JPH05307040A - Ｃ型肝炎検査用試薬、および検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＨＣＶ構造領域のエピトープを有する特定の
配列Arg Xaa Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro（Xaaは
好ましくはLeu、Lys又はArgを示す。）を必須ペプチド
として含むペプチドを抗原として利用しＣ型肝炎の抗体
を検査する試薬を構成する。 【効果】 ＨＣＶ構造領域に対する抗体を高い検出率で
特異的に検出することができる。ＨＣＶ感染を、早期に
しかも正確に検査することが可能となる。必要なペプチ
ドは、化学合成によって容易に調製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎検査用試薬お
よび検査方法に関するものである。最近の研究によれば
非Ａ非Ｂ型肝炎患者は、日本国内で約２００万人と推定
され、Ｃ型肝炎はこの９０〜９５％を占めている。

【０００２】

【従来技術】Ｃ型肝炎の原因となるウイルス（以下ＨＣ
Ｖと略す）については、構造が明らかにされつつあり、
近年ではＨＣＶに対する抗体（ＨＣＶ抗体）の有無をチ
ェックするための試薬もいくつか市販されるにいたって
いる。

【０００３】これまでに実用化されたＨＣＶマーカーと
しては、ＨＣＶの非構造領域であるＮＳ−３〜４の一部
に相当するＣ−１００−３抗原が知られている（SCIENC
E244;359-362,1989）。Ｃ−１００−３抗原をＨＣＶマ
ーカーに用い、世界で初めてＨＣＶに対する抗体の分析
が可能となった。しかし、Ｃ−１００−３抗原でＨＣＶ
感染者をスクリーニングした場合の陽性率は約７０％で
あり、残りの３０％が疑陰性となる問題がある一方、Ｃ
−１００−３抗原で作成したＨＣＶ抗体検出用ＥＬＩＳ
Ａキットで実際に輸血用血液をスクリーニングした時の
陽性率は約１．５％に達し、このうち約半数は疑陽性で
あることも報告されている。

【０００４】その後、ＨＣＶ抗体検出率の向上と、感染
の早期検査のためにＨＣＶコア領域を抗原として用いる
ことが提案された。コア領域の蛋白抗原を利用したＨＣ
Ｖ抗体検出用キットはいくつか検討され、前述のＣ−１
００−３抗原を用いたものに対して第２世代のキットと
呼ばれている。コア領域の蛋白からエピトープ部分に相
当する１個の合成ペプチドを設定し、これに前記非構造
領域ＮＳ−３〜４の領域中のエピトープ２個に相当する
合成ペプチドを組み合せてＨＣＶ抗体を検出する試みが
なされた（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88;3647-3651,199
1）。この方法によれば、Ｃ−１００−３抗原のＨＣＶ
マーカーより特異性が向上するものの、コア領域のエピ
トープを１つしか用意していないので他のエピトープに
対して産生された抗体は検出できず、充分な検出率が得
られない。

【０００５】実用化はされていないものの特開平３−１
３９２８２号公報にはコア領域に対する抗体との反応性
を持ついくつかのエピトープが示されている。これらの
エピトープを複数利用すれば抗体の検出率は上がるかも
しれないが、特異性の低下が予想され、また経済的にも
不利である。

【０００６】一方、これまでＨＣＶ抗体の検出に利用さ
れていたペプチドは、遺伝子組み換えによって得られた
ものが多いため、非特異反応が出やすい傾向があった。
例えば、前記Ｃ−１００−３抗原は、スーパーオキサイ
ドディスムターゼ（以下ＳＯＤと略す）との融合蛋白と
して発現させた遺伝子組み換え産物を利用しているた
め、ＳＯＤ部分に対する反応に起因する疑陽性をチェッ
クするためにはイムノブロット法等による追試をしなけ
れば有効なＨＣＶ抗体検出ができない。

【０００７】また、ＨＣＶのコア領域と部分的に相似の
ＡＲＩＭＡ＃１４（後述）をＴ−７ファージベクターで
発現させた融合蛋白を抗原として用いると、Ｔ−７ファ
ージ蛋白に対する抗体によって疑陽性反応を生じる。こ
の場合は非特異反応をＴ−７ファージ蛋白で吸収するこ
とによって疑陽性対策としている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】このように、遺伝子組
み換えによって得られたペプチドを抗原として抗体の検
出を行う場合には、非特異反応に対する特殊な配慮が必
要となる。しかも、現在のところ、これら非特異反応の
対策は特殊な操作を要するうえに、効果も不十分なこと
が多い。したがって、ＨＣＶ抗体との高い反応性を持ち
ながら、十分な特異性を維持している抗原が望まれてい
る。一方、上述融合蛋白の属性からくる非特異反応の問
題とは別に、抗原抗体反応に基づく本質的な問題もあ
る。即ち、前述したようにＨＣＶコア領域のエピト−プ
を１つしか用いない抗原ではＨＣＶ抗体検出率は低下す
る一方、複数利用すると検出率は向上しても非特異性反
応が増大するという問題である。一般にある抗原を用い
て抗体を検出しようとする場合、検出率を向上させるた
めにより反応性の高い抗原を用意すると、反応性の向上
につれて非特異反応が増加して特異性を下げること（い
わゆる測り込み）になり易く、逆に、抗原の特異性を高
めると検出できる抗体が減少する（いわゆる検出漏
れ）。このような背反する条件をクリアできる好適な抗
原は、末だ知られていない。

