ES2968241T3 - Biosensor de evanescencia para la sangre - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo de diagnóstico adaptado para el análisis de una muestra biológica en condiciones de detección evanescente. El dispositivo comprende un área de muestra provista de un medio de filtración de modo que se pueda analizar una muestra biológica en bruto. La presente invención también se refiere a un método de diagnóstico y a una mezcla de diagnóstico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biosensor de evanescencia para la sangre

Campo técnico

La presente invención se refiere a un dispositivo de biosensor adecuado para el análisis y diagnóstico sanguíneo. En particular, se refiere a un dispositivo combinado con un filtro de sangre que permite una prueba biológica rápida y fiable.

Técnica relacionada

El examinar la sangre humana para marcadores específicos es un método comúnmente usado que soporta diagnósticos médicos. Una muestra de sangre se toma del paciente y luego se analiza en un laboratorio para verificar la presencia o ausencia de un marcador diagnóstico o una cuantificación de un marcador. Para distinguirlos de procedimientos de diagnósticoin vivollevados a cabo en el propio paciente, las pruebas de laboratorio se conocen como diagnósticosin vitrocomúnmente abreviado como IVD, por sus siglas en inglés. Una tecnología comúnmente usada de las pruebas IVD es ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción, ELISA, por sus siglas en inglés), usada para determinar numerosos marcadores en fluidos biológicos y como tal, soportar un diagnóstico médico. ELISA y las tecnologías relacionadas se usan de manera extendida. Todas las pruebas ELISA usan un pozo sólido de alrededor de 200 microlitros de volumen para examinar la muestra de un paciente. Estos pozos están hechos de polímero orgánico como, por ejemplo, poliestireno, mediante un proceso de moldeo por inyección.

Formatos de análisis típicos usados para las pruebas ELISA inmunológicas son pruebas sándwich, pruebas competitivas o pruebas de anticuerpos. Una prueba sándwich usa dos ligandos, normalmente un par de anticuerpos, ambos específicos para la proteína a medirse, ejemplos son pruebas para gonadotropina coriónica beta-humana, beta HCG, por sus siglas en inglés, otras hormonas como, por ejemplo, una Hormona Foliculoestimulante (FSH, por sus siglas en inglés), Hormona Luteinizante (LH, por sus siglas en inglés), los marcadores de infección Proteína C Reactiva CRP, por sus siglas en inglés, o la Procalcitonina PCT, por sus siglas en inglés, proteínas marcadoras para ataques al corazón como, por ejemplo, Troponina I y Troponina T o Mioglobina.

Analitos adicionales conocidos son compuestos de bajo peso molecular como esteroides, fármacos, drogas de abuso o vitaminas. Las pruebas están diseñadas como pruebas competitivas.

Las pruebas de anticuerpos son, por ejemplo, la detección de anticuerpos antivirales, dirigidas contra proteínas de virus como, por ejemplo, HIV, HBV de HCV, o los anticuerpos antibacterianos o antiparasitarios. Además, las pruebas de anticuerpos se usan para la medición de anticuerpos autoinmunes o IgE alérgeno-relacionada.

Los principios de diferentes formatos ELISA son comparables. Un ligando se une al interior de un pozo ELISA. Un segundo ligando se encuentra en la solución y puede reaccionar con el ligando unido o con un analito que se ha unido al ligando inmovilizado. Para una prueba ELISA, el ligando en solución se acopla, de manera covalente, a una enzima como, por ejemplo, peroxidasa de rábano de fosfatasa alcalina.

La difusión hace que el ligando etiquetado en solución se mueva a las superficies del pozo y reaccione con el ligando unido a la superficie. Una prueba típica se lleva a cabo después de cierto tiempo de reacción de incubación, 30-120 min, la solución de analitos con ligando etiquetado en exceso se retira y el pozo se lava con una solución tampón. El conjugado de enzimas-ligando unido unido al pozo se mide haciendo que reaccione con un sustrato cromogénico adecuado que provee un producto coloreado adecuado para la cuantificación.

Las ventajas de ELISA son una alta sensibilidad y especificidad. Los límites de detección analítica están dados por los ligandos y sus afinidades. Un componente importante para la calidad son las composiciones de los tampones, pueden medirse analitos en el rango de 10 exp-6 mol/L y 10 exp-12 mol/L, en casos excepcionales, se han alcanzado límites de detección de 10 exp-13 mol/L. Incluso cuando se consideran todas las ventajas de ELISA, la necesidad de numerosas etapas de trabajo es una desventaja específica. Se requieren varias etapas de pipeteado y lavado para eliminar ligandos no unidos en exceso y el tiempo hasta el resultado se encuentra normalmente en el rango de horas antes de que pueda leerse un resultado. Durante este tiempo, el médico tratante tiene que esperar un resultado IVD que respaldará o descartará su diagnóstico clínico y, por lo tanto, un tratamiento basado en la evidencia dirigida se retrasa.

Un método mejorado para los analitos clínicos es el uso de biosensores. Un método popular es el uso de excitación en el campo de la evanescencia de analitos unidos y detección en tiempo real de moléculas unidas según se describe en los documentos EP1079226, EP1204856, EP1371967 o ejemplos de aplicación en el documento EP2639584 y en el documento de Schawaller y otrosJ Allergy Clin Immunol. 2018.El método se basa, como ELISA, en la interacción de un ligando unido a la superficie que reacciona en una manera no covalente con al menos un ligando de la solución en contacto con la superficie. La reacción tiene lugar en un pozo producido a partir de un polímero orgánico como, por ejemplo, poliestireno mediante moldeo por inyección. El ligando en la solución no se etiqueta con una enzima como en ELISA sino que, en cambio, se etiqueta con una fracción etiquetada fluorescente. Este marcador fluorescente se excita entonces con una fuente luminosa adecuada, preferiblemente de 635 nm de longitud de onda, y la fluorescencia emitida se monitorea de manera continua mediante el uso de un instrumento dedicado. El método permite el monitoreo continuo en tiempo real de una reacción de unión bioquímica.

