CN1157040A - 分析方法和用于分析的装置 - Google Patents

Abstract

一种使用色谱条的分析方法，色谱条上有一个结合区，其中有能单一地与被分析物结合的捕集物质2固定在色谱载体上，而示踪物(它包括能与分析物竞争而单一地与捕集物质2结合的捕集物质1以及一种标记物)预先设置在结合区的上游区域，或者在加入样品时加在该区域，设置和加入的方式可使其实现展开，而将明胶在加入样品时加在结合区上游的区域或预先设置在该区域。

Description

分析方法和用于分析的装置

技术领域

本发明涉及分析方法和用于分析的装置，具体涉及使用色谱条的分析方法以及用于该分析方法的装置。

背景技术

使用色谱条的分析方法是一种快速而方便的分析方法。如日本专利申请公开60-19226，1-63865和3-176659中所说明的，色谱条具有一色谱载体，在色谱载体中载有示踪物，示踪物包含能与被分析物单一地结合的物质(本发明中称为捕集物质1)以及一种标记物，它们的安排方式是使示踪物可实现色谱展开；或者在加入样品的同时加入示踪物而有一种能与被分析物单一地结合的物质(本发明中称为捕集物质2)固定于其下游区域。当样品溶液加至色谱载体上载有示踪物的区域，或当样品溶液与示踪物同时加至色谱载体上时，被分析物与示踪物结合，而结合有被分析物的示踪物以及未结合有被分析物的示踪物都沿纵向(即下游方向)展开。当示踪物到达捕集物质2被固定的区域时，只有被分析物(示踪物结合于其上)与捕集物质2结合，示踪物就聚集在该处，而被分析物未结合于其上的示踪物将在下游方向流出。于是，被分析物在水性样品溶液中的存在及其数量，就可从捕集物质2被固定的区域处的颜色显现而得知。

此外，与本发明相关连，日本专利申请公开3-176659说明了用明胶覆盖本发明称为标记区的区域的全部或一部分。

这类使用色谱条的分析方法可在短时间内进行分析，而且处理方便，但仍有一些方面需要改进，例如提高被分析物的检测灵敏度。因此，本发明需要解决的问题，是提供一种使用色谱条的分析方法，其检测灵敏度得到提高；并提供一种用于所述分析的装置，其检测灵敏度得到提高。

发明概述

本发明的发明人发现，当在加入样品时将明胶加至色谱载体的某一特定位置，或事先将其设置在色谱载体的某一特定位置，现有的分析方法和分析工具可在许多方面得到改进，例如检测灵敏度可显著提高，检测时间可缩短，而夹层方法中的前区(pro-zone)现象可减少。

因此，本发明的一个方面是一种使用色谱条的分析方法，色谱条的色谱载体至少具有一个结合区，在该区中有一种能与被分析物结合的捕集物质2，它直接固定于该区，或通过一种既能与被分析物结合又能与捕集物质2结合的捕集物质3而间接固定于其上；或者在固定捕集物质2的区域的下游部分，固定有捕集物质4，它能单一地与捕集物质1结合，(捕集物质1可与被分析物单一地结合，或通过与被分析物的竞争而与捕集物质2结合)；而在所述结合区的上游区域，事先配置有示踪物(包含捕集物质1和标记物)，或在加入样品时加入该种示踪物，设置或加入的方式可使示踪物进行色谱展开；所述分析方法包括在加入样品时在所述结合区的上游区域加入明胶，或者预先在所述结合区的上游区域设置明胶，但不包括已预先配置示踪物的区域(此区域在下文称为标记区)。

