ES2289746T3 - Deteccion de bibliotecas combinatorias de peptidos para seleccion de un ligando peptidico util en purificacion por afinidad de proteinas diana. - Google Patents

Abstract

LIGANDOS QUE INTERACTUAN CON UN OBJETIVO PUEDEN SER MAS FACILMENTE IDENTIFICADOS SI LAS INTERACCIONES POSITIVAS FALSAS (BIEN ESPECIFICAS O NO) DEL SISTEMA DETECTOR SE DIFERENCIAN DE LA INTERACCION DIANA-ESPECIFICA. SE PRESENTA UN METODO MEJORADO DE IDENTIFICACION DE PEPTIDOS QUE SE FIJAN A UNA PROTEINA DIANA. LOS PASOS SON: UNIR UNA BIBLIOTECA DE PEPTIDOS JUNTO CON UN MATERIAL DE SOPORTE, PERMITIENDO QUE REAGENTES DE DETECCION ENTREN EN CONTACTO CON LOS PEPTIDOS Y CON EL MATERIAL DE SOPORTE, IDENTIFICANDO ENTONCES ESTAS INTERACCIONES Y PERMITIENDO QUE LA PROTEINA DIANA SE FIJE SELECTIVAMENTE A LOS PEPTIDOS, PERMITIENDO QUE LOS REAGENTES DE DETECCION ENTREN EN CONTACTO CON LA PROTEINA DIANA AGLOMERADA, Y CARACTERIZANDO EL PEPTIDO FIJADO AL MATERIAL DE SOPORTE IDENTIFICADO. LA INTERACCION DE UN LIGANDO O DEL MATERIAL DE SOPORTE CON LOS REAGENTES DE DETECCION PROVOCARA UN CAMBIO DE COLOR DISTINTIVO QUE DISTINGUE A AQUELLOS LIGANDOS QUE SE FIJAN SELECTIVAMENTE A LA PROTEINA DIANA. EL PEPTIDO CARACTERIZADO PUEDE ENTONCES UTILIZARSE EN LA PURIFICACION DE AFINIDAD DE LA PROTEINA DIANA. EN UNA ADAPTACION, LA AUTOMATIZACION DEL ENSAYO SE DEMUESTRA MEDIANTE EL FLUJO DE TODOS LOS REAGENTES INMUNOLOGICOS A TRAVES DE BOLITAS EN UN FORMATO DE COLUMNA QUE ASEGURA UN LAVADO ALTAMENTE EFICAZ. EN UNA ADAPTACION PREFERIDA, UNA RESINA PARA LA SINTESIS PEPTIDA QUE ES HIDROFILICA CONTIENE ESPACIADORES Y PUEDE EXHIBIR UN FONDO NO ESPECIFICO MENOR QUE OTRAS RESINAS QUE PERMITE LA SINTESIS Y DIRIGEN LA EVALUACION DE LOS BIBLIOTECAS DE PEPTIDOS COMBINATORIOS PARA LA FIJACION A PROTEINAS DIANA UTILIZADAS. TAMBIEN SE PRESENTAN EJEMPLOS PARA EL USO DE ESTA NUEVA RESINA Y LA METODOLOGIA PARA IDENTIFICAR LIGANDOS PEPTIDOS PARA LA IDENTIFICACION DE PROTEINAS.

Description

Detección de bibliotecas combinatorias de péptidos para selección de un ligando peptídico útil en purificación por afinidad de proteínas diana.

Antecedentes

Las columnas de afinidad para péptidos ofrecen ventajas sustanciales sobre las técnicas cromatográficas existentes para la purificación de proteínas (1). La potencia de esta metodología de purificación, basada en secuencias de unión conocidas, ha hecho hincapié en la bibliografía (2), aunque una de las limitaciones principales ha sido la falta de secuencias conocidas que puedan actuar como ligandos (1). El reciente desarrollo de bibliotecas aleatorias de péptidos (denominadas también bibliotecas combinatorias, de mimótope o epítope) que contienen una amplia serie de combinaciones de aminoácidos para péptidos de una longitud definida ha permitido un procedimiento racional para caracterizar las interacciones proteína-péptido (3-13).

Siguiendo el procedimiento propuesto por primera vez por Scott y Smith (3), una biblioteca de hexámeros (6 restos aminoacídicos) puede producirse escindiendo químicamente oligonucleótidos sintetizados de secuencias aleatorias (de codones de 18 nucleótidos diferentes) en la región de codificación de una proteína de recubrimiento de bacteriófago. Más de 10^{7} de los 10^{14} posibles codones de nucleótido único pueden representarse con la tecnología actual de exposición de fagos (3-6). Los fagos se replican en células huésped de Escherichia coli, se recuperan, y después se incuban directamente con la proteína diana inmovilizada en la superficie de una placa de cultivo (3). Los fagos que contienen una secuencia peptídica que interacciona específicamente con la proteína diana son inmovilizados por la proteína diana mientras que los fagos que no se unen específicamente a la proteína diana se pierden en el lavado posterior. Los fagos unidos se recuperan y procesan de manera que puede identificarse el péptido que se une específicamente a la proteína diana.

Sin embargo, los procedimientos para detectar bibliotecas combinatorias de ligandos para purificación por afinidad tienen limitaciones fundamentales: 1) los fagos que exponen péptidos que se unen a la proteína diana deben aislarse por bioselección; 2) el ADN de los fagos de unión debe secuenciarse; 3) antes de que pueda evaluarse la unión o purificación con los péptidos, los péptidos deben sintetizarse y purificarse, y después debe realizarse el acoplamiento químico de los ligandos sobre un soporte cromatográfico; y 4) el micro-entorno de la secuencia peptídica presentado sobre la superficie del soporte cromatográfico puede ser muy diferente del presentado por los fagos, lo que puede afectar radicalmente a la capacidad del péptido para unirse a su diana. Estas limitaciones han hecho laborioso el uso de bibliotecas combinatorias como fuente de ligandos peptídicos e incierta la identificación de péptidos específicos para la proteína diana.