Varias ventajas vienen con esto como, por ejemplo, una excitación específica del ligando etiquetado de manera fluorescente unido en presencia de un ligando no unido en exceso en la solución. Un resultado sensible y cuantitativo es medir normalmente después de 10 a 20 min o incluso menos tiempo, mientras que un resultado ELISA está disponible solo después de varias horas.

Otra ventaja es que, después de añadir la muestra del paciente y el segundo ligando fluorescente, no se requieren etapas de manipulación de líquido adicionales como en ELISA. De manera notable, no se requieren etapas de lavado ni adición de sustratos de enzima. El método usa soluciones acuosas como, por ejemplo, PBS, puras o con reactivos adicionales como, por ejemplo, detergentes, tensoactivos, proteínas o potenciadores de reacción. Las muestras a medirse pueden ser orina, saliva, suero, plasma o sangre solubilizada en detergente.

Lamentablemente, y una primera desventaja del método actual es que un usuario final no puede usar directamente sangre sino que tiene que preparar plasma sanguíneo fuera del dispositivo medidor mediante el uso de, por ejemplo, un centrifugado o una filtración para eliminar partes celulares de la sangre completa como, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos o plaquetas.

Una segunda desventaja del dispositivo actual según se describe en las referencias de más arriba es el requisito de añadir a la muestra de paciente, a saber, plasma o suero, un segundo ligando etiquetado de manera fluorescente y la mezcla se transfiere al pozo y se mide. Esto no solo está asociado a las manipulaciones y, por lo tanto, al tiempo, sino que también puede ser una fuente de error.

El documento US 2019/226910 A1 describe métodos y un aparato de espectrometría de malla porosa. El documento US 2004/091397 A1 describe un dispositivo de inserción multipozo que permite la detección libre de etiquetas de células y otros objetos. El documento US 2011/005341 A1 describe un aparato de filtrado para filtrar un fluido. El documento US 2010/190197 A1 describe un dispositivo de soporte permeable anidado y un método para usar el dispositivo de soporte permeable anidado.

Breve descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es la provisión de un dispositivo que supere las desventajas y limitaciones del estado de la técnica.

Otro objeto de la invención es proveer un método mejorado de diagnóstico mediante el uso de un dispositivo de biosensor fácil de usar.

Según la invención, estos objetos se logran por el dispositivo y el método descritos en las reivindicaciones anexas.

Con respecto a aquello que se conoce en la técnica, la invención provee la ventaja de que.

En particular, el dispositivo según la presente descripción permite la separación de plasma sanguíneo de las células o eliminar las células de sangre completa y solo tener plasma sanguíneo. Se comprende que también puede ser suero sanguíneo que puede usarse en el dispositivo. La eliminación de las células presentes en la sangre es esencial dado que las células sedimentan por gravedad al fondo del pozo en un tiempo muy corto de alrededor de varios minutos. Cuando el fondo del pozo está cubierto de células, los analitos ya no pueden esparcirse al fondo del pozo así como un reactivo detector no puede alcanzar la superficie de detección, por lo tanto, no puede observarse un aumento en la señal con el tiempo.

La separación de las células sanguíneas del plasma sanguíneo puede lograrse colocando un filtro directamente sobre la superficie de detección. Este filtro tiene la propiedad de bloquear el paso de células y aquí principalmente los glóbulos rojos para el sedimento a la superficie de detección. Las moléculas en plasma, que son comúnmente los analitos a medirse, son mucho más pequeñas en sus dimensiones cuando se comparan con la célula y el tamaño de poro del filtro se elige para que sea suficientemente grande para dejar que los analitos como, por ejemplo, proteínas, inmunoglobulina, péptidos localicen los poros del filtro sanguíneo pero bloqueen el paso de los componentes celulares de la sangre. El filtrado de aglutinados de glóbulos rojos se aplica en la prueba de gel para inmunohematología donde se usa un proceso de filtración de sangre que permite el paso de glóbulos rojos individuales pero no permite el paso de aglutinados de glóbulos rojos a través de la matriz de gel. Son evidentes dos diferencias principales con respecto a la prueba de gel. Primero, el gel se encuentra en una suspensión líquida depositada en la cavidad de reacción mientras que, en la presente invención, se encuentra en una forma seca y el plasma sanguíneo trae el líquido. Segundo, el tamaño del poro en la prueba de gel se optimiza para el paso de glóbulos rojos individuales y el bloqueo del movimiento de aglutinados de glóbulos rojos. En la presente invención, la fibra/malla/tela pretende bloquear el movimiento de toda la célula a través de la matriz. Esto puede lograrse a través de la selección de una membrana de filtro con tamaños de poro mucho más pequeños que los diámetros celulares para bloquear el movimiento de los glóbulos rojos a través de la membrana de filtración. Existen numerosas membranas de filtración de sangre y se ofrecen comercialmente por Millipore, Ahlstrom o Pall. Su uso como membrana de filtración de sangre o su uso como almohadillas de liberación para reactivos se documenta de manera rutinaria y en el uso rutinario en el dispositivo inmunocromatográfico también conocido como dispositivos de flujo lateral. Otra posibilidad es el uso de papel de filtro Whatman como, por ejemplo, Whatman 3 MM o similar.

