CN1842707B - 朊病毒蛋白结合材料及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
朊病毒蛋白结合材料以及应用结合材料来检测或者去除样品中朊病毒蛋白的方法，样品如生物液体或者环境样品。结合材料可以结合一种或多种形式的朊病毒蛋白，包括细胞朊病毒蛋白(PrPc)，传染性朊病毒蛋白(PrPsc)，重组朊病毒蛋白(PrPr)，以及蛋白酶抗性朊病毒蛋白(PrPres)。来自包括人和仓鼠的多种不同物种的朊病毒被结合材料结合。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白结合(binding)领域，更具体地，涉及与朊病毒蛋白结合的材料以及应用朊病毒蛋白结合材料来检测或者去除生物样品中的朊病毒的方法。
背景技术
天然或者细胞朊病毒蛋白“PrPc”广泛分布于哺乳动物中，并且具有特别的非常保守的氨基酸序列以及蛋白结构。认为传染性朊病毒是由正常细胞(PrPc)朊病毒蛋白的修饰形式构成，并且称作“PrPsc”。朊病毒与其它传染性病原体有一些共同的特性，但是看起来其中并不含有核酸。相反，认为翻译后的构象变化导致了非传染性的PrPc转变为传染性的PrPsc，其中发生了α-螺旋转变成β-折叠。PrPc含有三个α-螺旋结构以及很少的β-折叠结构；与之相反，PrPsc富含β-折叠。相信PrPc到PrPsc的转变导致了可传播性海绵状脑病(TSEs)的发展，其中，PrPsc积累于中枢神经系统并且同时伴随着神经病理学的变化以及神经学上的功能紊乱。PrPsc，通常是指朊病毒蛋白的“骚痒症”形式，并且认为这对于在动物和人中可传播的神经退化疾病的传播和致病机理是必要的，并且很可能是充分的。
TSEs的具体例子包括骚痒症，该疾病侵袭绵羊和山羊；牛海绵状脑病(BSE)；可传播的水貂脑病，猫海绵状脑病和慢性消耗疾病(CWD)。在人中，TSE疾病可表现为苦鲁病，克雅(氏)病(或皮层-基底节-脊髓变性症候群(CJD))，格-施-沙综合征(Gerstmann-Straüssler-ScheinKer(GSS))，致命性失眠症以及CJD病的变异体(vCJD)。最近在人类中出现vCJD，导致BSE在英国很流行，并且其最有可能是由于吃了来源于感染了BSE或者“疯牛病”的家畜类的食物引起。在英国，20世纪80年代中期到90年代早期，由于摄取了感染了BSE的家畜神经组织潜在感染的食物的人数还不清楚。由于在人类中，口腔感染疾病的潜伏期可能超过20年，vCJD的实际发生率可能很多年都显现不出来。至今，已知超过150个人感染过该种疾病，主要在英国；然而在加拿大，法国，香港，以色列，意大利以及美国也报导过该种病例。英国在世界范围内出口被感染牛饲料产品表明，很可能全球都存在BSE，并且由此而带来了vCJD的可能性。与这些观察结果相一致的是在大多数欧洲国家、日本、加拿大、美国和以色列检测到BSE。所以，从包括食品在内的各种不同材料中检测并且去除传染性的朊病毒蛋白就变得非常重要。
所有TSEs的特征是：对于该类物质，缺乏可以检测到的宿主免疫应答。所以，到目前还没有确定对TSCs特异的抗体。此外，缺乏已知的核酸序列排除了应用聚合酶链式反应为基础的诊断方法。这样就没有常规的血清学检测可以用于确定被感染的动物。最近，改良的以免疫学为基础的技术已经用于确定在屠宰动物的脑中是否有PrPsc。
除了摄取来源于牛的被感染产品外，输血和器官移植是在人之间传播vCJD的另一种方式。在人中通过输血来传播vCJD的风险目前是未知的，但是，基于实验动物模型的数据，包括用实验手段使得口腔感染了BSE后的绵羊以及天然地感染了骚痒症的绵羊进行传播，结果它们具有非常可能的几率，已经最可能解释人与人之间vCJD的传播。不象其它的人TSEs，PrPsc存在于vCJD患者的淋巴网状内皮细胞系统中，因此增加了传染性物质存在于血液中的几率，并且可以通过输血进行传播。其它涉及的通过输血来提高传播风险的因素还不清楚，可以设想会很高，很多暴露于BSE的人群，缺乏对于vCJD潜伏期的诊断测试。此外，vCJD的毒性在灵长类和鼠中随着种族的适应性似乎有所增加，这意味着人与人之间的传播比牛对人的传播更有效。因此，迫切地需要一些方法来阻止vCJD通过输血传播。这样的措施可以包括被感染供体的早期确认以及动物来源的食物或者保健品中TSE物质的延缓、去除和灭活，所述动物来源的食物或者保健品应用于动物或者人的日常消费或应用，人和牛的血液来源制品，器官移植。很可惜，TSE的传染性对于灭活的化学和物理方法有显著的抗性，并且难以找到选择性灭活方法。
已经确定了很多结合于朊病毒蛋白的材料。发现从组合肽库中筛查结合于八肽重复序列(PHGGGWGQ)(SEQ ID NO：1)的配体，存在于所有已知的哺乳动物朊病毒蛋白中，并且还发现了一系列配体，正如在PCT/US01/11150中所描述的。其它的材料包括与淀粉样蛋白斑如刚果红(Congo Red)淀粉样蛋白斑相互作用的配体(Ingrosso，L.，等人，Congo Red Prolongs the Incubation Period in Scrapie-infectedHamsters.J.Virology 69：506-508(1995))；4-碘，4-脱氧阿霉素(Tagliavini，F.，等人，Effectiveness of Anthracycline Against Experimental PrionDiseases in Syrian Hamsters.Science 276：1119-1122(1997))；两性霉素B，卟啉和酞菁(Priola，S.A.，等人，Porphyrin and PhthalocyanineAntiscrapie Compounds，Science 287：1503-1506(2000))；金属(Stockel等人，Biochemistry，37，7185-7193(1998))；与Prp相互作用形成复合体的肽(参见美国专利5,750,361，Prusiner等人和Soto，C.等人，Reversionof Prion Protein Conformational Changes in Synthetic β-sheet BreakerPeptides，Lancet，355：192-197(2000))；肝素和其它聚硫酸化聚阴离子(Caughey，B.，等人，Binding of the Protease-sensitive Form of PrionProtein Prp to Sulphated Glycosaminoglycan and Congo Red，J.Virology68：2135-2141(1994))；抗体(Kascsak，R.J.，等人，Immunodiagnosis ofPrion Disease，Immunological Invest.26：259-268(1997))；和其它蛋白，例如血纤蛋白溶酶原(Fischer，M.B.等人。Binding of Disease-associatedPrion Protein to Plasminogen.，Nature 408：479-483(2000))。离子交换层析已经被用于纯化朊病毒蛋白污染的血液组分，例如血色素(美国专利号5,808,011，Gawryl等人)。然而，Gawryl等人教导的层析材料结合血色素，并且随后用梯度洗脱收集纯化的血色素。目前，还没有材料已经被完全表征或者发现能结合来自多种介质的朊病毒蛋白。
到目前为止，人TSE疾病是100％致命的。不幸的是，尽管包括两性霉素、硫酸化聚阴离子、刚果红染料和蒽环类(anthracycline)抗生素的大量化合物已经被报导为有希望的治疗剂，但所有这些化合物已经证明对于阻止朊病毒蛋白繁殖只有适度的潜力，并且没有一种化合物显示出对于在受控的临床研究中从被感染的宿主中去除预先存在的朊病毒蛋白有任何效果。因此，目前仍然迫切需要新型的治疗试剂。
从正常的可溶性蛋白到构象改变的、不可溶形式的装配和去装配的过程，被认为是很多种其它疾病的病因，这些疾病很多是属于神经系统方面的疾病。对于疾病的发病与正常蛋白转变为构象改变蛋白之间的关系，还了解的很少。除了朊病毒蛋白，这些不溶性蛋白的具体例子还包括：在阿耳茨海默(氏)病和大脑淀粉样血管病中的淀粉样蛋白斑之中的β-淀粉状肽；在帕金森病中向心性多层圆形小体(卢伊体)中的α-synuclein沉积物，额颞痴呆中神经原纤维缠结中的tau蛋白，以及皮克病；肌萎缩性(脊髓)侧索硬化中的超(过)氧化物歧化酶；以及亨延顿(氏)舞蹈病的huntingtin蛋白。这些高度不溶性蛋白通常形成由无分支的原纤维组成的聚集物，其共同的特征是β折叠构象。
需要便于区分或者分辨两种或者更多种不同构象形式的蛋白，如PrPc和PrPsc的方法学，从而理解这种转变的过程，并且发现与疾病相关形式发生特异地相互作用的结构。区分或者分辨蛋白的同工型的目前的方法学包括：在存在如尿素的离液剂条件下，在聚丙烯酰胺凝胶上的差别迁移率，即横向尿素梯度(TUG)凝胶；对于蛋白酶处理如蛋白酶K(PK)的差别敏感性，检测被称作PrPres的PrPsc的PK-抗性消化产物；差别温度稳定性；在非离子去垢剂中的相对溶解性；以及纤维结构结合某些化学物质，如刚果红和异黄酮S的能力。然而，仍需要鉴定另外的朊病毒蛋白结合材料。而且也仍需要鉴定对构象改变的蛋白质，特别是与疾病相关的蛋白质特异的高亲合性结合材料。这些试剂将用于开发可能的诊断试剂盒，分离和纯化不同形式的蛋白，用于从治疗试剂、生物制品、疫苗和食品中去除该疾病的传染性形式，并且用于治疗。
发明内容
本发明提供了结合于朊病毒蛋白的材料以及应用朊病毒蛋白结合材料(此后为“结合材料”)的方法。在一些实施方案中，结合材料是聚合物颗粒，优选的是色谱用树脂，其可以选择性地和特异地与朊病毒分析物结合。在其它的实施方案中，结合材料是特异和选择性地与朊病毒蛋白样品结合的无机材料。结合材料可以结合朊病毒蛋白的一种或者多种形式，包括细胞朊病毒蛋白(PrPc)、传染性朊病毒蛋白(PrPsc)以及重组朊病毒蛋白(PrPr)。来自不同物种包括人和仓鼠的朊病毒被结合材料结合。本发明还提供了含有在如层析柱的支持物上存在的结合材料的组合物。
结合材料用于在样品如生物液体或者环境样品中或者从样品中检测、结合、分离、去除、排除、提取或者分离朊病毒蛋白。结合材料用于去除样品中所有形式的朊病毒蛋白，或者可以选择性地选取来检测或者去除单一形式的朊病毒蛋白。因此结合材料可以用于在来自患者的样品中区别传染性和非传染性朊病毒蛋白，患者包括人TSEs的病人以及有骚痒症、BSE和CWD的动物。在一个实施方案中，使用在此描述的结合材料从生物液体中去除一种或者多种朊病毒蛋白，随后将纯化的或者去污染的生物液体施用或者返回到人或者动物中。在该实施方案中可以应用血液透析技术。结合材料也可以用于在样品中检测一种或者多种朊病毒蛋白。
本发明的另一方面提供了鉴定另外的结合材料的方法，尤其是对蛋白的构象改变形式具有特异性的结合材料，其中一些蛋白涉及到疾病的发展过程。
通过以下的详细说明和优选的实施方案，本发明的其它特征和优势将是显而易见的。
附图说明
图1是Western印迹的照片，显示了朊病毒蛋白结合材料与人血浆样品中的内源性PrPc的结合作用以及适当的对照。
图2是Western印迹的照片，显示了朊病毒蛋白结合材料与骚痒症脑组织匀浆中的PrPsc的结合作用以及适当的对照。
图3是Western印迹的照片，说明了朊病毒蛋白结合材料在含有人血清白蛋白的样品中捕获PrPc以及适当的对照。
图4是Western印迹的照片，说明了采用含有氨基功能团的树脂对掺入到人血清白蛋白中的PrPres的去除作用。
具体实施方式
在此描述了朊病毒蛋白结合材料以及应用朊病毒蛋白结合材料的方法。结合材料是聚合材料，如层析用树脂或者珠子，或者无机材料，如氧化铝，其可以与朊病毒蛋白特异性地并且亲和性地结合。聚合材料含有一个或者多个以下的功能团：带负电的部分；带正电的部分；不带电的部分以及疏水部分。优选地，聚合物结合材料具有结合于甲基丙烯酸或者聚甲基丙烯酸基质骨架(matrix backbone)的功能团。