【０００９】本発明は、このような従来技術の実状に鑑
み、ペプチドのアミノ酸数及びペプチドの種類が少ない
にもかかわらず、特異性を犠牲にすることなく、ＨＣＶ
抗体検出率を向上させ得る実用性の高い検査用試薬及び
検査法を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】かかる目的は、次の手段
により達成させる。即ち、本発明は、 配列１：Arg Xaa Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro （Xaaは任意のアミノ酸を示す。）を含むペプチドの１
種あるいは複数種、または、更に次の配列２および／ま
たは３のペプチドを加えた複数のペプチド、を含むＣ型
肝炎検査用試薬である。

【００１１】 配列２：Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg 配列３：Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys 又、本発明は、 配列１：Arg Xaa Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro （Xaaは任意のアミノ酸を示す。）を含むペプチドの１
種あるいは複数種、または、更に次の配列２および／ま
たは３のペプチドを加えた複数のペプチド、のいずれか
に対して反応性の抗体を検出するＣ型肝炎の検査方法で
ある。

【００１２】 配列２：Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg 配列３：Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys なお各アミノ酸の略号は、各々次のアミノ酸を示すもの
である。

【００１３】 Ala:アラニン Leu:ロイシン Arg:アルギニン Lys:リジン Asn:アスパラギン Met:メチオニン Asp:アスパラギン酸 Phe:フェニルアラニ
ン Cys:システイン Pro:プロリン Glu:グルタミン酸 Ser:セリン Gln:グルタミン Thr:トレオニン Gly:グリシン Trp:トリプトファン His:ヒスチジン Tyr:チロシン Ile:イソロイシン Val:バリン ここで、配列１の１０個のアミノ酸のうちXaaは任意ア
ミノ酸であって、選定の自由度は比較的大きい。他の部
分のアミノ酸は配列が特定されなければ高い抗原性を示
さないがXaaの部分はある程度の許容範囲がある。例え
ば、特開平３−１３９２８２号公報で公表された配列１
に相当するＨＣＶコア領域の部分配列では、Xaaのとこ
ろはLeuであるが、本発明による配列１ではLeuに限らず
Lys、Argでも高い抗原性を示す。むしろLysがLeuよりも
好ましい。

【００１４】本発明の配列１〜３で示されるペプチドの
アミノ酸配列は、公知（例えば特開平３−１３９２８２
号公報）の配列に比べ相当に短いにもかかわらず、ＨＣ
Ｖのコア領域の実質的に１〜３つのエピトープ部分と同
様の抗原機能を示す。即ち、抗原抗体反応による検出法
の本質的課題である特異性と反応性の両立を、ＨＣＶの
コア領域における１つ（配列１に対応）、２つ（配列１
＋配列２又は３）又は３つ（配列１＋２＋３）のエピト
ープ構造の特定の部分配列を利用し相当するペプチドを
抗原として用いることで達成することができる。又、融
合蛋白を用いないため非特異反応を低減できる。

【００１５】以下、本発明を詳述する。本発明において
必要なペプチドは化学的に合成したものを利用すれば良
い。配列１を含むペプチドとは、配列１に任意のアミノ
酸を数個から２０個前後付加したものや、後で述べるよ
うにスペーサーや担体蛋白で修飾したものが挙げられ
る。任意のアミノ酸の配列１への付加は、配列１のＮ末
端、Ｃ末端別個独立に行うことができる。例えば、配列
１に対応するＨＣＶコア領域のいくつかの公知配列を参
酌して選定することもできるが、それらに限られない。
その他にも、例えば配列２や３で示されるペプチドを配
列１のペプチドと連結させてもよい。配列１のペプチド
に配列２や３を連結するには、アミノ酸で数個から２０
個前後の任意のペプチドや、後で述べる担体蛋白等を介
して結合した方が反応性を維持する上で好ましい。配列
１を含むペプチドのみで本発明を構成することも当然に
可能である。