Uno puede usar ahora papel para aplicaciones comerciales y cortarlo para que encaje en la parte inferior del pozo. Dado que el papel se produce usando una suspensión de fibra de celulosa y eliminando el líquido mediante secado, es evidente que producir un filtro de papel en el pozo puede también lograrse haciendo una suspensión de fibras de celulosa en agua y añadiendo esta suspensión al pozo de sensor. El secado al aire generará entonces el papel de filtro directamente dentro del pozo. El papel puede también estar hecho de polímero orgánico como, por ejemplo, poliamida, o fibras orgánicas como, por ejemplo, las usadas en la fabricación textil, pueden usarse en lugar de las fibras de celulosa. Para garantizar un proceso de humectación fácil, se prefiere un material hidrofílico.

Otra posibilidad es usar un anticuerpo contra proteínas de superficie celular y, como tal, generar aglutinados de células. Estos pueden ser anticuerpos de antibanda 3, la banda 3 es una proteína de superficie de glóbulo rojo abundante, para aglutinar glóbulos rojos en agregados de células más grandes o anticuerpos anti HLA para aglutinar todas las células nucleadas presentes en la sangre o el uso de una mezcla de anticuerpos de aglutinación celular.

Otra posibilidad para evitar que la célula sanguínea sedimente es la aglutinación de las células sanguíneas mediante el uso de bromuro de hexametrina comúnmente conocido como polibreno. Otros compuestos poliméricos como, por ejemplo, sulfato de protamina, pueden usarse también.

Otra posibilidad es usar no solo una unidad de filtro sino, en cambio, usar varias unidades de filtración en tándem en una disposición secuencial como, por ejemplo, se representa en las Figuras 2a, 2b.

Una célula tiene normalmente un diámetro de al menos 2 micrómetros para una célula leída a alrededor de 100 micrómetros para un leucocito. Los analitos biológicos como, por ejemplo, proteínas, inmunoglobulina, hormonas peptídicas, tienen todos dimensiones moleculares de normalmente 10 nanómetros o menos. El químico de bajo peso molecular de 2kD o menos tiene dimensiones moleculares en el bajo rango de nanómetros. Las células pueden separarse de los analitos de proteína por su tamaño, mediante el uso de un medio de filtrado como, por ejemplo, una tela. El proceso se describe mejor como un proceso de filtración. El plasma sanguíneo líquido absorbe la malla de tela y se absorbe allí. La fuerza motriz es la fuerza capilar. El movimiento del líquido por fuerzas capilares se dirige por tres factores 1) gravedad 2) capilaridad, cuanto más pequeños sean los espacios entre fibras, más fuerte es la fuerza capilar y 3) hidrofilicidad, para un líquido acuoso como, por ejemplo, plasma humano y malla/tela hidrofílica es un diseño favorable.

De manera alternativa, la sedimentación de las células puede estar evitando al generar o incluir una capa líquida de alta densidad por encima del fondo del pozo. Esto puede lograrse añadiendo sacarosa en el pozo y secándola. Tras la disolución por el agua en la muestra de sangre biológica, la sacarosa se disuelve y una solución de sacarosa de alta densidad se forma sobre el fondo del pozo donde se ubica el campo de detección evanescente de 200 nm de profundidad. En lugar de sacarosa, pueden usarse otras moléculas de azúcar. Además, uno puede sustituir por un polímero hidrofílico orgánico como, por ejemplo, sacarosa-epicloridrina-copolímero, proporcionando con el agua de las muestras biológicas soluciones acuosas de alta densidad y evitando que las células sedimenten en la superficie de detección. El sacarosa-epicloridrina-copolímero es comúnmente conocido y comercialmente disponible como Ficoll. Incluso otra posibilidad es el uso de Percoll que consiste en sílice coloidal recubierto de polivinilpirrolidona y generado con agua en una solución de alta densidad en el fondo del pozo y que evita la sedimentación de las células en la superficie de detección.

De manera alternativa, la sedimentación sobre la superficie de detección donde se genera el campo evanescente es la detección de la interacción biomolecular no en la parte inferior del pozo sino en una pared lateral del pozo. Dado que las células sedimentan por gravedad en la parte inferior, la superficie de detección no está cubierta por células de sedimentación y es posible una medición.

La presente invención simplifica el sistema de biosensor actual al integrar el fraccionamiento de la sangre en una parte celular y una parte de plasma y al colocar el segundo ligando etiquetado de manera fluorescente en el pozo en forma seca.

El fraccionamiento de la sangre y la separación en células sanguíneas y plasma/suero sanguíneo se logra por un proceso de filtración de sangre. Existen numerosos materiales para la filtración sanguínea disponibles usualmente como una malla de tela, el uso entonces es cortar la tela en una forma geométrica adecuada. Esta se colocará luego directamente sobre la superficie del sensor. Técnicamente, esto puede lograrse posicionando la tela directamente sobre la superficie de detección. El posicionamiento es una distancia menor que el campo evanescente, a saber, dentro de los 200 nm. Entonces, el ligando etiquetado de manera fluorescente se pipeteará sobre la malla de tela y deshidratará para su almacenamiento ya sea mediante secado al aire y/o liofilización.

Una mejora de la invención de una malla de tela difícil de posicionar de manera precisa es el uso de una filtración sanguínea mediante el uso de una capa de filtración de sangre que se genera y produce directamente en el pozo y directamente sobre la superficie de detección. La capa de filtración de sangre consiste en una malla/tela secada sobre la superficie de detección de un pozo del biosensor. Para lograr esto, la malla puede estar hecha de materiales inorgánicos u orgánicos como, por ejemplo, vidrio, carbón, polímeros orgánicos sintéticos o de fuentes naturales como, por ejemplo, una gelatina o celulosa.

Para preparar un dispositivo de prueba para su uso con sangre completa las etapas son:

1 Recubrir la superficie de detección en la parte inferior de la superficie del pozo con un ligando de unión.

2 Añadir una capa de filtración de sangre por encima de la superficie de detección. Esta superficie puede dejar que el plasma sanguíneo pase y empape el filtro ubicado directamente sobre la superficie de detección de manera completa.