结合材料与样品中的朊病毒蛋白形成复合物，可以在从样品或在样品中检测、结合、分离、去除、排除、提取或者分离朊病毒蛋白的方法中使用，其中该样品如人或者动物来源的组织、器官、或者生物液体或者环境样品。本发明还提供了在人或者动物中，或者其组织、器官或者生物液体中诊断或者监控朊病毒疾病的方法。例如，在此描述的结合材料可以通过测定生物样品如全血、来源于血液的组合物或者组分、细胞、血清、血浆、血浆衍生物、脑脊液、尿液、眼泪、扁桃体、大脑、阑尾以及其它，从而用于检测或者诊断诸如CJD、vCJD、GSS、致命性失眠症、骚痒症、BSE和CWD和其它TSEs的病理。在血液、组织或者器官移植前，对动物或者个体中的朊病毒蛋白传染进行测定的重要性是显而易见的。结合材料可以特别地从样品或者生物液体如全血、血液组分、血清、血浆、血浆衍生物以及类似物中去除朊病毒蛋白。在生物液体传播给其它的动物或者人的情况下，如在输血或者施用如凝血因子的血液制品中，朊病毒蛋白的去除是非常必要的。结合材料可以从样品中去除或者检测所有不同形式的朊病毒蛋白，或者可以选择性地选取来去除或者检测单一形式的朊病毒蛋白，并且可以因此区分样品中的传染性和非传染性朊病毒蛋白。
定义
在此应用的术语“一个”、“一种”和“该”的定义是指“一个或多个”，并且还包括复数，除非在上下文中认为不适当。
术语“3F4抗体”是指对于PrPc的天然形式，而不是天然PrPsc或者PrPres，具有特异性的单克隆抗体。该抗体对于变性形式的仓鼠和人PrPc、PrPsc和PrPres有特异性。
正如在此所应用的，术语“来源于血液的组合物”、“血液组分”以及“血液组合物”可以互相交互使用，并意欲包括全血，红细胞浓缩物，血浆，血清，富集或者缺乏血小板的部分，血小板浓缩物，白血细胞，血浆沉淀物，血浆分级沉淀物以及上清，免疫球蛋白制剂包括IgA、IgE、IgG和IgM，纯化的凝结因子浓缩物，纤维蛋白原浓缩物，血浆分级中间物，白蛋白制剂，或者来源于人或者动物血液的其它不同的物质。这些术语也包括通过本技术领域内不同的常用方法如离子交换、亲和、凝胶透过、和/或者疏水层析或者通过用乙醇或者聚乙二醇示差沉淀纯化的来源于血液的蛋白。
术语“PrPc”是指天然朊病毒蛋白分子，其天然并广泛地表达于哺乳动物的体内。其结构高度保守并且与疾病状态不相关。
术语“PrPsc”是指PrPc分子的构象改变形式，本技术领域的普通技术人员认为该分子与诸如TSE/朊病毒蛋白的疾病包括vCJD、CJD、库鲁病、致命失眠、GSS、骚痒症、BSE、CWD以及其它的TSEs相关，包括捕获和实验动物中稀有的TSEs。PrPsc具有与正常的、细胞PrPc相同的氨基酸序列，但其中一部分α螺旋变成了β折叠，这一转变与疾病状态相关。
术语“PrPres”是指分子量为27-30kDa的PrPsc蛋白的蛋白酶抗性衍生物，其在蛋白酶K(PK)部分消化PrPsc后仍然存在。
术语“PrPr”是指通过重组技术表达的朊病毒蛋白。
术语“PrP”是指朊病毒蛋白的总称。
术语“珠子”是指固相颗粒或者微粒，其可以结合反应基团或者结合成分。珠子具有不规则的形状，包括有球形、椭圆形、杆状或者甚至是带角的形状，这些都属于该术语的范围。
术语“树脂”是指聚合介质。
在此应用的术语“聚合”描述的是由几种较小的、重复性化学或者结构单元(单体)组成的化合物或者分子。
样品
在此应用的术语“样品”是指任何溶液、悬液、提取物、组合物、制剂、产品、组分、组织、器官、细胞、或者其它的实物，它们按照本发明的某些方面和实施方案的方法与朊病毒蛋白结合材料相接触。按照本发明的某些方面和实施方案，样品包括但不限于，生物样品、食品、环境样品或者水样品。生物样品包括但不限于：来源于血液的样品；来源于脑的样品；体液，例如但不限于，血液、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、奶、管液、眼泪或者精液；生物提取物，如胶原提取物、腺体提取物、或者组织匀浆物或者提取物。生物样品来源于人或者动物，包括但不限于牛、绵羊、猪、马、鼠或者鹿科(Cervidae)动物。来源于血液的样品包括，但是不限于，血小板浓缩物、血浆蛋白制剂、免疫球蛋白制剂、纤维蛋白原制剂、因子XIII制剂、凝血酶制剂、因子VIII制剂、von Willebrand因子制剂、蛋白C制剂或者活化的蛋白C制剂。按照本发明的某些方面和实施方案的样品也包括，但不限于药物组合物、治疗剂组合物、化妆品组合物以及产品、食物或者食品、或者营养滋补组合物。食品样品的例子包括，但不限于明胶、果冻、奶、乳制品、胶原或者婴儿配方食品。
按照本发明的某些方面和优选的实施方案，样品也包括含有不同种蛋白的蛋白溶液，包括但不限于，人或者动物血清白蛋白。例如，样品包括但不限于，含有人血清白蛋白的治疗剂产品；人或者动物的血清白蛋白制剂；或者含有人或者动物血清白蛋白作为稳定剂的制剂。按照本发明的某些优选的实施方案，样品也可以含有浓度高达大约50％(w/v)的人或者动物的血清白蛋白，或者浓度从大约1％到大约50％，或者从大约5％到大约25％。在一个方面，在本发明的优选实施方案中，本发明出人意料地并有利地可以从具有高浓度蛋白的样品或在其中去除、分离或者结合朊病毒蛋白，特别地从血液蛋白中，如血清白蛋白。
环境样品包括但不限于土壤、污水或者水，如来自小溪、河流、含水土层、井、水处理设备的水或者休养用水。
样品包括但不限于，液体样品、固体样品或者胶质样品。固体样品可以用液相溶剂、有机溶剂或者临界流体提取得到，并且得到的上清可以与结合材料相互接触。固体样品的例子包括，但不限于来源于动物的产品，特别是那些暴露于传播朊病毒蛋白的试剂的样品，如来源于牛的骨粉、脑组织、角膜组织、排泄物、骨粉、牛肉副产品、羊、羊副产品、鹿和驼鹿、以及鹿和驼鹿副产品、以及其它动物和来源于其它动物的副产品。
材料
在此提供的结合材料结合于来源于朊病毒蛋白的肽或者多肽，或者完整的朊病毒蛋白分子，它们可以用于各种不同的分离程序，包括但不限于层析，例如但不限于，薄层层析、柱层析以及分批层析；固相支持物以及膜分离；反应器分离；磁性分离；免疫分离；以及胶体分离。在一个优选的实施方案中，在如层析柱的柱子中包含结合材料，加入样品，并且使其通过柱子以便样品中的朊病毒蛋白结合于结合材料上，并且保留在柱子中。样品中的其它成分通过柱子，并且可以进行收集。应当认识到在此描述的结合材料的应用并不限于分批层析或者柱层析。预想了用于结合朊病毒蛋白的结合材料的应用的各种不同的构造、修饰以及变化，并且这也属于本发明的范围。这样的变化和修饰包括，但不限于：分批过程，连续过程；移动床层析过程；低压、中压或高压过程；或者小、中或大规模过程。在可选择的实施方案中，结合材料可以位于膜上、纤维上、珠子上，注入非机织筛网中，涂覆纤维，包括在过滤器壳体之中，等等。
无机组分
在第一个实施方案中，结合材料含有无机化合物或者组分，例如但不限于，铝或者氧化硅。优选地，铝是氧化铝，氧化硅是热解法二氧化硅。最优选地，无机化合物是Al2O3；或者SiO2。这些结合材料可以以不同的形式提供，包括但不限于，珠子或者树脂。结合材料可以用于很多不同的分离过程，并且可能位于或者加入到层析柱中、膜中、或者任何合适的分离仪器和工具中，或者可以用于批量过程，或者在允许形成朊病毒蛋白结合材料和朊病毒蛋白的条件下，使得样品与材料相接触而用于任何分离过程。含有无机化合物的结合材料可以包括多个功能团。功能团是亲水性的，如带正电荷、带负电荷、不带电荷或者中性、疏水性的、两性的或者它们的组合。以下详细说明了特异的功能团。应该理解到，功能团可以是在无机化合物中固有存在的，或者通过修饰使得无机化合物包含了功能团。功能团包括有机和无机功能团。
聚合物组分
在第二个实施方案中，结合材料包括聚合材料或者组分，并且优选地包括聚合物基质，同时也称为聚合物基质骨架。任选地，一个或者多个功能团结合于聚合物基质中。在优选的实施方案中，聚合材料是树脂，优选地是，层析树脂。聚合性聚合物基质骨架优选的是甲基丙烯酸骨架，正如以下所述，但不限于，市售的TSKTM，和TOYOPEARLTM或者FRACTOGELTM树脂(Tosoh Bioscience，Montgomeryville，PA)。这些包括，但不限于，带正电的、带负电的、不带电的、疏水功能团或者它们的组合。特别优选的功能团在以下有更详细的说明。
结合材料可以是任何形式，或者可以制造、加工成形、在形式上制成，或者用于任何固体表面的支持物上，包括，但不限于，珠子、膜、筒、滤器、浸量尺、微量滴定板、试管、固体粉末、浇铸或者挤压成型模具、筛网、磁珠复合材料、或者任何其它的用如下材料包被的固体材料，如聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙酯、人造丝、尼龙、聚(乙烯基丁酸盐)、聚偏乙烯双氟化物(PVDF)、硅酮、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、硝化纤维、以及类似物。可选择地，可以应用形成凝胶的物质，如蛋白(如明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺。形成多个水相的聚合物也是适合的，如葡聚糖、聚烷撑乙二醇或者表面活性剂，如磷脂、长链(12-24个碳原子)的烷基铵盐以及类似物。结合材料任选地分布于这些组分中。
结合材料特别优选地，是颗粒、微粒或者珠子形式。微粒结合材料优选地具有大小从大约1μm到500μm的范围，更优选地是从大约20μm到150μm的颗粒或者珠子。
功能团
按照本发明的某些方面和实施方案的朊病毒蛋白结合材料包括功能团。在此应用的术语“功能团”是指化学基团、亚基、或者亚结构，它们对分子或者材料赋予化学、物理或者物理化学特征。在此说明的功能团包括，但不限于，亲水性的功能团，如带正电的、带负电的或者不带电的或者中性的、或者疏水的功能团。也预想了两性分子或者多功能性的功能团，并且它们也属于本发明的范围。功能团包括有机的和无机的功能团。优选的功能团含有胺、苯基或者亚硫酸盐基团。优选的胺基是伯胺、仲胺、叔胺或者季铵离子，如二甲基氨基乙基(DMAE)或者三甲基氨基乙基(TMAE)。其它的例证性功能团包括，但不限于：-CH2-CHOH-CH2NH2；-C6H5；-(CH2)3-CH3；-CH2-CH2-N+H(C2H5)2；-SO2-CH2-CF3；-CH2-CH2-N+H(CH3)2；-CH2-CH2-N+(CH3)3；-SO3 2-。另一些可用的功能团包括磺酰基和2，2，2-三氟乙烷磺酰基(tresyl)。
尽管并不想要受限于本叙述，但应该想到朊病毒蛋白具有三种不同的结合区域，它们分别与带正电的功能团、带负电的功能团和疏水的功能团结合。因此，应用一种或者几种结合材料，每一种包括一个或者多个类型的功能团，用于增加和/或更加特异地鉴定或去除样品中的朊病毒蛋白。当应用两个或者更多个结合材料时，样品与两种或者多种结合材料同时接触，或者一个接一个，或者以任意次序相接触。因此，结合材料优选地由两种或者更多种结合材料组成，每一种或者含有带正电的功能团、带负电的功能团、不带电的功能团，或者含有疏水的功能团。当结合材料是以微粒形式并且采用柱层析时，每一种不同类型的结合材料可以在同一个柱子中或者分别在不同的柱子中。在更为优选的实施方案中，应用三种结合材料，一种是具有带正电的功能团，一种是具有带负电的功能团，一种是具有疏水性的功能团。
正如在此所应用的，术语“带正电的功能团”是指带有净正电荷的化学成分。正电荷功能团的非限定性例子包括，含有氨基的基团，如伯胺、二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、三甲基氨基乙基和四级氨基基团。术语“带负电的功能团”在此是指带有净负电荷的化学成分。术语“不带电荷的功能团”在此是指中性的或者不带电荷的任何化学成分。带负电荷的功能团的非限定性实例包括含有亚硫酸盐的基团。此外，术语“疏水功能团”是指对于用水浸湿有抗性的任何基团，包括烷基、芳香基团、硅氧烷和氟化的基团。疏水功能团的非限定性实例是含有苯基和丁基的基团。术语“两性的功能团”是指同时疏水和亲水的基团。