本发明的另一方面是一种分析用工具，它至少包括前述的色谱条和明胶，或包括设置有明胶的色谱条，其中明胶预先设置于所述色谱载体结合区的上游区域，但不包括标记区。

附图简单说明：

图1是色谱条的说明。

图2是用本发明分析方法进行分析的结果示意图(实施例2)。

图3是用本发明分析方法进行分析的结果示意图(实施例3)。

实施本发明的最佳方式用本发明的方法测定其在样品中的存在或数量的被分析物没有特别限制，前提是存在与被分析物单一地结合的化合物。这种化合物的例子包括：其中引入了生物素的化合物(抗生物素蛋白与其单一地结合的化合物)；含有抗生物素蛋白的化合物；互补DNA；具有抗原性的化合物或半抗原；与某种抗原的抗体单一地结合的化合物；与其抗原单一地结合的抗体或抗体片段；与糖配体单一地结合的外源凝集素和与外源凝集素单一地结合的糖配体；以及与受体单一地结合的配体和与配体单一地结合的受体。当然，这些结合反应具有高反应活性或亲和性时，检测灵敏度就高。这些分析物的例子包括：微生物；病毒；抗原，如致病微生物、病毒之类的特异性抗原，以及前列腺癌之类的肿瘤的标示抗原；抗体，如由微生物、病毒等感染诱发的抗体，自身抗体之类的抗体，以及急性期蛋白抗原之类的特异性抗体；粪便的血红蛋白或血红蛋白特异性抗原；细胞，如培育出某种特异性抗原的细胞，具有某种特异性糖配体的细胞，以及具有某种特异性受体的细胞；激素，如甲状腺激素，甲状旁腺激素，生殖腺剌激之类的激素，以及生理上活泼的蛋白或肽(如细胞因子和monokine等)；蛋白或糖蛋白，如酶、含蛋白多糖、γ-精蛋白(seminoprotein)、和淀粉状蛋白前体等；血液中的低分子化学物质或药物；信号转移控制因子，如拮抗剂、颉顽药等；血栓溶解/血液凝固控制因子；基因表达控制因子；细胞粘连分子；外源凝集素，如免疫调节剂外源凝集素等；以及RNA，DNA等核酸。尤其是，可用粪便、尿等作为非侵害性的样品。

捕集物质1包括一种通过捕集被分析物而与它单一地结合的化合物，或者与被分析物竞争而与捕集物质2单一地结合的化合物。即当被分析物是一种抗原时，捕集物质1是一种与该抗原单一地结合的抗体或抗体片段(下文“抗体”包括与抗原单一地结合的抗体片段)，或者捕集物质1是一种与抗体单一地结合的抗原或化合物(下文“抗原”包括与抗体单一地结合的化合物)；而当被分析物是一种抗体时，捕集物质1是一种抗原或抗体。同样，当被分析物是一种配体(或是具有配体的化合物)时，捕集物质1是一种受体(或具有受体的化合物)或是一种配体；而当被分析物是一种受体时，则捕集物质1是一种配体或受体。在某些情况下，捕集物质1通过被分析物而单一地结合于捕集物质3，结果使它通过捕集物质3而与捕集物质2结合。被分析物与捕集物质1的结合可以是可逆的，也可以是不可逆的，但亲和性太低时，检测灵敏度降低。

在捕集物质1中加入标记物就形成示踪物。在捕集物质1中加入标记物的方法，可以通过吸收或掺入，或是通过氢键或共价键使它们结合。简言之，标记物加入的方式应使捕集物质1不容易与它脱离，并且能被捕集物质2或被分析物识别。

当捕集物质1与被分析物、捕集物质2(将在下文说明)、或捕集物质4(也将在下文说明)结合时，标记物就产生一个信号(即一种颜色)，以表明其存在。较好的是标记物由不溶于水或防水性差的微颗粒构成。较好的标记物的例子包括金胶体等金属胶体和硒胶体等非金属胶体；有机胶体；染料颗粒；着色聚苯乙烯等着色的有机聚合物；其中包封有显色剂的脂质体等油质微粒。当胶体等不显现颜色时，就加入显色剂。显色剂的例子包括在可见光区域显色的物质，也包括萤光物质或在紫外区域显色的物质。通过设置在结合区中的酶之类物质而显现颜色(包括萤光)的物质也属于本发明的显色剂。

当将样品溶液加至色谱条上时，示踪物(它本身或者它与被分析物结合的形式)就在色谱载体中展开和迁移。示踪物能够以溶液(或悬浮液)形式使用，但可通过冰冻干燥等方法以粉末形式保存。

示踪物有两种设置方法，使其可用水性溶剂在色谱载体上实现色谱展开。第一种方法是，将一段浸透过示踪物水溶液然后干燥的色谱载体，预先放置在结合区(结合区将在下文说明)上游处的基底材料或色谱载体上，与结合区相隔一定距离。在这种方法中，设置示踪物的位置称为标记区。第二种方法是，在加入样品时将示踪物加在色谱载体上。因此，在这种方法中，色谱条上没有标记区。