En la síntesis mixta, de división y acoplamiento demostrada por primera vez por Furka (7), millones de secuencias peptídicas únicas se generan sobre perlas resinosas basadas en poliestireno. Las mejoras posteriores a la técnica han permitido identificar secuencias reactivas (10). Sin embargo, la identificación de secuencias específicas para la diana mediante estos ensayos de unión se ha puesto en peligro por una alta tinción del fondo debido a un lavado ineficaz del lote y la incapacidad inherente para diferenciar entre secuencias en las perlas que interaccionan con los reactivos de detección de aquellas que interaccionan específicamente con la proteína diana.

Lam (26) muestra un procedimiento en el que la sustancia diana se añade a los ligandos en la primera etapa junto con un sistema de detección. Las perlas que se unen se separan de la población total, los componentes del primer sistema de detección y la diana se retiran de las perlas y después se ensayan frente a la misma sustancia diana con un segundo sistema de detección. Law (26) muestra una comparación de los ligandos identificados con dos sistemas de detección diferentes para la misma sustancia diana para identificar únicamente aquellos ligandos que se unen en ambos sistemas.

Para superar las dificultades para distinguir cuál es el único péptido (perla) interaccionando específicamente con la proteína diana y cuál es el péptido (perla) que está reaccionando con los reactivos de detección, se han sintetizado péptidos sobre una resina cromatográfica hidrófila y se ha elaborado un procedimiento de tinción en dos etapas que tiñe las perlas que reaccionan con los reactivos de detección de un color y aquellas específicas para la proteína diana de otro. Típicamente esto se realiza con conjugados anticuerpo-enzima como reactivos de detección, aunque pueden usarse otros reactivos. Para crear las condiciones de lavado más eficaces posibles, se realizaron todos los ensayos en columnas de cromatografía líquida de alta presión (HPLC), aprovechando las características de flujo a través de la resina. Cada reactivo se pone en contacto con las perlas como una inyección HPLC diferente con un programa de lavado que retira la unión no específica mediante un gradiente salino. De esta manera, se realiza la automatización del ensayo y se eliminan las variaciones de un ensayo a otro comunes con los ensayos discontinuos.

Además de las dificultades para identificar los péptidos que se unen específicamente a la proteína diana, el uso de medios cromatográficos que pueden proporcionar el soporte para la síntesis de los péptidos y HPLC está limitado. La mayoría de soportes para la síntesis de péptidos son resinas basadas en poliestireno que no son apropiadas para usar con ensayos biológicos. Se sabe bien en la bibliografía que las resinas basadas en poliestireno presentan interacciones tanto específicas como no específicas con diversas proteínas del plasma (11). Para disminuir la unión no específica a los reactivos de detección, se han usado resinas peptídicas hidrófilas en la síntesis y detección de péptidos (12, 13). Diversas resinas para la síntesis de péptidos basadas en poliestireno se han hecho hidrófilas (8, 9); éstas, sin embargo, están diseñadas para síntesis química y no para ensayos biológicos directos (13), ni como soportes cromatográficos a gran escala.

Meldal, et al. han demostrado el uso de una resina polimérica de acrilamida disponible en el mercado modificada para la generación de bibliotecas de péptidos (12). Aunque son apropiadas para la síntesis de péptidos y bibliotecas de sondeo, las resinas de acrilamida no tienen la rigidez química necesaria para la cromatografía de alto rendimiento a gran escala.

Para superar los problemas asociados con las resinas hidrófobas, se ha desarrollado una nueva resina modificada que puede usarse para la síntesis, detección, evaluación de péptidos, y posiblemente tenga un uso cromatográfico final. La resina que forma la base de esta invención es un polímero de metacrilato polihidroxilado disponible en el mercado en Toso-Haas (14). Las características distintivas de esta resina son la naturaleza hidrófila inherente del polímero, el gran tamaño de poro (nominalmente 1000 ángstrom), rigidez mecánica y química, y los intervalos graduados de diámetros de perla para aplicaciones directas en separaciones cromatográficas. Esta resina, después de una modificación sencilla para generar un grupo amino libre para la síntesis de péptidos, muestra buena resistencia química respecto a la síntesis clásica de péptidos reactivos.

Esta resina y el ensayo de tinción de dos-colores han permitido identificar secuencias peptídicas que se unen a proteínas diana que, en contraste con la técnica anterior, se seleccionan para que sean específicas únicamente para la proteína diana y no para los reactivos. Las perlas que se unen a los reactivos de detección se excluyen mediante este procedimiento.

Sumario de la invención

La invención es un procedimiento para determinar qué péptido en una biblioteca combinatoria de péptidos se une específicamente con una proteína diana como se define en la reivindicación 1. La biblioteca de péptidos se une a soportes cromatográficos y después se incuba con los reactivos de detección, dando como resultado un cambio detectable (por ejemplo, un cambio de color) del soporte donde los péptidos o el soporte se unen con los reactivos de detección. La proteína diana se añade después a los soportes en condiciones que conducen a la proteína diana a unirse de una manera específica a un péptido sobre el soporte. Los reactivos de detección se añaden de nuevo, dando como resultado esta vez un cambio diferente (por ejemplo, un color diferente) capaz de distinguir la proteína diana unida específicamente al péptido del primer cambio anterior. En la realización preferida los reactivos de detección son anticuerpos y sus conjugados enzimáticos, y el procedimiento se realiza usando un aparato de HPLC, que sirve como un medio eficaz para añadir reactivos y lavar los reactivos no reaccionados del sistema. El péptido identificado puede fabricarse entonces y unirse a un soporte cromatográfico para usarlo en la purificación por afinidad de la proteína diana. El soporte preferido es hidrófilo y altamente poroso, teniendo un tamaño medio de poro preferido de aproximadamente 800 a aproximadamente 1200 ángstrom, preferiblemente aproximadamente 1.000 ángstrom. Aunque un sistema de detección marcado preferido incluye una marca conjugada con enzima (etiqueta) que, dependiendo del sustrato elegido, permitirá la generación de cambios de color observables, pueden usarse otras marcas o etiquetas o combinaciones (por ejemplo, anticuerpos radio-marcados o con marcado fluorescente).

