ｉｎｃ、にょって報告されたＨＣＶキ ャブシフト反応性： Ｒ−反応性；　Ｎ＝非反応性；　Ｉ＝中間−Ｊ」−虹一 址　…　ム　ム　ニ １　５０００　５０００　１７　２７　５０００　Ｒ２５０００５０００Ｓｏ　 ２４２　５０００　Ｒコ　２０６８　２５９５　３７　３５　５００ＯＲユ１　 ２０　２２　１９　３２　Ｎ ５　１６２９　２７　ｌｉｌ　４８５００ＯＲ６１７４６６０１２３２８５００ ＯＲ ７４０７４１８２４２８Ｎ ａ　４５　３２　コロ　２Ｂ　９６　Ｎ９　５０００　５０００　２７　５１　 ５００ＯＲ１０３１Ｎ４　３７　コ０　１７９　Ｎ１１　５０００　１ｍ５１　 ２４　２５　５００ＯＲ１３３４５３１６０１８２８４５口０ＯＲｉｓ　Ｒ００ ０１９７２３８５５５０００Ｒ１６５０００５０００２３２コ２９．５００ＯＲ １７コア３２　５０００　３５　３９　５０００　ＲｌＢ　５２１　４５　コア 　４コ　３４２９　Ｒｉ９　２１　２８　２４　２４　３ＯＮ２０　４０　６２ 　４２　３ｇ’９１’　工２１　５０００　３４２６　コ２ａａＳＯＯＯ２２６ ８３１０４７ｊｌ　８６　５０００２３　５０００　４４５　１ｉ７　８０　５ ０００２４ＳＯＯＯ５０００コ０４７５０口０Ｒ２５’　５０００　５０００　 ４コ　４９　５０００　Ｒ１、結果はｎＭクマＩＩンとして提示される。２．０ ０より大きい値が反応性。

２、ＢｏｓＬｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ　Ｉｎｃ、の報告により、Ｍ換えｃ２２ キャブジッドと、 Ｒ−反応性；　Ｎ−非反応性；　■−中間旦　７ＪＱ　ニ　ュ　胚 １、結果はｎＭクマリンとして提示。２００より大の値が反応性。

２、Ｈａ′ｒｖｅｙ　Ａｌｔｅｒにより提供された診断。

（以下余白） 配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：　Ｌｅａｈｙ、　Ｄａｖｉｄ　ＣＴｏｄｄ、　Ｊｏｈｎ　Ａ Ｊｏｌｌｅｙ＋　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｂ （ｉｉ）発明の名称：　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ　ＦＯＲＮ０Ｎ−Ａ　Ｎ０Ｎ− ＢＨＥＰＡＴＩＴＩＳ （ｉｊ）配列の数：２５ （ｉｖ）連絡住所： （Ａ）名宛人：　Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ。

（Ｂ）ストリー）　：　Ｏｎｅ　Ｂａｘｔｅｒ　Ｐａｒｋｗａｙ、　ＤＦ２−２ Ｅ（Ｃ）市：　Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ （Ｄ）州：　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ （Ｅ）国：　ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰコード：　６００１５ （Ｖ）コンピュータ読み取り可能形式：（Ａ）媒体タイプ：　フロッピーディス ク（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシ ステム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−００５、（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔ Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＄１．Ｑ。