3 Eliminar el líquido mediante un método adecuado como, por ejemplo, secado al aire y/o liofilización.

4 Añadir el ligando 2 etiquetado de manera fluorescente a la capa de filtro de sangre.

Otra manera de preparar un dispositivo de prueba para su uso con sangre completa incluye las etapas de:

1 Recubrir la superficie de detección en la parte inferior de la superficie del pozo con un ligando 1 de unión.

2 Añadir el ligando 2 etiquetado de manera fluorescente en el pozo y eliminar el líquido mediante un método adecuado como, por ejemplo, secado al aire y/o liofilización.

3 Añadir una capa de filtración de sangre directamente en contacto cercano sobre la superficie de detección. Esta superficie puede dejar que el plasma sanguíneo pase y empape el filtro ubicado directamente sobre la superficie de detección de manera completa.

El dispositivo, cuando se prepara como se describe más arriba, contiene un ligando unido a la superficie que une el analito, y un ligando de detector seco etiquetado de manera fluorescente sobre la malla de tela de filtración de sangre. Al añadir sangre al dispositivo, el ligando etiquetado de manera fluorescente se solubiliza tras la adición de la sangre. El ligando fluorescente reacciona con el analito a determinarse presente en la muestra de sangre. La capa de filtro retiene, de manera efectiva, las células presentes en la muestra de sangre y esencialmente solo el plasma/suero sanguíneo atraviesa la capa de filtro a la parte inferior del pozo. Posteriormente, los analitos en el plasma sanguíneo reaccionan con el ligando unido a la superficie. Por consiguiente, se genera una señal fluorescente. El ligando etiquetado unido al analito se esparce en una manera dependiente de la concentración según la segunda ley de difusión de Fick a la superficie de detección. Un aumento de señal dependiente del tiempo se observa en un rango de 1 a 120 minutos a medida que el complejo trimolecular compuesto de ligando unido a la superficie - analito - ligando etiquetado de manera fluorescente se forma en la parte inferior del pozo con el tiempo. Solo aquí donde se forma el campo evanescente de la luz de excitación, el fluoróforo se ilumina con luz de excitación, en consecuencia, y absorbe fotones y, en consecuencia, emite fotones que se miden de manera cuantitativa en tiempo real.

Breve descripción de los dibujos

Realizaciones a modo de ejemplo de la invención se describen en la descripción y se ilustran por los dibujos, en los cuales:

• La Figura 1 muestra el dispositivo ópticamente unidireccional descrito en el documento EP1371967.

• La Figura 2a muestra una imagen de despiece esquemática del dispositivo según una realización de la presente descripción.

• La Figura 2b muestra el dispositivo montado según una realización de la presente descripción.

• La Figura 3 muestra una disposición esquemática de un filtro según la presente descripción, cuando se encuentra empaquetado y seco.

• La Figura 4 muestra el filtro en un pozo de biosensor de evanescencia según la presente descripción.

• La Figura 5 muestra el montaje de un dispositivo según la presente descripción.

Ejemplos de realizaciones de la presente invención

La Figura 1 muestra el dispositivo 102 ópticamente unidireccional según la técnica anterior. Pozos 101 individuales contienen los reactivos químicos para llevar a cabo y medir analitos con una prueba de unión. Reactivos y muestras de sangre se han implicado en varias etapas de preparación, incluidas las etapas de filtrado y lavado, con anterioridad a su análisis a través del dispositivo 102.

Con referencia a las Figuras 2a y 2b, el dispositivo según la presente descripción comprende un recipiente 204 inferior, que tiene un área 207 de muestra donde colocar una muestra biológica para su análisis. La muestra biológica puede colocarse directamente dentro del área 207 de muestra. De manera alternativa, un vial que comprende una muestra biológica puede insertarse en el área 207 de muestra. Dicho vial es transparente o comprende al menos una superficie transparente para permitir la detección óptica de la muestra que contiene.

La muestra biológica denota cualquier fluido biológico extraído del cuerpo como, por ejemplo, sangre, fluido linfático, saliva, orina y similares. En particular, denota sangre. La muestra biológica preferiblemente se refiere a un fluido biológico crudo, lo cual significa que no se ha visto previamente implicado en una etapa de filtración o en una etapa de lavado. En otras palabras, la muestra comprende todos sus componentes originales, incluidas las células biológicas, analitos, proteínas, y cualquier molécula presente al momento de extracción del cuerpo. En particular, cuando la muestra es sangre, comprende todas las células como, por ejemplo, los glóbulos rojos, así como el suero y las moléculas allí comprendidas.

El analito denota cualquier componente presente en la muestra, siendo objeto del análisis biológico. El analito denota, en particular, partes pequeñas de la muestra, con dimensiones por debajo de 1 micrómetro, preferiblemente por debajo de 100 monómetros, o por debajo de alrededor de 10 nanómetros. En particular, el analito denota una o más moléculas como, por ejemplo, péptidos, proteínas, aminoácidos, hormonas, inmunoglobulinas, ácidos nucleicos y fracciones de ellos o una combinación de ellos.

El recipiente 204 inferior comprende una detección de superficie que permite detectar y analizar la muestra biológica mediante el uso de medios ópticos. En particular, la detección de superficie es superficie 203 de detección evanescente. La superficie 203 de detección evanescente puede, por ejemplo, disponerse en la parte inferior del área 207 de muestra para permitir la detección óptica de la parte inferior del dispositivo, debajo de la muestra. De manera alternativa, la superficie 203 de detección evanescente corresponde a una pared lateral del área 207 de muestra, que permite la detección óptica desde un lado del dispositivo.