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Esquema de un procedimiento de inmunotinción con dos colores.

A: Población inicial de perlas que tienen polipéptidos (X_{1-6}) unidos a las mismas. Los polipéptidos en cada perla individual tienen sustancialmente la misma secuencia. La columna se equilibra por lavado con tampones.

B: Añadir el primer anticuerpo (Ab^{TP}) e incubar, después enjuagar. El enjuagado retira el Ab^{TP} ligeramente unido; lo que queda es Ab^{TP} unido no específicamente y específicamente sobre las perlas. N.B. Ab^{TP} es un anticuerpo que se une específicamente a la proteína diana.

C: Añadir el segundo anticuerpo que está conjugado a la enzima (Ab*Enz). Incubar, y después enjuagar. Lo que queda es Ab*Enz unido fuertemente y específicamente al Ab^{TP} unido y también unido no específicamente y específicamente a las perlas. N.B. Ab*Enz se une específicamente a Ab^{TP}.

D: Añadir el sustrato de colorante azul para la enzima que tiñe las perlas unidas a la enzima de color azul. Incubar, después enjuagar el exceso de colorante azul.

E: Añadir la proteína diana (TP}). Incubar, y después enjuagar. La proteína diana se une específicamente a numerosos polipéptidos entre la población de perlas.

F: Añadir Ab^{TP} e incubar, después enjuagar. El Ab^{TP} se une específicamente a TP}.

G: Añadir Ab*Enz. Incubar, después enjuagar. Ab*Enz se une específicamente a Ab^{TP}.

\newpage

H: Añadir sustrato de colorante rojo para la enzima que tiñe la perlas unidas a la enzima de color rojo. N.B. Cualquier actividad enzimática restante de las perlas del primer color dará como resultado aquellas perlas que se vuelven moradas o marrones.

I: Aislar las perlas rojas visualmente y someter las perlas individuales a análisis de la secuencia peptídica.

Figura 2: Cromatograma de la técnica de inmunoensayo para proteína Ribonucleasa S (RNasa S) inyectada en la resina YNFEVL-TSK diluida (1:20 p/p) con TSK-Blank. La línea superior (A) es la absorbancia a 280 nm; la línea media (B) es el caudal, y la línea inferior (C) indica las condiciones del gradiente.

Figura 3: La validación del ensayo de afinidad por HPLC mediante proteína RNasa S y resina peptídica (YNFEVL-TSK). La figura superior muestra el perfil de absorbancia a 289 nm para Albúmina de Suero Humana (HSA) (A) y proteína RNasa S en HSA (B). La figura inferior es el trazado de la presión a partir del cromatograma B.

Figura 4A: Cromatogramas de la unión del Factor IX a YANKGY-TSK. El trazo inferior (A) es un blanco con tampón. El trazo medio (B) es la proteína de soporte (1,0 ml de HAS al 0,5%). El trazo superior muestra que 55 \mug de Factor IX inyectados en la columna se liberan durante el lavado con ácido.

Figura 4B: Esta figura muestra el pico del Factor IX a partir del cromatograma en la Figura 4A a una escala aumentada.

Figura 5: Cromatogramas de diversas cantidades de Factor IX inyectado en YANKGY-TSK. El trazo inferior (A) es 55 \mug de Factor IX sin HSA. El trazo B es 110 \mug de Factor IX y C es 220 \mug de Factor IX, ambos sin HSA. El trazo D es 220 \mug de Factor IX calentado a 95ºC durante 5 min antes de la inyección. El trazo superior (E) es 220 \mug de Factor IX en HSA.

Figura 6: SDS-PAGE (Figura 6A) y transferencia Western (Figura 6B) de mezclas de Factor IX y HSA. Los carriles 1 y 9 son patrones de peso molecular. El carril 2 es Factor IX (Enzyme Research Labs; South Bend, IN). El carril 3 es un patrón de HSA (Miles Inc.). El carril 4 es el material de partida que se inyectó en la columna de afinidad YANKGY-TSK (1,0 ml, 220 \mug de Factor IX en HSA). El carril 5 es el primer pico de flujo a través. El carril 6 es el segundo pico de flujo a través. El carril 7 es el lavado con NaCl. El carril 8 es el pico eluido con ácido. Aproximadamente 10 \mug de la proteína total se cargaron en cada carril.

Figura 7: Cromatograma (Figura 7A), SDS-PAGE (Figura 7B) y transferencia Western (Figura 7C) de 1,0 ml de plasma humano citrado en la resina Acetil-YANKGY-TSK. Se cargaron aproximadamente 10 \mug en cada carril y el gel electrotransferido se cargó con la misma cantidad de muestra que el gel teñido con Coomassie. Los carriles 1, 5, 7, 9, y 11 estaban en blanco. Carril 2: 1,0 \mug de Factor IX; Carril 12: 0,0625 \mug de Factor IX. Carriles 3 y 13: patrones de peso molecular. Carriles 4 y 15: plasma humano. Carril 6: flujo a través (t = 0 a 12 min); Carril 8: flujo a través (t = 12 a 15 min). Carril 10: el eluido con ácido. Carril 14: un intermedio del Factor IX parcialmente purificado. La transferencia Western abajo a la izquierda no muestra Factor IX en el material de partida o flujos a través. Una fuerte banda inmuno-detectada correspondiente al zimógeno del Factor IX está en el eluido con ácido.