本发明的某些方面和实施方案中，朊病毒结合材料含有带正电荷的功能团、带负电荷的功能团、和无电荷或中性的功能团、疏水的功能团或者两者都有。带负电荷的功能团的一个例子是含亚硫酸的基团。带正电荷的功能团的一个例子是氨基基团。不带电荷的功能团的一个例子是苯基或丁基基团。疏水功能团的例子是苯基基团或丁基基团。根据本发明的某些方面和实施方案，使用氨基基团，包括结合材料中的伯胺、仲胺、叔胺或季铵基团都是对朊病毒结合有独特优势的。然而，使用不同的基团，这依赖于特定的朊病毒蛋白，样品，以及样品与结合材料接触的条件都在本发明的范围内。
很多种不同的物质可任选地用于结合材料，如薄层，例如，为了赋予结合材料不同的期望特征。例如，蛋白包被，例如，明胶可以用于避免非特异结合并且增强信号的检测或者其它类似的特性。
表面功能化以及间隔基
在优选的实施方案中，结合材料在它们的表面具有不同的功能团。应当理解到，这些功能团固有地存在于结合材料的表面，或者可以通过本技术领域熟练技术人员已知的程序加入到结合材料的表面。连接各种不同的基团或者化合物于不同的表面的技术方法是公知的，并且这些方法详细地描述于参考文献中。
功能团是用于结合朊病毒蛋白的，按照在此描述的方法，用于连接另外的功能团，或者用于任何物理、化学或者物理化学特性的任何修饰，物质的特性，例如但不限于，其离子特性或者疏水性。存在于优选的结合材料表面的功能团包括，但不限于，羧酸、醛、氨基、氰基、烯基、羟基、巯基、环氧基及其类似基团。
在优选的实施方案中，功能团可以包括间隔基。间隔基是在也被称作基质或者支持物的材料和功能团之间提供空间和距离的基团。间隔基优选地由碳、氮或氧原子组成。一方面，间隔基被用于更好地改变朊病毒蛋白结合材料的朊病毒蛋白结合属性。按照某些实施方案，间隔基的长度可以是多至20个原子，或者多至15个原子，或者5个到10个原子。间隔基优选地，但不限于由烷基、聚乙二醇(PEG)、碳水化合物基团、氨基酸、长至20个氨基酸长度的肽或者从1到10个氨基酸长度的肽或者其混合物组成。最优选地，间隔基含有烷基和PEG的组合。
市售层析树脂
优选地，结合材料是一种或者多种以下的市售层析树脂：FRACTOGELTM EMD；TOYOPEARLTM Amino、Butyl、Phenyl、或者AF-Tresyl；或者TSK-GELTM Amino，Phenyl或者DEAE树脂。更加优选地，结合材料包括，但不限于：FRACTOGELTM EMD TMAE，FRACTOGELTM EMD SO3 2-，FRACTOGELTM EMD DMAE，ToyopearlTMAmino，TSK-GELTM Amino，TSK-GELTM Phenyl，TSK-GELTM DEAE，TOYOPEARLTM Butyl，TOYOPEARLTM Phenyl，氧化铝，TOYOPEARLTM AF-Tresyl，以及硅土树脂。在最优选的实施方案中，结合材料是TOYOPEARLTM Amino，TSK-GELTM Amino，TSK-GELTMPhenyl或者FRACTOGELTM EMD SO3 2-。已经预想了应用其它市售层析树脂以及支持物，包括无机支持物，其也属于本发明的范围。
在本发明优选的实施方案中，结合材料包括聚甲基丙烯酸酯，羟基聚甲基丙烯酸酯，或者AMINO 650TM树脂(Tosoh Biosciences)，以及氨基，如伯胺、仲胺、或者叔胺。按照优选的实施方案的结合材料可以进一步包括如结构式O-R-O-CH2-CHOH-CH2的间隔基，其中R的长度是1-10个碳。结合材料可任选地涂覆到或者图案化施加到固体支持物上，如珠子、膜或者层析树脂。
结合材料的鉴定
除了以上列出的结合材料外，可以按照如下所述，鉴定另外的结合材料。筛选结合材料结合朊病毒分析物的能力。在此使用的术语“分析物”或“多个分析物”是指多种分子，包括，但不局限于，蛋白质、多糖和它们的任何聚集体或混合物。结合材料用已知含有朊病毒蛋白的样品孵育，除去未结合的蛋白质，使用常规方法例如对朊病毒蛋白特异的标记抗体检测结合的蛋白质。分析物已经与其结合的结合材料被鉴定出是合适的结合材料。没有一抗或二抗的对照组也用于除去非特异结合的材料。
在优选的实施方案中，被鉴定的结合材料与其结合的朊病毒分析物是在来源于人或动物的血或脑样品中发现的朊病毒蛋白。更优选地，分析物是在血或来源于血的产物中发现的。进一步优选地，分析物与人或动物的TSE或者TSE的诱发因子相关。
使用结合材料除去朊病毒蛋白
结合朊病毒蛋白或者朊病毒蛋白片断的结合材料在多种分析、制备和诊断应用中有用。在一些实施方案中，结合材料含有固相，或者固体表面，以珠子或膜的形式存在，可以用于从样品中结合和除去朊病毒蛋白或肽。结合材料可以接触样品，例如生物液体，在足以导致形成朊病毒蛋白结合材料复合物的条件下，样品中的朊病毒蛋白结合到结合材料上。然后结合材料从样品中分离，从而除去与样品的配体结合的朊病毒蛋白。使用用于结合蛋白的珠子和膜的方法在技术领域是公知的，例如在Baumbach等人的美国专利U.S.5,834,318和PCT/US01/11150中描述的。
在本发明的一些实施方案中，基本上所有朊病毒蛋白都可以从样品中除去。“基本上所有”的意思是朊病毒蛋白的浓度显著降低。换句话说，把所有样品或部分样品转移到健康患者身上只能带来在公众健康指导方针下可以接受的低的朊病毒传染的风险。使用单一结合材料或者多种结合材料，基本上所有朊病毒蛋白可以同时或者连续地从样品中除去。当使用多种结合材料时，优选地，如以上描述的，使用两种或者更多种结合材料，每种含有正电荷功能团、负电荷功能团或者疏水功能团。在更优选的实施方案中，使用两种或多种结合材料，每种含负电荷功能团或者疏水功能团。样品接连地以任何顺序与两种或多种结合材料接触。在优选实施方案中，使用三种结合材料，每一种含有一种正电荷功能团、负电荷功能团和疏水功能团。
在其他的实施方案中，只有特定的朊病毒材料从样品中除去。例如，只有传染性朊病毒(PrPsc)从样品中除去或者只有非传染性朊病毒(PrPc)从样品中除去。在此描述的一个重要发现是多种具有不同朊病毒特异性的结合材料的鉴定。表4所示为几种结合材料和它们对仓鼠和人，非传染性和传染性朊病毒的特异性。选择性除去人PrPsc的优选结合材料含有氨基基团，例如包括在ToyopearlTM Amino-650M或者TSK-GELTM-Amino 750C色谱柱树脂或其功能相当物中的氨基基团，或者含有苯基基团，例如在TSK-GELTM Phenyl-5PW或功能相当物中含有的苯基基团。
优选地，结合材料是填充在柱子例如色谱柱中的珠子。然后样品溶液、匀浆液或悬液或者由于重力或者由于压力通过柱子，例如高压液相色谱柱子。样品中的朊病毒蛋白将如在此描述的结合到柱子中的结合材料上。收集通过柱子的样品，除去朊病毒污染或者至少减少朊病毒物质的水平。
一旦样品通过柱子，洗脱结合的朊病毒蛋白，并且将其收集用于分析，或者如果需要的话，用于诊断或预示目的。假如期望从结合材料中除去朊病毒蛋白，柱子的流动相可以首先变为除去弱结合杂质的缓冲液，从而洗涤柱子。然后通过煮沸或者通过加入含有强去污剂例如十二烷基肌氨酸钠去垢剂(十二烷基肌氨酸钠，Shelton Scientific-IBI，Shelton，CT)或者十二烷基硫酸钠(SDS)，离液剂例如盐酸胍，或低pH的试剂例如乙酸，或者通过结合配体的化学修饰例如氨基基团的乙酰化作用从柱子上除去朊病毒蛋白。
从其中除去朊病毒的生物样品的例子包括，但不局限于，全血、来源于血液的组合物或组分、血清、脑脊液、尿、唾液、奶、肠液、眼泪、精液或者人或动物的脑源组分。别的生物样品包括那些含有胶原或腺体提取物的生物样品。在一个实施方案中，朊病毒通过使用含有一种或多种在此描述的结合材料的血液透析环从人或动物的血中除去。在该实施方案中，血液从人或动物中除去，直接注入含有一种或多种在此描述的结合材料的设备中，其中朊病毒蛋白从血液中除去是由于它们结合到结合材料上，然后无朊病毒的血液或朊病毒减少的血液直接导入返回至人或动物体中。
朊病毒蛋白也可以使用在此描述的结合材料从(或者用于动物或者用于人的消耗的)生物样品例如食品中除去。例如，样品含有来源于动物的或者从动物获得的动物材料，包括，但不局限于，牛、羊、猪、马、鼠、仓鼠或者鹿科动物。可替代地，样品材料可以是指人；牛科；羊科；猪科；马科；鼠科，例如来源于鼠和仓鼠；和来源于鹿科的材料，例如鹿和驼鹿。朊病毒蛋白可以根据本发明的某些方面和实施方案所涉及的方法从其中除去的来源于动物的材料包括，但不局限于明胶、果冻、奶、胶原和婴儿配方食品。朊病毒蛋白根据本发明的某些方面和实施方案所涉及的方法从其中根据除去的样品也包括，但不局限于，药品组分、治疗组分、营养添加组分、食品或者化妆品组分。
根据优选的实施方案，样品是蛋白溶液，含有多种蛋白质，包括，但不局限于，人或动物的血清白蛋白。例如，样品可以是，但不局限于，含有人血清白蛋白作为稳定剂的血浆蛋白制剂、免疫球蛋白制剂、纤维蛋白原制剂、凝血因子XIII制剂、凝血酶制剂、凝血因子VIII制剂、冯·维勒布兰德凝血因子制剂(von Willebrand factor preparation)、蛋白质C制剂、激活蛋白C制剂或者前述的任何组合制剂或改变；含有人血清白蛋白的治疗产品；人或动物血清白蛋白制剂；以及含有人或动物血清白蛋白作为稳定剂的稀释蛋白制剂。根据优选实施方案，样品含有人或动物血清白蛋白的浓度高达大约50％(w/v)，或者从大约1％到大约50％，或者从大约5％到大约25％。在一个方面，在优选实施方案中，本发明出乎意料地并且有利地从具有高浓度的蛋白质，特别是血蛋白，例如血清白蛋白的样品中或在其中除去、分离或结合朊病毒蛋白。
在此描述的结合材料也用于从环境样品如来源于诸如溪流、河、蓄水池、井、水处理设备或消遣用水的水中除去朊病毒蛋白。
使用结合材料检测朊病毒
在此描述的结合材料也在检测生物或环境样品中存在朊病毒蛋白或肽或者量化朊病毒蛋白或肽的方法中使用。在其中检测朊病毒蛋白的生物样品包括，但不局限于，全血、来源于血液的组合物或组分、血清、脑脊液、尿液、唾液、奶、肠液、眼泪、精液、来源于脑的组合物、粪便、或胶原的提取物或匀浆、腺体、组织(例如扁桃体或盲肠)或器官。定性和定量的检测方法都被预想到，并且都在本发明的某些方面和实施方案的范围内。
如以上描述的关于朊病毒蛋白的去除，结合材料也用于检测作为食品的来源于动物的材料中朊病毒蛋白的存在。对于检测目的，术语“来源于动物的材料”是指以上描述的材料和含有动物部件的材料，例如肌肉、结缔组织或者器官组织。来源于动物的材料进一步包括，但不局限于，骨粉、牛肉、牛肉副产品、羊、羊副产品、鹿、鹿副产品、猪肉、猪肉副产品、香肠、火腿和婴幼儿食品。
在此描述的结合材料也用于检测环境样品，例如那些以上描述的环境样品和土壤提取物中的朊病毒蛋白。
由于发现多种具有不同朊病毒结合特性的结合材料，所以结合材料在单一样品中或样品之间区别传染性和非传染性朊病毒的方法中有用。因此，提供了用于诊断和预测人或动物的朊病毒疾病的方法。朊病毒疾病包括，但不局限于，可传播的海绵状脑病(TSEs)，例如骚痒症，该疾病可以影响绵羊和山羊；牛海绵状脑病(BSE)，可以影响牛；可传播的水貂脑病，猫的海绵状脑病，和长耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和驼鹿的慢性消瘦病(CWD)；苦鲁病，皮层-基底节-脊髓变性症候群(CJD)，格-施-沙综合征(GSS)，致命性不眠症和变异的皮层-基底节-脊髓变性症候群(vCJD)，这些疾病都会影响人类。
在一个实施方案中，使样品通过对PrPsc比对PrPc有更高特异性的结合材料，使用以下描述的方法检测结合的PrPsc朊病毒。然后使相同的样品通过对PrPc比对PrPsc有更高特异性的结合材料，使用以下描述的方法检测结合的PrPc。表4提供了几种结合PrPc和PrPsc的结合材料的特异性。优选地，选择性检测人PrPsc的结合材料含有类似于TOYOPEARLTM TSK-GELTM-Amino 750C Amino-650M 或TSK-GELTM-Amino 750C化合物中含有的氨基基团，或者含有类似于TSK-GELTM Phenyl-5PW(所有树脂来自Tosoh Biosciences，Montgomeryville，PA)中含有的苯基。