【００１６】次に、配列１と配列２および／または３の
ペプチドと組み合わせて、即ちそれぞれ連結させずに混
合させた状態で同時に抗原として用いれば、配列１単独
やそれを含むペプチドの単独使用より良好な結果がえら
れる。１種のペプチドだけでは検出率が低下する場合が
あるからである。ペプチドを組み合わせて利用する場合
には、配列１のペプチドと配列２および／または３のペ
プチドの使用量を１：２〜２：１程度とすると良い。
又、配列１と配列２，３との組み合せ使用の場合は、そ
れぞれを担体蛋白や他の任意ペプチド等を結合させ、こ
れらを混合して用いるとよいが、これについて次に説明
する。尚、配列１のXaaは任意のアミノ酸をとり得るた
め異なるXaaごとに異なるエピト−プを有するとも考え
られるが、Xaa以外の配列は共通でエピト−プに明確な
相違があるかは明らかでないので複数種の配列１を用い
るよりは、明らかに対応エピト−プが異なる配列１，２
を併用した方が検出率の向上は達成しやすい。しかし、
複数種の配列１の使用を排除するものではなく、場合に
よっては有効であり得る。

【００１７】本発明におけるペプチドは、ペプチド分子
をそのまま抗原抗体反応に利用しても良いが、予めスペ
ーサ分子や担体蛋白を結合させておくことによって、よ
り反応性に優れるものとすることが可能である。例え
ば、スルフォサクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチ
ル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（Sulfosuccini
midyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxyla
te、以下Sulfo-SMCCと略す）、スルフォサクシンイミジ
ル-6-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサ
ノエート（Sulufosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithi
o)propionamido]hexanoate、以下Sulfo-LC-SPDPと略
す）、N-(ε-マレイミドカプロイロキシ)サクシンイミ
ド（N-(ε-maleimidocaproiloxy)succinimido、以下EMC
Sと略す）等のスペーサーをペプチドのＮ末端に共有結
合させれば、抗体との反応性は向上する。また、このス
ペーサーを介してヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡと略
す）やウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）等の不
活性な担体蛋白を結合させると、更に良い結果が得られ
る。担体蛋白を結合させるときには、ペプチド側のスペ
ーサーとは別に、担体蛋白側にもスペーサーを導入して
おいても良い。担体蛋白として用いる蛋白は、非特異的
な反応をできるだけ小さくするために、実際に試料とす
る動物に由来する蛋白を用いると良い。つまり、ヒトの
血清を試料とするときは、ＨＳＡを用いるようにするの
である。

【００１８】本発明に係るペプチド、あるいはその修飾
物は、適用する免疫分析系に合わせた形で提供すること
が可能である。例えば、抗原を固相ビーズや容器壁に結
合させた状態で、検出対象となる抗体と反応させる固相
免疫測定法の場合は、本発明に係るペプチドやその修飾
物を物理吸着なり、化学結合によって固相に結合させ
る。複数種のペプチドを利用するのであれば各ペプチド
を混合物として同時に担体に結合させても良いし、個別
に担体に結合した後に得られた担体を合わせても良い。
この例の場合、固相上のペプチドに捕捉されたＨＣＶ抗
体はヒト・イムノグロブリンに対する抗体を利用して検
出することができる（サンドイッチ法）。ヒト・イムノ
グロブリンに対する抗体として、クラスを認識するもの
を用いれば、ＨＣＶ抗体をクラスごとに分別して検出す
ることも可能である。固相に結合したペプチドを用いる
免疫分析系としてはサンドイッチ法の他に、標識抗体を
用いる競合法が挙げられる。

【００１９】本発明においては、多い場合でも実質的に
２つ程度のエピトープを用いるのにすぎないため、競合
法を採用した場合は標識抗体としてモノクローナル抗体
を利用することが可能である。利用するペプチドに特異
的なモノクローナル抗体を、固相上のペプチドの配合比
やアフィニティを考慮して適当に混合したものを標識抗
体として用いれば良いのである。

【００２０】本発明に係るペプチドあるいはその修飾物
は、標識抗原として利用することもできる。この場合
は、ヒト・イムノグロブリンに対する抗体を固相化した
り（サンドイッチ法）、あるいはＨＣＶに対する抗体を
固相化したもの（競合法）と組み合せて免疫分析系を構
成できる。ここに例示した各種免疫分析系における標識
としては酵素、発光物質、蛍光物質、ラジオアイソトー
プ等公知のものが利用できる。これら標識は、適当なス
ペーサー分子やアビチン−ビオチン結合等によって結合
させる。

【００２１】更に本発明に係るペプチドあるいはその修
飾物は、ラテックス粒子等と組み合せて粒子凝集反応、
あるいは凝集阻止反応に応用することもできる。

【００２２】本発明によるＨＣＶ検査用試薬や検査方法
に必要な希釈液、標識検出用基質、陽性対照等を含む各
成分は、適当に組み合せてキットの形にすることができ
る。例えば、固相ビーズに本発明に係るペプチドを結合
させて、標識抗ヒトＩｇＧ抗体と組み合せてアッセイキ
ットとする。