Realizaciones específicas y preferidas Materiales y Procedimientos

Química de la Resina Para la síntesis de péptidos, una resina cromatográfica de tipo metacrilato polihidroxilado, preferiblemente el quelato Toyopearl 650M (tamaño de partícula 65 \mum, tamaño de poro 1000 \ring{A}; TosoHaas, Montgomeryville, PA) se enjuagó en un recipiente de reacción de 25 g con agua, metanol y dimetilformamida (DMF). Un exceso molar de cinco veces de etilendiamina sobre resina carboxilato se acopló sobre el resto carboxilato con un ligero exceso molar de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBOP, Novabiochem La Jolla, CA) y N-metilpirrolidinona (NMM, exceso molar de tres veces sobre PyBOP; Aldrich Chemical Co.; Milwaukee, WI) en DMF durante 60 minutos. La resina aminada se lavó con DMF, después con metanol, después se secó al vacío.

Para generar una resina no escindible, dos acoplamientos de síntesis de péptidos en fase sólida convencional siguieron para introducir dos moléculas de \beta-alanina (Novabiochem) como restos espaciadores (denominados TSK-Blank). Para generar una resina escindible para péptidos solubles un exceso molar de dos veces (sobre la amina en las perlas) de ácido p-[(R,S)-\alpha-[1-(9H-fluoren-9-il)-metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]-fenoxiacético (Novabiochem) se activó con un ligero exceso molar de PyBOP y NMM, después se añadió a la resina TSK-Blank aminada. Se permitió que transcurriera el acoplamiento durante 4 horas, con lavados posteriores con DMF y metanol. Pueden usarse otras químicas de unión, que son ampliamente conocidas por los especialistas en la técnica, y son compatibles con los restos funcional disponibles en diferentes resinas de metacrilato polihidroxilado. Una resina de amida Rink disponible en el mercado se usó para comparación.

Química de la Biblioteca Combinatoria de Péptidos Las bibliotecas combinatorias de péptidos se generaron de una manera similar a la de Furka (7). Un bloque de síntesis a gran escala en el sintetizador de múltiples péptidos se usó para realizar cada acoplamiento de una manera semi-automatizada. Medio gramo de resina TSK-Blank aminada seca se añadió a cada uno de los 18 recipientes de reacción y 18 de los 20 L-aminoácidos de origen natural (en esta realización se omitieron cisteína y metionina; sin embargo, esto no es un requisito para la utilización de esta invención) se acoplaron mediante química FMOC convencional (véase a continuación). La resina de cada recipiente se combinó y se lavó en DMF con agitación con argón. La resina se redistribuyó equitativamente en los 18 recipientes de reacción y el siguiente aminoácido se acopló como el primero. Esto se repitió hasta que se hubo completado la biblioteca de hexámeros (dos días de trabajo). La resina se combinó, se lavó con metanol, se secó al vacío, después se desbloqueó con Reactivo R (18) (ácido trifluoroacético al 90% (TFA), tioanisol al 5%, etanoditiol al 3%, anisol al 2%; todos de Aldrich) durante 3 horas con agitación con argón. La resina se lavó con 20 volúmenes de columna de metanol, después se secó al vacío.

Síntesis Discontinua de Péptidos Las secuencias se sintetizaron por el procedimiento en fase sólida (15) en un Sintetizador de Múltiples Péptidos Gilson AMS422 (16) con FMOC como \alpha-amino protección (16, 17). Dependiendo de si los péptidos se escindirían o no de las perlas para análisis, se usaron la resina TSK-Blank aminada escindible, o la resina TSK Blank no escindible, o la resina Rink (para comparación) como el soporte de la síntesis. Los acoplamientos sencillos de aminoácidos a gran escala (exceso molar de 5 veces; 1 ml de 0,5 M en DMF) se activaron in situ con PyBOP (0,5 ml de 0,3 M en DMF) y NMM (0,25 ml de 1,19 M en DMF) con nuestra resina TosoHaas modificada (0,3 g, 200 \mumol) o resina de amida Rink (0,5 g, 200 \mumol). Se permitió que transcurriera el acoplamiento con agitación burbujeando argón durante 45 minutos. Todos los péptidos se escindieron y/o bloquearon con el Reactivo R durante 3,5 horas.

Para análisis por cromatografía de afinidad, los péptidos no escindibles de la resina TSK se desprotegieron (como se realiza de forma general en la técnica) en el recipiente de síntesis, se lavaron extensivamente con metanol y se secaron al vacío. Para el análisis de péptidos, las resinas peptídicas TSK escindible y Rink se escindieron y desprotegieron en viales de centelleo de 20 ml. Estas mezclas peptídicas se filtraron de la resina directamente en 40 ml de éter dietílico anhídrido frío (Aldrich) mediante un embudo de vidrio sinterizado de porosidad media. Las tortas de filtrado de los péptidos se disolvieron en acetonitrilo al 50%/agua y se liofilizaron en un vial de centelleo tarado. Estos péptidos precipitados, no purificados se disolvieron a 25-50 mg/ml en acetonitrilo al 50%/agua y 1 ml se purificó por HPLC preparativa (Gilson, Inc.) con una columna de fase inversa de 22 mm X 250 mm (C18 15u 300\ring{A}) (Vydac; Hesperia, CA). Para determinar la pureza, los péptidos en bruto se disolvieron a 10 mg/ml en acetonitrilo al 50%/agua y los péptidos purificados se disolvieron a 10 mg/ml en acetonitrilo al 20%/agua. Se analizaron alícuotas de 10 \mul por HPLC en microbore (Analizador de Microproteínas Ultrarrápido, Michrom BioResources, Inc.; Sacramento, CA) con una columna de fase inversa de 2,1 mm x 150 mm C18 5u 300\ring{A} y un gradiente del 2 al 60% de acetonitrilo en agua durante 12 minutos.

