PT742438E - Rastreio de bibliotecas combinatórias de péptidos para a selecção de ligandos de péptidos úteis na purificação por afinidade de proteínas-alvo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Rastreio de bibliotecas combinatórias de péptidos para a selecção de ligandos de péptido úteis na purificação por afinidade de proteínas-alvo"

Antecedentes As colunas de afinidade de péptidos oferecem vantagens substanciais em relação a técnicas de cromatografia existentes para a purificação de proteínas (1) . A importância desta metodologia de purificação, baseada em sequências de ligação conhecidas, tem sido enfatizada na literatura (2), mas uma limitação principal tem sido a falta de sequências conhecidas que possam actuar como ligandos (1). 0 desenvolvimento recente de bibliotecas aleatórias de péptidos (também chamadas bibliotecas combinatórias de mimotopos ou de epítopos), que contêm uma vasta gama de combinações de aminoácidos para péptidos de um determinado tamanho, tem permitido uma abordagem racional para caracterizar as interacções proteína-péptido (3-13).

Seguindo o procedimento proposto pela primeira vez por Scott e Smith (3), pode-se produzir uma biblioteca de hexâmeros (6 resíduos de aminoácidos) clivando oligonucleótidos sintetizados quimicamente de sequências aleatórias (de 18 diferentes códões de nucleótidos) na região codificante de uma proteína de revestimento de bacteriófago. Podem-se representar mais de 10 dos 10 de códões únicos de nucleótidos possíveis com a tecnologia de phage-display actual (3-6). Os fagos são replicados em células hospedeiras de Escherichia coli, colhidos e depois incubados directamente na proteína-alvo imobilizada na -2- superfície de uma placa de cultura (3). Os fagos que contêm uma sequência peptídica que interage especificamente com a proteína-alvo são imobilizados pela proteína-alvo, enquanto os fagos que não se ligam especificamente à proteína-alvo se perdem na lavagem subsequente. Os fagos ligados são colhidos e processados de modo a que o péptido que se liga especificamente a proteína-alvo possa ser identificado.

Contudo, os métodos para rastrear bibliotecas combinatórias de ligandos para a purificação por afinidade têm grandes limitações: 1) os fagos que apresentam péptidos que se ligam à proteína-alvo têm de ser isolados através do processo de biopanning; 2) o ADN do fago de ligação tem de ser sequenciado; 3) antes de se determinar a ligação ou a purificação com os péptidos, os péptidos têm de ser sintetizados e purificados, e depois tem de se realizar uma ligação química dos ligandos num suporte cromatográfico; e 4) o microambiente da sequência peptídica presente na superfície do suporte cromatográfico pode ser muito diferente daquele apresentado pelo fago, o que pode influenciar radicalmente a capacidade do péptido de se ligar ao seu alvo. Estas limitações tornaram a utilização de bibliotecas combinatórias enquanto fonte de ligandos de péptidos difícil, e tornaram incerta a identificação de péptidos específicos de proteínas-alvo.

Na síntese pela metodologia de mistura e separação demonstrada pela primeira vez por Furka (7), geram-se milhões de sequências peptídicas únicas em esferas (beads) resinosas baseadas em poliestireno. As melhorias subsequentes da técnica permitiram identificar sequências reactivas (10) . Contudo, a identificação de sequências -3- específicas para um alvo por parte destes ensaios de ligação tem sido comprometida por uma elevada coloração de fundo devido a lavagem batch ineficiente e à incapacidade inerente de distinguir entre as sequências nas esferas que interagem com os reagentes de detecção e as esferas que interagem especificamente com a proteína-alvo.

Law (26) ensina um método no qual uma substância-alvo é adicionada aos ligandos no primeiro passo juntamente com um sistema de detecção. As esferas que se ligam são separadas da população total, os componentes do primeiro sistema de detecção e o alvo são removidos das esferas e, depois, são testados novamente contra a mesma substância-alvo com um segundo sistema de detecção. Law (26) ensina uma comparação dos ligandos identificados com os dois sistemas de detecção separados para a mesma substância-alvo para identificar apenas aqueles ligandos que se ligam em ambos os sistemas.

Para superar as dificuldades em distinguir que péptido (esfera) único está a interagir especificamente com a proteína-alvo e que péptido (esfera) está a reagir com os reagentes de detecção, sintetizei péptidos numa resina cromatográfica hidrófila e desenvolvi um procedimento de coloração de duas fases que cora as esferas que reagem com os reagentes de detecção com uma cor e as esferas específicas da proteína-alvo com outra cor. Isto é realizado, habitualmente, com conjugados de anticorpo-enzima como reagentes de detecção, apesar de se poder utilizar outros reagentes. Para criar as condições de lavagem mais eficazes possíveis, realizam-se todos os ensaios em colunas de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), tirando partido das características do fluxo de -4- passagem (flow-through) da resina. Cada reagente é posto em contacto com as esferas com uma injecção de HPLC separada com um programa de lavagem que remove toda a ligação não especifica através de um gradiente de sal. Logo, realiza-se a automatização do ensaio e eliminam-se variações entre procedimentos que são habituais nos ensaios de batch.

Além das dificuldades em identificar péptidos que se ligam especificamente à proteina-alvo, a utilização de meios cromatográficos capazes de proporcionar o suporte para a sintese de péptidos e de HPLC é limitada. Quase todos os suportes de sintese de péptidos são resinas baseadas em poliestireno que não são adequadas para utilização em ensaios biológicos. Está descrito na literatura que as resinas baseadas em poliestireno exibem quer interacções especificas, quer não especificas com várias proteínas plasmáticas (11). Para diminuir a ligação não específica aos reagentes de detecção, têm sido utilizadas resinas de péptidos hidrófilas na síntese e no rastreio de péptidos (12, 13). Têm-se tornado hidrófilas várias resinas de péptidos baseadas em poliestireno (8, 9); estas, porém, foram concebidas para síntese química e não para ensaios biológicos directos (13), nem para suportes cromatográficos de grande escala.