【００２３】

【作用】本発明における配列１を含むペプチドは、ＨＣ
Ｖ抗体と高い反応性を持ち、しかも他の抗体との非特異
的反応を起こしにくい。このペプチドに配列２および／
または３のペプチドを組み合わせることによって、ＨＣ
Ｖ抗体の検出率は更に向上する。本発明におけるペプチ
ドは、例えば特開平３−１３９２８２号公報に示された
エピトープ構造を取り出した部分配列又はそれらと共通
部分を有する配列である。しかし特開平３−１３９２８
２号公報に示された配列よりもかなり短い配列なので、
合成が容易であり、ＨＣＶ抗体に対して高度な特異性を
維持している部分を選択したため非常に特異的な分析が
可能である。

【００２４】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。

【００２５】（１）ペプチドの合成 次のようなアミノ酸配列を持つ本発明によるペプチド６
種を、ペプチド合成装置（バイオサーチ社製、モデル９
６００）により合成した。尚、配列１でXaaがLeu 、Lys
、Arg であるものをそれそれ配列１ａ、１ｂ、１ｃと称
する。配列１と他のアミノ酸の結合点を・で示す。

【００２６】配列１ａ： Arg Leu Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro 配列２： Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg 配列３： Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys 配列１ａ７（配列１ａ＋７アミノ酸）： Ｔhr Arg・Arg Leu Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro・Ala Leu Met Ala Val 配列１ｂ９（配列１ｂ＋９アミノ酸）： Val Val Pro・Arg Lys Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro・Ala Leu Met Ala Val Lys 配列１ｃ９（配列１ｃ＋９アミノ酸）： Pro Thr Arg・Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro・Ala Leu Met Ala Val Lys 合成は段階的固相法に従って行った。固相にはt-ブチル
オキシカルボニルアミノアシル-4-(オキシメチル)-メリ
フィールド樹脂（渡辺化学工業製）を用い、アミノ酸
（Ｌ体）はアミノ基をt-ブチルオキシカルボニル基（以
下t-BOCと略す）で保護した。また各アミノ酸の側鎖
は、各々次の保護基で保護した。

【００２７】 トレオニン（Thr/T）、セリン（Ser/S）：ο-ベンジル
基 グルタミン酸(Glu/E)：γ−ベンジルエステル アルギニン(Arg/R)：メシチレン−２−スルフォニル基 リジン(Lys/K)：2-クロロベンジルオキシカルボニル基 その他のアミノ酸の側鎖：無保護 カップリングは、樹脂上ペプチド末端t-BOCアミノ酸のt
-BOC基をトリフルオロ酢酸で脱保護し、カップリングす
る次のアミノ酸のカルボキシル基をN,N'-ジイソプロピ
ルカルボジイミドで活性化し、室温で１〜４時間混合し
反応を行った。反応時間は、アミノ酸の種類と組み合せ
によって設定した。反応しなかった遊離のアミノ酸は、
1-アセチルイミダゾールでアセチル化することによって
不活化した。必要な反応サイクル終了後、トリメチルシ
リルトリフルオロメタンスルホン酸、チオアニソール、
およびトリフルオロ酢酸で保護基の除去と合成ペプチド
の樹脂からの切り離しをおこない、エーテルでペプチド
を回収した。回収したペプチドをゲル濾過によって粗精
製した後、ＯＤＳ−８０ＴＭ（水−アセトニトリル、
０．１％ＴＦＡ含有）カラムで逆相ＨＰＬＣ分析を行
い、ピークフラクションを分取した。

【００２８】（２）検査試薬の調製１ （１）で合成したペプチドを用い、ＨＣＶ抗体検出のた
めの５種類の試薬を調製した。試薬番号と用いた配列番
号の対応関係を以下に示す。 ・試薬１ａ：配列１ａ ・試薬２：配列２ ・試薬３：配列３ ・試薬１ａ７：配列１ａ７ ・試薬１ａ７＊２：配列１ａ７＋配列２ 試薬２、試薬３は配列２、３の単独効果をみるもので、
本発明による試薬の効果を検証すべく比較のため調製し
た。配列１ａ、１ａ７、２および３に示すペプチドを以
下の方法で固相化した。各合成ペプチド抗原を５０mM炭
酸緩衝液（ｐＨ９．６）に２．０μg/ml(２．０〜５．
０μg/ml程度の濃度範囲であれば結果的に同様の検出率
が得られる。）となるように溶解し、ＥＬＩＳＡ用マイ
クロタイタープレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰＣ１２、ヌン
ク製）の各ウエルに１００μｌずつ分注した（１ウェル
当りの抗原の量は０．２μg：０．２μg/ｗ、以下同
様）。４℃で一晩静置後、洗浄液（０．０５％ Tween20
含有１０mMリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）３００μlで３
回洗浄し乾燥してそれぞれの配列による試薬を得た。ま
た配列１ａ７と配列２に示したペプチドを１：１となる
ように混合したものを用い、同様の操作によってマイク
ロタイタープレート（分注濃度０．２＋０．２＝０．４
μg/ｗ）に吸着させて試薬を得た。一方、抗ヒト・イム
ノグロブリンＧモノクローナル抗体をマレイミド法によ
ってペルオキシダーゼ標識したもの（０．１％ＢＳＡ含
有リン酸緩衝液、以下ＰＯＤ標識抗ＩｇＧ抗体と略
す）、並びにテトラメチルベンチジン０．１７mg/ml、
０．０１５％過酸化水素、０．１２５Mクエン酸緩衝液
（ｐＨ４．２）からなる発色基質液を用意した。