El dispositivo puede estar provisto de o combinarse con elementos ópticos como, por ejemplo, uno o más prismas, filtro 509 óptico, y una unidad de medición de luz como, por ejemplo, un fotodiodo o un fotomultiplicador 510.

El dispositivo según la presente descripción comprende medios para separar los analitos del resto de la muestra. En particular, el dispositivo comprende medios para retener partes más grandes de la muestra y permitir la migración de las partes más pequeñas como, por ejemplo, los analitos. En particular, el dispositivo está provisto de al menos un elemento de filtración como, por ejemplo, un primer filtro 201. Dicho primer filtro puede ser cualquier elemento de filtración conocido como, por ejemplo, celulosa o tela o una malla comúnmente usada para separar células biológicas de sus moléculas dirigidas. El primer filtro 201 comprende fibras 302 de filtro (Figura 3) que definen un espacio 301 intersticial que define una porosidad. Cuando la superficie 203 de detección evanescente se dispone en la parte inferior del área 207 de muestra, un primer filtro 201 dispuesto por encima de la superficie 203 de detección evanescente permite mantener las células biológicas de la muestra lejos de la superficie 203 de detección evanescente. Se evita que las células biológicas y, en particular, los glóbulos rojos, pasen a través del espacio intersticial del primer filtro 201 mientras las moléculas dirigidas fluyen hasta la superficie 203 de detección evanescente. La porosidad del primer filtro 201 puede adaptarse según el tamaño del analito y/o los componentes de muestra. La porosidad del primer filtro 201 puede adaptarse para bloquear la difusión del elemento superior a alrededor de 1 micrómetro o superior a 10 micrómetros, o superior a 100 micrómetros.

El primer filtro 201 puede tener una porosidad regular a través de su grosor. De manera alternativa, el primer filtro 201 puede presentar una porosidad decreciente desde su superficie superior, que recibe la muestra, hasta su superficie inferior, más cercana a, o correspondiente a, la superficie 203 de detección evanescente. De manera alternativa, el primer filtro 201 puede ser una combinación de dos o más capas que tienen diferentes porosidades.

El primer filtro 201 puede, por consiguiente, filtrar glóbulos rojos de una muestra de sangre, y evitar que estos cubran la superficie 203 de detección evanescente.

Según la presente invención, el primer filtro 201 además comprende uno o más reactivos que incluyen ligandos que permanecen libres dentro del espacio 301 intersticial. Dicho reactivo o combinación de reactivos puede, por consiguiente, diluirse en una muestra y reaccionar con analitos dirigidos. Según la presente invención, el primer filtro 201 comprende al menos un primer ligando L1 que lleva una etiqueta fluorescente para formar un ligando 206 etiquetado de manera fluorescente. El reactivo o la combinación de reactivos puede añadirse al primer filtro 201 dentro de una solución y luego permanecer dentro del primer filtro 201 después de una etapa de secado. El primer filtro 201 puede, por consiguiente, prepararse con uno o varios reactivos antes de colocarse o integrarse en el dispositivo. De manera alternativa, el primer filtro 201 puede ya estar integrado dentro del dispositivo y sujeto a una preparación antes de poner en práctica el análisis biológico de una muestra.

El primer filtro 201 y/o el segundo filtro 202 pueden ser, por ejemplo, filtros comercialmente disponibles como el tipo de Whatmann o 3MM. Pueden usarse otros varios tipos de filtro. Un filtro de papel puede producirse fuera del pozo tomando normalmente una suspensión de fibras de celulosa en agua y retirando el agua. De manera alternativa, una malla de tela puede producirse directamente dentro del dispositivo, mediante adición de una suspensión acuosa de fibras en el pozo y secado de la misma.

El dispositivo según la presente descripción, por consiguiente, comprende todos los reactivos y componentes necesarios para detectar uno o más analitos y llevar a cabo una prueba cuantitativa de una muestra como, por ejemplo, una muestra de sangre.

El primer filtro 201 puede, de manera opcional, comprender aditivos como, por ejemplo, anticoagulantes. Ejemplos de anticoagulantes utilizables son heparina o EDTA. Estos aditivos opcionales pueden estar libres en el espacio 301 intersticial o unidos a la fibra 302 del primer filtro 201. Los anticoagulantes permiten evitar que el proceso de coagulación tenga lugar y, como tal, actúan como una barrera adicional para las partes celulares de sangre y evitan la sedimentación de las células hacia la superficie de detección por gravedad.

El dispositivo de la presente descripción permite, de manera ventajosa, llevar a cabo una prueba a partir de una muestra cruda sin tratamiento preliminar como, por ejemplo, etapas de filtración o lavado. Luego, inmediatamente, se inicia la medición en el lector y el resultado puede obtenerse después de varios minutos.

Otra ventaja es el uso de reactivos secos, ya incluidos en un filtro integrado al dispositivo. Dicha disposición limita o evita errores que resultan de la mezcla de reactivos de detector o de un volumen incorrecto. Una ventaja adicional es la estabilidad aumentada de reactivos secos en comparación con reactivos líquidos. Como tales, los reactivos o combinación de reactivos precondicionados dentro de un filtro ya integrado al dispositivo permiten una estabilidad mejorada y reproducibilidad de la prueba biológica.

Incluso otra ventaja es el pequeño volumen de medición que reduce la necesidad de grandes cantidades de reactivos biológicos potencialmente costosos, lo cual hace al dispositivo más económico cuando se compara con los dispositivos de medición estándares. Además, no se requiere adición alguna de otras soluciones o reactivos para obtener un resultado. La adición de una muestra de paciente como, por ejemplo, sangre completa, plasma, suero, saliva, orina, etc., trae el agua disolvente, que disuelve los reactivos secos en el pozo y la medición comienza. Esto es opuesto a otros métodos de laboratorio donde inevitablemente una solución de líquido se provee con la prueba y es un requisito esencial para llevar a cabo la prueba.