Meldal et al. demonstraram a utilização de uma resina de polímero de acrilamida comercialmente disponível modificada para a geração de bibliotecas de péptidos (12). Apesar de apropriadas para a síntese de péptidos e para sondar bibliotecas, as resinas de acrilamida não têm a rigidez química necessária para cromatográfia de alta eficiência de grande escala. -5-

Para superar os problemas associados às resinas hidrofóbicas, desenvolvi uma nova resina modificada que pode ser utilizada para a sintese, rastreio e avaliação de péptidos, e possivelmente para utilização cromatográfica final. A resina que constitui a base desta invenção é um polímero de metacrilato polihidroxilado comercialmente disponível pela TosoHaas (14). As características distintas desta resina são a natureza hidrófila inerente do polímero, o tamanho grande dos poros (nominalmente 1000 angstrõms), a rigidez mecânica e química e os intervalos graduados dos diâmetros de esfera para aplicações directas em separações cromatográficas. Esta resina, após modificação simples para gerar um grupo amino livre para a síntese peptídica, mostra boa resistência química aos reagentes clássicos de síntese peptídica.

Esta resina e o ensaio de coloração de duas cores permitiram-nos identificar as sequências peptídicas que ligam as proteínas-alvo que, em contraste com a arte anterior, são seleccionadas para serem específicas apenas para a proteína-alvo e não para os reagentes. As esferas que se ligam aos reagentes de detecção são excluídas do meu método.

RESUMO DA INVENÇÃO A minha invenção é um procedimento para determinar, numa biblioteca combinatória de péptidos, que péptido se liga especificamente a uma proteína-alvo, como definido na reivindicação 1. A biblioteca de péptidos está ligada a suportes cromatográficos e é depois incubada com os -6- reagentes de detecção, dando origem a uma alteração detectável (por exemplo, uma alteração de cor) do suporte onde os péptidos ou o suporte se ligam aos agentes de detecção. A proteína-alvo é depois adicionada aos suportes sob condições conducentes à ligação da proteína-alvo de um modo específico a um péptido no suporte. São adicionados novamente reagentes de detecção, dando desta vez origem a uma alteração diferente (por exemplo, uma cor diferente), o que distingue a proteína-alvo ligada especificamente ao péptido, da primeira alteração anterior. No modo de realização preferido, os agentes de detecção são anticorpos e os seus conjugados enzimáticos, e o procedimento é realizado utilizando um aparelho de HPLC, que serve como meio eficiente para adicionar reagentes e para lavar reagentes que não reagiram para fora do sistema. 0 péptido identificado pode depois ser produzido e ligado a um suporte cromatográfico para utilização na purificação por afinidade da proteína-alvo. 0 suporte preferido é hidrófilo e muito poroso, tendo um tamanho de poro médio preferido de cerca 800 a cerca de 1200 angstrõms, preferencialmente 1000 angstrõms. Apesar de um sistema de detecção marcado preferido incluir um marcador (tag) conjugado a uma enzima que, dependendo do substrato escolhido, permitirá a geração de alterações de cor observáveis, podem-se utilizar outros marcadores ou tags ou combinações (por exemplo, anticorpos marcados radiologicamente ou marcados com fluorescência).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Esquema do procedimento de imunocoloração de duas cores. -Ί Α: População inicial de esferas que têm polipéptidos (Xi_6) ligados a elas. Os polipéptidos têm em cada esfera individual essencialmente a mesma sequência. A coluna é equilibrada através da lavagem com tampões. B: Adicione o primeiro anticorpo (AbTP) e incube, depois enxagúe. 0 enxaguamento remove o AbTP ligado frouxamente; o que resta é AbTP ligado especificamente e não especificamente nas esferas. N.B.: o AbTP é um anticorpo que se liga especificamente a proteina-alvo. C: Adicione o segundo anticorpo que está conjugado à enzima (Ab*Enz). Incube, e depois enxagúe. 0 que resta é Ab*Enz ligado fortemente e especificamente ao AbTP ligado e também ligado não especificamente e especificamente às esferas. N.B.: 0 Ab*Enz liga-se especificamente ao AbTP. D: Adicione o substrato de corante azul à enzima que cora as esferas ligadas à enzima com uma cor azul. Incube, depois enxagúe o excesso de corante azul. E: Adicione a proteina-alvo (TP - target protein) . Incube e depois enxagúe. A proteina-alvo liga-se especificamente a vários polipéptidos entre a população das esferas. F: Adicione o AbTP, incube e depois enxagúe. 0 AbTP liga-se especificamente à TP. G: Adicione o Ab*Enz. Incube, depois enxagúe. 0 Ab*Enz liga-se especificamente ao AbTP. H: Adicione o substrato de corante vermelho à enzima que cora as esferas ligadas à enzima com a cor vermelha. N.B.: Qualquer actividade enzimática remanescente das primeiras esferas coradas fará com que essas esferas se tornem violeta ou castanhas. I: Isole as esferas vermelhas visualmente e submeta as esferas individualmente a análise de sequenciação peptidica.

Figura 2:

Cromatograma da técnica de imunoensaio para a proteína de Ribonuclease S (RNase S) injectada na resina YNFEVL-TSK diluída (1:20 p/p) com TSK-Blank. A linha superior (A) é a absorvência a 280 nm; a linha média (B) é a velocidade de fluxo, e a linha inferior (C) indica as condições do gradiente.

Figura 3:

Validação do ensaio de afinidade HPLC pela proteína de RNase S e péptido-resina (YNFEVL-TSK). A figura superior mostra o perfil de absorvência a 280 nm para a albumina sérica humana (HSA - human serum albumin) (A) e para a proteína de RNase S em HSA (B) . A figura inferior é o traçado da pressão do cromatograma B.

Figura 4Ά:

Cromatogramas da ligação do Factor IX à YANKGY-TSK. O traçado inferior (A) é um -9- branco de tampão. 0 traçado médio (B) é a proteína de transporte (1,0 ml de HSA a 0,5%). O traçado superior mostra que 55 pg de Factor IX injectado na coluna são libertados durante a lavagem ácida.

Figura 4B: Esta figura mostra o pico do Factor IX do cromatograma na Fig. 4A numa escala aumentada.

Figura 5: Cromatogramas de várias quantidades de

Factor IX injectado em YANKGY-TSK. O traçado inferior (A) são 55 pg de Factor IX sem HSA. 0 traçado B são 110 pg de Factor IX e C são 220 pg de Factor IX, ambos sem HSA. O traçado D são 220 pg de Factor IX aquecido a 95 °C durante 5 min. antes da injecção. O traçado superior (E) são 220 pg de Factor IX em HSA.