【００２９】（３）ＨＣＶ抗体の検出１ ＨＣＶの感染が疑われる血清検体（２０例）、および正
常人血清検体（１０例）を試料とし、試薬１ａ、試薬１
ａ７、試薬２、試薬３、および試薬１ａ７＊２によりＥ
ＬＩＳＡを行った。比較のため、公知ペプチドであるＢ
−１およびＡＲＩＭＡ＃１４（以下Ｎ−１４と略す）か
ら調製した試薬についても分析を行った。尚、Ｂ−１、
Ｎ−１４の抗原濃度は０．１μg/ｗである。上記配列１
ａ等では０．２μg/ｗであるが、この相違はそれらの最
適抗原濃度（即ち、感度の低下を招くことがない経済濃
度）が異なるからで、それぞれの抗原の最適条件で調製
したことに変わりない。Ｂ−１は文献（J.Virology.65/
3,p1105-,1991年）に記載されたＨＣＶ構造領域のアミ
ノ酸配列のＮ末端側からカウントして１０〜１２２番目
までのアミノ酸配列に相当するペプチドであり、ＡＲＩ
ＭＡ＃１４はＨＣＶの構造領域中のエピトープとして報
告（BIOmedica 6(2),p26-,1991年）されたペプチドであ
る。また市販のＨＣＶ抗体検出用キット（Ｃ−１００−
３抗原を利用したもの）による分析結果の比較も行っ
た。更に一部の血清検体については、市販のイムノブロ
ット法による追試用のキット（ＲＩＢＡテスト、オーソ
社製、商品名）による確認試験も実施した。操作は次の
とおりである。抗原固相化プレートの各ウエルに検体希
釈液（０．０５％Tween20、０．１２５％NaN3、１０mM
リン酸緩衝液ｐＨ７．２）２００μlと血清検体２０μl
ずつをとり、２５℃で１時間反応させた。反応後、反応
液を除去して洗浄液（０．０５％Tween20、１０mMリン
酸緩衝液ｐＨ７．２）３００μlで５回洗浄し、ＰＯＤ
標識抗ＩｇＧ抗体１００μlを分注して２５℃で１時間
反応させた。反応後、反応液を除去して洗浄液３００μ
lで５回洗浄し発色基質液１００μlを入れた後、２５℃
で３０分間反応させ、２Nの硫酸で反応停止後４５０nm
の吸光度を測定した。結果は表１に示すとおりである
（表中、試薬はＰで表示してある。）。表１において、
イムノブロット法による追試の結果（表中、「ＲＩＢ
Ａ」と表示してある。）と比較して市販品（表中、「Ｃ
−１００」と表示してある。）に疑陽性が相当多く観察
されたのに対して、試薬１ａ７や試薬１ａ７＊２ではＲ
ＩＢＡともよく一致しており、本発明による試薬１ａ７
や試薬１ａ７＊２の検出率の高さが証明された。尚、試
薬２及び３もほぼ同等の作用が認められたが、配列１を
含む試薬１ａ、１ａ７、１ａ７＊２と対比すると検出漏
れとなる場合（検体ＮＯ．１６，１７）があり、配列
２、３の単独使用では時として検出漏れを生ずることが
判る。又、試薬１ａ７＊２では試薬１ａ、１ａ７よりも
更に検出率が向上することが判る。又、Ｂ−１とのデ−
タの一致、不一致はそれだけで、検査用試薬の優劣を直
接意味するものではないが、一般に、ＨＣＶ感染の疑わ
れる検体においてＢ−１で陽性のものが陰性となるもの
は、検出率が低い試薬であると考えることができる。こ
の見地からすれば試薬１ａ、１ａ７、１ａ７＊２は試薬
２、３及びＮ−１４より良好である。

【００３０】

【表１】 更にＨＣＶ陽性検体については、配列１ａ７および配列
２によるインヒビションテストを試みた。固相化に利用
した配列１ａ７および配列２のペプチドを検体希釈液
（２００μｌ）中に１０μg添加し、試薬１ａ７と試薬
２における反応の変化を観察した。その結果、表２に示
すとおりＨＣＶ抗体陽性検体は、配列１ａ７のペプチド
１０μgの添加で完全にインヒビションされ、特異性の
高さが確認された。又、配列２においても、ＨＣＶ抗体
陽性検体に対しては、完全なインヒビションが認められ
その限りで特異性が高かった。