Análisis El análisis de aminoácidos se realizó como se describe en Spackman (20) con un Analizador de Aminoácidos 6300 (Beckman Instruments, Inc.; Fullerton, CA) usando detección con ninhidrina. Las determinaciones de la masa del péptido se realizaron por ionización por bombardeo con átomo rápidos de ión positivo (FAB) en un espectrómetro de masas JEOL HX-110 de doble enfoque. Los péptidos se aplicaron puntualmente en acetonitrilo al 50%/agua sobre una matriz de tioglicerol. El intervalo de masa explorado depende de la masa esperada del péptido. La secuenciación del péptido se realizó por química de Edman usando un Secuenciador de Proteína/Péptido ABI 477A (Applied Biosystems; Foster City, CA) interconectado con un Analizador de HPLC 120A (C18 PTH, cromatografía en fase inversa) para determinar los aminoácidos de feniltiohidantoína (PTH). Se realizaron ELISA intercalados como se describe en Bessos (21). Las muestras de proteína se cuantificaron mediante el ensayo Biuret (22), después se analizaron por técnicas SDS-PAGE (23) y transferencia Western (24).

Inmuno-ensayos por HPLC de Bibliotecas Para diferenciar entre perlas de resina peptídica que se unen al reactivo de detección y que se unen a la diana, se ha desarrollado una técnica de tinción cromatográfica de péptidos con dos colores. La Figura 1 es un esquema de la realización preferida de la técnica. Todos los ensayos se realizaron en un Analizador de Microproteínas Ultrarrápido en una columna de acero inoxidable de 2,1 mm D.I. X 150 mm de longitud (volumen = 520 \mul) a 37ºC. La biblioteca de resina seca se introdujo en la columna al vacío, después la columna se unió a la célula detectora de flujo y se lavó con 20 volúmenes de columna de metanol al 20%/agua, 5 volúmenes de columna de 100% de Tampón A (HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, 20 mg/ml de D-manitol; todos de Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO), después 5 volúmenes de columna de Tampón B al 50% (Tampón A con NaCl 1,0 M) para limpiar la resina. El ensayo completo estaba compuesto por siete programas de inyección cromatográfica unidos secuencialmente y ejecutados como un lote (EXChrom Chromatography Data System, Scientific Software, Inc.; San Ramon, CA). Cada programa de inyección tenía una duración de 90 min. Al comienzo de cada programa de inyección, una muestra de 1,0 ml de bucle de reactivo se inyectó a 200 \mul/min durante 3,5 min, después se dejó perfundir en la columna a 5 \mul/min durante 50 min antes de que el flujo aumentara a 400 \mul/min para la duración del ensayo. A los 60-75 min, un gradiente salino de NaCl 0,1 M a 1,0 M eluyó las proteínas de unión no específica. Este tampón de alto contenido salino se usó para lavar la columna durante 15 min, después la columna se volvió a equilibrar a las condiciones originales.

Para cada lote de ensayo hubo 7 inyecciones: 1) Tampón A como blanco; 2) Albúmina de Suero Humana al 0,5% (HSA; Miles, Inc., Clayton, NC) sin proteína diana (Figura 1A); 3) primer anticuerpo diluido 1:1000 (Figura 1B); 4) conjugado del segundo anticuerpo diluido 1:1000 con fosfatasa alcalina (Figura 1C). Cada inmunoreactivo se diluyó en HSA al 0,5% en Tampón A. Después del cuarto programa de inyección, el trabajo discontinuo se detuvo para el primer procedimiento de tinción. En este ejemplo particular, se detuvo el flujo de tampón, la columna se desconectó y la resina se extrajo con 100% de Tampón A a 300 \mul/min. 15 fracciones (2 gotas por fracción) se recogieron en una placa de microtitulación de 24 pocillos (Corning/Costar).

Se añadió BCIP/NBT y la tinción se realizó en el pocillo. La observación visual del procedimiento de tinción permitió tiempos de tinción óptimos. Como alternativa, la tinción puede realizarse en la columna, haciendo que todo el procedimiento está totalmente automatizado (Figura 1D). Las fracciones de resina teñidas se cargaron en tubos de reacción de 3 ml, se lavaron extensivamente con agua, se secaron al vacío, después se volvieron a insertar secas en la columna en el mismo orden que se fraccionó la resina. La resina TSK-Blank se usó para rellenar la salida de la columna para sustituir cualquier resina perdida. Después de re-equilibrar la columna, la proteína diana (cantidad de muestra de 2,4 pmol en Tampón A con HSA al 0,5%) se inyectó (programa de inyección número 5) (Figura 1E). Los siguientes dos programas de inyección, 6 y 7, eran iguales que los programas número 3 y 4 (Figura 1F y 1G). Una vez completados estos programas, las perlas de resina se fraccionaron como en el caso anterior, después se tiñeron con Rojo Rápido en los pocillos de la placa de microtitulación y se inspeccionaron visualmente.

Purificación por Afinidad de Proteínas Diana La purificación por afinidad de proteínas diana se usó para evaluar la capacidad para purificar proteínas con las secuencias peptídicas identificadas como específicas. Las secuencias individuales derivadas de la biblioteca que se descubrió que se unían a proteínas diana se sintetizaron en un formato discontinuo sobre resina TSK-Blank como se ha descrito anteriormente. La resina peptídica desprotegida se introdujo seca en una columna de blanco como se ha descrito anteriormente y se lavó con 20 volúmenes de columna de metanol al 20%/agua, después con 10 volúmenes de columna de Tampón A, y se ensayó por inyecciones secuenciales de 1,0 ml de 1) Tampón A como blanco, 2) HSA al 0,5%, y 3) proteína diana en HSA al 0,5%. Las proteínas unidas no específicamente se retiraron por lavado de la columna en una etapa de gradiente de NaCl 1,0 M para dos volúmenes de columna, y la proteína diana se eluyó de la columna en una solución de ácido débil.