捕集物质2通过被分析物而与带有被分析物的示踪物结合，或者通过捕集物质1而与带有捕集物质1的示踪物结合。在后一种通过捕集物质1而结合的情况中，捕集物质1是通过与被分析物的竞争而与捕集物质2结合。不论哪一种情况，捕集物质2都单一地结合于被分析物。在另一种方式中，它可通过单一地与捕集物质3结合(捕集物质3单一地结合于被分析物)，而间接地结合于被分析物。当被分析物是一种抗原时，捕集物质2的一个例子是一种抗体(按前面的定义，这里的“抗体”也包括单一地与抗原结合的抗体片段)。当捕集物质2是一种抗体而捕集物质1也是一种抗体时，最好是它们能识别待检测抗原的不同表位。同样，当被分析物是一种抗体时，捕集物质2是一种抗原(按前面的定义，这里的“抗原”也包括单一地与抗体结合的化合物)；当被分析物是一种受体时，它是一种配体；而当被分析物是一种配体时，它是一种受体。另外，当捕集物质2单一地与捕集物质3结合时，捕集物质2的例子为抗生物素蛋白、抗生物素抗体、和外源凝集素等。

捕集物质2可通过色谱载体的适当官能团与捕集物质2上某一官能团之间的共价键，或通过色谱载体对捕集物质2的强烈吸附，而固定在色谱载体上。另外，捕集物质2可与微颗粒结合或吸附于其上，然后这些颗粒分散并固定在色谱载体上。在这方面，“固定”表示物质的设置方式使其不会被水性溶剂显著地分散或展开。捕集物质2固定于其上的区域称为结合区。

当捕集物质1、捕集物质2、捕集物质3或捕集物质4是一种抗体时，在大多数情况下使用的是单克隆抗体，但如果通过必要的适当方法，如吸附处理、选择抗原或动物品种等，即使是血清抗体也可以使用。

捕集物质3是一个共轭体，它包括单一地与被分析物结合的部分以及单一地与捕集物质2结合的另一部分。如在讨论捕集物质1时所详细说明的，当被分析物是一种抗体时，单一地与被分析物结合的部分是一种抗原；当被分析物是一种抗原时，该部分是一种抗体；当被分析物是一种配体时，它是一种受体；而当被分析物是一种受体时，它是一种配体。单一地与捕集物质2结合的部分，例如，当捕集物质2是抗生物素蛋白时，它是生物素；当捕集物质2是生物素时，它是抗生物素抗体或抗生物素蛋白；当捕集物质2是外源凝集素时，它是一种糖配体。

捕集物质3可预先设置在色谱载体的固定区上游的一个任选区域，其设置方式是当水性样品溶液加至色谱条上时，它能在色谱载体上展开和迁移；或者它是在加入样品时加至色谱载体上。其设置方法与设置示踪物的方法相同。

捕集物质4单一地与捕集物质1结合。

色谱载体并无特别限制，只要它能用水性溶剂展开溶质。例如，它可以是用纤维素、硝化纤维素、乙酸纤维素、聚丙烯酸酯、玻璃、琼脂糖、或聚氨酯等或是这些材料与一种无机粉末相结合所制造的非织造织物。

在必要时可将色谱载体层叠在适当基底材料上而得到色谱条。

众所周知，明胶凝胶是由鱼、哺乳类动物之类的脊椎动物得到的。所用明胶的熔融温度较好为15℃或15℃以上，更好为25℃或25℃以上。

在本发明中，明胶凝胶的熔融温度按以下方法测量。

将明胶溶解在含有0.9％氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，使最终浓度为10g/dl。将一份1ml所得到的明胶溶液放入长度为100mm，直径为12.5mm的试管中，并用塞子将试管封口。将试管完全浸没在0℃的水浴中，使明胶实现胶凝。然后，使水浴的温度以每1℃经历2分钟的速率缓慢上升，然后测量试管倒置时明胶凝胶最初滴落的温度。