Figura 6: SDS-PAGE (Fig. 6A) e Western blot (Fig. 6B) das misturas de Factor IX e HSA. As colunas 1 e 9 são pesos moleculares padrão. A coluna

2 é o Factor IX (Enzyme Research Labs; South Bend, IN) . A coluna 3 é um padrão de HSA (Miles Inc.) A coluna 4 é o material inicial que foi injectado na coluna de afinidade YANKGY-TSK (1,0 ml, 200 pg de Factor IX em HSA) . A coluna 5 é o primeiro pico de fluxo de passagem. A coluna 6 é o segundo pico de fluxo de passagem. A coluna 7 é a lavagem de NaCl. A coluna 8 é o pico -10- eluído ácido. Colocaram-se aproximadamente 10 pg de proteína total em cada coluna.

Figura 7: Cromatograma (Fig. 7A) , SDS-PAGE (Fig. 7B) e

Western blot (Fig. 7C) de 1,0 ml de plasma humano citrado na resina Acetil-YANKGY-TSK. Colocaram-se aproximadamente 10 pg em cada coluna e o gel submetido a electroblot foi carregado com a mesma quantidade de amostra que o gel corado com azul de Commassie. As colunas 1, 5, 7, 9 e 11 estavam em branco.

Coluna 2: 1,0 pg de Factor IX; Coluna 12: 0,0625 pg de Factor IX. Colunas 3 e 13: padrões de peso molecular. Colunas 4 e 15: plasma humano. Coluna 6: fluxo de passagem (t = 0 a 12 min.); Coluna 8: fluxo de passagem (t = 12 a 15 min.). Coluna 10: o eluente ácido. Coluna 14: um produto intermédio do Factor IX parcialmente purificado. O Western blot em baixo à direita não apresenta Factor IX no material inicial ou nos fluxos de passagem. Há uma banda imunodetectada forte que corresponde ao zimogénio do Factor IX no eluente ácido.

MODOS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICOS E PREFERIDOS

Materiais e Métodos

Química de Resina Para a síntese de péptidos, enxaguou-se uma resina de cromatografia de tipo metacrilato polihidroxilado, preferencialmente Toyopeart 650 M Chelate -11 - (tamanho de partícula de 65 pm, tamanho de poro 1000 Â; TosoHaas, Montgomeryville, PA) num recipiente de reacção de 25 g com água, metano e dimetilformamida (DMF). Juntou-se um excesso molar quíntuplo de etilenodiamina em relação ao carboxilato de resina na fracção de carboxilato com um ligeiro excesso molar de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfónio (PyBOP, Novabiochem, La Jolla, CA) e N-metilpirrolidinona (NMM, excesso molar triplo em relação a PyBOP; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) em DMF durante 60 minutos. A resina aminada foi lavada com DMF, depois com metanol e depois seca in vacuo.

Para originar uma resina não clivável, realizaram-se duas ligações padrão de síntese peptídica em fase sólida para introduzir duas moléculas de espaçadores de resíduos de β-alanina (Novabiochem) (designados por TSK-Blank). Para originar uma resina clivável para péptidos solúveis, activou-se um excesso molar duplo (em relação à amina nas esferas) de ácido p-[(R,S)-α-[1-(9H-fluoren-9-il)-metoxiformamido]-2,4-dimetoxibenzil]-fenoxiacético (Novabiochem) com um ligeiro excesso molar de PyBOP e NMM, depois adicionado à resina TSK-Blank aminada. Deixou-se continuar a reacção de ligação durante 4 horas, com lavagens subsequentes de DMF e metanol. Podem-se utilizar outros procedimentos químicos de ligação, que são amplamente conhecidos daqueles com experiência na arte e que são compatíveis com as fracções funcionais disponíveis em diferentes resinas de metacrilato polihidroxilado.

Utilizou-se para comparação uma resina de amida Rink comercialmente disponível. -12-

Química de Péptidos de Biblioteca Combinatória Geraram-se bibliotecas combinatórias de péptidos de um modo similar ao de Furka (7) . Utilizou-se um bloco de síntese de grande escala no sintetizador múltiplo de péptidos para realizar cada ligação de um modo semiautomático. Adicionou-se meio grama de resina TSK-Blank aminada e seca a cada um dos 18 recipientes de reacção e 18 dos 20 aminoácidos naturais (neste modo de realização, omiti a cisteína e a metionina; contudo isto não é um requisito para a utilização desta invenção) foram ligados através de química FMOC padrão (ver abaixo). A resina de cada recipiente foi recolhida e lavada em DMF com agitação com árgon. A resina foi redistribuída uniformemente pelos 18 recipientes de reacção e o aminoácido seguinte foi ligado como o primeiro. Isto foi repetido até a biblioteca de hexâmeros estar completa (dois dias de trabalho). A resina foi recolhida, lavada com metanol, seca in vacuo, depois desbloqueada com Reagente R (18) (90% de ácido trifluoroacético (TFA), 5% de tioanisol, 3% de etanoditiol, 2% de anisol; tudo da Aldrich) durante 3 horas com agitação de árgon. A resina foi lavada com 20 volumes de coluna de metanol, depois seca in vacuo. Síntese de Péptidos em Batch Sintetizaram-se sequências peptídicas através do método de fase sólida (15) num sintetizador múltiplo de péptidos Gilson AMS422 (16) com FMOC como protecção a-amino (16, 17) . Conforme os péptidos eram clivados ou não das esferas, para análise, utilizaram-se como suporte para a síntese quer a resina TSK-Blank aminada clivável, quer a resina TSK-Blank não clivável, ou a resina Rink (para comparação). Activaram-se in situ ligações simples de aminoácidos (excesso molar quíntuplo; 1 ml de 0,5 M em DMF) com PyBOP (0,5 ml de 0,3 M em DMF) e -13- ΝΜΜ (0,25 ml de 1,19 M em DMF) com a nossa resina TosoHaas modificada (0,3 g, 200 μιηοΐ) ou resina de amida Rink (0,5 g, 200 gmol). Deixou-se continuar a reacção de ligação com agitação de borbulhamento com árgon durante 45 minutos. Todos os péptidos foram clivados e/ou bloqueados com Reagente R durante 3,5 horas.