当使用在此提供的方法检测样品中的朊病毒时，样品与结合材料在足以造成朊病毒蛋白和结合材料之间形成复合物的条件下接触。然后用常规方法检测复合物，从而检测样品中朊病毒的存在。例如，结合材料(第一配体)可以用可检测的标记物进行标记。作为可替代的例子，复合物可以通过标记第二配体，例如抗体或别的蛋白质，把标记的第二配体与样品在存在结合材料的条件下进行结合，检测标记了的第二配体-朊病毒-结合材料复合物进行检测。第二配体可以共价地或者非共价地结合于朊病毒。已知有多种标记物和结合技术，并且广泛地在科学和专利文献中被报导。在一个实施方案中，第二配体在生产的过程中被标记。合适的标记物包括放射性核苷酸、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光成分、化学发光组分、磁性颗粒以及类似物。
结合于朊病毒蛋白结合材料的朊病毒蛋白，或者朊病毒蛋白-朊病毒结合材料复合物的定性和定量的检测方法包括在本发明的某些方面和实施方案的范围内。形成复合物的朊病毒结合材料可以被填充到或在制成柱子、膜或过滤器，或者结合到或制成或固定在固体支持物上。定性和定量地检测结合的朊病毒蛋白，并且随后从朊病毒结合材料上释放的方法也包括在本发明的某些方面和实施方案的范围内。
检测可以用任何方法进行，包括免疫印迹、Western分析、凝胶移位分析、放射性或生物发光标记物的示踪法、核磁共振、电子顺磁共振、停流光谱法、柱色谱法、毛细管电泳或者别的基于大小或电荷，或两者的变化的分子示踪方法。检测前，第二配体-朊病毒复合物可以或者可以不与结合材料分离。其它测定分析方法包括，但不局限于，脂质体免疫测定法(LIAs)，这种方法使用设计用于结合特异分子(如第二配体)的脂质体，并且释放被包被的试剂或标记物。然后释放的化学药物根据标准技术进行检测。
非放射性标记物通常用间接的方法加上。一般地，第二配体分子(如，生物素)共价结合于结合材料(第一配体)上。然后第二配体结合于第三配体(如，链菌抗生物素)分子，该第三配体分子或者固有的可检测，或者共价结合于信号系统，如可检测的酶、荧光化合物、或者化学发光化合物。可以使用多种第二和第三配体。当第二配体具有天然的第三配体，例如，生物素、甲状腺素和皮质醇，第二配体可以用于与标记的、天然发生的第三配体结合。可替代地，任何半抗原或抗原化合物可以与抗体结合。
用于检测结合材料-朊病毒复合物的特定标记物或可检测基团并不是关键的。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学特性的任何材料。这样的可检测标记物已经得到了很好的发展，一般地，在这些方法中使用的任何标记物可以运用于本方法中。所以，标记物可以是任何可以被分光镜、光化学的、生化的、免疫化学的、电子的、光学的或者化学的方法检测的组分。有用的标记物包括荧光染料(如，异硫氰酸荧光素，德克萨斯红，若丹明等等)，放射性标记物(如，3H，125I，35S，14C，或32p)，酶(如，LacZ(β半乳糖苷酶)，CAT(氯霉素乙酰转移酶)，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，以及一般在EIA(酶免疫测定)或者ELISA(酶联免疫吸附分析)中用作可检测酶的其它酶，和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如，聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳，等等)珠子。标记物可以根据本技术领域公知的方法直接或间接连接到想要分析的组分上。如以上所示，许多标记物都可以使用，标记物的选择取决于所需要的灵敏度，化合物偶联的容易性，稳定性要求，可以获得的设备，和垃圾处理规定。
第二配体也可以直接连接到信号产生化合物上，如，通过与酶或荧光基团相连。感兴趣的作为标记物的酶首选是水解酶，特别是磷酸酯酶、酯酶和糖苷酶或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括，但不局限于，萤光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，伞形花内酯，等等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢-2，3-二氮杂萘二酮，如鲁米诺。
本技术领域的普通技术人员公知检测标记物的方法。所以，例如，在标记物是放射性标记物的情况下，检测方法包括，但不局限于，用闪烁计数器或照相胶片作放射自显影。当标记物是荧光标记物时，可以通过用合适波长的光激发荧光，并且检测所得到的荧光来检测，如通过显微镜、目测，通过照相胶片，通过使用电子探测器如电荷耦合器件(CCDs)或光电倍增管，以及类似方法。类似地，酶标记物可以通过提供合适的酶的底物，并且检测得到的反应产物进行检测。最后，单一比色标记物可以简单地通过观察与标记物相关的颜色进行检测。所以，在多种浸渍分析中，共轭金通常呈紫色，同时多种共轭珠子呈珠子的颜色。
本发明的结合材料也可以用于除去或检测从固体样品材料提取到溶液中的朊病毒蛋白或肽。例如，固体样品可以用含水溶液、有机溶剂或临界液体提取，得到的上清可以与结合材料接触。固体样品的例子包括，但不局限于，动物来源的产品，特别是那些暴露于传染朊病毒的产品，如，来源于牛的骨粉。在一些实施方案中，结合材料可以用于检测土壤中存在的朊病毒蛋白。其它的固体样品包括，但不局限于，脑组织、角膜组织、粪便物、骨粉、牛副产品、羊、羊副产品、鹿和驼鹿、鹿和驼鹿的副产品、以及别的动物或动物来源的产品。
可替代地，朊病毒或朊病毒结合材料复合物可以用蛋白酶K(PK)处理。PrPc对PK高度敏感，同时PrPsc被部分消化形成PrPres。PrPres分子本身对蛋白水解作用具有高度抗性，所以，PK处理将消化PrPc，并且将把PK敏感的PrPsc转化为PrPres。除去PK后，PrPres可以变性，被抗体如3F4检测出来。
在另一个实施方案中，根据本发明，结合材料可以用于把PrPc中的PrPsc选择浓缩。
结合材料用于朊病毒定量
结合材料-朊病毒复合物或可替代地，朊病毒或结合材料-朊病毒复合物的抗体可以通过本技术领域的普通技术人员已知的多种方法中的任何一种方法进行检测和定量。这些方法包括但不局限于，分析生物化学方法如分光光度法、放射照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、高扩散色谱法(hyperdiffusionchromatography)和类似方法，以及多种免疫方法，如但不局限于，液体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫分析(RIAs)、酶联免疫吸收分析(ELISAs)、免疫荧光分析和类似方法。
降低非特异性结合
当使用固体支持物作为分析组分来检测样品中的朊病毒蛋白时，本技术领域的普通技术人员应该意识到，通常期望降低对固体支持物的非特异结合。本技术领域的普通技术人员熟悉降低这样的非特异结合的方法。一般地，这涉及用蛋白质组分把固体支持物进行包被。特别地，蛋白质组分，如牛和人的血清白蛋白(BSA)，和明胶可以被广泛使用。
本发明将通过具体的实施例进行更详细的描述。以下实施例用于举例说明，并非以任何方式对发明进行限制或限定。
实施例1
朊病毒结合材料的确认
采用正常的仓鼠脑匀浆液，如以下描述的，使用NBT/BCIP发色团(氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸-p-甲苯胺盐)，运用朊病毒珠上结合实验，检验80种聚合物或无机粒子。结合结果见表1，其中“-”表示没有结合，“+”表示阳性结合。粒子等级中的“+”越多，观察到的结合就越强。具有至少“++”的12种粒子需要进一步评估。表2总结了12种粒子结合正常仓鼠朊病毒蛋白的能力。越高的分值表示朊病毒结合的量有所增加。
表1
筛选用于朊病毒蛋白结合的聚合材料或无机粒子
| 参考序号 | 名称 | 制造商 | 结合结果 |
| 1 | ToyopearlTMAmino-650M | Tosoh Bioscience(Montgomeryville，PA) | +++ |
| 1’ | Acetylated Amino-650M | 由North Carolina StateUniversity(NCSU)进行乙酰化，使用ToyopearlTMAmino 650M | - |
| 2 | TSK-GEL TM Amino 750C | Tosoh Bioscience | +++ |
| 3 | ToyopearlTMEpoxy 700EC | Tosoh Bioscience | + |
| 4 | ToyopearlTMAF-Carboxy-650M | Tosoh Bioscience | - |
| 5 | ToyopearlTMAF-Heparin-650M | Tosoh Bioscience | + |
| 6 | AmberchromTM CG-71m | Tosoh Bioscience | - |
| 7 | AmberchromTM CG-300m | Tosoh Bioscience | - |
| 8 | ToyopearlTM HW-40C | Tosoh Bioscience | - |
| 9 | ToyopearlTM HW-50F | Tosoh Bioscience | - |
| 10 | ToyopearlTM AF-Chelate-650M | Tosoh Bioscience | - |
| 11 | ToyopearlTM DEAE-650M | Tosoh Bioscience | + |
| 12 | ToyopearlTM DEAE-650C | Tosoh Bioscience | - |
| 13 | ToyopearlTM Super Q-650M | Tosoh Bioscience | + |
| 14 | ToyopearlTM Super Q-650C | Tosoh Bioscience | + |
| 15 | ToyopearlTM QAE-550C | Tosoh Bioscience | - |
| 16 | ToyopearlTM CM-650M | Tosoh Bioscience | - |
| 16’ | ToyopearlTM CM-650C | Tosoh Bioscience | - |
| 17 | ToyopearlTM SP-650M | Tosoh Bioscience | - |
| 18 | ToyopearlTM SP-550C | Tosoh Bioscience | - |
| 19 | TSK-GELTM Ether-5PW | Tosoh Bioscience | - |
| 20 | TSK-GELTM Phenyl-5PW | Tosoh Bioscience | +++ |
| 21 | ToyopearlTM Butyl-650C | Tosoh Bioscience | ++ |
| 22 | ToyopearlTM Phenyl-650C | Tosoh Bioscience | ++ |
| 23 | ToyopearlTM Hexyl-650C | Tosoh Bioscience | - |
| 24 | TSK-GELTM DEAE-5PW | Tosoh Bioscience | +++ |
| 25 | TSK-GELTM Q-5PW | Tosoh Bioscience | + |
| 26 | ToyopearlTM AF-Tresyl 650M | Tosoh Bioscience | ++ |
| 27 | AmberliteTM XAD-7HP | Supelco(Bellefonte，PA) | - |
| 28 | Amberlite TM XAD-1180 | Supelco | - |