Validación del inmunoensayo de la Biblioteca de HPLC

Proteína Ribonucleasa S En esta realización, el ensayo por HPLC se validó usando un péptido de unión de control para una proteína diana específica. El péptido que se une a la proteína RNasa S identificado anteriormente (25), YNFEVL, se sintetizó en resina TSK-Blank como se ha indicado en la sección anterior, después se diluyó con TSK-Blank hasta que la proporción final de resina peptídica a TSK-Blank era de 1:20 del peso total. La Figura 2 muestra el programa de inyección del trazo UV por HPLC en microbore, perfil de flujo y condiciones de gradiente de la técnica de inmunoensayo usando proteína RNasa S como la proteína diana (HSA es la proteína soporte). Se encontraron perlas rojas (indicando que la proteína diana estaba interaccionando con las perlas de resina YNFEVL-TSK) a una frecuencia del 5% por toda la columna demostrando que la columna no está agotada de diana o inmunoreactivos durante la ejecución de la inmunotinción cromatográfica de la biblioteca de péptidos. También había presentes perlas blancas transparentes de TSK-Blank que no mostraron reactividad con el sistema de detección o con la proteína RNasa S. Las perlas azul oscuro, que indicaban interacciones no específicas o inmunoreactivas-específicas, solo estaban presentes a una frecuencia muy baja (menor del 0,01%). Algunas perlas se astillaron o ranuraron durante los procedimientos de síntesis, escisión, o análisis cromatográfico, aunque en general, la integridad de las perlas como soporte cromatográfico no pareció verte comprometida cuando las perlas no colapsaron a altas presiones (mayores de 27,6 MPa (4.000 psi)).

Validación del Método de Cromatografía por Afinidad por HPLC

Cromatografía por Afinidad de la Proteína Ribonucleasa S En esta realización la metodología de afinidad por HPLC se valida mediante el sistema proteína RNasa S/péptido YNFEVL descrito anteriormente. La síntesis del péptido se realizó como se ha indicado en la sección anterior. La Figura 3 muestra el análisis por cromatografía de afinidad por HPLC de proteína RNasa S. 42 nmoles de proteína RNasa S se inyectaron en un volumen de 1,0 ml en la columna a 200 \mul/min durante 3 min. El flujo disminuyó a 5 \mul/min durante 5 min para perfundir la columna, después aumentó a 400 \mul/min para retirar por lavado la proteína no unida. A los 13 min, una inyección de 1,0 ml de Tampón A con NaCl 1,0 M eluyó la proteínas con unión no específica, después la columna volvió a NaCl 0,1 M hasta los 19 min cuando empezó un gradiente brusco a ácido acético al 2% en agua y un flujo de 800 \mul/min. Después de 5 min, la columna volvió al Tampón A para equilibrar la resina. El pico a 22 min representa la proteína diana eluida en el lavado con ácido.

Ejemplo

Biblioteca de Hexámero -Factor IX Diana Una biblioteca de hexámeros de péptidos se ensayó con este ensayo de inmunotinción cromatográfica de la biblioteca de péptidos para su capacidad para unirse a la serina proteasa del zimógeno del Factor IX. La biblioteca se ensayó como se describe y se encontraron diversas secuencias de perlas rojas. Las perlas teñidas individuales se recogieron a mano con una pipeta en un microscopio de disección. De las 6 perlas aisladas de dos análisis independientes, dos perlas dieron una secuencia transparente (YANKGY e YNYFNQ). La cantidad de péptido por perla se descubrió que era de aproximadamente 10 pmol (0,1 mequiv./g), que es suficiente para la secuenciación.

Purificación por Afinidad de Factor IX/Albúmina El péptido derivado de la biblioteca identificado anteriormente se une a y purifica una mezcla de un zimógeno del Factor IX, altamente purificado disponible en el mercado en una solución de albúmina de suero humana. La secuencia YANKGY se sintetizó de forma discontinua como se ha descrito y el análisis cuantitativo de aminoácidos mostró la secuencia apropiada. Se ensayó la capacidad para unirse al Factor IX de esta resina peptídica. La Figura 4 muestra los cromatogramas, demostrando que el ligando peptídico YANKGY sintetizado en la TSK-Blank se une al Factor IX. HSA se unió a la columna en una pequeña extensión. Sin embargo, esto se eluyó mediante el lavado con sal como pone de manifiesto la ausencia de un pico durante la elución con ácido. En contraste, cuando el Factor IX se añade a la HSA, hubo un pico definido eluido por el ácido. Esto demuestra que la proteína diana (Factor IX) se une al péptido con suficiente avidez para indicar especificidad.

La Figura 5 muestra los cromatogramas para cantidades crecientes de Factor IX añadidas a la columna. Se observó una correlación directa entre el área del pico de ácido y la cantidad de Factor IX inyectada. Calentando el Factor IX durante 5 min disminuyó la unión a la columna, como se demuestra por la disminución del área del pico de ácido. El cromatograma superior en la Figura 5 muestra el trazo UV de 220 \mug de Factor IX en HSA. El área del pico de ácido a partir de esta prueba (Figura 6, carril 5) no fue significativamente diferente del área del pico a la del Factor IX sin HSA (Figura 6, carril 3), consistente con el Factor IX que se separa de HSA. Las alícuotas de las fracciones tomadas de esta prueba se ensayaron para la detección del Factor IX por ELISA (datos no mostrados). No se detectó Factor IX en el pico del flujo a través (de la Figura 5, trazo superior); el 17% de la cantidad de Factor IX inyectado se detectó en el pico de NaCl; y el 25% en el pico de ácido. El Factor IX puede estar parcialmente desnaturalizado durante la elución con ácido que no pudo considerarse por la falta de recuperación completa basada en los resultados de ELISA. De hecho, los controles añadiendo ácido al Factor IX antes del análisis en el ELISA muestran una disminución del 40 al 50% en la señal de ELISA. El resto de fracciones se hicieron precipitar en acetona fría (-20ºC) y se analizaron reduciendo SDS-PAGE, normalizando la muestra a la proteína total. La Figura 6 muestra que hay una purificación clara del Factor IX desde HSA. La unión del Factor IX a la columna YANKGY-TSK se confirmó por análisis de transferencia Western: una banda muy leve de Factor IX se observó en el material de partida y no se observó Factor IX detectable en la fracción de flujo a través sino que se observaron bandas oscuras correspondientes al Factor IX en ambos lavado con NaCl y el pico de ácido.