Para a análise de cromatografia de afinidade, os péptidos de resina não cliváveis TSK foram desprotegidos (como é normalmente praticado na arte) no recipiente de síntese, abundantemente lavados com metanol e secos in vácuo. Para a análise peptidica, a resina de TSK clivável e a resina de péptidos Rink foram clivadas e desprotegidas em 20 ml de frascos de cintilação. Estas misturas de péptidos foram filtradas para fora da resina directamente em 40 ml de éter dietílico anidro (Aldrich) através de um funil de vidro sinterizado de porosidade média. Os bolos de filtração dos péptidos foram dissolvidos em 50% de acetonitrilo/água e liofilizados num frasco de cintilação tarado. Estes péptidos não purificados e precipitados foram dissolvidos a 25-50 mg/ml em acetonitrilo/água a 50% e purificou-se 1 ml através de HPLC preparativa (Gilson, Inc.) com uma coluna de fase reversa de 22 mm x 250 mm (C18 15u 300Â) (Vydac; Hesperia, CA). Para confirmar o grau de pureza, dissolveram-se péptidos brutos a 10 mg/ml em acetonitrilo/água a 50% e os péptidos purificados foram dissolvidos a 10 mg/ml em acetonitrilo/água a 20%. Analisaram-se alíquotas de 10 μΐ através de HPLC microbore (Ultrafast Microprotein Analyzer, Michrom BioResources, Inc.; Sacramento, CA) com uma coluna de fase reversa de 2,1 mm x 150 mm C18 5u 300Â e um gradiente de 2 a 60% de acetonitrilo em água durante 12 minutos. -14-

Análise Efectuou-se a análise de aminoácidos como a descrita por Spackman (20) com um Analisador de Aminoácidos 6300 (Beckman Instruments, Inc.; Fullerton, CA) utilizando detecção de ninidrina. Realizaram-se determinações da massa dos péptidos através de inonização por bombardeamento por átomos e iões rápidos (FAB) num espectrómetro de massa de dupla focagem JEOL HX-110. Os péptidos foram salpicados em acetonitrilo/água a 50% numa matriz de tioglicerol. O intervalo de massa detectado dependeu da massa esperada do péptido. A sequenciação peptidica foi realizada através de química Edmand utilizando um Sequenciador de Proteínas/Péptidos ABI 477A (Applied Biosystems; Foster City, CA) ligado a um Analisador HPLC 120A (C18 PTH, cromatografia de fase reversa) para determinar aminoácidos de feniltiohidantoína (PTH). Realizaram-se ELISA tipo sandwich como descrito por Bessos (21). As amostras de proteínas foram quantificadas pelo teste do Biureto (22) , depois analisadas por SDS-PAGE (23) e por técnicas de Western hlot (24).

Imunoensaios de HPLC da Biblioteca Para diferenciar entre a detecção de esferas péptido-resina que se ligam ao reagente e que se ligam ao alvo, desenvolvemos uma técnica de cromatografia de coloração de bibliotecas de péptidos de duas cores. A Figura 1 é um esquema do modo de realização preferido da técnica. Todos os ensaios foram realizados num Analisador de Microproteínas Ultra-Rápido numa coluna de aço inoxidável de 2,1 mm de diâmetro interno x 150 mm (volume = 520 μΐ) de comprimento a 37 °C. Colocou-se resina de biblioteca seca na coluna através de vácuo, sendo depois a coluna ligada à células detectora de fluxo e lavada com -15- 20 volumes de coluna de metanol/água a 20%, 5 volumes de coluna de Tampão A a 100% (10 mM de Hepes, 100 mM de NaCl, 2,5 mM de CaCl2, 2 0 mg/ml de D-manitol; todos da Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), depois 5 volumes de coluna de Tampão B a 50% (Tampão A com 1,0 M de NaCl) para lavar a resina. O ensaio total foi composto por sete programas de injecção cromatográfica ligados e executados sequencialmente como um batch (ExChrom Chromatography Data System, Scientific Software, Inc.; San Ramon, CA). Cada programa de injecção durou 90 min. No principio de cada programa de injecção, injectou-se uma alça de amostragem de 1,0 ml de reagente a 200 μΐ/min. durante 3,5 min., deixando-se seguidamente a perfundir a coluna a 5 μΐ/min. durante 50 min. antes de o fluxo aumentar para 400 μΐ/min. durante o tempo do teste. Aos 60-75 min., um gradiente de sal de 0,1 M até 1,0 M de NaCl eluiu proteínas de ligação não especifica. Este tampão de sal elevado foi utilizado para lavar a coluna durante 15 min.; depois a coluna foi equilibrada novamente nas condições originais.

Para cada conjunto de ensaios havia 7 injecções: 1) Branco de tampão A; 2) Albumina sérica humana a 0,5% (HSA; Miles, Inc., Clayton, NC) sem proteína-alvo (Fig. IA); 3) Primeiro anticorpo diluído 1:1000 (Fig. 1B); 4) conjugado de segundo anticorpo - fosfatase alcalina diluído 1:1000 (Fig. 1C) . Cada imunorreagente foi diluído em HSA a 0,5% em Tampão A. Após o quarto programa de injecção, o trabalho em batch foi interrompido para o primeiro procedimento de coloração. Neste exemplo em particular, interrompeu-se o fluxo do tampão, desligou-se a coluna e extraiu-se a resina com Tampão A a 100% a 300 μΐ/min. Recolheram-se 15 fracções (2 -16- gotas por fracção) numa placa de microtitulação de 24 poços (Corning/Costar) .

Adicionou-se BCIP/NBT e realizou-se a coloração no poço. A observação visual do procedimento de coloração permitiu tempos de coloração óptimos. Em alternativa, a coloração pode ser levada a cabo na coluna, tornando todo 0 procedimento completamente automático (Fig. 1D) . As fracções de resina coradas foram colocadas em tubos de reacção de 3 ml, lavadas abundantemente com água, secas in vãcuOf depois novamente colocadas a seco na coluna na mesma ordem que a resina foi fraccionada. Utilizou-se resina TSK-Blank para preencher a saída da coluna para substituir qualquer resina perdida. Após reequilibração da coluna, injectou-se a proteína-alvo (2,4 pmol de amostra em Tampão A com HSA a 0,5%) (programa de injecção 5) (Fig. 1E) . Os dois programas de injecção que se seguem, 6 e 7, foram os mesmos que os programas com os números 3 e 4 (Figs. 1F e 1G) . Após estes programas estarem completos, as esferas de resina foram fraccionadas como antes, depois coradas com Fast Red nos poços da placa de microtitulação e inspeccionadas visualmente.