La superficie 203 de detección evanescente puede recubrirse con al menos un segundo ligando L2 que permite unir el analito dirigido, ya sea solo o combinado con un ligando 206 etiquetado de manera fluorescente. La superficie 203 de detección evanescente colocada debajo del primer filtro 201 permanece libre de los elementos más grandes de la muestra que de otra manera evitarían un buen análisis óptico.

De manera alternativa, el segundo ligando L2 se coloca dentro de un segundo filtro 202 dispuesto debajo del primer filtro 201. El segundo filtro 202 se coloca sobre o cerca de la superficie 203 de detección evanescente para permitir la detección óptica y la medición. En particular, cuando el filtro está lleno de plasma sanguíneo o suero sanguíneo, entonces el líquido permanece en el filtro. La reacción de unión con el segundo ligando L2 se mide mientras la muestra permanece dentro de la malla.

Los términos “debajo de” y “encima de” tienen el significado usual. En particular, la orientación del dispositivo según la presente descripción es como se representa en las figuras. El primer filtro 201, por consiguiente, se encuentra por encima del segundo filtro 202, la muestra estando colocada en el área 207 de muestra y sujeta a la gravedad natural desde la parte superior hasta la parte inferior del dispositivo.

Con referencia a la Figura 5, el segundo ligando L2 está unido sobre la superficie 203 de detección evanescente. Las fibras 302 permite que el analito 501 combinado a un conjugado 502 fluorescente eluyan y se unan al segundo ligando L2, mientras que el conjugado 502 etiquetado permanece en suspensión dentro de la muestra. El haz 507 de luz saliente que entra en la parte 204 inferior del dispositivo se refleja en la superficie 203 de detección. La luz resultante emitida desde el fluoróforo 508 unido se filtra a través de una unidad 509 óptica y se mide cuantitativamente con una unidad de medición de la luz como, por ejemplo, un fotodiodo o un fotomultiplicador 510.

Ejemplo: prueba de unión Beta HCG con sangre completa.

Un chip de biosensor de evanescencia se recubre con 20 pL de antígeno beta HCG a 100 U por mL en PBS durante 2 h o más a temperatura ambiente. El anticuerpo en exceso se retira mediante lavado con PBS y luego sigue una etapa de bloqueo de 1 h mediante el uso de 30 pL 1 % BSA en PBS 0,025 % Tween20. El pozo se lava consecutivamente 2 veces con PBS, 2 veces con 1 % de sacarosa y finalmente se seca al aire. Como filtro de sangre, uno puede usar una fibra de vidrio Tissue Ahlstrom Grado 8964 o, por ejemplo, una almohadilla de conjugado de fibra de vidrio como, por ejemplo, Millipore Cat GFCP203000. Los filtros pueden usarse como filtro de un uso o luego una combinación en tándem de la capa de filtro y filtros en el pozo, una mezcla de reacción concentrada de 5 pliegues se añade, la cual consiste en el conjugado anti beta HCG monoclonal anti a beta HCG (Hytest 5501 SP-1) APC producido según procedimientos estándares mediante el uso de química SMCC / SATA y purificado en S-200HR FPLC.

Además, se describe en la presente memoria una mezcla de diagnóstico adaptada para identificar un analito dirigido en condiciones de detección evanescente. La mezcla de diagnóstico puede comprender uno o más de un reactivo de detección etiquetado de manera fluorescente, una proteína animal, una proteína portadora, un agente de color, un detergente, un antioxidante y un tampón. Por ejemplo, la mezcla de diagnóstico puede comprender una combinación de anti-beta HCG 5501APC, PAK bovina IgG (Roche), BSA (Roche), negro brillante BN, polivinilpirrolidona, sacarosa, Tween 20, ácido ascórbico, HEPES pH 7.4 10mM On, 10x PBS mM relacionado con PO43mM y H2O hasta 100 %.

Anti-beta HCG 5501APC puede usarse en la prueba sándwich que se muestra en el reactivo de detección etiquetado de manera fluorescente. APC aloficocianina es la fracción molecular de fluorescencia. En lugar de APC, pueden usarse otros fluoróforos adecuados como, por ejemplo, Cy5, Dy649 Bodipy, etc. La cantidad de anti-beta HCG 5501APC puede estar comprendida entre 10 pg/mL y 50 pg/mL, preferiblemente entre alrededor de 20 pg/mL y 40 pg/mL o alrededor de 30 pg/mL.

PAK bovina IgG (Roche) es una proteína animal y sirve como un agente bloqueante al capturar cualquier reactividad humana antianimal en las muestras de plasma humano. De manera alternativa, pueden usarse proteínas de caballo, pollo, ratón, rata, cabra, oveja. La concentración es variable y debe ser considerablemente más alta que el reactivo de detección específico respectivamente, el reactivo de captura en la parte inferior del pozo. La concentración puede estar comprendida entre 1 y 30 mg/mL, o entre 2 y 10 mg/mL. Puede ser de alrededor de 5 mg/mL.

BSA (Roche) es una proteína portadora comúnmente usada en inmunoensayos. BSA polimerizada puede también usarse. Las concentraciones pueden variar entre 1 a 20 mg/mL. Preferiblemente, es de alrededor de 5 mg/mL.