Cromatografía por Afinidad del Factor IX Derivado del Plasma La relevancia de este ligando peptídico derivado de la biblioteca es purificar zimógeno del Factor IX humano a partir de plasma humano no purificado. Una inyección de 1,0 ml de plasma citrado humano se puso en contacto con una columna de acetil-YANKGY-TSK de la manera mostrada en el ejemplo anterior. El flujo a través y los picos de ácido se recogieron sobre hielo y se ensayaron inmediatamente para análisis de proteína total, SDS-PAGE y transferencia Western. La Figura 7 muestra el cromatograma de purificación, SDS-PAGE y transferencia Western de las fracciones recogidas. Las muestras se normalizaron para proteína total como se ha descrito anteriormente. Hay numerosas bandas de proteínas en el material de partida, siendo albúmina la predominante. La banda del Factor IX no es visible en ninguna fracción en el gel teñido con Commassie. La transferencia no muestra Factor IX en el material de partida (está por debajo de la sensibilidad del sistema de detección), ni Factor IX en el flujo a través, aunque una banda muy grande en el pico de ácido. Con un paso sobre la columna de afinidad YANKGY-TSK, analizando la proteína total y por transferencia Western, la purificación aproximada fue 200 veces la del plasma. Esto demuestra de forma conclusiva que esta secuencia derivada de la biblioteca se une a y purifica el zimógeno del Factor IX a partir de plasma humano.

Otros Sistemas de Detección para este Ensayo por HPLC

Sistemas de detección no colorimétricos. Los especialistas en la técnica pueden entender adicionalmente que la invención puede ampliarse fácilmente al uso de diferentes reactivos que son funcionalmente equivalentes a aquellos usados en los ejemplos anteriores. Los anticuerpos conjugados son la realización preferida; sin embargo, pueden usarse también conjugados directos con la enzima diana con esta técnica. Se sabe bien en la técnica que la secuencia peptídica HPQ se unirá a estreptavidina. Si esta secuencia estuviera contenida en una biblioteca de péptidos podría identificarse por esta técnica de tinción cromatográfica de la biblioteca con dos colores. En este ejemplo la tercera inyección debería contener alguna clase de molécula de marcado capaz de conferir color a la perla (tal como una molécula fosfatasa). La columna se extraería, y el reactivo del primer color (NBT/BCIP) se aplicaría a las perlas. La columna volvería a rellenarse como se ha descrito anteriormente, y la inyección diana sería estreptavidina conjugada con fosfatasa. Con la adición posterior del reactivo de tinción diferencial (Rojo Rápido) las perlas teñidas del segundo color serían específicas para la estreptavidina diana.

Además, el reactivo de tinción no tiene que ser una enzima. Cualquier etiqueta que confiera una señal podría utilizarse para diferenciar los ligandos que reaccionan con el sistema de detección de aquellos que reaccionan con la diana. Por ejemplo, las moléculas fluorescentes que confieren diferentes colores podrían usarse con detección por clasificación celular activada por fluorescencia; las etiquetas con isótopos radiactivos (125I/131I o 35S-Met/75Te-Met) podrían identificarse en autoradiogramas o por recuento por centelleo; o las etiquetas con isótopos no radiactivos (por ejemplo, 14N/15N) podrían identificarse por RMN; o identificación por color de modo mixto donde las perlas que interaccionan con los reactivos de detección están coloreadas como se ha descrito anteriormente y las perlas específicas para la diana se identifican por luminiscencia con 3-(4-metoxiespiro(1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo(3,3,1,13,7)decan)-4-il)fenil fosfato disódico (CSPD, Tropix, Bedford, MA) o cualquier otro reactivo luminiscente.

Conclusión

En conclusión, se ha desarrollado un procedimiento que identifica rápidamente secuencias derivadas de bibliotecas combinatorias que son específicas para la diana. Este análisis de inmunotinción cromatográfica con dos colores de la biblioteca de péptidos se ha usado para identificar secuencias que se unen a la cascada de coagulación de zimógeno del Factor IX. La técnica se ha validado usando una secuencia peptídica que se sabe que se une a la proteína Ribonucleasa S. Esta técnica se ha extendido adicionalmente al uso del ligando peptídico identificado para construir un medio de cromatografía por afinidad para la purificación de la proteína diana.

Este procedimiento conduce a esquemas experimentales útiles adicionales. Usando una estrategia de modificación de resina combinatoria con este análisis de inmunotinción cromatográfica con dos colores de la biblioteca de péptidos pueden identificarse modificaciones útiles para separaciones de moléculas de estructura similar (por ejemplo, isoformas de proteínas, o las mismas proteínas de diferentes fuentes, tales como el inhibidor de alfa 1 proteinasa de oveja del inhibidor de alfa-1 proteinasa humana transgénica en la leche de oveja). En estos ejemplos una isoforma de la molécula diana puede incluirse en la primera mitad del ensayo para generar el primer color. La isoforma diferente puede incluirse en la segunda mitad del ensayo para generar el segundo color. De esta manera, la especificidad por la segunda isoforma se identificaría mediante las perlas teñidas sólo por el segundo color.

Las interacciones de unión son farmacológicamente importantes, por lo que esta estrategia puede ser útil para conducir a la identificación en el descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, un biblioteca de péptidos puede sondarse con receptores celulares solubles tales como la forma soluble del receptor del factor de crecimiento epidérmico o la forma soluble del receptor de eritropoyetina para identificar ligandos peptídicos de significado farmacológico potencial. Un gran tamaño de poro de la resina es necesario para proporcionar acceso completo al péptido para estas grandes proteínas. El procedimiento puede usarse también para identificar interacciones de unión entre otras clases de moléculas (es decir, no peptídicas). Se ha descubierto también que este procedimiento es útil para una rápida evaluación y optimización de ligandos derivado de la detección de bibliotecas de fagos.

Los ejemplos anteriores pretenden ilustrar la invención y se cree que a los especialistas en la técnica se les ocurrirán variaciones. Por consiguiente, se pretende que el alcance de la invención se limite únicamente a las siguientes reivindicaciones.