Purificação por Afinidade da Proteína-Alvo Empregou-se purificação por afinidade da proteina-alvo para determinar a capacidade de purificar proteínas com as sequências peptídicas identificadas como específicas. As sequências individuais derivadas de bibliotecas que se descobriu que se ligavam a proteínas-alvo foram sintetizadas num formato batch em resina TSK-Blank como acima descrito. A resina de péptido desprotegida foi colocada em seco numa coluna em branco como acima descrito e lavada com 20 volumes de -17- coluna de metanol/água a 20%, depois 10 volumes de coluna de Tampão A, e testada através de injecções sequenciais de 1,0 ml de 1) Branco de tampão A, 2) HSA a 0,5%, e 3) proteina-alvo em HSA a 0,5%. As proteínas ligadas de modo não específico foram lavadas para fora da coluna num gradiente gradual de 1,0 M de NaCl para dois volumes de coluna, e a proteína-alvo foi eluída da coluna numa solução de ácido fraco.

Validação do Imunoensaio de HPLC da Biblioteca

Proteína de Ribonuclease S Neste modo de realização, o ensaio de HPLC foi validado através da utilização de um péptido de ligação de controlo para uma proteína-alvo específica. 0 péptido de ligação da proteína de RNase S previamente identificado (25), YNFEVL, foi sintetizado numa resina TSK-Blank como é descrito na secção anterior, depois diluído com TSK-Blank até a relação final de péptido-resina para TSK-Blank ser de 1:20 do peso total. A Figura 2 mostra o programa de injecção de HPLC microbore do traçado UV, perfil de fluxo e condições de gradiente da técnica de imunoensaio utilizando proteína de RNase S como proteína-alvo (HSA é o transportador da proteína). Encontraram-se esferas vermelhas (indicando a interacção da proteína-alvo com as esferas de resina YNFEVL-TSK) com uma frequência de 5% ao longo da coluna, demonstrando que a coluna não está desprovida de alvo ou de imunorreagentes durante os testes cromatográficos de imunocoloração de bibliotecas de péptidos. Também estiveram presentes esferas transparentes brancas da TSK-Blank que não apresentaram reactividade com o sistema de detecção ou com a proteína de RNase S. As esferas azul-escuras que indicam interacções não -18- específicas ou específicas de imunorreagente estiveram apenas presentes numa frequência muito baixa (menos que 0,01%). Algumas esferas ficaram lascadas ou riscadas durante o procedimento de síntese, clivagem ou análise cromatográfica, mas, em geral, a integridade das esferas como suporte cromatográfico não pareceu ser comprometida, pois as esferas não colapsaram perante pressões elevadas (maiores que 4000 psi).

Validação do Método de Cromatografia de Afinidade de HPLC

Cromatografia de Afinidade da Proteína de Ribonuclease S Neste modo de realização, a metodologia de afinidade de HPLC é validada pelo sistema de proteína de RNase S/péptido YNFEVL previamente descrito. A síntese peptídica foi realizada como descrito na secção anterior. A Figura 3 mostra a análise de cromatografia de afinidade HPLC da proteína de RNase S. Injectaram-se 42 nmol de proteína de RNase S num volume de 1,0 ml na coluna a 200 μΐ/min durante 3 min. Reduziu-se o fluxo para 5 μΐ/min durante 5 min. para perfundir a coluna, depois aumentou-se até 400 μΐ/min. para retirar a proteína não ligada. Aos 13 min., uma injecção de 1,0 ml de Tampão A com 1,0 M de NaCl eluiu as proteínas ligadas não especificamente; depois a coluna voltou a 0,1 M de NaCl até aos 19 min., altura em que se iniciou um gradiente acentuado de 2% de ácido acético em água e um fluxo de 800 μΐ/min. Após 5 min., a coluna voltou ao Tampão A para equilibrar a resina. O pico aos 22 min. representa a proteína-alvo eluída na lavagem ácida.

EXEMPLO -19-

Biblioteca de Hexâmeros-Alvo Factor IX Testou-se uma biblioteca peptidica de hexâmeros com este ensaio cromatográfico de imunocoloração de bibliotecas peptidicas quanto à sua capacidade de ligar o zimogénio de Factor IX de protease de serina. A biblioteca foi testada como descrito e encontraram-se várias sequências de esferas vermelhas. Seleccionaram-se manualmente esferas individuais coradas com uma pipeta sob um microscópio de dissecção. Das 6 esferas isoladas a partir de duas análises independentes, duas esferas originaram uma sequência bem definida (YANKGY e YNYFNQ). A quantidade de péptido por cada esfera foi quantificada em aproximadamente 10 pmol (0,1 meq/g), o que é suficiente para sequenciação.

Purificação por Afinidade de Factor IX/Albumina O péptido derivado da biblioteca acima identificado liga-se e purifica uma mistura de um zimogénio de Factor IX comercialmente disponível altamente purificado, numa solução de albumina sérica humana. A sequência de YANKGY foi sintetizada em hatch como descrito e a análise quantitativa dos aminoácidos mostrou a sequência conveniente. A resina de péptido foi testada quanto à sua capacidade de ligar o Factor IX. A Figura 4 mostra os cromatogramas, demonstrando que o ligando de péptido de YANKGY sintetizado na TSK-Blank não liga o Factor IX. HSA ligou-se à coluna num grau pequeno. Contudo, esta foi eluída pela lavagem ácida, como é demonstrado pela ausência de um pico durante a eluição ácida. Em contraste, quando se adicionou Factor IX à HSA, havia um nítido pico eluído pelo ácido. Isto prova que a proteína-alvo (Factor IX) se ligou ao péptido com avidez suficiente para demonstrar especificidade. -20-