明胶是在加入样品溶液时使用，或者预先设置在色谱载体上。当在加入样品溶液时使用，它可以溶解在样品溶液中，或者作为明胶水溶液与样品溶液分别加入。制备水性明胶溶液所用的水性溶剂，一般最好使用制备样品溶液所用的同样溶剂。当明胶是在加入样品溶液时使用，明胶溶液中明胶的浓度最好是在0.1-1.5％(重量)。当明胶是预先设置的，预先设置的数量最好也是相对于样品溶液为上述重量％。

当明胶是在加入样品溶液时加入，它是加在结合区上游的位置。当明胶是预先设置的，它是设置在结合区上游的位置，但不包括标记区。作为加入位置和设置位置的例子，最适当的位置是预先任意选定的，而最好的结果有时是将明胶设置在区域7而得到的。当得到明胶预先设置在色谱载体上的设置有明胶的色谱条时，明胶是设置在预先选定的位置，位于结合区的上游区域，但不包括标记区，其设置方式可使它能用水性溶剂展开。也就是说，有一段色谱载体，预先用明胶水溶液浸渍，然后干燥，再将这段载体设置在基底材料上或色谱载体上。

同样，当单一地与捕集物质1结合的捕集物质4固定在色谱载体上，位于捕集物质2结合处的下游区域，以制备结合区时，最好在捕集物质2固定的区域与捕集物质4固定的区域之间的区域加入或预先设置明胶。

当按本发明以外的其它方法使用明胶时，例如把明胶预先设置在标记区时，在许多情况下会引起探测时间延长、探测灵敏度降低等问题。另一方面，当明胶是在加入样品时使用，即使它是加在标记区，也不会发生这些问题。其原因是，当明胶预先设置在标记区时，明胶在保存色谱条的同时会对标记区产生某些影响。

样品溶液的水性溶剂可以是水，但一般使用pH缓冲液。水性溶剂的pH最好在5-9。

样品溶液是加在标记区上或标记区的上游区域(当存在标记区时)，或加在结合区的上游区域(当不存在标记区时)。“加入”样品，在这里是指将样品溶液放在色谱条上，或是将色谱条的最上游端浸在样品溶液中。

当示踪物和/或捕集物质3未预先设置在色谱载体上时，它们可在加入样品时加入。关于其加入方法，它们一般是与样品一起加入。

本发明用于分析的装置有两种情况。

在第一种情况，至少结合使用色谱条(其中未预先设置明胶)和明胶。在这种情况，可进一步结合使用一种水性溶剂。而且，明胶可以溶解或不溶解在该水性溶剂中。

第二种情况包括设置有明胶的色谱条。在这种情况，也可结合使用水性溶剂等其它组分。不论上面哪种情况，示踪物和/或捕集物质3，当未预先设置在色谱条上时，可以使用冰冻干燥等方法制备的粉末或其水性溶液(或悬浮液)。

以下参照附图进一步说明本发明。

图1表示设置有标记区的色谱条。色谱条1由色谱载体2与基底材料(如果有必要时)构成。色谱载体2上有标记区3，其设置方式是使示踪物可用水性溶剂展开。

标记区3的上游可按情况需要而设置一个上游区5，当设有此区时，在许多情况下它就是样品溶液的加入位置。这个区域可对样品溶液中的悬浮物质进行过滤，并可含有使分析顺利进行的辅助物质。这类辅助物质的例子包括能使被分析物与捕集物质1的结合反应更单一或更定量化的物质，以及不溶性标记物的显色剂等。

当将样品溶液加至标记区3的上游区域或是加至标记区3，包含在样品中的被分析物，如果它能与捕集物质1结合，就将被示踪物加上标记。然后，被分析物结合于其上的示踪物、被分析物未结合于其上的其余示踪物、以及其余的被分析物通过色谱展开而向图1中的右方迁移(即向下游方向迁移)，并到达设置在标记区3下游的结合区4。

标记区3和结合区4并不直接地彼此连接，而是隔开一个可任选的距离。间距区7可有凝胶放于其上，或者设置在其上的标记物质3上，使它可进行色谱展开。在有些情况下，在其上可进一步设置标记物的显色剂。