【００３１】

【表２】 （４）試薬の調製２ （１）で合成したペプチドに各種架橋剤を導入したもの
を抗原として試薬を調製した。 各種架橋剤の合成ペプチドへの導入 (A)Sulfo-SMCCの合成ペプチドへの導入 Sulfo-SMCC（ＰＩＥＲＣＥ製）０．１３２mgと合成ペプ
チド（配列１ａ７または２）０．５mgを１００mMリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後に混合し、液量を０．１
mlに調整した後、２５℃で２時間反応させ１Mグリシン
１０μlを加えて反応を停止した。 (B)EMCSの合成ペプチドへの導入 EMCS（同仁化学製）０．１mgをジメチルホルムアミド１
０μlに溶解し、合成ペプチド（配列１ａ７または２）
０．５mgととともに１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解後に混合し、液量を０．１mlに調整した後、
２５℃で２時間反応させ１Mグリシン１０μlを加えて反
応を停止した。 (C)Sulfo-LC-SPDPの合成ペプチドへの導入 Sulfo-LC-SPDP（ＰＩＥＲＣＥ製）０．１５mgと合成ペ
プチド（配列１ａ７または２）０．５mgを１００mMリン
酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解後に混合して、液量を０．１
mlに調整した後、２５℃で２時間反応させ１Mグリシン
１０μlを加えて反応を停止した。 (D)DSSの合成ペプチドへの導入 DSS（ＰＩＥＲＣＲ製）０．２mgをジメチルホルムアミ
ド５０μlに溶解し、合成ペプチド（配列１ａ７または
２）０．５mgとともに１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）０．１５mlに添加して、４℃で８時間かくはんして
反応させ１Mグリシン１０μlを加えて反応を停止した。 固相化抗原の作成 （２）の方法に準じて前記(A)〜(D)の架橋剤を導入した
各抗原の固相化プレートを作成した。

【００３２】（５）ＨＣＶ抗体の検出２ （４）で作成した試薬を用い、ＥＬＩＳＡによるＨＣＶ
患者血清中の抗体測定を試みた。また（４）で得た各抗
原によるインヒビションテストも併せて行った。 ＥＬＩＳＡによるＨＣＶ患者血清中の抗体測定 前記（４）で作成した抗原固相化プレートを用いて、
（３）に準じてＨＣＶ患者血清中の抗体を測定した。
尚、検体には、架橋剤の効果をみるためぺプチド単独で
は陰性（Ｂ−１では陽性）になるものを多く選択してい
る。結果は表３、表４に示した。各合成ペプチドの抗原
性は、架橋剤との結合によって増強されたが、増強効果
は架橋剤の種類によって異なっていた。Sulfo-SMCC、EM
CS、Sulfo-LC-SPDPは同程度に有効であり、DSSは前３者
に比べて若干劣っていた。特に、Sulfo-SMCCを導入した
配列１ａ７では検出漏れが全く認められなかった。一
方、配列２では架橋剤の結合によっても検出漏れは完全
には防止できなかった。一般に、架橋剤による増強効果
は配列１ａ７においてより顕著であった。またＢ−１抗
体が陰性の患者血清検体中に、架橋剤導入抗原と反応す
る例が認められた。

【００３３】

【表３】

【００３４】

【表４】 インヒビションテスト Sulfo-SMCCを導入した合成ペプチド（配列１ａ７）を用
いた抗体測定の際に、合成ペプチド、Sulfo-SMCC導入ペ
プチド、Sulfo-SMCC、ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ製）またはＢ
−１のいずれかを検体希釈液（２００μｌ）中に１０μ
g添加して反応の変化を観察した。結果は表５に示し
た。その結果、検体ＮのようにＢ−１およびSulfo-SMCC
導入合成ペプチドではインヒビションされたが、合成ペ
プチドそのものやSulfo-SMCC単独ではインヒビションさ
れない例が認められた。このことから架橋剤の導入によ
り合成ペプチドの反応性が明らかに変化しコアの全領域
をカバーする抗原に近づくことが確認された。

【００３５】

【表５】 （６）試薬の調製３ （４）で各種架橋剤を導入したペプチドに、更に担体蛋
白を結合させたものを抗原として試薬を調製した。 Sulfo-SMCC架橋剤導入ペプチド抗原の担体蛋白への結
合 ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ製）またはＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ製）
１０mgを６m尿素を含む１００mMＥＤＴＡ溶液２mlに溶
解した。n-ブタノール０．２mlとNaBH4２０mgを加え、
２５℃で３０分間かくはんした後に１００mMNaH2PO4１m
lとアセトン０．４mlを滴下して還元ＢＳＡ溶液、ある
いは還元ＨＳＡ溶液とした。この溶液０．３mlに（４）
におけるグリシンで反応停止する前の反応液（Sulfo-SM
CC架橋剤導入ペプチド抗原：（４）（Ａ）参照）
（０．１ml）を加え、４℃で８時間かくはんして反応さ
せた後５０mMのN-エチルマレイミド５０μlを添加して
反応を停止させた。更にＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−５０
（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ製）で精製して、担体蛋白に結合
したSlufo-SMCC架橋剤導入合成ペプチド（以下ＢＳＡ結
合ペプチド、ＨＳＡ結合ペプチドと略す）を得た。 固相化抗原の作成 （２）の方法に準じてＢＳＡ結合ペプチド、およびＨＳ
Ａ結合ペプチドの固相化プレートを作成した。