A Figura 5 mostra os cromatogramas para crescentes quantidades de Factor IX adicionadas à coluna. Verificou-se uma correlação directa entre a área do pico ácido e a quantidade de Factor IX injectada. A aquecimento do Factor IX durante 5 minutos diminuiu a ligação à coluna, como foi demonstrado pela redução da área do pico ácido. O cromatograma superior na Figura 5 mostra o traçado UV de 220 pg de Factor IX em HSA. A área do pico ácido deste teste (Figura 6, coluna 5) não foi significativamente diferente da área do pico do Factor IX sem HSA (Figura 6, coluna 3), consistente com o Factor IX quando está separado da HSA. Testaram-se aliquotas de fracções retiradas deste teste quanto à detecção de Factor IX por ELISA (dados não apresentados). Não se detectou nenhum Factor IX no pico de fluxo de passagem (da Figura 5, traçado superior); 17% da quantidade de Factor IX injectado foram detectados no pico de NaCl; e 25% no pico ácido. O Factor IX pode ser parcialmente desnaturado durante a eluição ácida, que pode ser responsável pela falta de uma recuperação total com base nos resultados do ELISA. De facto, os controlos com adição de ácido ao Factor IX antes da análise no ELISA mostram uma redução de 40 a 50% no sinal de ELISA. O resto das fracções foi precipitado em acetona fria (-20 °C) e analisado por SDS-PAGE redutora, normalizando a amostra em proteína total. A Figura 6 mostra que existe uma purificação nítida do Factor IX da HSA. A ligação do Factor IX à coluna YANKGY-TSK foi confirmada por análise de

Western blot: Observou-se uma banda muito ténue de Factor

IX no material inicial e não se observou nenhum Factor IX detectável em nenhuma das duas fracções de fluxo de -21 - passagem, mas observaram-se bandas escuras correspondentes ao Factor IX quer na lavagem de NaCl, quer no pico ácido.

Cromatoqrafia de Afinidade do Factor IX Derivado do Plasma A importância deste ligando peptidico derivado da biblioteca é a purificação do zimogénio do Factor IX humano a partir de plasma humano não purificado. Colocou-se em contacto uma injecção de 1,0 ml de plasma humano citrato com uma coluna de acetil-YANKGY-TSK no modo acima descrito. Recolheram-se os picos de fluxo de passagem e picos ácidos sobre gelo e testaram-se imediatamente em análises de proteínas totais, SDS-PAGE e Western blot. A Figura 7 mostra o cromatograma de purificação, SDS-PAGE e Western blot das fracções recolhidas. As amostras foram normalizadas em proteínas totais como anteriormente descrito. Existem muitas bandas de proteínas no material inicial, sendo a banda predominante a albumina. A banda do Factor IX não é visível em nenhuma fracção no gel corado com azul de Commassie. O Western blot não apresenta nenhum Factor IX no material inicial (está abaixo da sensibilidade do sistema de detecção) , nenhum Factor IX no pico de fluxo de passagem, apresentando contudo uma banda muito grande no pico ácido. Com uma passagem sobre a coluna de afinidade de YANKGY-TSK, e analisando as proteínas totais e por Western blot, a purificação aproximada foi 200 vezes maior do que a do plasma. Isto demonstra conclusivamente que esta sequência derivada de biblioteca liga e purifica o zimogénio de Factor IX a partir do plasma humano.

Outros Sistemas de Detecção para Este Ensaio HPLC -22-

Sistemas de Detecção não Colorimétricos Aqueles com experiência na arte poderão ainda verificar que a invenção pode ser facilmente alargada para utilizar diferentes reagentes que são funcionalmente equivalentes aos utilizados nos exemplos prévios. Os conjugados de anticorpos são o modo de realização preferido; no entanto, também podem ser utilizados conjugados directos de enzimas-alvo com esta técnica. É bem sabido na arte que a sequência peptídica HPQ ligará a estreptavidina. Se estivesse contida numa biblioteca peptídica, esta sequência poderia ser identificada através desta técnica cromatográfica de coloração de biblioteca de duas cores. Neste exemplo, a terceira injecção deveria conter algum tipo de molécula de marcação capaz de conferir uma cor à esfera (como uma molécula de fosfatase). A coluna seria extraída e o primeiro reagente de coloração (NBT/BCIP) seria aplicado às esferas. A coluna seria recolocada como descrito anteriormente, e a injecção-alvo seria estreptavidina conjugada com fosfatase. Com a adição subsequente do reagente de coloração diferencial (Fast Red) as esferas coradas com a segunda cor seriam específicas para o alvo de estreptavidina.

Além disso, o reagente de coloração não tem de ser uma enzima. Poder-se-ia utilizar qualquer tag que confira um sinal para diferenciar os ligandos que reagem com o sistema de detecção daqueles que reagem como alvo. Poder-se-iam, por exemplo, utilizar as moléculas fluorescentes que conferem diferentes cores com identificação através de triagem celular activada por fluorescência; poder-se-iam identificar tags de isótopos radioactivos (125I/131I ou 35S-Met/75Te-Met) em autorradiogramas ou por contagem de -23- cintilação; ou poder-se-iam identificar tags de isótopos radioactivos (por exemplo, 14N/15N) por RMN; ou fazer identificação de cor em modo misto em que as esferas que interaqem com os reaqentes de detecção são coradas como acima descrito e as esferas alvo-especificas são identificadas através de luminescência com 3— (4 — metoxiespiro(1,2-dioxetano-3,2'- (5'cloro)triciclo(3.3.1.13,7)decan)— 4 —il)fenilfosfato dissódico (CSPD, Tropix, Bedford, MA) ou qualquer outro reagente luminescente.

CONCLUSÃO

Concluindo, desenvolveu-se um método que pode identificar rapidamente sequências derivadas de bibliotecas combinatórias que são alvo-especificas. Esta análise cromatográfica de imunocoloração de duas cores de biblioteca peptidica tem sido utilizada para identificar sequências que se ligam ao zimogénio de Factor IX da cascata da coagulação. A técnica tem sido validada utilizando uma sequência peptidica que sabemos estar ligada à proteina de Ribonuclease S. Esta técnica tem sido adicionalmente ampliada para utilizar o ligando de péptido identificado para construir um meio de cromatografia de afinidade para a purificação da proteína-alvo.

Este método aplica-se a outros esquemas experimentais igualmente úteis. Ao utilizar uma estratégia de modificação de resina combinatória com esta análise cromatográfica de imunocoloração de duas cores de biblioteca de péptidos, podem ser identificadas modificações de substrato cromatográfico úteis para a separação de moléculas de -24- estrutura similar (por exemplo, isoformas de proteínas, ou as mesmas proteínas de diferentes fontes, como o inibidor da alfa-l-proteinase da ovelha do inibidor da alfa-1-proteinase humano transgénico expresso no leite de ovelha). Nestes exemplos, pode-se incluir uma isoforma da molécula-alvo na primeira metade do ensaio para originar a primeira cor. A isoforma diferente pode ser incluída na segunda metade do ensaio para originar a segunda cor. Desta maneira, seria identificada a especificidade para a segunda isoforma através das esferas coradas apenas pela segunda cor.