ｖｅｒｓｉｏｎ　１１．２５ （ｖｉ）現行出願データ： （Ａ）出願番号：　ＵＳ　７／７１８．０５２（Ｂ）出願日７　１９９１年６月 ２０日（Ｃ）分類： （ｖｉ）代理人情報： （Ａ）氏名：　Ｂａｒｔａ、Ｋｅｎｔ （Ｂ）登録番号：　２９．０４２ （Ｃ）参照／ドケット番号：　ＰＡ−４１４８ＣＴＰ（ｉｘ）テレコミュニケー ション情報：（Ａ）を話：　７０８／９４Ｂ−３３０８（Ｂ）テレファックス： 　７０８／９４Ｂ−２６４２（２）配列番号ｌについての情報： （１）配列の特！！［＝ （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）８ｊ［の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （ｉｉ）分子の種Ｍ：　ペプチド （ｆｘ）配列の記述：　配列番号１ （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （１１）分子の種類二　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号２ Ａｒｑ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　工１ａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　 Ａｓｐ、入ｒｇ　Ｔｈｒｌ　５　１０ Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ＬｙＳ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　Ａｒｇ　ｋｒｑＡｒｇ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ（２）配列番号３についての情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （１１）分子の種Ｍ：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号３ （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴二 （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジー：　未知 （１１）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号４ 人ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　工１ａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　 Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｈｒｌ　５　工Ｏ Ｇよｎ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　入Ｓｎ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジー：　未知 （ｉｉ　）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号５ Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　工１ｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　 Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｈｒｌ　５　１０ Ｇ工ｎ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡｒｇ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ２５　コ０ （２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）Ｍの数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （ｉｉ）分子の種Ｍ：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号６ 人ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　工１ａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　 Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｈｒｌ　５　１０ Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　Ａｒｇ　入ｒ９人ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ２５　コ０ （２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジー：　未知 （１１）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号７ Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ工１ａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｈｒｌ　５　１゜ Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ｘｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　Ａｒｇ　ｘｒｇＡｒｇ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ２５　コ０ 特表千６−５００７９６　（１４） （２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （！１）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号８ Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　 Ｌｙｓ（２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジー：　未知 （ｉｉ）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号９ Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　入ｓｐ　Ｇｉｎ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｇ　 Ａｓｐ　Ａｒｇ　ＴｈｒＧ１．ｎ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　 Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ１５２゜ 入ｒｇ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　 Ｌｙｓ２５３゜ （２）配列番号ｌＯについての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （１１）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号！Ｏ Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ工１ａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｈｒｃｌｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒ ｇ　Ｂａｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ１５　２゜ Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　入ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＬＹ５＋ 　Ｌｙｓ２５　３゜ （２）配列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）Ｍの数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （ｉｉ）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号１１ Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　工１ａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　 Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｈｒｌ　５　１０ Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＬＹＳｌｌ　Ａｒｇ　Ｓａｒτｈｒ 　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ１５　２゜ Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　 Ｌｙｓ（２）配列番号１２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３４個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジー：　未知 （ｉｉ）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号１２ Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇ１ｎ工ｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｐ　Ａｒｇ　ＴｈｒＧｌｎ　Ｇｌｎ　ｋｒｑ　Ｌ”ＩＦＳ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　 Ａｒｇ　ｋＳｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　Ａｒ９Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ（２）配列番号１３に ついての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸２８個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （１１）分子の種Ｍ：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号１３ Ｍａｔ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｘｌ＊　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　 Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｇ工　５　１１ ０Ａｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　 Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＰｈａＰｒｏ　ＧＩＹ　ＧＩＹ　ＧＩＹ （２）配列番号１４についての情報： （ｉ）配列の＊＠： （Ａ）長さ：　アミノ酸１２個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （ｉｉ　）分子の種類：　ペプチド （ｔｘ）配列の記述：　配列番号１４ Ｍａｔ　ｓａｒ　Ｔｌ’ｌＬ−工１ａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒ ｑ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＬＹ！１５１゜ Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　ｋｘｑ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　 Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈａｌ５　２゜ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ （２）配列番号１５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸２８個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （１１）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号１５ Ｈ，ｔ５ａｒ　Ｔｈｒ工Ｉｇ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙ ｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓｌ　５　１１ ０Ａｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　 Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈａｌ５　２０ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ （２）配列番号１６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸１２個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジー：　未知 （ｉｉ　）分子の種類：　ペプチド （ｔｘ）配列の記述：　配列番号１６ Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　入ｒｑ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　Ａｒｇ　入ｒｇ（２）配列番号１７についての情報： （ｉ）配列の特＠、： （Ａ）長さ：　アミノ酸１２個 ＣＢ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （ｉｉ）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号１７ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｇｎ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　Ａｒｇ　入ｒ、ｇ（２）配列番号１８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸１２個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （１１）分子の種類：　ペプチド （ＩＸ）配列の記述：　配列番号１８ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　入ｒｑ　Ａｒｇ（２）配列番号１９についての情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸４２個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （１１）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号１９ 工１ｅ　エユａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　 Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｈａｌ　５　工０ Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｇｌｎ　Ｉ（ｉｓ 　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ１５　２゜ 工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　Ｍａｔ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　 Ｇｉｎ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ２５　３０　コ５ Ｃ，ｌｎ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ（２）配列番号２０につい ての情報： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：　アミノ酸３６個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数二　未知 （Ｄ）トポロジー：　未知 （ｉｉ）分子の種類：　ペプチド （Ｅｘ）配列の記述：　配列番号２０ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　）ｕ：ｑ 　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＡＦ９Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　５ａｒ　 Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＡｒｇＧｌｎ　Ｐｒｏ　工１ａ　Ｐ ｒｏ　Ｌｙｓ　八ｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ２５ 　コ０　３５ （２）配列番号２１についての情報： （ｉ）配列の′＃徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸２５個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （ｉｉ）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号２１ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　 Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｙｌ　５　工０ Ｌｙｓ　Ｖａｌ工１ａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐ ｈａ　Ａｌａ　Ａｓｐｅｕ （２）配列番号２２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３７個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数；　未知 （Ｄ）トポロジー：　未知 （ｉｉ）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号２２ Ｌａｕ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ工１ａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａ ｌａ　Ｐｒｏ　ＬａｕＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　入１ａ　Ｌａ ｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇａｕ （２）配列番号２３についての情報： （１）配列の特＠、： （Ａ）長さ：　アミノ酸３８個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （１１）分子の種Ｈ：　ペプチド （ｉｘ）配列の記述：　配列番号２３ Ｍａｔ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　工ｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　 Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓｌ　５　１１ ０Ａｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　 Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＰｈａＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｉｌａ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ２５　３ｏ　コ５ Ｌａｕ　Ｐｒ。