| 29 | Diaion/sepabeadsTM HP 20SS | Supelco | - |
| 30 | Diaion/sepabeadsTMSP 207 | Supelco | + |
| 31 | MCI Gel CHP 20P | Supelco | - |
| 32 | Silica gel grade 7754 | Supelco | - |
| 33 | DavisilTM Silica gel grade 634 | Supelco | - |
| 34 | DavisilTM Silica gel grade 643 | Supelco | - |
| 35 | Blue rayon trisulfonated(syn：Copper Phthalocyamine) | Supelco | 没有测试。是bluerayon纤维。 |
| 36 | AmberliteTM IRC-718 | Supelco | - |
| 37 | DiaionTM CR 20 | Supelco | - |
| 38 | AmberliteTM IRA-958 | Supelco | - |
| 39 | DowexTM MSA-1 | Supelco | - |
| 40 | AmberliteTM IRA-910 | Supelco | + |
| 41 | DiaionTM PA 418 | Supelco | - |
| 42 | FractogelTM EMD DMAE650(S) | E.Merck(Gibbstown，NJ) | ++++ |
| 43 | FractogelTM EMD Phenyl1650(S) | E.Merck | - |
| 44 | FractogerlTM EMD TMAE650(S) | E.Merck | +++++ |
| 45 | FractogelTM EMD Propyl 650(S) | E.Merck | - |
| 46 | FractogelTM EMD Amino(M) | E.Merck | - |
| 47 | FractogelTM EMD SO3 2-650(S) | E.Merck | ++ |
| 48 | FractogelTM EMD COO-650(S) | E.Merck | + |
| 49 | PMMAPoly(methylmethacrylate) | Bangs Laboratories(Fishers，IN) | - |
| 50 | Aluminum oxide-100+325 | Aldrich(Milwaukee，WI) | ++ |
| 51 | Polyethylene | Aldrich | - |
| 52 | Aluminum oxide-100+400 | Aldrich | + |
| 53 | Poly(styrene/maleic anhydride) | Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO) | - |
| 54 | Aminomethylpolystyrene resin | Aldrich | - |
| 55 | Aluminum oxide，activated | Aldrich | - |
| 56 | Silica，fumed | Aldrich | ++ |
| 57 | PVDF SOLVAY 1008/1001 | Solvay(Auburn Hills，MI) | ++++(非特异性)* |
| 58 | PVDF SOLVAY 1015/1001 | Solvay | +++(非特异性)* |
| 59 | Silica gel for column，35-70um | Acros(Pittsburgh，PA) | - |
| 60 | Silica gel 60-200mesh | Acros | - |
| 61 | PolyStyrene，0.93um | Bangs | 没有实验，乳液 |
| 62 | Bangs Lab Silica，0.20um | Bangs | 没有实验，乳液 |
| 63 | Bangs Lab Silica，0.97um | Bangs | 没有实验，乳液 |
| 64 | 1，2DAP1-Epoxy 700EC | Aldrich | - |
| 65 | 1，3DAP-Epoxy 700EC | Aldrich | - |
| 66 | 1，4DAB2-Epoxy 700EC | Aldrich | - |
| 67 | L-Lysine-Epoxy 700EC | Aldrich | + |
| 68 | TETA3-Epoxy 700EC | Aldrich | + |
| 69 | Prometic CG-1083 | Prometic BioSciences(Cambridge，UK) | ++++(非特异性)* |
| 70 | Prometic CG-1085 | Prometic BioSciences | +(非特异性)* |
| 71 | Prometic CG-1086 | Prometic BioSciences | +(非特异性)* |
| 72 | Prometic CG-1082(紫色) | Prometic BioSciences | +(非特异性)* |
| 73 | Prometic CG-1084(紫色) | Prometic BioSciences | ++(非特异性)* |
| 74 | Prometic CG-1087(紫色) | Prometic BioSciences | +(非特异性)* |
| 75 | Prometic CG-1014(紫色) | Prometic BioSciences | ++(非特异性)* |
| 78 | Prometic CG-1107(紫色) | Prometic BioSciences | ++++(非特异性)* |
| 79 | Prometic CG-1108(紫色) | Prometic BioSciences | ++++(非特异性)* |
| 76 | Ethylenediamine，polymer-bound | Aldrich | - |
| 77 | Pharmacia Source 30Q | Pharmacia(Piscataway，NJ) | + |
| 80 | Clear-Base Resin(HCl) | Peptide International(Louisville，KY) | - |
1DAP：二氨基丙烷
2DAB：二氨基丁烷
3TETA：三亚乙基四胺
4AmberchomTM是Rohm and Haas Company(Philadelphia，PA)的注册商标
*Nonspecific：指没有抗体3F4的阴性对照，具有与用抗体3F4检测的信号相同的信号。
表2
聚合结合材料结合一般仓鼠朊病毒(HaPrPc)的能力
| 聚合物化合物 | 基本树脂 | 制造商 | HaPrPc |
| FractogelTM EMDTMAE 650(S) | PMMA** | E.Merck | 5 |
| FractogelTM EMD SO3 2-650(S) | PMMA | E.Merck | 2 |
| FractogelTM EMDDMAE 650(S) | PMMA | E.Merck | 4 |
| ToyopearlTMAmino-650M | PMMA | Tosoh Bioscience | 3 |
| TSK-GELTM Amino750C | PMMA | Tosoh Bioscience | 3 |
| TSK-GELTMPhenyl-5PW | PMMA | Tosoh Bioscience | 3 |
| TSK-GELTMDEAE-5PW | PMMA | Tosoh Bioscience | 3 |
| ToyopearlTMButyl-650C | PMMA | Tosoh Bioscience | 2 |
| ToyopearlTMPhenyl-650C | PMMA | Tosoh Bioscience | 2 |
| Aluminumoxide-100+325 | Al2O3 | Aldrich | 2 |
| Aldrich silica，fumed | SiO2 | Aldrich | 2 |
| ToyopearlTM AF-Tresyl650M | PMMA | Tosoh Bioscience | 2 |
**PMMA：聚合的甲基丙烯酸酯
如下进行使用NBT/BCIP的朊病毒珠上结合实验(prion bindingon-beads test)。从10％的仑鼠脑组织匀浆中获得正常PrP，样品于室温在搅拌器中溶于0.5％十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)(200μL的10％到4ml脑组织)中30分钟。样品以14,000rpm离心5分钟。弃上清，并且将其用所需的培养基稀释。将96孔微量滴定平板(Cat.No.3075，Becton Dickinson，Franklin Lanes，NJ)和Millipore MultiScreen-DV板(Cat.No.MADV N65 10，Millipore公司，Bedford，MA)，首先用购自Pierce(Rockford，IL)的1％(W/V)酪蛋白以200μL/孔于65℃封闭1小时。10毫克(10mg)干珠子在1ml的10mM PBS pH 7.4中溶胀，洗涤2次。倒空微量滴定板，每孔加入20-30μl溶涨珠子的悬液。悬液沉降，弃去多余的水分。
将正常仑鼠脑匀浆物予以稀释，是以1∶10稀释在5％的人血清白蛋白(Alpha Therapeutic Corp.Los Angeles，CA)中，其中5％的人血清白蛋白已经在60℃下被热处理10小时。每孔加入150μL体积的悬液，与珠子室温孵育1.5小时。弃去未结合的蛋白溶液，往每孔中加入100μL的、以1∶4000稀释在1％酪蛋白中的3F4单克隆抗体(SignetLaboratories，Inc.，Dedham，MA)。对照孔含有100μl的1％酪蛋白。珠子用3F4孵育，于4℃轻微摇晃过夜。
然后珠子用10mM pH 7.4的PBS+10μM CuCl2洗涤2次。将第二抗体，即结合了碱性磷酸酶的抗鼠IgG偶联物(#A3688，Sigma，St.Louis，MO)，以1∶1000在1％酪蛋白中稀释，并以100μl/孔的体积加入孔中。样品室温振荡孵育1小时。将所有的珠子转移到Millipore(Bedford，MA)MultiScreen-DV板进行洗涤。样品用pH 7.4的PBS+Cu2++Tween 20(0.05％)洗涤3次，用PBS+Cu2+洗涤3次，用1M NaCl洗涤2次，用pH 9.5的50mM Tris-HCl+5mM MgCl2洗涤2次。
将1步骤NBT/BCIP底物混匀，将100μl直接加入每一孔中，直到得到理想的显色(亮紫)。一般孵育5-15分钟。滤纸(#1703932，BioRad，Hercules，CA)裁成合适形状，用蒸馏水湿润。珠子悬液真空下加入到S & S Minifold I Dot-Blot系统(Schleicher-Schuell Bioscience，Keene，NH)的印迹孔中。孔用水漂洗，将结果扫描到计算机中。
实施例2
朊病毒结合材料的确定
使用两种不同的检测系统，用仑鼠脑匀浆物以成批模式进行朊病毒结合材料的鉴定。首先，用靶材料孵育后对珠子进行染色检测朊病毒结合到材料的量。第二种方法检测流出液中含有的未结合成分中存在的朊病毒量，并且用SDS-PAGE和western印迹洗涤样品。每种方法的详细描述如下。
如以下表3所示，ToyopearlTM Amino-650M，TSK-GELTM Amino750C和TSK-GELTM Phenyl-5PW提供了仑鼠脑PrPc的最特异的结合。
表3
第二次筛选的结果