As interacções de ligação são farmacologicamente importantes, e portanto esta estratégia pode ser útil para identificar pistas na descoberta de fármacos. Pode-se, por exemplo, testar uma biblioteca de péptidos com receptores celulares solúveis, como a forma solúvel do receptor do factor de crescimento da epiderme ou a forma solúvel do receptor de eritropoietina, para identificar ligandos de péptidos com potencial importância farmacológica. É necessário um tamanho de poro grande da resina para proporcionar o acesso total ao péptido por parte destas grandes proteínas. 0 método também pode ser utilizado para identificar interacções de ligação entre outro tipo de moléculas (isto é, não peptídicas). Também descobrimos que este método é útil para uma avaliação rápida e uma optimização de ligandos derivados de bibliotecas de fagos de rastreio.

Os exemplos acima referidos servem para ilustrar a invenção e pensa-se que ocorrerão variações deles àqueles com experiência na arte. De acordo com isso, pretende-se que o -25- âmbito da invenção seja apenas limitado reivindicações abaixo. -25- pelas -1 -

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO A lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor, não sendo parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Literatura não relacionada com patentes citada na descrição • BAUMBACH, G.A.; HAMMOND, D.J. Biopharm., 1992, vol. 5, 24 [0035] • HUANG, P.Y.; CARBONELL, R.G. Biotechnol. and Engin.

[0035] • SCOTT, J.K.; SMITH, G.P. Science, 1990, vol. 249, 386 [0035] • DEVLIN, J.J. et al. Science, 1990, vol. 249, 404 [0035] • CWIRLA, S.E. et al. PNAS, 1990, vol. 87, 6378 [0035] • FOLGORI, A. et al. EMBO, 1994, vol. 13, 2236 [0035] • FURKA, A. et al. Int. J. Pept. Protein Res., 1991, vol. 37, 487-493 [0035] • ZALIPSKY, S. et al. Peptides: Structure and Function, Proceedings of the Ninth American Peptide Symposium. Pierce Chemical Co, 1985, 257 [0035] • BAYER, E.; RAPP, W. Chemistry of Peptides and Proteins. vol. 3 [0035] • LAM, K.S. et al. Nature, 1991, vol. 354, 82-84 [0035] • BOISSON-VIDAL, C. et al. Biomedical Materials Res., 1991, vol. 25, 67-84 [0035] • MELDAL, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, vol. 91, 3314-3318 [0035] -2- • VAGNER, J. et al. Innovative Perspectives in Solid Phase Synthesis [0035] • KATO, Y. et al. J. Chromatography, 1986, vol. 354, 511-517 [0035] • MERRIFIELD, R.B. Fed. Proc., 1962, vol. 21, 412 [0035] • GAUSEPOHL, H. et al. Peptide Research, 1992, vol. 5, 315-320 [0035] • ATHERTON, E. et al. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1978, 539-540 [0035] • FIELDS, G.B. et al. Int. J. Pept. Prot. Res., 1990, vol. 35, 161 [0035] • ALBERICIO, F. et al. J. Org. Chem., 1990, vol. 55, 3730-3743 [0035] • SPACKMAN, D.H. et al. Anal. Chem., 1958, vol. 30, 1190 [0035] • BESSOS, H. et al. Thrombos. Res., 1985, vol. 40, 863 [0035] • DAVIS, E.M. Am. Biotech. Lab., 28 July 1988 [0035] • LAEMMLI, U.K. Nature, 1970, vol. 277, 680 [0035] • BOWEN, P. et al. Nuc. Acids Res., 1980, vol. 81 [0035] • SMITH, G.P. et al. Gene, 1993, vol. 128, 37-42 [0035] • LAM, K.S. et al. J. Immunol. Meth., 1995, vol. 180, 219-223 [0035] -3-

REFERÊNCIAS 1. Baumbach, G.A., Hammond, D.J., Biopharm. 5 24 (1992). 2. Huang, P.Y., Carbonell, R.G., Biotechnol. and Engin., no prelo. 3. Scott, J.K., Smith, G.P., Science 249 386 (1990). 4. Devlin, J.J., et al., Science 249 404 (1990). 5. Cwirla, S.E., et al., PNAS 87 6378 (1990). 6. Folgori, A., et al., EMBO 13 2236 (1994). 7. Furka, A. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 37 487-493 (1991) . 8. Zalipsky, S., et al., Peptides: Structure and Function, Proceedings of the Ninth American Peptide Symposium (Deber, C.M., Hruby, V.J., & Kopple, K.D. eds.), p. 257. Pierce

Chemical Co., Rockford, IL (1985). 9. Bayer, E., Rapp, VS., Chemistry of Peptides and Proteins 3 (Ovchinnokov, Y.A., Ivanov, V.T., eds.). 10. Lam, K.S., et al., Nature 354 82-84 (1991). 11. Boisson-_Vidal, C., et al., Biomedical Materials Res., 25 67-84 (1991). 12. Meldal, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 3314-3318 (1994). 13. Vagner, J., et al., Innovative Perspectives in Solid Phase Synthesis (Epton, R., ed.), no prelo 14. Kato, Y., et al., J. Chromatography 354 511-517 (1986). 15. Merrifield, R.B., Fed. Proc. 21 412 (1962). 16. Gausepohl, H., et al., Peptide Research 5 315-320 (1992) . 17. Atherton, E., et al., J. Chem. Soc. Chem. ComCommun. 539-540 (1978). 18. Fields, G.B., et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 35 161 (1990). -4- 19. Albericio, F., et al., J. Org. . Chem . 55 3730-3743 (1990). 20. Spackman, D.H., et al., Anal. Chem. 30 1190 (1958). 21. Bessos, H., et al., Thrombos. Res. 40 863 (1985). 22. Davis, E.M., Am. Biotech. Lab. ., July 28 (1988). 23. Laemmli, U.K., Nature 277 680 (1970 ) · 24. Bowen, P., et al,, Nuc. Acids Res. 81 (1980) . 25. Smith, G.P., et al., Gene 128 37-42 (1993). 26. Lam, K.S. et al., J. Immunol. Meth. 180 219-223 (1995