（２）配列番号２４についての情報： （り配列の特徴： （Ａ）長さ：　アミノ酸３８個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　未知 （Ｄ）トポロジｍ：　未知 （１１）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ　）配列の記述：　配列番号２４Ａｒｑ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒ ｇ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＰｈａＬａｕ　Ｐｒ。

（２）配列番号２５についての情報： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：　アミノ酸３８個 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）　ｆｆｌの数：　未知 （Ｄ）トポロジー：　未知 （ｉｉ）分子の種類：　ペプチド （ｉｘ　）配列の記述：　配列番号２５Ｍａｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｐｒ ｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ、　ＬｙｓＡｒｑ　Ａｓ ｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＬＹ Ｓ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ工１ａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ｖａｌ　’ｌ’ｙｒ　Ｌａｕ２５　３０　コ５ Ｌａｕ　Ｐｒ。

く フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／　ＣＯ７Ｋ　９９： ００ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ 、ＪＰ （７２）発明者　ジョリー、マイケル、イーアメリカ合衆国６００７３イリノイ 、ラウンドレイク、ノースサークルドライブ　３４４９

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．肝炎Ｃウイルスゲノムの最初の８４連続したオープン読み枠５′ヌクレオチ ドによってコードされるアミノ酸配列を実質的に有する合成ペプチドを含むこと を特徴とする非Ａ非Ｂ肝炎の診断に有用なエピトープ基。
2. ２．【配列があります】および【配列があります】よりなる群から選ばれたアミ ノ酸配列を有する第１のエピトープ、および 【配列があります】および【配列があります】よりなる群から選ばれたアミノ酸 配列を有し、前記第１のエピトープの３′末端においてそれへ連続している第２ のエピトープ を含むことを特徴とするＨＣＶのキヤプシッドタンパクに含まれるエピトープ。
3. ３．ＨＣＶウイルスゲノムの最初の１１４連続した５′オープン読み枠ヌクレオ チドによってコードされるアミノ酸配列を実質的に有する合成ペプチドに対する 抗体を含んでいるサンプルを、固体基質上に固定した前記ペプチドと接触させる ステップ、未結合抗体を前記固体基質へ結合した抗体から分離するステップ、 前記固体基質上の結合した抗体の存在を検出するステップを含んでいることを特 徴とするＨＣＶ抗原に特異性の抗体を検出するためのアッセイ方法。
4. ４．【配列があります】および【配列があります】よりなる群から選ばれたアミ ノ酸配列を有する第１のエピトープと、【配列があります】および【配列があり ます】 よりなる群から選ばれた第２エピトープを有するペプチドに対して特異性の抗体 を含有するサンプルを、固体基質上に固定した前記ペプチドと接触させるステッ プ、 未結合抗体を前記固体基質へ結合した抗体から分離するステップ、 前記固体基質上の結合した抗体の存在を検出するステップ、を含んでいることを 特徴とするＨＣＶ抗原に特異性の抗体を検出するためのアッセイ方法。
5. ５．前記基体基質は、マイクロタイタープレートの表面、ガラス繊維フィルター 、常磁性微粒子、およびラテックス粒子よりなる群がら選ばれる請求項３または ４のアッセイ方法。
6. ６．前記結合した抗体は抗スペシス特異性酵素接合抗体によって検出される請求 項３または４のアッセイ方法。
7. ７．肝炎Ｃウイルスの最初の８４連続した５′オープン読み枠ヌクレオチドによ ってコードされるアミノ酸配列を実質的に有する合成ペプチドに対する抗体を含 んでいるサンプルを、固体基質上に固定した前記ペプチドと、アミノ酸配列【配 列があります】を実質的に有するペプチドの競合量の存在下接触させるステップ 、前記固体基質上に固定化した前記ペプチドへ結合した抗体をそのように結合し なかった抗体から分離するステップ、前記固体基質上の結合した抗体の存在を検 出するステップを含んでいることを特徴とするＨＣＶ抗原に特異性の抗体を検出 するための競合阻害アッセイ方法。
8. ８．肝炎Ｃキヤプシッドタンパクのアミノ末端を含むアミノ酸１−２８、または 【配列があります】，【配列があります】および【配列があります】よりなる群 より選ばれたその一部分を含むペプチドに対する抗体を含んでいるサンプルを、 固体基質上に固定化した前記ペプチドと、アミノ酸配列【配列があります】を実 質上有するペプチドの競合量の存在下接触させるステップ、 前記固体基質上に固定した前記ペプチドへ結合した抗体をそのように結合しなか った抗体から分離ステップ、前記固体基質上の結合した抗体の存在を検出するス テップを含んでいることを特徴とするＨＣＶ抗原に特異性の抗体を検出するため の競合阻害アッセイ方法。
9. ９．発螢光団で標識した請求項１または４のペプチドとサンプルとをインキュベ ートし、そして螢光分極の増加を測定することを含むことを特徴とするＨＣＶ抗 原に特異性の抗体の検出のためのアッセイ方法。