结合区4有两种情况。在第一种情况，与被分析物结合的示踪物被捕集在该区并显色，或者示踪物与被分析物竞争而被捕集在该区并显色。在第二种情况，捕集物质4固定在一个位于捕集物质2固定于其上的区域(此区域对应于上述第一种情况中的结合区)下游的区域。在这种情况，其设置可按情况需要而任选，但当设置该区并用以检测颜色展开时，是将它用作结合区4。在第二种情况，未与捕集物质2结合的示踪物或者与被分析物竞争而未被捕集物质2捕集的示踪物在这结合区被捕集物质4捕集并显色。

当设置有捕集物质3时，捕集物质3与结合于示踪物的被分析物结合，而由此形成的示踪物/被分析物/捕集物质3复合物通过捕集物质3而结合于捕集物质2，并停止在结合区4。另外一种方式是，捕集物质3与捕集物质2结合，然后在结合区4单一地与被分析物结合。

在结合区4下游的区域6可按情况需要而设置，其目的是当捕集物质1能与被分析物结合时，使未通过捕集物质1与被分析物结合的示踪物流出，或使样品溶液中所含的被分析物以外的可溶性组分流出。在某些情况下，可在下游区域6设置一种当水性样品溶液的水性溶剂流入时会显色的物质(例如pH指示剂等)，以判定检测的可靠性。

当色谱条上没有标记区3时，分析方法与上面所说相同，只是示踪物是在加入样品时加入。

实施例1

由用硒胶体标记的抗人血红蛋白抗体构成的示踪物的制备：

将91mM L-抗坏血酸钠和32mM氧化硒在约4℃搅拌15分钟，然后在约42℃搅拌70小时，制得硒胶体。

将所得的硒胶体用10mM二-三羟甲基氨基甲烷(bis-tris buffer)缓冲溶液(pH7.0)稀释至其在550nm的吸光度为15。将抗人血红蛋白小鼠单克隆抗体(0.02％)加入至稀释的制剂中，然后将混合物在室温下搅拌1小时。然后用10mM三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液(pH7.2)洗涤得到的以硒胶体标记的抗人血红蛋白抗体，并用它作为示踪物。

标记区的制备：

将示踪物加至含有1％酪蛋白的10mM三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液(pH7.2)中，得到示踪物悬浮液，并将混合物在550nm波长的吸光度调节至等于1.0。将一片玻璃纤维薄膜(Lypore 9524，由美国LYDALL制造)浸在这样制得的悬浮液中，使它吸饱该悬浮液，然后将玻璃纤维薄膜干燥，用作标记区。

结合区的制备：

将抗人血红蛋白小鼠单克隆抗体(它具有与前述的抗人血红蛋白抗体不同的结合部位)与含有150mM氯化钠的30mM三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液(pH7.4)混合，使最终浓度为2mg/ml。另外，将厚度为100μm，长方形(0.4×6.0cm)的薄片(PET 100 PE LR 007A，Lintech制造)与用作色谱载体的硝化纤维薄膜(0.4×4.5cm的长方形，孔隙大小为5μm，美国Schleicher&Schuell制造)粘合起来，使它们的长边沿其长度并列，而上端对齐。抗体混合溶液在离粘合在薄片上的硝化纤维薄膜底端约1cm的区域点成一线，而将各点彻底干燥，以固定抗人血红蛋白抗体。

色谱条的制备：

将切成0.4×0.4cm正方形的含有用硒胶体标记的抗人血红蛋白抗体的玻璃纤维垫片粘在薄片上，位于已固定有抗人血红蛋白抗体的硝化纤维的下侧，使它轻微地与硝化纤维接触。在该垫片下侧的薄片上，粘上切成0.4×1.3cm的疏水性非织造织物(Sontala 8801，Du Pont，U.S.A.制造)，使其轻微地与硝化纤维接触，作为预过滤器，从而得到色谱条。

分析：

以含有0.1％牛血清清蛋白(Seikagaku Kogyo，Tokyo制造)、0.9％氯化钠和0.1％叠氮化钠的0.1M三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液(pH7.6)，并补充加入人血红蛋白(由Sigma，U.S.A制造)作为样品。在其中加入猪皮明胶(由Sigma，U.S.A制造)，使最终浓度为0.7％。将一份25μl样品溶液施加在色谱条的预过滤器上。加入样品7分钟后，可通过用肉眼观察硒胶体所引起的“红色”来判断分析结果。用肉眼可观察到其“红色”的血红蛋白的最小浓度，就作为分析的灵敏度。