【００３６】（７）ＨＣＶ抗体の検出３ （６）で作成した固相化プレートを用い、（２）の方法
に準じてＢ−１による抗体測定が陽性となったＨＣＶ患
者血清（５４例）中の抗体を測定した。結果は表６に示
す。表６に示すとおり、ＢＳＡ結合ペプチド、ＨＳＡ結
合ペプチドとも同じ成績であった。

【００３７】

【表６】 また健常人血清について両者で測定したところ、表７に
示すとおりＢＳＡ結合抗原では約２％に非特異陽性を認
めたのに対して、ＨＳＡ結合抗原では非特異陽性の出現
を認めなかった。

【００３８】

【表７】 又、同様に公知のペプチド（Ｂ−１、およびＮ−１４）
による試薬で同じ検体の分析を行い、両者の結果を比較
した。

【００３９】（８）ＨＣＶ抗体の検出４ （１）で合成した配列１ｂ９及び１ｃ９から（４）及び
（６）に基づき以下に示す抗原（ＨＳＡ結合抗原）を誘
導し、これを（２）の方法に準じてマイクロタイタープ
レ−トに感作（ウェル分注時の抗原濃度は０．５μg/ｗ
とした。）したものによって、ＨＣＶの感染が疑われる
患者検体（１０５例）中のＨＣＶ抗体検出（ＥＬＩＳＡ
法）を試みた。結果を表８に、又、それを集計したもの
を表９にそれぞれに示す。

【００４０】若干の反応性の違いがあるものの、およそ
同等の反応性を持つことが確認された。 配列１ｂ９−スペ−サ−（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）−Ｈ
ＳＡ：（１ｂ９−ＨＳＡという） 配列１ｃ９−スペ−サ−（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）−Ｈ
ＳＡ：（１ｃ９−ＨＳＡという）

【００４１】

【表８】

【００４２】

【表９】 （９）ＨＣＶ抗体の検出５ 配列１ｂ９と配列３について、それぞれスペ−サ−（Ｓ
ｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を介してＨＳＡを結合した抗原を
用意した。更にこれを１：１に配合し試薬（Ｐ１ｂ９＊
３という）を調整し、これを（２）の方法に準じてマイ
クロタイタープレ−ト（分注濃度０．５＋０．５＝１．
０μg/w）に感作したものによって、種々の検体中のＨ
ＣＶ抗体の検出（ＥＬＩＳＡ法、一部ＲＩＡ法）を試み
た。又、同様に公知のペプチド（Ｂ−１およびＮ−１
４）による試薬で同じ検体の分析を行い、両者の結果を
比較した。

【００４３】検体としては、前記ＨＣＶ感染が疑われる
検体の他、Ｂ−１陽性検体（１３９例）、ＲＦ陽性検体
（５０例）、正常検体人（１００例）を用いた。

【００４４】ここでＲＦ陽性検体を用いたのは、ＲＦは
リウマチ因子でＨＣＶ感染疑陽性の原因となるため、Ｒ
Ｆの干渉を受けて陽性となるものは非特異反応を起こし
やすいと考えられるからである。

【００４５】結果を表１０（ＨＣＶ感染が疑われる検
体）、表１３（Ｂ−１陽性検体）、表１６（ＲＦ陽性検
体）、表１９（正常検体）にそれぞれ示す。なお、それ
ぞれの表を各検体群について集計したものを表１１、１
２（表１０に対応）、表１４、１５（表１３に対応）、
表１７、１８（表１６に対応）、表２０（表１９に対
応）に示す。ＨＣＶ感染が疑われる検体において、Ｎ−
１４で陰性のものがＰ１ｂ９＊３陽性となる例が認めら
れ、Ｐ１ｂ９＊３の検出率はＢ−１と比べても高いもの
であった（表１０−１２）。Ｂ−１陽性検体を基準とし
Ｐ１ｂ９＊３とＮ−１４を比較した表１３−１５では、
Ｐ１ｂ９＊３の検出率がＮ−１４より高いことが明らか
に認められた。ＲＦ陽性検体においては、Ｂ−１は高感
度のためＲＦの干渉を受ける傾向が強かったが、Ｐ１ｂ
９＊３はＮ−１４と同程度であり、あまり干渉を受けな
いことが認められた（表１６−１８）。正常検体におい
ては、Ｐ１ｂ９＊３、Ｂ−１、Ｎ−１４ともに陽性を検
出しなかったが、Ｂ−１は検出傾向（吸光度が比較的高
い）が高く、測り込みし易いと認められるが、Ｐ１ｂ９
＊３はＢ−１よりもその傾向が小さくＮ−１４と大きな
差は認められなかった（表１９）。なお表１９の結果か
ら算出したカット・オフ値は、Ｐ１ｂ９＊３が０．３１
９、Ｂ−１が０．４４５、Ｎ−１４が０．０３７であっ
た。