| 聚合物颗粒 | 通过使用NBT/BCIP的珠上实验评价结合作用 | 通过用ECL-plus的Western印迹评价结合作用 |
| ToyopearlTM Amino-650M | +++ | +++ |
| TSK-GELTM Amino 750C | +++ | +++ |
| TSK-GELTM Phenyl-5PW | +++ | ++++ |
| ToyopearlTM Butyl-650C | ++ | + |
| ToyopearlTM Phenyl-650C | ++ | + |
| TSK-GELTM DEAE-5PW | +++ | 5+(非特异性) |
| ToyopearlTM AF-Tresyl 650M | ++ | - |
| FractogelTM EMD DMAE 650(S) | ++++ | 5+(非特异性) |
| FractogelTM EMD TMAE 650(S) | +++++ | 5+(非特异性) |
| FractogelTM EMD SO3 2-650(S) | ++ | +++ |
| Aluminum oxide-100+325 | ++ | + |
| Aldrich silica，fumed | ++ | 5+(非特异性) |
对于珠上检测方法，将96孔微粒滴定板(Cat.no.3075，Falcon，Becton Dickinson，Franklin Lanes，NJ)和Millipore Multiscreen-DV板(Cat.no.MADV N65 10，Millipore，Bedford，MA)用1％(w/v)酪蛋白以200μL/孔于65℃封闭1小时。将每份10毫克的每种聚合物浸泡于1mL的pH 7.4的10mM PBS中，洗涤2次。排空96孔板，每孔加入20-30μL的树脂悬液。树脂沉降，弃去多余溶液。往树脂中加入150μl以1∶10溶于5％人血清白蛋白中的正常仓鼠脑匀浆溶液。混合物室温孵育1.5小时。排空孔，往每孔中加入处于1％酪蛋白中的100μl 3F4抗体(1∶4000)，冰箱中轻微振荡过夜孵育。然后珠子用100mM pH 7.4的PBS+10μM CuCl2洗涤2次，然后以100μl/孔加入结合了碱性磷酸酶的第二抗体(Cat no.A3688，Sigma，St.Louis，MO)，轻微振荡，室温孵育1小时。
排空所有的孔，将珠子转移到Multi-Screen板中，在该板上用pH7.4的10mM PBS+10μM CuCl2+0.05％Tween 20将珠子洗涤3次，然后用10mM PBS+10μM CuCl2洗涤，用1M NaCl洗涤2次，用pH 9.5的50mM Tris-HCl+5mM MgCl2洗涤2次。
然后已经洗涤的珠子与100μL NBT/BCIP底物反应5-15分钟以显色。使用S & S Minifold I Dot-Blot系统将珠子转移到滤纸上，进行所形成颜色的测定。
对于未结合部分的测定，100μL的每种珠子样品预先用pH 7.4的10mM PBS于4℃过夜湿润，置于微量离心管中。用PBS至少洗涤4次后，转移珠子至Ultrafree-MC 0.45μm过滤单元(UFC30HVNB，Millipore，Bedford，MA)中，用PBS再次洗涤。用0.5％十二烷基肌氨酸钠处理10％的仓鼠脑匀浆液(HBH)，用PBS以1∶10和1∶20稀释。将其往每种珠子样品中加入200μl，振荡孵育8分钟，然后以10,000rpm离心2分钟，回收未结合部分。将26-μL的流出液置于0.7mL微量离心管中，-20℃储存，进行Western印迹分析。
进行Western印迹前解冻样品，加入10μL样品缓冲液(NuPAGE，SDS样品缓冲液，NP0007，Invitrogen，Carlsbad，CA)和4μL还原剂(NuPAGE样品还原剂，NP0004，Invitrogen)(DTT，1M，溶于H2O中)。溶液90-100℃孵育10分钟。将样品加到15孔的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(NP0323，Invitrogen)上。对于每孔凝胶，western印迹分析使用17μL样品，蛋白质染色凝胶使用14μL样品。分子量标记物的体积(MultiMark Multi-Colored Standard，LC5725，Invitrogen)是5μL。Western印迹使用PVDF膜，1％酪蛋白作为封闭剂，1∶10,000的3F4作为一抗，1∶3000的连接有辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗鼠抗体作为二抗，ECL+作为底物。胶片曝光6分钟。
结合到结合材料上的、具有高PrP的样品在流出物中不产生信号，值为“5+”。没有结合的样品的值为“-”。其它样品的值介于这两个值之间。
实施例3
确定朊病毒蛋白结合特异性
一般来说，将由不同结合材料组成的潮湿珠子定量地置于单独的一次性使用的柱子中。含有玻璃材料的柱子小得只能保留珠子，但大到足以让活化溶液(challenge solution)流过。活化溶液是含有朊病毒蛋白的脑匀浆液，溶于十二烷基肌氨酸钠(Sigma)中；掺入到红细胞浓缩共混物中。更具体而言，活化溶液含有TSE传染性人脑匀浆液、传染性仓鼠脑匀浆液、非传染性人脑匀浆液或者非传染性仓鼠脑匀浆液。允许活化溶液在确定的时间期间内通过靶结合材料，同时收集流出液。然后冲洗珠子，从装珠子的柱子定量转移到收集瓶中，这样为了随后确定特异朊病毒蛋白结合和非特异的蛋白结合的处理，从收集瓶中除去已知量的珠子。储存流出液和剩余的反应珠子，以便以后可能的分析。
使用以下描述更为详细的方法，确定七种朊病毒蛋白结合材料的结合活性，如表4中描述。结合材料以结合正常的或者传染性人或者仓鼠朊病毒蛋白的结合能力来分级(表现出结合最大量朊病毒蛋白的结合材料的级别是1)。例如，FractogelTM EMD TMAE 650(S)结合材料(具有甲基丙烯酸骨架和功能团-CH2-CH2-N+(CH3)3)结合最大量的仓鼠和人传染性朊病毒蛋白(PrPsc)，FractogelTMEMD SO3 2-650(S)结合材料(具有甲基丙烯酸骨架和功能团-SO3 2-)结合最大量的仓鼠和人正常朊病毒蛋白。这些数量是通过如下方法确定的，将结合的蛋白从朊病毒结合材料上释放下来，电泳分离释放的蛋白质，使用Western印迹分析从结合材料上释放而来的蛋白质的免疫活性，采用朊病毒特异的单克隆抗体进行。抗体对朊病毒蛋白的结合通过化学发光检测。通过比较胶片上的电泳条带的暗度进行定量(指示与已经结合到结合材料上的朊病毒蛋白相结合的抗体)，对照条带是2ng，10ng和50ng鼠IgG，从而对结合材料确定分值。通过互相直接地比较样品带，确定具有相同分数的结合材料的等级。
表4
11种聚合化合物的分级
二次筛选后，基于它们与正常仓鼠朊病毒(HaPrPc)，正常人朊病毒(HuPrPc)，传染性仓鼠朊病毒(HaPrPsc)和传染性人朊病毒(HuPrPsc)的结合能力进行分级。
| 聚合物化合物和功能团 | 基础树脂 | 制造商 | HaPrPc | HuPrPc | HaPrPsc | HuPrPsc |
| FractogelTM EMDTMAE 650(S)-CH2-CH2-N+(CH3)3 | PMMA | E.Merck | 2 | 2 | 1 | 1 |
| FractogelTM EMDSO3 2-650(S)-SO3 2- | PMMA | E.Merck | 1 | 1 | 10 | 9 |
| FractogelTM EMDDMAE 650(S)-CH2-CH2-N+H(CH3)2 | PMMA | E.Merck | 3 | 3 | 2 | 7 |
| ToyopearlTMAmino-650M-CH2-CHOH-CH2NH2 | PMMA | TosohBioscience | 6 | 10 | 4 | 4 |
| TSK-GELTM Amino750C-CH2-CHOH-CH2NH2 | PMMA | TosohBioscience | 5 | 9 | 3 | 3 |
| TSK-GELTMPhenyl-5PW-C6H5 | PMMA | TosohBioscience | 7 | 5 | 5 | 2 |
| TSK-GELTMDEAE-5PW-CH2-CH2-N+H(C2H5)2 | PMMA | TosohBioscience | 4 | 7 | 6 | 8 |
| ToyopearlTMButyl-650C-(CH2)3-CH3 | PMMA | TosohBioscience | 8 | 4 | 8 | 5 |
| ToyopearlTMPhenyl-650C C6H5 | PMMA | TosohBioscience | 9 | 6 | 9 | 6 |
| Aluminumoxide-100+325 | Al2O3 | Aldrich | 10 | 8 | 7 | 10 |
| ToyopearlTMAF-Tresyl 650MSO2-CH2-CF3 | PMMA | TosohBioscience | 11 | 11 | 11 | 11 |
制备无水珠子
通过把珠子用水配制的20％甲醇溶液湿润，大量制备无水珠子。使用前将珠子静置至少24小时。当无水珠子的最初量在0.5g到2.5g之间时，预湿的珠子浆液转移到50ml塑料锥形管中。弃去多余液体，加入25ml 20％的甲醇。然后样品轻微振荡或者颠倒30秒。当最初的珠子重量超出前述范围时，调节甲醇的体积，少于0.5g的树脂使用10ml甲醇，2.5到4.0g树脂使用40ml甲醇。珠子通过重力沉降大约12-15分钟，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心地提取并且弃去上清溶液(包括细碎物)。将甲醇洗涤一次以上，然后加入20％甲醇，成为1∶1(v/v)的珠子浆液。珠子于4℃储存。
制备珠子浆液
转移440微升(440μl)珠子浆液至15ml塑料锥形管中(每个柱子使用220μl湿珠子)，加入10ml工作缓冲液(20mM柠檬酸缓冲液/140mM NaCl，pH 7.0)。样品轻微振荡或者颠倒30秒。珠子通过重力沉降大约12-15分钟，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心吸除并且弃去上清溶液(包括细碎物)。将工作缓冲液重复冲洗2次以上，加入足量的工作缓冲液，使体积比为1∶1。样品再次轻微振荡或者颠倒30秒，沉降，室温静置过夜。通过加入必要的工作缓冲液保持工作缓冲液的体积为1∶1，将水合珠子于4℃保持在缓冲液中，直到使用。
制备预先水合的珠子
AminoToyopearlTM和别的珠子以20％乙醇中的湿浆液的形式获得，不需要进行额外的水合步骤。然而，要如下平衡至工作缓冲液。生产商估计商品化浆液含有体积百分比为大约72％的树脂，并且每柱子使用300μL浆液。转移珠子至15毫升塑料管(例如Falcon)中，加入10ml工作缓冲液。样品轻微振荡或者颠倒30秒。珠子通过重力沉降大约12-15分钟，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心提取并且弃去上清溶液(包括细碎物质)。将工作缓冲液重复冲洗至少2次，加入足量的工作缓冲液，使体积比为1∶1。样品再次轻微振荡或者颠倒30秒，沉降，室温静置过夜。通过加入必要的工作缓冲液保持工作缓冲液的体积为1∶1，将水合珠子于4℃保持在缓冲液中，直到使用。
红细胞的制备和处理
将一袋110ml的AdsolTM(Baxter，Bloomington，IN)加到大约250ml一袋的含有大约250-300ml RBC和残留白细胞和血小板的红细胞浓缩液(RBC)中。得到的血细胞比容(红细胞(RBC)体积/总体积)大约为50-55％。AdsolTM：CPD(柠檬酸磷酸右旋糖)和RBCs颠倒混合。然后将来自收集的混合物室温下八小时内通过Pall leukoreduction滤器(Pall Corporation，East Hills，NY)，置于新的袋中。此过程减少了RBC混合物中白细胞的量。过滤掉白细胞的RBC于4℃在新袋中可以保存长达42天。此制剂中缓冲液混合物的最终组分是30.6％Adsol/8.5％CPDv∶v。使用前，检测RBC制剂的溶血百分率，通过测量离心后的上清在415nm处的吸光度来进行。相对于制备后立即获得的溶血值，溶血值的增量大于2％的RBC制剂不被使用。