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Referencias

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Claims (23)

1. Un procedimiento para seleccionar un ligando que se unirá a una sustancia diana, en el que el ligando es de una biblioteca aleatoria de ligandos en la que los ligandos están inmovilizados sobre materiales de soporte individuales y en el que la unión se detecta mediante un sistema de detección que tienen componentes, comprendiendo el
procedimiento:

(1) incubar los ligandos inmovilizados aleatorios con los componentes del sistema de detección para generar una primera señal, detectando de esta manera solo aquellos ligandos que se unen a un componente del sistema de detección y no detectando aquellos ligandos que se unen a la sustancia diana y no se unen a los componentes del sistema de detección; y

(2) añadir después la sustancia diana a los ligandos inmovilizados aleatorios y los componentes del sistema de detección, de manera que el sistema de detección genera una segunda señal que es diferente de la primera señal, permitiendo de esta manera la detección de un ligando que se une a la sustancia diana contra el fondo de la primera señal que identifica ligandos que se unen a los componentes del sistema de detección.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el sistema de detección comprende una etiqueta conjugada con enzima.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el sistema de detección comprende una etiqueta marcada con radioisótopo.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el sistema de detección comprende etiqueta marcada con fluorescente.

5. El procedimiento de la reivindicación 2, 3 ó 4 en el que la etiqueta es un anticuerpo.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el sistema de detección es un sistema de detección generador de color.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la primera señal es un primer color, y la segunda señal es un color diferente de dicho primer color.

8. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el ligando es un péptido y la sustancia diana es una proteína

9. El procedimiento de la reivindicación 8 en el que la proteína se selecciona entre el grupo constituido por proteínas del plasma y proteínas expresadas a partir de célula o hibridoma modificado genéticamente.

10. El procedimiento de la reivindicación 9 en el que el péptido comprende aproximadamente de 3 a 10 restos aminoacídicos.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 en el que la proteína es el Factor IX.

12. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el material de soporte es una resina.

13. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que el material de soporte es hidrófilo.

14. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que el material de soporte es poroso.

15. El procedimiento de la reivindicación 14 en el que el tamaño medio de poro del material de soporte poroso varía de aproximadamente 800 a aproximadamente 1200 ángstrom.

16. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que las etapas ocurren en una columna de HPLC.

17. El procedimiento de la reivindicación 16 en el que la presión de la columna de HPLC es de aproximadamente 0 a 27, 6 MPa (0 psi a 4000 psi).

18. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el ligando es un péptido, la sustancia diana es una proteína diana específica, los materiales de soporte individuales son perlas de soporte cromatográfico individuales, y los componentes del sistema de detección comprenden un primer y un segundo anticuerpo, comprendiendo el procedi-
miento:

(a) inmovilizar péptidos aleatorios sobre perlas de soporte cromatográfico individuales para crear una población de perlas de soporte, teniendo unido cada perla de soporte a su superficie péptidos sustancialmente idénticos
entre sí;

(b) poner en contacto las perlas de soporte de la etapa (a) con el primer anticuerpo, siendo capaz el primer anticuerpo de unirse específicamente a la proteína diana, en condiciones que permiten la unión tanto específica como no específica a la proteína diana, siendo capaz también el primer anticuerpo de unirse específicamente y no específicamente a las perlas de soporte y a los péptidos sobre las perlas de soporte;

(c) poner en contacto las perlas de soporte de la etapa (b) con el segundo anticuerpo, siendo capaz el segundo anticuerpo de unirse específicamente al primer anticuerpo y teniendo conjugado al mismo una enzima capaz de reaccionar con un primer y un segundo sustrato, donde el primer y el segundo sustratos son diferentes y producen dos cambios de color diferentes, en condiciones suficientes para unir el segundo anticuerpo al primer anticuerpo, siendo capaz también dicho segundo anticuerpo de unirse específicamente y no específicamente a las perlas de soporte y a los péptidos sobre las perlas de soporte;

(d) añadir el primer sustrato a las perlas de soporte de la etapa (c) en condiciones suficientes para provocar la primera señal, que es un primer cambio de color en las perlas de soporte individuales que tienen unido a las mismas el segundo anticuerpo;

(e) añadir la proteína diana a las perlas de soporte de la etapa (d) en condiciones suficientes para permitir la unión específica de la proteína diana a al menos uno de los péptidos unidos a las perlas de soporte;

(f) poner en contacto las perlas de soporte de la etapa (e) con el primer anticuerpo en condiciones suficientes para unir el primer anticuerpo específicamente a la proteína diana;

(g) añadir el segundo anticuerpo que tiene la enzima conjugada con el mismo a las perlas de soporte de la etapa (f) en condiciones suficientes para unir el segundo anticuerpo específicamente al primer anticuerpo unido a la proteína diana unida a los péptidos unidos a las perlas de soporte;

(h) añadir el segundo sustrato a las perlas de soporte de la etapa (g) en condiciones suficientes para provocar la segunda señal, que es un segundo y diferente cambio de color que distingue aquellas perlas de soporte que tienen unido a las mismas los péptidos que se unen con la proteína diana;

(i) separar las perlas de soporte que tienen el péptido que se une a la proteína diana en base al cambio de color provocado por la etapa anterior; y

(j) secuenciar el péptido sobre el soporte separado en la etapa (i).

19. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que hay etapas de lavado entre las etapas (a) y (b), (b) y (c), (c) y (d), (e) y (f), (f) y (g), y (g) y (h).

20. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que las perlas de soporte cromatográfico individuales comprenden perlas de resina hidrófila porosa que tienen un tamaño medio de poro que varía de aproximadamente 800 a aproximadamente 1200 ángstrom.

21. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que los péptidos tienen una longitud que varía de aproximadamente 3 a 10 restos aminoacídicos.

22. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que las perlas de soporte están contenidas dentro de una columna.

23. El procedimiento de la reivindicación 22 en el que la columna está unida a un aparato de cromatografía automatizado.