Negro brillante BN es un color azul y sirve como un bloqueador químico que absorbe luz parásita residual que entra en el volumen a granel en el pozo y puede dar lugar a una señal fluorescente de fondo. El negro brillante puede sustituirse por otro color azul no fluorescente como, por ejemplo, azul brillante, o por color verde como, por ejemplo, clorofila, o por un color negro simple o nanopartículas entonces coloreadas en el volumen a granel del líquido. La concentración puede estar comprendida entre 0,1 y 5 mg/mL. Preferiblemente, es de alrededor de 0,2 mg/mL.

La polivinilpirrolidona 0,5 % es un reactivo a granel comúnmente usado y mejora y aumenta las señales de interacción no covalente. Los rangos de concentraciones a usarse son de 0,1 a 5 %.

La sacarosa actúa como un reactivo que estabiliza las proteínas cuando estas están secas. La sacarosa es un azúcar simple y de bajo coste que actúa como un protector secante para las proteínas. Asimismo, la sacarosa se usa como lioprotector comúnmente en el producto liofilizado. Otros azúcares pueden usarse aquí, notablemente la trehalosa es conocida por su uso como lioprotector y agente estabilizador de proteínas secas. Las concentraciones pueden estar comprendida entre alrededor de 0,1 y 10 %, o entre 0,5 y 5 %. Puede ser, por ejemplo, de alrededor del 1 %.

Tween 20 es un detergente comúnmente usado en inmunoensayos en concentraciones por encima de la concentración micelar crítica. Obviamente, Tween 20 puede reemplazarse por otros detergentes, ya sean aniónicos, catiónicos o detergentes no cargados, y sirve como un reactivo para reducir la unión no específica. Detergentes anfotéricos, que llevan cargas positivas y negativas, pueden también usarse. La cantidad de dicho detergente puede estar comprendida entre 0,01 y 1 %. Puede ser de alrededor de 0,05 %.

El ácido ascórbico se usa como antioxidante y sirve para proteger el fluoróforo del daño de la radiación. Pueden usarse otros antioxidantes como, por ejemplo, butilhidroxitolueno. La concentración del antioxidante puede estar comprendida entre alrededor de 0,1 y 2 %. Puede ser, por ejemplo, de alrededor del 0,125 %.

HEPES pH 7.4 10mM es un compuesto tampón y sirve para estabilizar el pH de la solución durante el proceso de secado. Otros tampones pueden usarse como, por ejemplo, tampones de fosfato o sistemas de tampones orgánicos como, por ejemplo, citrato, Tris, Bistrispropano, MOPS. Las concentraciones pueden variar de 1 a 20 mM de sustancia tampón en casos excepcionales hasta 50 mM o incluso 100 mM.

10x PBS, mM relacionado con PO4 3mM sirve como una sustancia tampón y el cloruro de sodio sirve como un compuesto que mejora la solubilidad y, por consiguiente, que aumenta la solubilidad de los reactivos.

H2O se añade para conformar el volumen hasta el 100 %. Preferiblemente, es agua esterilizada.

Las concentraciones de las componentes dadas son solo indicativas y pueden variar de manera acorde en un rango de 10 veces menos hasta tres veces más alto.

De manera opcional, la mezcla puede complementarse con polietilenglicol que actúa de manera doble como un potenciador de reacción y como un crioprotector que evita el daño a proteínas sensibles al efecto dañino de la congelación.

También de manera opcional, IgG de ratón puede añadirse para bloquear cualquier anticuerpo anti-ratón humano, HAMA, por sus siglas en inglés, presente ocasionalmente en muestras de plasma humano. Esta IgG de ratón puede presentarse como monómero o como IgG de ratón polimerizada.

La presente invención también se refiere a un método de diagnóstico o a un método de análisis de una muestra biológica de fluido.

Dicho método comprende la etapa de añadir una mezcla de diagnóstico en un filtro integrado al dispositivo descrito más arriba. La mezcla de diagnóstico puede colocarse en el primer filtro 201 dentro del dispositivo. De manera alternativa, un filtro externo puede tratarse con la mezcla de diagnóstico.

La mezcla de diagnóstico se deja entonces secar al aire. Esta etapa de secado puede llevarse a cabo a presión ambiente y a temperatura ambiente. De manera alternativa, la etapa de secado puede llevarse a cabo a una temperatura superior a 20 °C y por debajo de alrededor de 40 °C. De manera alternativa, la mezcla de diagnóstico puede estar sujeta a liofilización y/o deshidrocongelación para eliminar el agua.

El método de diagnóstico también incluye la etapa de colocar una muestra en el primer filtro 201 dentro del dispositivo, en donde la muestra corresponde a una muestra cruda directamente tomada del cuerpo del paciente. La muestra se coloca una vez que los reactivos y los potenciales aditivos incluidos en el primer filtro o un filtro adicional estén secos.

Luego, la detección óptica permite identificar el analito dirigido y registrar la medición con el tiempo. La cantidad de analito puede determinarse dado que la intensidad de la detección óptica está relacionada con su concentración. La detección óptica incluye iluminar el fluoróforo unido a la superficie de detección a través del campo evanescente de una fuente luminosa y medir la luz fluorescente generada.

Las muestras probadas son A. 15 microlitro de plasma sanguíneo humano resp. B. 15 microlitro de sangre completa humana. La unión del conjugado anti beta HCG APC 5501 APC a beta HCG unida a la superficie se mide en tiempo real y el aumento en recuentos Pton durante más de diez minutos se registra. Este aumento en fotones representa la señal y es proporcional a la concentración del analito, en este caso aquí anti-beta HCG APC, y se da como el aumento en señal durante un tiempo de medición de 10 minutos y los recuentos de unidad por segundo se abrevian como cps. Los resultados se expresan en recuentos netos tomando la señal de pozos recubiertos con beta HCG y restando la señal negativa de fondo del pozo que no se había recubierto con beta HCG. Dos matrices diferentes se han usado 1 plasma humano y 2 sangre EDTA humana de un donante masculino saludable.