脑匀浆液的制备和处理
正常的仓鼠脑匀浆液(10％w/v)由马里兰大学(the University ofMaryland)的Dr.Robert Rohwer和同事根据他们建立的方法制备。以1.8ml体积制备等份溶液，于-80℃冷冻保存或者液氮保存，直到使用。可选择地，匀浆液融化一次进行分装。每次实验每柱子使用60微升的脑匀浆液。
脑匀浆液样品融化后，样品置于湿冰上。然后向每60μl融化的脑匀浆液的等份溶液中加入6.6μl的5％十二烷基肌氨酸钠试剂(将0.5g十二烷基肌氨酸钠溶于9.5ml的CPD:Adsol缓冲液中(8.5％CPD，30.6％Adsol和60.9％PBS v∶v∶v))。样品轻微地在湿冰上旋涡振荡30分钟，进行变性。然后样品在微型离心机中4℃，14,000rpm离心5分钟。转移上清至新管中，弃去沉淀物。然后上清置于湿冰上，最长1小时。得到的上清是含有0.5％十二烷基肌氨酸钠试剂的10％脑匀浆液。将得到的分装物于制备后1小时内加到柱子上，处理过程中置于湿冰上。
水合珠子定量转移到柱子上
往每个空柱子上加入750μL 0.1％TweenTM 20溶液。然后往每个柱子上加入1毫升20％的乙醇(v∶v)，使其在重力下流过。再往每柱子上加入2×1ml除气的去离子水，以洗掉乙醇溶液，除去任何捕获在玻璃料中的空气。使用定量吸移管管理器，把400μl的水合珠子悬液转移到柱子中。多余的工作缓冲液依靠重力流过经转移的湿珠子，然后在导入样品前，用1ml工作缓冲液将柱子洗涤3次。
制备RBC共混物(活化溶液)
用注射器和18号(或者更大号的)针头，把540μl的RBC/柱子置于聚丙烯圆锥管中。为了把AdsolTM层分离于上部，将管子以3,000rpm离心10分钟。然后往上部AdsolTM层上加上60μl的10％处理过的脑匀浆液，从而减少RBC制剂和高浓度掺入材料，即脑匀浆液和十二烷基肌氨酸钠去垢剂之间的直接接触。共混物颠倒混合，置于湿冰上，在制备的4小时内使用。在柱分析使用前，使混合物恢复到室温，保持10分钟。
将活化溶液加到柱子中
当所有的柱子都填充了水合珠子后，混合活化溶液，将其非常仔细地以0.5ml/柱的体积分层加到珠子上。使溶液靠重力通过柱子。总的流经时间在大约5到20分钟之间。
将最初0.5ml的流出活化溶液收集入2ml冷冻管中。往每个柱中再加入0.5ml工作缓冲液，流出液再收集入相同的冷冻管中。将装有珠子的柱子用1毫升工作缓冲液洗涤5次，其中珠子通过移液操作连续地重悬，以确保彻底和均匀的洗涤。然后，按照如下所述将珠子从柱中回收。
定量回收结合的珠子
往每柱中加入0.75ml工作缓冲液。用移液管冲洗柱子以悬浮珠子，将悬液快速转移到刻度管中。珠子悬液在管中沉降，尽量除去上清而不扰动珠子层。然后上清加回到相同的柱子中，将以上步骤重复2次，以便把柱子中剩下的任何珠子转移到管中。然后允许珠子通过重力沉降10分钟，记录带刻度的管子中的珠子层体积。
制备用于分析的结合珠子
首先，将每管中的工作缓冲液水平调节到1ml，然后通过轻微旋涡管子制得珠子悬液。使用移液管移出500μl的悬液，转移到小的EppendorfTM(Brinkmann instruments，Westbury，NY)微量离心管中。让悬液沉降10分钟，将沉降的珠子的体积调节到100μL。然后离心转移后的珠子，除去上清。立即制备珠子等份溶液，进行电泳和western印迹分析。
无水珠子与水合珠子的定量比较
以沉降珠子的体积为基础计算干重，膨胀率如下：
珠子干重＝沉降体积/膨胀率
膨胀率＝水合珠子体积(μL)/干重(mg)
对于ToyopearlTM，42.5mg干重＝在20％甲醇中的200μL湿珠子
膨胀率(在20％甲醇中)＝200/42.5＝4.71
实施例4
Western印迹分析
以下的Western印迹程序，设计用于评估来自掺入红细胞浓缩液(RBC)的脑匀浆液溶液中回收或去掉传染性或非传染性朊病毒蛋白。这些程序用于从以上实施例3中描述的柱子朊病毒结合分析中获得的样品，包括暴露于活化溶液的珠子样品和流过柱子的活化溶液样品，并且收集这些样品。
一般地，靶向结合材料的珠子与含有朊病毒的溶液反应，样品来源于这样的珠子的柱子结合分析，或者来源于这些反应的流出液。然后通过Western印迹来分析制备的样品中朊病毒蛋白质的存在。使用对朊病毒蛋白特异的鼠单克隆抗体作为一抗进行朊病毒蛋白的荧光检测。然后用结合有碱性磷酸酶的二抗检测这些朊病毒的免疫复合物，用X光片对化学发光反应进行显影。
样品制剂的凝胶电泳
在实施例3中描述的柱子分析之后，优选地立即进行以下步骤。
对每个制备的柱子珠子样品，通过涡流把100μL的悬浮好的珠子与100μL的Invitrogen 2X样品缓冲液进行混合。同样通过把柱分析中得到的未使用的脑匀浆液(正常的人脑，散发性CJD脑，正常的仓鼠脑，羊骚痒症仓鼠脑，等等)与Invitrogen 2X样品缓冲液混合制备对照组。更特异地，往40μL的2X样品缓冲液中加入20μL脑匀浆液。
同样如下制备鼠IgG对照。通过把20μl的2.5mg/ml的鼠IgG与480μl的PBS混合，制备每泳道50ng的标准物，相当于100μl/ml。把25的这种混合物加到475的2X Invitrogen样品缓冲液中，得到5ng/ml溶液。对于高浓度的直接上样凝胶标准物，以每泳道10μl使用该标准物，给出50ng/泳道。将5微升100μg/mL的鼠IgG溶液与495μL 2X Invitrogen还原样品缓冲液混合。这产生了1ng/μL的鼠IgG；每泳道使用10μl这种混合物，得到10ng/泳道(高浓度直接上样凝胶标准物)(10ng/泳道)。也通过稀释前述步骤的中浓度标准物制备鼠IgG低浓度直接上样凝胶标准物(2ng/泳道)，前述步骤的中浓度标准物即通过将溶于上样缓冲液的50μL的1ng/μL鼠IgG与200μL的Invitrogen 2X样品缓冲液混合来得到(产生0.2ng/μL)。每孔上样10μL即2ng/泳道。也可以如生产商指导的制备Invitrogen SeeBlue Plus2 Pre-Stained分子量标准物。
所有样品在Invitrogen缓冲液中90℃加热10分钟。然后短暂离心样品，-20℃存储过夜。第二天上午在将样品应用于SDS-PAGE凝胶前重复加热程序。
免疫反应程序
当12％Bis Tris NuPAGE SDS-PAGE凝胶用如以上描述的样品上样后，凝胶以恒压200V电泳45分钟，进行电印迹转移程序。将蛋白质转移到其上的膜置于Fisher方形皿中，在摇床上用25ml Western Breeze封闭剂(12.5ml水，5ml稀释剂A和7.5ml稀释剂B)室温孵育1小时。弃去封闭溶液。
膜在以1∶5,000稀释于20ml新鲜的Western Breeze一抗稀释液(14ml水，4ml稀释液A，2ml稀释液B)中的Signet 3F4一抗溶液中孵育。一抗预先以1∶1稀释于甘油中，所以，工作稀释度是1∶10,000。膜在冷冻条件下在摇床上孵育。
弃去一抗溶液，将膜洗涤3次，每次用20ml Western BreezeTM抗体洗涤溶液(将1.25ml抗体洗涤溶液(16×)溶于18.75ml水中)于室温在摇床上洗涤10分钟。然后膜用AP3(KPL，Gaithersburg，MD)二抗孵育，二抗是以1∶10,000稀释于20ml Western Breeze一抗稀释液中得到的溶液，室温在摇床上孵育60分钟。弃去二抗溶液，用如上描述的WesternBreeze Antibody Wash洗涤膜。然后用20ml pH 9.8的20mM Tris-HCl，1mM MgCl2室温将膜洗涤10分钟。
化学发光产生程序
转移膜至干燥的托盘中，浸泡于5ml Western Breeze预混的化学发光底物(CDP StarTM substrate，Applied Biosystems，Foster City，CA)中轻轻搅动5分钟。用纸巾轻轻吸干膜，然后置于保护纸中。接着将膜从保护纸中转移到暗盒中(没有增感屏)，室温保持30分钟，室温暴露于放射显影5分钟。
实施例5
从人血浆中结合内源PrPc
为了表现朊病毒结合树脂从人血浆中除去PrPc的能力，进行以下实验，所述人血浆是内源的、未穿入PrPc的人血浆。
对于通过朊病毒结合材料结合内源PrPc的作用，使用的是未稀释的、新鲜的、汇合的人血浆。冷冻混合的人血浆37℃解冻，通过0.45μm滤器过滤，加入十二烷基肌氨酸钠至终浓度为0.05％。如本说明书中其它地方描述的，进行血浆与柱子的结合，以及朊病毒的检测。
从人血浆中结合内源PrPc的实验结果在图1中描述。组A描述在没有十二烷基肌氨酸钠时，珠子洗脱液中朊病毒蛋白的Western印迹检测结果(第1道是分子量标记物；第2道-低浓度鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的人血小板；第6-7道-树脂a；第8-9道-树脂b；第10-11道-Amino 650-M；第12-13道-乙酰化Amino 650)。组B描述组A中样品的未结合部分的Western印迹检测结果(第1道-分子量标记物；第2道-低浓度鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的仓鼠脑(nHB)；第6道-正常的人血小板，第7-8道-树脂a；第9-10道-树脂b；第11-12道-Amino 650-M；第13-14道-乙酰化Amino 650)。组C表示在存在十二烷基肌氨酸钠时，朊病毒蛋白的Western印迹检测结果(第1道是分子量标记物；第2道-低浓度鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的仓鼠脑；第6道-人血小板，第7道-正常人血浆+十二烷基肌氨酸钠，1∶10；第8道-树脂a；第9道-树脂a；第10道-树脂b；第11道-树脂b；第12道-Amino 650-1；第13道-Amino 650-2)。组D表示在存在十二烷基肌氨酸钠时，通过朊病毒蛋白的Western印迹，检测组C样品中的未结合部分的结果(第1道是分子量标记物；第2道-低浓度鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的仓鼠脑；第6道-人血小板，第7道-正常人血浆+十二烷基肌氨酸钠；第8道-树脂a；第9道-树脂a；第l0道-树脂b；第11道-树脂b；第12道-Amino 650-1；第13道-Amino 650-2)。
参考图1，组A，第10和11道，和组C，第12和13道，检测PrPc结合到ToyopearlTM Amino 650-M树脂上的结合作用；假如通过乙酰化作用除去氨基上的电荷，那么就不能进行结合(结果如组A，第12和13道所示)。
实验结果表明了树脂从人血浆中结合内源性PrPc的能力，从而提供树脂可以用于从人或动物中除去PrP样品的证据。
实施例6
从血成分中结合PrPsc的间隔物要求
如图1所示，ToyopearlTM Amino 650-M树脂从人血浆中结合内源PrPc。至少此树脂的一部分含有间隔臂或者基团，为TosohTM所专有。研究间隔物对PrPsc结合的重要性。
如下填充四个(4)用于确定吸收剂的蛋白质分离试剂盒(PIKSITM)柱子(0.5ml/每个)：每个实验样品两个柱子，一个是缺少间隔物的ToyopearlTM Amino 650M，一个是商品化的有间隔物的ToyopearlTMAmino 650M树脂。同时也检测没有间隔物的ToyopearlTM Amino 650C树脂。