判断的结果见表1。由表1可明显看出，使用明胶时(a)与不使用明胶时(b)相比，灵敏度增大了约80倍。

                          表    1

	人体血红蛋白浓度(ng/ml)
												0	0.156	0.313	0.625	1.25	2.5	5.0	10	25	50	100
	a	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+												+
b												-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+

实施例2

重复实施例1的过程，但在加入样品后1分钟开始判断，然后每隔1分钟判断一次，直至加样品后12分钟。

结果见图2，由图2可明显看到，使用明胶时(曲线a)与不使用明胶时(曲线b)相比，分析时间约缩短为1/3。

实施例3

重复实施例1的过程，但样品溶液中的人血红蛋白浓度改变为图3所示的数值。结果见图3，由图3可明显看到，使用明胶时(曲线a)与不使用明胶时(曲线b)相比，可测量的人血红蛋白浓度的上限约高10倍。换言之，使用明胶时，显然前区现象减少了。

实施例4

重复实施例1的过程，但使用表2所示的明胶制剂来检测人血红蛋白。在本例中，人血红蛋白浓度固定为10ng/ml，而加入至样品溶液中的明胶数量改变为1.0％。结果见表2。明胶的熔融温度是用前面所述的方法测定。

                               表    2

	明胶熔融温度(℃)	人血红蛋白检测结果
			猪皮明胶(Sigma)牛皮明胶(Sigma)猪骨明胶(Difco)冷鱼明胶(Sigma)无	31.424.927.50.0	+++++±-

工业实用性

使用本发明的分析方法或分析装置，被分析物的检测灵敏度可得到提高。而且，检测所需的时间可以缩短。此外，夹层方法中的所谓前区(pro-zone)现象减少了。

Claims (10)

1.一种使用色谱条的分析方法，其特征在于其中的色谱载体至少具有一个结合区，有一种能与被分析物结合的捕集物质2直接固定于该区，或者通过捕集物质3间接固定于该区，而捕集物质3能同时与被分析物和捕集物质2二者结合；或者有一种捕集物质4固定在捕集物质2所固定的区域的下游区域，捕集物质4能单一地与捕集物质1结合，而捕集物质1单一地与被分析物结合，或者与被分析物竞争而单一地与捕集物质2结合；而捕集物质1和标记物构成的示踪物预先设置在所述结合区的上游区域，或者在加入样品时加在该处，其设置和加入方式可使示踪物能进行色谱展开；所述分析方法包括在加入样品时将明胶加在所述结合区的上游区域，或者将明胶预先设置在所述结合区的上游区域，但不包括预先设置示踪物的区域。

2.如权利要求1所述的分析方法，其特征还在于所述的明胶凝胶在15℃或15℃以上熔融。

3.如权利要求1所述的分析方法，其特征还在于所述的明胶凝胶在25℃或25℃以上熔融。

4.如权利要求1，2或3所述的分析方法，其特征还在于其中的样品是粪或尿。

5.如权利要求1所述的分析方法，其特征还在于当能单一地与捕集物质1结合的捕集物质4固定在捕集物质2所固定的区域下游的区域作为结合区时，明胶是加在或预先设置在捕集物质2固定的区域与捕集物质4固定的区域之间的区域。

6.一种用于分析的装置，其特征在于它至少包括权利要求1的色谱条和明胶，或包括设置有明胶的色谱条，其中明胶预先设置在权利要求1的结合区的上游区域，但不包括预先设置示踪物的区域。

7.如权利要求7所述的分析装置，其特征还在于所述的明胶凝胶在25℃或25℃以上熔融。

8.如权利要求7所述的分析装置，其特征还在于所述的明胶凝胶在15℃或15℃以上熔融。

9.如权利要求6、7或8所述的分析装置，其特征还在于其中的样品是粪或尿。

10.如权利要求1所述的分析装置，其特征还在于当能单一地与捕集物质1结合的捕集物质4固定在捕集物质2所固定的区域下游的区域作为结合区时，明胶是加在或预先设置在捕集物质2固定的区域与捕集物质4固定的区域之间的区域。

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