Resultado: para el filtro de sangre Ahlstrom, se observa la misma señal cuando se usa plasma sanguíneo o cuando se usa sangre completa EDTA anticoagulada. Los valores duplicados son buenos. Para la membrana Millipore, el plasma sanguíneo da buena señal, sin embargo, cuando se usa sangre EDTA anticoagulada la señal se reduce y los valores duplicados son menos precisos. Sin embargo, ambas membranas funcionan como membranas de filtración de sangre y ambas membranas pueden usarse para secar una mezcla de detección con fluoróforo en las membranas.

El proceso de filtración de sangre funciona de manera efectiva y permite medir analitos en sangre completa usando la tecnología de biosensor de evanescencia.

La presente invención puede contener o estar definida por una o más de las siguientes características:

Permite medir sustancias siguiendo las etapas de presentar una superficie que contiene al menos otro reactivo L1 unido a la superficie, contactar la superficie con una solución que contiene la sustancia a medirse y un ligando L2 etiquetado de manera fluorescente donde cada uno de los ligandos se une solo o en combinación con la sustancia para formar un complejo, e iluminar el fluoróforo unido a la superficie a través del campo evanescente de una fuente luminosa y medir la luz fluorescente generada, en donde todos los reactivos para la medición están presentes en una forma seca en el dispositivo y se disuelven por un líquido.

Todos los reactivos para una prueba se presentan en forma seca y el único líquido para solubilizar y disolver todos los reactivos requerido es el líquido de la muestra biológica.

Una membrana de filtro porosa se posiciona directamente sobre la superficie de detección.

La membrana de filtro se producein situen el pozo mediante adición de una suspensión que contiene fibra al fondo del pozo y retirando el líquido mediante secado.

Las fibras tienen un diámetro de 0,5 a 10 micrómetros, preferiblemente de 1 a 1-5 micrómetros.

El tamaño de poro del filtro permite el paso de compuestos moleculares y no permite el paso de compuestos celulares.

Una membrana de filtro porosa o una capa de fibra seca se posiciona directamente sobre la superficie de detección y los reactivos requeridos para medir la sustancia de las muestras biológicas se secan en el filtro de membrana poroso. Dos membranas individuales están directamente en contacto con la superficie de detección. La membrana 1 elimina la materia particulada de la muestra y la membrana 2 tiene los reactivos requeridos para la prueba en forma seca recubiertos sobre esta.

La cámara de reacción donde se genera el campo de evanescencia tiene un volumen de 0,1 a 30 microlitros.

Una superficie cíclica o elíptica iluminada por luz de excitación tiene un área de 0,1 a 20 milímetros cuadrados, preferiblemente entre 0,3 y 7 milímetros cuadrados y especialmente preferiblemente entre 1 y 3 milímetros cuadrados. El dispositivo de pruebas de diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones previas se caracteriza por que el volumen de la reacción se determina por el espacio geométrico en el dispositivo.

El dispositivo está esterilizado.

Símbolos de referencia en las figuras

201 primer filtro

202 segundo filtro

203 superficie de detección

204 recipiente inferior

L1 primer ligando

206 ligando etiquetado de manera fluorescente

207 área de muestra

301 espacio intersticial

302 fibras de filtro

303 superficie inferior

404 prisma

L1 primer ligando

L2 segundo ligando

501 analito

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo de diagnóstico que comprende un recipiente (204) inferior que tiene un área (207) de muestra, en donde el recipiente (204) inferior comprende una superficie (203) de detección evanescente y medios de detección ópticos, en donde el área (207) de muestra comprende al menos un primer filtro (201) provisto de fibras (302) que definen el espacio (301) intersticial, el primer filtro colocándose sobre o por encima de la superficie (203) de detección evanescente, caracterizado por que dicho al menos primer filtro comprende uno o más reactivos libremente dispersos dentro del espacio intersticial como elementos secos, e incluye un primer ligando (L1) y una etiqueta fluorescente.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho primer filtro (201) se coloca por encima de la superficie (203) de detección y por que la superficie de detección está recubierta con al menos un segundo ligando (L2).

3. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 o 2, que además comprende un segundo filtro (202) colocado por debajo del primer filtro (201).

4. Dispositivo según la reivindicación 3, en donde dicho segundo filtro se coloca en contacto directo con la superficie de detección y comprende al menos un segundo ligando (L2).

5. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el primer filtro está permanentemente integrado dentro del dispositivo de diagnóstico.

6. Dispositivo según la reivindicación 5, en donde dicho primer filtro resulta de una suspensión que contiene una fibra seca colocada dentro del área (207) de muestra.

7. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas fibras de filtro tienen un diámetro de 0,5 a 10 micrómetros, preferiblemente de 1 a 1-5 micrómetros.

8. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la porosidad del primer filtro es inferior a alrededor de 100 micrómetros, preferiblemente inferior a 1 micrómetro.

9. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el área (207) de muestra tiene un volumen de 0,1 a 30 microlitros.

10. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la porosidad del primer filtro se adapta para bloquear la difusión de elementos superiores a 1 micrómetro, preferiblemente superiores a 10 micrómetros, y más preferiblemente superiores a 100 micrómetros.

11. Método de diagnóstico que usa el dispositivo definido a través de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el método comprendiendo la etapa de añadir una mezcla de diagnóstico en un filtro integrado al dispositivo y una etapa de secado de dicha mezcla de diagnóstico de modo que los reactivos de diagnóstico se dispersan dentro del filtro en una forma seca.

12. Método de diagnóstico según la reivindicación 11, que además comprende la etapa de colocar una muestra biológica sobre dicho filtro, en donde la muestra biológica es una muestra biológica cruda directamente tomada del cuerpo de un paciente.