用0.5％十二烷基肌氨酸钠处理2毫升(2ml)10％羊骚痒症脑匀浆液(SBH)。通过把3ml SBH加到297ml工作缓冲液中，对十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用工作缓冲液稀释(1∶100)，柱子用这样的十二烷基肌氨酸钠处理过的上清进行活化。柱子用10ml稀释于缓冲液的SBH，通过以0.5ml/min的流速上样，活化2次。收集流出液，从每个柱子中除去树脂等份物，用10ml工作缓冲液洗涤。
用每种树脂和缓冲液中的活化溶液对每种样品的其中一半用蛋白酶K消化。样品，如在本文其它地方描述的那样，进行Western印迹检测。得到的结果如图2所示(第1道是分子量标记物；第2道是用缓冲液配制的用0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH-PK；第3道是用缓冲液配制的用0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH+PK；第4道是MWM；第5道是Amino 650M(商品化的)-PK(1)；第6道是Amino 650M(商品化的)-PK(2)；第7道是Amino 650M(商品化的)+PK(1)；第8道是Amino650M(商品化的)+PK(2)；第9道是Amino 650M(试验的)+PK(1)；第10道是Amino 650M(实验的)+PK(2)；第11道是Amino 650M(实验的)+PK(1)；第12道是Amino 650M(实验的)+PK(2)；第13道是Amino650C-PK(1)；第14道是Amino 650C-PK(2)；第15道是Amino650C+PK(1)；第16道是Amino 650C+PK(2))。如图2所示的实验结果清楚地表明，间隔臂的存在对于Amino 650-M树脂的PrPsc结合作用是必要的。
实施例7
在存在高浓度的人血清白蛋白(HSA)下捕获PrPc
为了举例说明树脂从含有多种蛋白质的治疗产品中除去PrP的能力，研究了存在人血清白蛋白时，从中结合PrPc的作用。
将四根Bio-RadTM柱子，用ToyopearlTMAmino 650M氨基树脂填充。树脂床高1cm，体积为0.5ml。树脂用工作缓冲液充分冲洗。柱子上加载的样品如下：
柱子I-工作缓冲液中的1％nHaBH(正常仓鼠脑匀浆液)；
柱子II-1％HaBH，用工作缓冲液配制的25％HSA(Sigma)；
柱子III-1％HaBH，用工作缓冲液配制的25％HSA(Sigma)和20mM N-Ac-Trp(Acros Organics，Belgium)；
柱子IV-1％HaBH，American Red Cross制剂(ARC制剂)。
将20mM N-Ac-Trp溶于用工作缓冲液配制的25％HSA中，振荡，37℃加热45分钟。如以上描述的制备10％nHaBH上清，以1∶10稀释于选择的材料中(步骤2)，得到1％的nHaBH。
每个柱子的底部与4通道的蠕动泵相连。以上步骤制备的5毫升(5ml)1％nHaBH以0.5ml/min的流速通过柱子I-IV。柱子被洗涤，以10ml工作缓冲液/柱子、以0.5ml/min的流速洗涤。回收树脂，如以上描述制备样品，跑12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶。
使用3F4一抗的Western印迹被用于检测已经被树脂俘获的PrPc。印迹的照片如图3所示(第1道-低浓度鼠对照组；第2道-中浓度鼠IgG对照组；第3道-nHaBH对照组；第4道-1％HaBH柱子；第5道-1％HaBH，25％HSA柱子；第6道-1％HaBH，25％HSA，20mM N-AC-Trp柱子；第7道-1％HaBH，ARC制剂柱子)。在每道中可以见到大约相同密度的条带，这表明：ToyopearlTM 650-M氨基树脂，在从多种途径获得的25％人血清白蛋白存在的条件下，俘获了仓鼠脑匀浆液中的PrPc。
如图3所示的实验结果表明：树脂从含有HAS的样品中结合朊病毒蛋白的能力，从而提供了树脂可以用于在多种治疗产品中结合朊病毒蛋白，并且确保使用血蛋白的治疗产品，例如作为稳定剂或治疗剂，以及可以受到PrP污染的治疗产品的安全性的证据。
实施例8
在人血清白蛋白中，PrPsc结合到氨基树脂上
在以下描述的实验中，说明了在掺入在白蛋白中的传染性PrPsc的结合作用。将12个PIKSI柱子用ToyopearlTM Amino 650M树脂进行填充，每个0.5ml。将2ml 10％SBH(羊骚痒症脑匀浆液)用0.5％十二烷基肌氨酸钠处理。
按照如下概述，制备以下六种活化物。
1.用缓冲液配制的SBH活化物：用工作缓冲液稀释(1∶100)经过十二烷基肌氨酸钠处理的上清；将0.22ml SBH加到22ml工作缓冲液中。
2.用HSA(American Red Cross(ARC)制剂)配制的SBH活化物：将十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用25％HAS稀释(1∶100)；将0.22mlSBH加到22ml HSA(American Red Cross制剂)中。
3.用含有N-乙酰-DL-色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用含有20mM N-乙酰-色氨酸和20mM辛酸酯的25％HSA稀释(1∶100)；白蛋白从sigma购买，不含添加剂；将0.22ml的SBH加到22ml的HSA溶液中。
4.用含有N-乙酰-色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用25％HSA稀释(1∶100)；将0.22ml的SBH加到22ml含有N-乙酰-色氨酸的HSA中。
5.用含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用25％HSA稀释(1∶100)；将0.22ml的SBH加到22ml含有20mM辛酸酯的HSA溶液中。
6.用单独的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用25％HSA稀释(1∶100)；将0.22ml SBH加到22ml的HSA溶液(Sigma)中。
每种树脂用10ml溶液重复活化2次。柱子以0.5ml/min的流速上样，以蠕动泵控制流速。收集流出溶液，以及收集来自每个柱子的树脂。对每种树脂和缓冲液中的活化物导入蛋白酶K消化液。根据在此描述的方法，样品进行Western印迹。印迹在图4中描述(组A：第1道-分子量标准物；第2道-缓冲液配制的0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH-PK；第3道-缓冲液配制的0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH+PK；第四道-缓冲液配制的SBH-PK(1)；第5道-缓冲液配制的SBH-PK(2)；第6道-缓冲液配制的SBH+PK(1)；第7道-缓冲液配制的SBH+PK(2)；第8道-HSA(ARC组成)配制的SBH-PK(1)；第9道-HSA(ARC组成)配制的SBH-PK(2)；第10道-HSA(ARC组成)配制的SBH+PK(1)；第11道-HSA(ARC组成)配制的SBH+PK(2)；第12道-HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第13道-HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第14道-HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第15道-HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)；列；组B：第1道-分子量标准物；第2道-缓冲液配制的0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH-PK；第3道-缓冲液配制的0.1％Sark处理的SBH+PK；第4道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第5道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第6道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第7道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)；第8道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第9道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第10道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第11道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)；第12道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第13道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第14道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第15道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)。
图4中所示的结果表明，当与人血清白蛋白混合时，传染性PrPres可以结合到氨基树脂上，并且多种添加剂不会干扰结合。
虽然本发明的实践或检验中可以使用与在此描述的方法和材料相似或相当的方法和材料，但是以上描述的是合适的方法和材料。所有的出版物、专利申请、专利和在此提及的其它引述的参考资料被完整地引用于此，作为参考。另外，材料、方法和实施例仅仅是例证性的，其目的不在于限制。
上述的描述用于描述与发明有关的几个实施方案。可以对实施方案和结构进行多处修正、添加和删除，只要不脱离发明的范围和精神。
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>1
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln
1 5
Claims (6)
1.一种分离样品中的传染性朊病毒蛋白的方法，所述方法包括在使所述传染性朊病毒蛋白与朊病毒蛋白结合材料之间形成复合物的条件下，用该朊病毒蛋白结合材料接触所述样品，其中该朊病毒蛋白结合材料包括聚甲基聚丙烯酸酯基本树脂和-OCH2-CHOH-CH2NH2官能团。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚甲基丙烯酸酯基本树脂是以衍生自羟基官能度的多孔、粒状甲基丙烯酸酯树脂材料的形式，具有以下的结构：
其中R是羟基化的脂族基。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述朊病毒蛋白结合材料包括衍生自伯胺基终止的羟基间隔链的多孔、粒状甲基丙烯酸酯材料，具有以下的化学结构：
具有约100μmol/mL的配体密度，且其中R是羟基化脂族基，和HW-65是甲基丙烯酸酯珠粒，其具有65μm的平均粒子大小和
的平均孔径大小。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是生物样品、食品、环境样品或水样品。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括高达50wt％的血清白蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述朊病毒蛋白结合材料包括连接到官能团上的间隔基。
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