Lisboa, 07.09.2007

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método de seleccionar um ligando que se ligará a uma substância-alvo, em que o ligando vem de uma biblioteca aleatória de ligandos em que os ligandos são imobilizados em materiais de suporte individuais e em que a ligação é detectada por meio de um sistema de detecção que tem componentes, compreendendo o método: (1) incubar os ligandos aleatórios imobilizados com os componentes do sistema de detecção para gerar um primeiro sinal, detectando assim apenas os ligandos que se ligam a um componente do sistema de detecção e não detectando os ligandos que se ligam à substância-alvo e não se ligam aos componentes do sistema de detecção; e (2) adicionar depois uma substância-alvo aos ligandos aleatórios imobilizados e aos componentes do sistema de detecção, de tal modo que o sistema de detecção gera um segundo sinal, que é diferente do primeiro sinal, permitindo assim a detecção de um ligando que se liga à substância-alvo contra o fundo dos ligandos identificados no primeiro sinal que se ligam aos componentes do sistema de detecção. 2. 0 método da reivindicação 1 em que o sistema de detecção compreende um marcador conjugado a uma enzima. 3. 0 método da reivindicação 1 em que o sistema de detecção compreende um marcador com um radioisótopo. -2- 4. 0 método da reivindicação 1 em que o sistema de detecção compreende um marcador fluorescente. 5. 0 método da reivindicação 2, 3 ou 4 em que o marcador é um anticorpo. 6. 0 método da reivindicação 1 em que o sistema de detecção é um sistema de detecção gerador de cor. 7. 0 método da reivindicação 1 em que o primeiro sinal é uma primeira cor e o segundo sinal é uma cor diferente da referida primeira cor. 8. 0 método da reivindicação 1 em que o ligando é um péptido e a substância-alvo é uma proteína. 9. 0 método da reivindicação 8 em que a proteína é seleccionada de entre o grupo que consiste em proteínas plasmáticas e proteínas expressas a partir de um hibridoma ou célula geneticamente alterada. 10. 0 método da reivindicação 9 em que o péptido compreende cerca de 3 a 10 resíduos de aminoácidos. 11. 0 método da reivindicação 9 em que a proteína é o Factor IX. 12. 0 método da reivindicação 1 em que o material de suporte é uma resina.
2. 13. O método da reivindicação 12 em que o material de suporte é hidrófilo. -3- 14. 0 método da reivindicação 13 em que o material de suporte é poroso. 15. 0 método da reivindicação 14 em que o tamanho médio do poro do material de suporte poroso está entre cerca de 800 e cerca de 1200 angstroms.
3. 16. O método da reivindicação 1 em que os passos ocorrem numa coluna de HPLC.
4. 17. O método da reivindicação 16 em que a pressão da coluna de HPLC é cerca de 0 psi até 4000 psi. 18. 0 método da reivindicação 1 em que o ligando é um péptido, a substância-alvo é uma proteína alvo específica, os materiais de suporte individuais são esferas de suporte cromatográfico individual e os componentes do sistema de detecção compreendem um primeiro e um segundo anticorpo, compreendendo o método: (a) imobilizar péptidos aleatórios em esferas de suporte cromatográfico individuais para criar uma população de esferas de suporte, tendo cada esfera de suporte ligados à sua superfície péptidos substancialmente idênticos entre si; (b) pôr em contacto as esferas de suporte do passo (a) com o primeiro anticorpo, sendo que o primeiro anticorpo é capaz de se ligar especificamente à proteína-alvo sob condições que permitem quer ligação específica quer não específica à proteína-alvo, sendo o primeiro anticorpo igualmente capaz de se ligar especificamente e não -4- especificamente quer às esferas de suporte quer aos péptidos nas esferas de suporte; (c) pôr em contacto as esferas de suporte do passo (b) com o segundo anticorpo, sendo que o segundo anticorpo é capaz de se ligar especificamente ao primeiro anticorpo e tem conjugado a ele uma enzima capaz de reagir com um primeiro e um segundo substrato, em que o primeiro e o segundo substrato são diferentes e produzem duas alterações de cor diferente, sob condições suficientes para ligar o segundo anticorpo ao primeiro anticorpo, sendo o dito segundo anticorpo igualmente capaz de se ligar especificamente e não especificamente quer às esferas de suporte quer aos péptidos nas esferas de suporte; (d) adicionar o primeiro substrato às esferas de suporte do passo (c) , sob condições suficientes para causar o primeiro sinal, que é uma primeira alteração de cor em esferas de suporte individuais que têm a elas ligado o segundo anticorpo; (e) adicionar a proteina-alvo às esferas de suporte do passo (d) sob condições suficientes para permitir a ligação especifica da proteína alvo a pelo menos um dos péptidos ligados às esferas de suporte; (f) pôr em contacto as esferas de suporte do passo (e) com o primeiro anticorpo sob condições suficientes para ligar o primeiro anticorpo especificamente à proteína-alvo; (g) adicionar o segundo anticorpo, que tem a enzima conjugada a si, às esferas de suporte do passo (f) , sob condições suficientes para ligar o segundo anticorpo especificamente ao primeiro anticorpo ligado à proteína-alvo, ligada aos péptidos ligados às esferas de suporte; -5- (h) adicionar o segundo substrato às esferas de suporte do passo (g) sob condições suficientes para causar o segundo sinal, que é uma segunda e diferente alteração de cor, que distingue as esferas de suporte que tem a si ligadas os péptidos que se ligam à proteina-alvo; (i) separar as esferas de suporte que têm o péptido que se liga à proteina-alvo com base na alteração de cor causada pelo passo anterior; e (j) sequenciar o péptido no suporte separado no passo (i) . 19. 0 método da reivindicação 18 em que há três passos de lavagem entre os passos (a) e (b) , (b) e (c) , (c) e (d) , (e) e (f) , (f) e (g) , e (g) e (h) .
5. 20. O método da reivindicação 18 em que as esferas de suporte cromatográfico individuais compreendem esferas de resina hidrófila porosas que têm um tamanho de poro médio entre cerca de 800 e cerca de 1200 angstrõms.
6. 21. O método da reivindicação 18 em que os péptidos têm um tamanho entre cerca de 3 e 10 resíduos de aminoácidos.
7. 22. O método da reivindicação 18 em que as esferas de suporte estão contidas dentro de uma coluna.
8. 23. O método da reivindicação 22 em que a coluna está ligada a um aparelho de cromatografia automatizado. Lisboa, 07.09.2007