【００４６】このように、本発明のペプチドの組み合せ
たＰ１ｂ９＊３は、ＨＣＶ抗体の検出率、あるいは特異
性の点において、Ｎ−１４をしのぎ、Ｂ−１と同等ある
いはそれ以上の結果を示した。

【００４７】

【表１０】

【００４８】

【表１１】

【００４９】

【表１２】

【００５０】

【表１３】

【００５１】

【表１４】

【００５２】

【表１５】

【００５３】

【表１６】

【００５４】

【表１７】

【００５５】

【表１８】

【００５６】

【表１９】

【００５７】

【表２０】

【００５８】

【表２１】

【００５９】

【発明の効果】実施例の結果からも明らかなように、本
発明によるＨＣＶ抗体の検出試薬は、検出率と特異性に
優れる。また本発明による配列１で示されるペプチド
は、構成アミノ酸が少ないため化学合成によって得ら
れ、遺伝子組み換えによって製造されたペプチド抗原に
多い非特異反応を除くことができる。しかも１〜２種類
程度の少ないペプチドで十分な検出率を実現できるので
経済的にも有利である。更に本発明によるペプチドは、
Slufo-SMCCに代表される架橋剤を導入することで、もと
のペプチドに比べてＨＣＶコア抗体に対する反応性が向
上する。また導入した架橋剤を介してＨＳＡのような血
清蛋白を担体蛋白として結合させれば、良好な反応性が
得られるとともに非特異反応を抑制することが可能とな
る。以上のように、本発明によればＨＣＶ感染を早期
に、しかも正確に検査することが可能となる。

【００６０】

【配列表】

【００６１】配列番号：1 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：ＨＣＶコア領域に対する抗体と反応性のペプ
チド

【００６２】配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：ＨＣＶコア領域に対する抗体と反応性のペプ
チド

【００６３】配列番号：３ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：ＨＣＶコア領域に対する抗体と反応性のペプ
チド

【００６４】配列番号：４ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：ＨＣＶコア領域に対する抗体と反応性のペプ
チド

【００６５】配列番号：５ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：ＨＣＶコア領域に対する抗体と反応性のペプ
チド 配列 Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg 1 5 10 Arg Ser Lys Asn Glu Lys 15

【００６６】配列番号：６ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：ＨＣＶコア領域に対する抗体と反応性のペプ
チド 配列 Thr Arg Arg Leu Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro Ala Leu Met Ala Val 1 5 10 15

【００６７】配列番号：７ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：ＨＣＶコア領域に対する抗体と反応性のペプ
チド 配列 Val Val Pro Arg Lys Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro Ala Leu Met Ala Val 1 5 10 15 Lys

【００６８】配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 他の情報：ＨＣＶコア領域に対する抗体と反応性のペプ
チド 配列 Pro Thr Arg Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro Ala Leu Met Ala Val 1 5 10 15 Lys

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 正雄 栃木県大田原市下石上字東山1381−３ 栄 研化学株式会社那須事業所内 (72)発明者 吉田 巌 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内 (72)発明者 高見沢 昭久 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内 (72)発明者 柴谷 武爾 大阪府大阪市淀川区加島３丁目16番89号 田辺製薬株式会社応用生化学研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列１：Arg Xaa Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro （Xaaは任意のアミノ酸を示す。）を含むペプチド、ま
   たは、更に次の配列２および／または３のペプチドを加
   えた複数のペプチド、を含むＣ型肝炎検査用試薬。 配列２：Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg 配列３：Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys
2. 【請求項２】配列１におけるXaa がLeu 、Lys 、Arg か
   らなる群から選択されたアミノ酸である請求項１のＣ型
   肝炎検査用試薬。
3. 【請求項３】ペプチドが、スペーサーおよび／または担
   体蛋白と結合していることを特徴とする請求項１又は２
   のＣ型肝炎検査用試薬。
4. 【請求項４】担体蛋白がヒト・血清アルブミンであるこ
   とを特徴とする請求項３のＣ型肝炎検査用試薬。
5. 【請求項５】 配列１：Arg Xaa Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro （Xaaは任意のアミノ酸を示す。）を含むペプチド、ま
   たは、更に次の配列２および／または３のペプチドを加
   えた複数のペプチド、のいずれかに対して反応性の抗体
   を検出するＣ型肝炎の検査方法。 配列２：Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg 配列３：Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys