KR20070116615A

KR20070116615A - 내부 검량 시스템을 사용하는 진단 시험용 키트

Info

Publication number: KR20070116615A
Application number: KR1020077022189A
Authority: KR
Inventors: 수에동 송; 치부에제 오비 치데벨루-에제; 로잔 마리 매튜스 케일러
Original assignee: 킴벌리-클라크 월드와이드, 인크.
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2006-01-19
Publication date: 2007-12-10
Also published as: CN101151531A; EP1866644B1; US20060223193A1; JP2008534956A; US8932878B2; MX2007011884A; EP1866644A1; CN105403698A; US20110177616A1; WO2006107371A1; US7939342B2

Abstract

측면 흐름 분석 장치 및 다수의 분석 시약을 포함하는, 시험 샘플 중에 있는 시험 분석물을 검출하기 위한 진단 시험용 키트를 개시한다. 분석 시약은 시험 샘플 중의 시험 분석물의 존재 또는 양을 나타내는 검출 신호를 생성할 수 있는 검출 프로브를 포함한다. 검출 정확도를 추가로 증진시키기 위하여, 검량 분석물의 존재 또는 양을 나타내는 검량 신호를 생성할 수 있는 검량 프로브 또한 사용된다. 검출 신호를 검량하기 위하여 검량 신호를 사용할 수 있다.

측면 흐름 분석 장치, 진단 시험용 키트, 검출 프로브, 감량 프로브

Description

내부 검량 시스템을 사용하는 진단 시험용 키트{DIAGNOSTIC TEST KITS EMPLOYING AN INTERNAL CALIBRATION SYSTEM}

다양한 분석 방법 및 장치가 시험 샘플 중에 존재할 수 있는 분석물의 존재 및/또는 농도를 측정하기 위한 분석에 보편적으로 사용된다. 예를 들면, 면역분석법은 유기체에 대해 병원성이거나 외래인 항원의 존재에 반응하여 항체가 생산되는 면역계의 기전을 사용한다. 이들 항체 및 항원, 즉, 면역반응물은 서로 결합할 수 있고, 이에 따라 생물학적 샘플 중 그 특정 항원의 존재 또는 농도를 측정하는데 사용될 수 있는 매우 특이적인 반응 기전을 야기시킨다.

분석물들이 분석적으로 검출될 수 있도록 검출가능한 성분으로 표지된 면역반응물을 사용하는 수개의 면역분석법이 잘 공지되어 있다. 예를 들면, "샌드위치-타입" 분석 포맷은 전형적으로 분석물에 대하여 특이적인 결합 구성원 (예로서, 항체)과 접합된 검출 프로브와 시험 샘플을 혼합하여 분석물과 접합된 프로브 사이에 복합체가 형성되도록 하는 것을 포함한다. 이어서, 이들 복합체는, 검출 대역내 고정화된 수용 물질 (예로서, 항체)과 접촉할 수 있다. 분석물/프로브 접합 복합체와 고정화된 수용 물질 사이의 결합이 발생함으로써 분석물의 존재를 지시하는데 검출가능한 "샌드위치" 복합체가 국소화된다. 이러한 기술을 사용하여 정량적 또는 반-정량적 결과를 얻을 수 있다. 이러한 샌드위치-타입 분석법의 몇몇 일례 는 미국 특허번호 제4,168,146호 (그럽(Grubb) 등) 및 미국 특허번호 제4,366,241호 (톰(Tom) 등)에 기재되어 있다. 대체 기술은 "경쟁적-타입" 분석법이다. 경쟁적 분석법에서, 표지된 프로브를 일반적으로 분석물과 동일한 분자, 또는 분석물의 유사체인 분자와 접합시킨다. 따라서, 표지된 프로브는 이용가능한 수용 물질에 대하여 관심의 대상이 되는 분석물과 경쟁하게 된다. 경쟁적 분석법은 전형적으로 합텐과 같은 분석물의 검출에 사용되고, 각 합텐은 1가이며 단지 1개의 항체 분자와 결합할 수 있다. 경쟁적 면역분석 장치의 일례는 미국 특허번호 제4,235,601호 (듀츠(Deutsch) 등), 미국 특허번호 제4,442,204호 (리오타(Liotta)) 및 미국 특허번호 제5,208,535호 (뷰츨러(Buechler) 등)에 기재되어 있다.

이러한 분석법들 중 다수는 특히 반-정량적 및 정량적 검출을 위한 유효하고 의미 있는 결과를 제공하기 위하여 검량(calibration)에 의존한다. 외부 검량 시스템에 있어서, 표준 곡선은 대체로 일련의 공지된 양의 분석물을 포함하는 표준 샘플로부터 수득되며, 이어서, 샘플로부터 수득된 결과는 샘플 중의 분석물의 존재 및/또는 양을 추론하기 위하여 표준 곡선과 비교된다. 외부 검량 방법은 비교적 디자인이 용이하며 실행이 단순하다. 그러나, 이는 종종 환경 및 배치-대-배치(batch-to-batch) 변화로부터의 간섭을 받기 쉬우며, 따라서 신뢰성이 없다.

이에, 이러한 문제들을 극복하기 위해 몇몇 내부 검량 시스템이 개발되었다. 예를 들면, 미국 특허번호 제5,387,503호 (셀머(Selmer) 등)에는, 공지된 용량의 샘플을 소정량의 검량제(calibrator) 분석물과 혼합하고 상기 혼합물을 고체 지지체와 접촉시키는 것을 포함하는 내부 검량 기술이 기재되어 있다. 고체 지지체는 제1 이산 구역중의 시험 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 시약, 및 제2 이산 구역중의 검량제 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 시약을 포함한다. 시험 분석물에 대하여 표지된 시약과 검량제 분석물에 대하여 유사하게 표지된 시약의 혼합물 또한 고체 지지체에 적용된다. 시험 분석물 및 검량제 분석물, 각각에 결합한 표지된 시약의 수준을 비교하여 샘플 중 시험 분석물의 양을 측정한다. 불행하게도, 그러한 내부 검량 기술은, 크로마토그래프 방법을 사용하는 분석물의 비균질 분리를 포함하는 측면 흐름 장치에는 용이하게 혼입될 수 없다. 게다가, 특히 최종 사용자가 정규 의료 전문의도 기술자도 아닐 때 현장(point-of-care) 적용시에는 분석 시약을 사전에 혼합하여야 한다는 요건이 부담이 되며 지나치게 복잡한 것이 된다.

그 자체로서, 현재는 정확하고 상대적으로 저렴하며 사용이 간편하고 용이한, 측면 흐름 분석을 위한 정확한 내부 검량 시스템이 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명의 하나의 실시태양에 따라, 시험 샘플 중에 있는 시험 분석물의 존재 또는 양을 검출하기 위한 진단 시험용 키트를 개시한다. 진단 시험용 키트는 다공성 막을 포함하는 측면 흐름 분석 장치를 포함한다. 다공성 막이 검출 대역 및 검량 대역을 규정한다. 제1 수용 물질은 검출 대역내 고정되어 있고, 제2 수용 물질은 검량 대역내 고정되어 있다. 측면 흐름 분석 장치 이외에도, 진단 시험용 키트는 또한 다수의 분석 시약을 포함하며, 이 중 하나 이상이 측면 흐름 분석 장치상에 배치된다. 분석 시약은 검량 분석물, 검출 프로브, 및 검량 프로브를 포함한다. 검출 프로브는 시험 분석물, 제1 수용 물질, 또는 그의 조합물에 우선적으로 결합하도록 구성된 제1 특이 결합 구성원과 접합된다. 검량 프로브는 검량 분석물, 제2 수용 물질, 또는 그의 조합물에 우선적으로 결합하도록 구성된 제2 특이 결합 구성원과 접합된다.

본 발명의 또다른 실시태양에 따라, 측면 흐름 장치를 사용하여 시험 분석물을 정량적으로 또는 반-정량적으로 검출하는 방법을 개시한다. 본 장치는 제1 특이 결합 구성원과 접합된 검출 프로브, 및 제2 특이 결합 구성원과 접합된 검량 프로브와 소통하고 있는 다공성 막을 포함한다. 다공성 막은 또한 검출 대역 및 검량 대역을 규정한다. 본 방법은 측면 흐름 장치를 검량 분석물과 접촉시키고, 측면 흐름 장치를 시험 샘플과 접촉시키고, 검출 대역에서 생성된 검출 신호 강도를 측정하고, 검량 대역에서 생성된 검량 신호 강도를 측정하는 것을 포함한다. 시험 분석물의 양은 검량 신호 강도에 의해 검량되는 검출 신호 강도에 비례한다.

본 발명의 추가의 또다른 실시태양에 따라, 측면 흐름 장치를 사용하여 시험 분석물을 정량적으로 또는 반-정량적으로 검출하는 방법을 개시한다. 본 장치는 검량 분석물, 제1 특이 결합 구성원과 접합된 검출 프로브, 및 제2 특이 결합 구성원과 접합된 검량 프로브와 소통하고 있는 다공성 막을 포함한다. 다공성 막은 또한 검출 대역 및 검량 대역을 규정한다. 본 방법은 측면 흐름 장치를 시험 샘플과 접촉시키고, 검출 대역에서 생성된 검출 신호 강도를 측정하고, 검량 대역에서 생성된 검량 신호 강도를 측정하는 것을 포함한다. 시험 분석물의 양은 검량 신호 강도에 의해 검량되는 검출 신호 강도에 비례한다.

본 발명의 다른 특징 및 측면들은 하기에서 보다 상세하게 논의된다.

본 발명의 최상의 양식을 비롯하여, 당업계의 통상의 숙련인들을 위한 본 발명의 충분하고 실시가능한 개시는 첨부된 도면을 참조로 하여 본 명세서의 나머지 부분에 더욱 구체적으로 상술되어 있다.

도 1은 본 발명의 측면 흐름 분석 장치의 한 실시태양의 투시도이고;

도 2는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 샌드위치 분석 포맷의 한 실시태양의 개략적 도해이며;

도 3은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 간접 분석 포맷의 한 실시태양의 개략적 도해이고;

도 4는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 경쟁 분석 포맷의 한 실시태양의 개략적 도해이다.

본 명세서 및 도면에서 도면 부호의 반복된 사용은 본 발명의 동일하거나 유사한 특징 또는 요소들을 나타내기 위한 것이다.

대표적인 실시태양의 상세한 설명

정의

본 원에서 사용되는 바, 용어 "분석물"은 일반적으로 검출하고자 하는 물질을 언급한다. 예를 들면, 분석물은 항원 물질, 합텐, 항체, 및 그의 조합물을 포함할 수 있다. 분석물은 제한하는 것은 아니지만, 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩 티드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물 (치료 목적으로 투여되는 약물과 불법적인 목적으로 투여되는 약물을 포함한다), 약물 중간체 또는 부산물, 세균, 바이러스 미립자, 및 상기 물질들 중 임의의 것의 대사 물질 또는 그에 대한 항체를 포함한다. 몇몇 분석물의 특정 일례로는 페리틴: 크레아티닌 키나제 MB (CK-MB); 디곡신; 페니토인; 페노바르비톨; 카르밤아제핀; 반코마이신; 젠타마이신; 테오필린; 발프로산; 퀴니딘; 항체 형성호르몬 (LH); 여포 자극 호르몬 (FSH); 에스트라디올; 프로게스테론; C-반응성 단백질; 리포칼린; IgE 항체; 사이토카인; 비타민 B2 마이크로-글로불린; 당화 헤모글로빈 (Gly. Hb); 코르티솔; 디기톡신; N-아세틸프로카인아미드 (NAPA); 프로카인아미드; 풍진 IgG 및 풍진 IgM과 같은 풍진에 대한 항체; 톡소플라스마증 IgG (Toxo-IgG) 및 톡소플라스마증 IgM (Toxo-IgM)과 같은 톡소플라스마증에 대한 항체; 테스토스테론; 살리실레이트; 아세트아미노펜; B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg); B형 간염 코어 항원에 대한 항체, 예로서, 항-B형 간염 코어 항원 IgG 및 IgM (항-HBC); 인체 면역 결핍 바이러스 1 및 2 (HIV 1 및 2); 인체 T-세포 백혈병 바이러스 1 및 2 (HTLV); B형 간염 e 항원 (HBeAg); B형 간염 e 항원에 대한 항체 (항-HBe); 인플루엔자 바이러스; 갑상선 자극 호르몬 (TSH); 티록신 (T4); 총 트리요오도타이로닌 (총 T3); 유리 트리요오도타이로닌 (유리 T3); 암배아 항원 (CEA); 지질단백질, 콜레스테롤, 및 트리글리세리드; 및 알파 태아 단백질 (AFP)를 포함한다. 남용 약물 및 규제 약물은 제한하는 것은 아니지만, 암페타민; 메탐페타민; 바르비투레이트, 예로서, 아모바르비탈, 세코바르비탈, 펜토바르비탈, 페노바르비탈, 및 바르비탈; 벤조디아제핀, 예로서, 리브륨 및 발륨; 칸나비노이드, 예로서, 하쉬쉬 및 마리화나; 코카인; 펜타닐; LSD; 메타쿠알론; 아편제, 예로서, 헤로인, 모르핀, 코데인, 하이드로모르폰, 하이드로코돈, 메타돈, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 아편; 펜시클리딘; 및 프로폭시헨을 포함한다. 다른 잠재적인 분석물들은 미국 특허번호 제6,436,651호 (에버하트(Everhart) 등) 및 미국 특허번호 제4,366,241호 (톰 등)에 기재되어 있을 것이다.

본 원에서 사용되는 바, 용어 "시험 샘플"은 일반적으로 분석물을 함유할 것으로 의심되는 생물학적 물질을 언급한다. 시험 샘플은 임의의 생물학적 공급원, 예로서, 혈액, 간질액, 타액, 접안 렌즈액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 유액, 복수액, 점액, 콧물, 가래, 윤활액, 복막액, 질액, 멘스, 양수, 정액 등을 비롯한 생리학적 유체로부터 유래될 수 있다. 환경 또는 식품 생산 분석을 수행하기 위하여 물, 식품 등과 같은 생리적 유체 이외의 다른 액체 샘플이 사용될 수 있다. 게다가, 분석물을 함유할 것으로 의심되는 고체 물질도 시험 샘플로서 사용될 수 있다. 시험 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득한 것으로서 사용될 수 있거나, 샘플의 특징을 변형시키기 위하여 전처리한 후 사용될 수 있다. 예를 들면, 그러한 전처리는 혈액으로부터 혈장을 제조하는 것, 점액을 희석시키는 것 등을 포함할 수 있다. 전처리 방법은 또한 여과, 침전, 희석, 증류, 혼합, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가, 용해 등을 포함할 수 있다. 더욱이, 액체 매질을 형성하거나 분석물을 유리시키기 위하여 고체 시험 샘플을 변형시키는 것이 유리할 수 있다.

상세한 설명

이제 본 발명의 다양한 실시태양들에 대하여 보다 상세하게 살펴보고자 하며, 이들 중 하나 이상의 일례들이 하기 기재되어 있다. 각 일례는 본 발명을 제한하고자 함이 아닌, 설명하기 위하여 제공되는 것이다. 사실상, 본 발명에서 본 발명의 범주 또는 정신으로부터 벗어나지 않고 다양한 변형 및 변화들이 이루어질 수 있다는 것은 당업계의 숙련인에게 명백할 것이다. 예를 들면, 하나의 실시태양의 일부분으로 설명되거나 또는 예시된 특징들이 또다른 실시태양에서 사용되어 추가의 다른 실시태양을 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허 청구의 범위 및 이들의 등가물의 범위 내에 속하는 이러한 변형 및 변화들을 포함하고자 한다.

일반적으로, 본 발명은 시험 샘플 중에 있는 시험 분석물의 존재 또는 양을 검출하기 위한 것으로서, 측면 흐름 분석 장치 및 다수의 분석 시약을 사용하는 진단 시험용 키트에 관한 것이다. 분석 시약은 시험 샘플 중 시험 분석물의 존재 또는 양을 나타내는 검출 신호를 생성할 수 있는 검출 프로브를 포함한다. 검출 정확도를 추가로 증진시키기 위하여, 검량 분석물의 존재 또는 양을 나타내는 검량 신호를 생성할 수 있는 검량 프로브 또한 사용된다. 검출 신호를 검량하기 위하여 검량 신호를 사용할 수 있다.

시험 분석물과 검량 분석물간의 보다 용이한 식별을 위해 검량 분석물은 보통 시험 샘플에 대하여 외래의 것이거나 일정한 농도로 존재한다. 추가로, 보통은 검량 분석물이 pH, 온도, 염 농도 등의 조건과 관련하여 시험 분석물과 유사한 분해 프로파일 (또는 시간의 경과에 따른 활성 손실)을 나타내는 것도 바람직하다. 이러한 방식으로, 검량 분석물은 동일한 반응 조건 및 저장 시간하에서 유사하게 작용함으로써 검량 분석물의 검량 곡선은 실질적으로 시험 분석물의 검량 곡선과 유사할 것이다. 원하는 경우, 예를 들면, 검량 분석물은 시험 분석물과 동일한 단백질 계열의 구성원일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 시험 분석물은 C-반응성 단백질 ("CRP")로서, 이는 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)의 체세포 C-다당류와 침전물을 형성하는 글로블린이다. CRP는, 5개의 비공유 결합된 서브유니트를 포함하는 5각형의 환형 대칭을 갖는 올리고머 혈장 단백질인 "펜트락신" 계열의 단백질에 속하는 것이다. "펜트락신" 계열중 2개의 공통 분기, 즉, "CRP-양" 단백질 및 혈청 아밀로이드 P ("SAP") 양 단백질이 존재한다. 포스포콜린과 결합하는 단백질은 CRP-양인 것으로 간주되는 반면, 당질 부위와 결합하는 부위는 SAP-양인 것으로 간주된다. 따라서, CRP가 시험 분석물인 실시태양에서, 선택되는 검량 분석물은 펜트락신 계열의 구성원일 수 있고, 더욱더 바람직하게는, 포스포콜린과 결합하는 펜트락신 단백질일 수 있다. 그러한 포스포콜린-결합 펜트락신 단백질의 몇몇 일례로는 제한하는 것은 아니지만, 펜트락신 3 ("PTX3"), 뉴런 펜트락신 1, 및 뉴런 펜트락신 2를 포함한다. 예로서, ([Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology : Production of the Long 펜트락신 PTX3 in Advanced Atherosclerotic Plagues ]; [Michael S. Rolph, et al.; 2002; 22:e10])을 참조한다. 그러나, 검량 분석물이 시험 분석물과 동일한 계열의 구성원일 필요는 없다. 사실상, 다수의 적용에 있어서는 보다 낮은 수준의 검량 정확도를 필요로 하고, 그 자체로서, 비교적 저렴하고 보다 용이하게 사용할 수 있는 검량 분석 물이 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 예를 들면, CRP에 대한 검량 분석물은 비-펜트락신 계열의 단백질 (예로서, 이량체, 삼량체 등), 예로서, 알부민, 소 혈청 알부민(BSA), β-카제인, 또는 hCG (상기 모두는 CRP과 유사한 분해 프로파일을 갖는 것으로 여겨진다)로부터 선택되는 단백질일 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 시험 분석물 및 검량 분석물 각각을 검출하기 위해 본 발명에서 검출 프로브 및 검량 프로브가 사용된다. 검량 프로브는 일반적으로 검출 프로브와 동일한 유형의 검출가능한 물질을 함유한다. 가시적으로 또는 계측 장치에 의해 검출될 수 있는 신호를 생성할 수 있는 임의의 물질이 검출 프로브 또는 검량 프로브로서 사용될 수 있다. 적합한 검출가능한 물질은 예를 들면, 발광성 화합물 (예로서, 형광, 인광 등); 방사성 화합물; 시각적 화합물 (예로서, 착색 염료 또는 금속 물질, 예로서, 금); 신호-생성 물질을 함유하는 리포좀 또는 다른 소낭; 효소 및/또는 기질 등을 포함할 수 있다. 다른 적합한 검출가능한 물질은 미국 특허번호 제5,670,381호 (조우( Jou ) 등) 및 제5,252,459호 (타르카 ( Tarcha ) 등) (모든 목적을 위해 전체적으로 본 원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있을 것이다. 검출가능한 물질이 유색인 경우, 이상적인 전자기 방사선은 상보형 파장 광이다. 예를 들면, 청색 검출 프로브는 적색광을 강하게 흡수한다.

몇몇 실시태양에서, 검출가능한 물질은 광학적으로 검출가능한 신호를 생성하는 발광성 화합물일 수 있다. 예를 들면, 적합한 형광 분자는 제한하는 것은 아니지만, 플루오레세인, 유로퓸 킬레이트, 피코빌린단백질, 로다민, 및 그의 유도체 및 유사체를 포함할 수 있다. 다른 적합한 형광 화합물은, 보편적으로 "양자점"으 로서 언급되는 반도체 나노결정이다. 예를 들면, 그러한 나노결정은 식 CdX (여기에서, X는 Se, Te, S 등이다)의 핵을 함유할 수 있다. 나노결정은 또한 식 YZ (여기에서, Y는 Cd 또는 Zn이고, Z는 S 또는 Se이다)의 상부 쉘로써 부동화될 수도 있다. 적합한 반도체 나노결정의 다른 일례는 또한 미국 특허번호 제6,261,779호 (바버라-길렘(Barbera-Guillem) 등) 및 제6,585,939호 (다프리치(Dapprich)) (모든 목적을 위해 전체적으로 본 원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있을 것이다.

추가로, 적합한 인광 화합물로는 하나 이상의 금속, 예로서, 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 백금, 인듐, 팔라듐, 몰리브덴, 테크네튬, 구리, 철, 크롬, 텅스텐, 아연 등의 금속 착물을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 것은 루테늄, 레늄, 오스뮴, 백금 및 팔라듐이다. 금속 착물은 수성 또는 비수성 환경에서 착물의 가용성을 촉진시키는 하나 이상의 리간드를 함유할 수 있다. 예를 들면, 리간드의 몇몇 적합한 일례로 제한하는 것은 아니지만, 피리딘; 피라진; 이소니코틴아미드; 이미다졸; 비피리딘; 테르피리딘; 페난트롤린; 디피리도페나진; 포르피린, 포르핀 및 그의 유도체를 포함한다. 그러한 리간드는 예를 들면, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, 카르복실레이트, 카르복스알데하이드, 카르복스아미드, 시아노, 아미노, 하이드록시, 이미노, 하이드록시카르보닐, 아미노카르보닐, 아미딘, 구아니디늄, 유레이드, 황-함유 기, 인-함유 기, 및 N-하이드록시-숙신이미드의 카르복실레이트 에스테르일 수 있다.

포르피린 및 포르핀 금속 착물은 메틸렌 브릿지와 함께 커플링된 피롤기들을 보유하여, 내부 공간에 금속이 킬레이트화되어 있는 환형 구조물을 형성한다. 이 분자들 중 다수는 실온에서 적합한 용매 (예로서, 물) 및 산소가 없는 환경에서 강한 인광 성질을 나타낸다. 인광 성질을 나타낼 수 있는 일부 적합한 포르피린 착물로는 제한하는 것은 아니지만, 백금(II) 코프로포르피린-I 및 III, 팔라듐(II) 코프로포르피린, 루테늄 코프로포르피린, 아연(II)-코프로포르피린-I, 그의 유도체 등을 포함한다. 유사하게, 인광 성질을 나타낼 수 있는 일부 적합한 포르핀 착물로는 제한하는 것은 아니지만, 백금(II) 테트라-메조-플루오로페닐포르핀 및 팔라듐(II) 테트라-메조-플루오로페닐포르핀을 포함한다. 추가의 다른 적합한 포르피린 및/또는 포르핀 착물은 미국 특허 제4,614,723호 (슈미트( Schmidt ) 등); 제5,464,741호 (헨드릭스( Hendrix )); 제5,518,883호 (소이니( Soini )); 제5,922,537호 (이 워트 ( Ewart ) 등); 제6,004,530호 (새그너 ( Sagner ) 등); 및 제6,582,930호 (포노마레브( Ponomarev ) 등) (모든 목적을 위해 전체적으로 본 원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다.

비피리딘 금속 착물 또한 인광 화합물로서 사용될 수 있다. 적합한 비피리딘 착물의 몇몇 일례로는 제한하는 것은 아니지만, 비스[(4,4'-카보메톡시)-2,2'-비피리딘] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)프로필]-1,3-디옥솔란 루테늄(II); 비스(2,2'-비피리딘)[4-(부탄-1-알)-4'-메틸-2,2'-비피리딘]루테늄(II); 비스(2,2'-비피리딘)[4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)-부티르산]루테늄(II); 트리스(2,2'-비피리딘)루테늄(II); (2,2'-비피리딘)[비스-비스(1,2-디페닐포스피노)에틸렌] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)프로필]-1,3-디옥솔란 오스뮴(II); 비스(2,2'-비피리딘)[4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘)-부틸아민]루테늄(II); 비스(2,2'-비피리딘)[1-브로 모-4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)부탄]루테늄(II); 비스(2,2'-비피리딘)말레이미도 헥산산, 4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-부틸아미드 루테늄(II) 등을 포함한다. 인광 성질을 나타낼 수 있는 추가의 다른 적합한 금속 착물은 미국 특허번호 제6,613,583호 (리히터(Richter) 등); 제6,468,741호 (마세이(Massey) 등); 제6,444,423호 (미드(Meade) 등); 제6,362,011호 (마세이 등); 제5,731,147호(바드(Bard) 등); 및 제5,591,581호 (마세이 등) (모든 목적을 위해 전체적으로 본 원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있을 것이다.

몇몇의 경우에서, 발광성 화합물은 상대적으로 장시간의 방출 수명 및 상대적으로 큰 "스톡스 이동(Stokes shift)"을 가질 수 있다. 용어 "스톡스 이동"은 일반적으로 발광성 방사선의 스펙트럼 선 또는 밴드가 여기 선 또는 밴드에 비해 더 긴 발광 파장으로 이동하는 것으로 정의된다. 상대적으로 큰 스톡스 이동은 발광성 화합물의 여기 파장이 발광 파장으로부터 멀리 떨어지게 하며, 여기와 발광 파장간의 큰 차이는 방출된 신호로부터 반사된 여기 방사선을 더욱 쉽게 제거할 수 있게 하므로 바람직하다. 추가로, 큰 스톡스 이동은 또한 샘플 중 발광성 분자로부터의 간섭, 및/또는 몇몇 체액 (예로서, 혈액)에 존재하는 단백질 또는 콜로이드로 인한 광산란을 최소화시킨다. 게다가, 큰 스톡스 이동은 또한 배경 간섭을 제거하기 위한 고가의 고정밀도 필터의 필요성을 최소화시킨다. 예를 들면, 몇몇 실시태양에서는 발광성 화합물이 약 50nm 초과, 일부 실시태양에서는 약 100nm 초과, 몇몇 실시태양에서는 약 100 내지 약 350nm의 스톡스 이동을 나타낸다.

예를 들면, 큰 스톡스 이동을 갖는 예시적인 형광 화합물로는 사마 륨(Sm(III)), 디스프로슘(Dy(III)), 유로퓸(Eu(III)) 및 테르븀(Tb(III))의 란탄계 원소 킬레이트를 포함한다. 그러한 킬레이트는 킬레이트가 실질적으로 더 짧은 파장에서 여기된 후에 강하게 적색-이동된(red-shifted), 협대역의 긴 수명의 방사를 나타낼 수 있다. 전형적으로 킬레이트는 분자 내 란탄계 원소에 근접하게 위치하는 발색단으로 인해 강한 자외선 여기 밴드를 갖는다. 발색단에 의해 여기된 후, 여기 에너지는 여기된 발색단으로부터 란탄계 원소로 전이될 수 있다. 그 후, 란탄계 원소에 특징적인 형광 방사가 이어진다. 예를 들면, 유로퓸 킬레이트는 플루오레세인의 단지 약 28nm에 비해, 약 250 내지 약 350nm의 스톡스 이동을 갖는다. 또한, 유로퓸 킬레이트의 형광은, 수명이 약 100 내지 약 1000㎲로, 다른 형광 화합물의 약 1 내지 약 100 나노초에 비해 수명이 길다. 게다가, 이들 킬레이트는 전형적으로 약 50％ 방사에서 밴드폭이 약 10nm 미만인 좁은 발광 스펙트럼을 갖는다. 하나의 적합한 유로퓸 킬레이트는 N-(p-이소티오시아네이토벤질)-디에틸렌 트리아민 테트라아세트산-Eu⁺³이다.

게다가, 불활성이고, 안정하며, 수성 용액 또는 현탁액 중에서 본질적으로 형광성인 란탄계 원소 킬레이트 또한 본 발명에 있어서, 수성 용액 또는 현탁액 중에서 제한된 용해도 및 소광 문제를 갖는 킬레이트를 보호하기 위해 종종 사용되는 미셀-형성 시약에 대한 필요를 제거하는데 사용될 수 있다. 그러한 킬레이트의 하나의 일례는 4-[2-(4-이소티오시아네이토페닐)에티닐]-2,6-비스([N,N-비스(카복시메틸)아미노]메틸)-피리딘이다 (참조: [Lovgren, T. et al.,; Clin. Chem. 42, 1196-1201 (1996)]). 수개의 란탄계 원소 킬레이트는 또한 예외적으로 높은 신호-대-잡음비를 나타낸다. 예를 들면, 그러한 킬레이트의 하나가 테트라덴테이트 β-디케토네이트-유로퓸 킬레이트이다 (참조: [Yuan, J. and Matsumoto, K.; Anal. Chem. 70, 596-601(1998)]). 상기 기술한 형광 표지 이외에도, 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 표지들이 미국 특허번호 제6,030,840호 (뮬리낵스 ( Mullinax ) 등); 제5,585,279호 (데이빗슨 ( Davidson )); 제5,573,909호 (싱어 ( Singer ) 등); 제6,242,268호 (비더 ( Wieder ) 등); 및 제5,637,509호 (헤밀라 ( Hemmila ) 등) (모든 목적을 위해 전체적으로 본 원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있을 것이다.

상기 기술한 바와 같은 검출가능한 물질은 단독으로 또는 미립자 (때로는 "비드" 또는 "마이크로비드"로 언급된다)와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 천연 발생 미립자, 예로서, 핵, 미코플라즈마, 플라스미드, 플라스티드, 포유동물 세포 (예로서, 적혈구 허깨비), 단세포 미생물 (예로서, 박테리아), 다당류 (예로서, 아가로스) 등이 사용될 수 있다. 추가로, 합성 미립자 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 형광 또는 착색 염료로 표지된 라텍스 극미립자가 사용된다. 비록 임의의 합성 미립자가 본 발명에 사용될 수 있지만, 미립자는 전형적으로 폴리스티렌, 부타디엔 스티렌, 스티렌아크릴-비닐 삼량체, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐피리딘, 폴리디비닐벤젠, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 아크릴로니트릴, 비닐 클로라이드-아크릴레이트 등, 또는 그의 알데하이드, 카르복실, 아미노, 하이드록실 또는 하이드라지드 유도체로부터 제조된다. 다른 적합한 미립자들 은 미국 특허번호 제5,670,381호 (조우 등) 및 제5,252,459호 (타르카 등)에 기재되어 있을 것이다. 상업적으로 구입가능한, 적합한 형광 미립자의 일례로는 몰레큘러 프로브즈, 인코포레이티드(Molecular Probes, Inc.)에 의해 상품명 "플루오스피어(FluoSphere)" (레드 580/605) 및 "트랜스플루오스피어(TransfluoSphere)" (543/620)하에 시판되는 형광 카르복실화 미소구 뿐만 아니라, 역시 몰레큘러 프로브즈, 인코포레이티드에 의해 시판되는 "텍사스 레드(Texas Red)" 5- 및 6-카르복시테트라메틸로다민을 포함한다. 게다가, 적합한 착색된 라텍스 극미립자의 상업적으로 구입가능한 일례로는 뱅스 라보라토리, 인코포레이티드(Bang's Laboratory, Inc.)에 의해 시판되는 카르복실화 라텍스 비드를 포함한다. 금속 미립자 (예로서, 금 미립자) 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.

사용시, 미립자들의 형태는 일반적으로 변할 수 있다. 하나의 특정 실시태양에서, 예를 들면, 미립자의 형태는 구형이다. 그러나, 판, 봉, 디스크, 막대, 관, 불규칙 형태 등과 같은 다른 형상 또한 본 발명에 의해 주시된다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 미립자의 크기 또한 변할 수 있다. 예를 들면, 미립자의 평균 크기 (예로서, 직경)는 약 0.1nm 내지 약 1,000μ, 몇몇 실시태양에서는 약 0.1nm 내지 약 100μ 및 몇몇 실시태양에서는, 약 1nm 내지 약 10μ 범위일 수 있다.

일반적으로 각 분석물 또는 수용 물질에 보다 용이하게 결합할 수 있도록 하는 방식으로 검출 프로브 및 검량 프로브를 변형시키는 것이 바람직하다. 그러한 경우, 프로브는 그에 부착되어 접합된 프로브를 형성하는 특정의 특이 결합 구성원 으로 변형될 수 있다. 특이 결합 구성원은 일반적으로 특이 결합쌍, 즉, 분자들 중 하나는 화학적으로 및/또는 물리적으로 제2 분자와 결합하고 있는 2개의 상이한 분자의 구성원으로 언급된다. 특이 결합 구성원에 대한 선택은 일반적으로 관심의 대상이 되는 시험 분석물, 및 상응하는 검량 분석물에 따라 달라진다. 독립적인 분석 수행능을 위해서는 보통 검량 프로브 보다는 검출 프로브가 상이한 특이 결합쌍의 구성원과 접합되는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 접합된 검량 프로브는 우선적으로 검량 분석물과 결합하거나 (샌드위치 및 간접 분석 포맷), 검량 분석물에 대한 특이 결합 구성원과 결합할 것이다 (경쟁적 분석 포맷). 그러나, 접합된 검량 프로브는 일반적으로 시험 분석물 또는 시험 분석물에 대한 특이 결합 구성원과는 결합하지 않을 것이다. 그 자체로서, 분석법은 실질적인 교차-반응에 대한 우려없이 시험 분석물 및 검량 분석물에 대하여 동시에 실시될 수 있으며, 이로써, 검량 분석물 분석법은 시험 항원을 검량하는데 사용될 수 있다. 또한, 검량 분석물과 시험 분석물간의 관계와 유사하게, 보통 특이 결합 구성원은 pH, 온도, 염 농도, 저장 시간 조건과 관련하여 유사한 분해 프로파일을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 면역반응성 특이 결합 구성원의 몇몇 일례로 제한하는 것은 아니지만, 항원, 합텐, 압타머, 항체 (1차 또는 2차), 및 재조합 DNA 방법 또는 펩티드 합성에 의해 형성된 것을 비롯한 그의 착물을 포함할 수 있다. 항체는 단일클론 또는 다중클론 항체, 재조합 단백질 또는 그의 혼합물(들) 또는 단편(들) 뿐만 아니라 항체 및 다른 특이 결합 구성원의 혼합물일 수 있다. 그러한 항체의 제조 및 그의 특이 결합 구성원으로서의 사용 적합성에 대한 세부사항들은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 다른 일반적인 특이 결합쌍은 제한하는 것은 아니지만, 비오틴과 아비딘 (또는 그의 유도체), 비오틴과 스트렙타비딘, 당질과 렉틴, 상보적 뉴클레오티드 서열들 (표적 핵산 서열을 검출하기 위해 DNA 혼성화 분석법에 사용되는 프로브 및 포획 핵산 서열 포함), 재조합 방법에 의해 형성된 것을 비롯한 상보적 펩티드 서열들, 효과기와 수용체 분자, 호르몬과 호르몬 결합 단백질, 효소 보조인자와 효소, 효소 저해제와 효소 등을 포함한다. 추가로, 특이 결합쌍은 원래의 특이 결합 구성원의 유사체인 구성원을 포함할 수 있다. 예를 들면, 분석물의 유도체 또는 단편, 즉 분석물-유사체는 이것이 분석물과 공통적인 에피토프를 적어도 하나 갖는 한 사용될 수 있다.

특이 결합 구성원은 일반적으로 다양한 잘-공지되어 있는 기술들 중 임의의 것을 사용하여 검출 프로브에 부착될 수 있다. 예를 들면, 특이 결합 구성원의 검출 프로브 (예로서, 미립자)에 대한 공유적 부착은 카르복실, 아미노, 알데하이드, 브로모아세틸, 요오도아세틸, 티올, 에폭시 및 다른 반응성 또는 연결 관능기 뿐만 아니라 잔류 유리 라디칼 및 라디칼 양이온을 사용하여 달성될 수 있으며, 이를 통해 단백질 커플링 반응이 달성될 수 있다. 표면 관능기는 또한 프로브의 표면이 상대적으로 높은 표면 농도의 극성 기들을 함유할 수 있기 때문에 관능화된 공단량체로서 혼입될 수 있다. 게다가, 폴리(티오페놀)과 같이, 비록 프로브가 종종 합성 후에 관능화되지만, 프로브는 추가의 변형을 필요로 하지 않고서 단백질과 직접 공유 연결할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 접합의 제1 단계는 카르 보디이미드를 사용한 프로브 표면상의 카르복실기의 활성화이다. 제2 단계에서, 활성화된 카르복실산 기들은 항체의 아미노기와 반응하여 아미드 결합을 형성한다. 활성화 및/또는 항체 커플링은 완충제, 예를 들면, 인산염-완충처리된 염수(PBS) (예로서 pH 7.2) 또는 2-(N-모르폴리노)에탄 설폰산 (MES) (예로서, pH 5.3)중에서 일어날 수 있다. 생성된 프로브는 이어서, 예를 들면, 임의의 남아있는 활성화 부위를 차단하기 위하여 에탄올아민과 접촉시킬 수 있다. 전반적으로, 이 방법은 접합된 검출 프로브를 형성하는데, 여기에서, 항체는 프로브에 공유적으로 부착된다. 공유 결합 이외에, 다른 부착 기술들, 예를 들면, 물리적 흡착 또한 본 발명에 사용될 수 있다.

검출 프로브 및 검량 프로브가 형성되는 방식과는 상관없이, 이들은 전형적으로 시험 샘플에 적용되기 전에 분석 장치상에 배치된다. 프로브를 분석 장치에 미리 적용시키는 것이 다양한 잇점을 제공한다. 예를 들면, 미리 적용시킴으로써 추후의 사용자는 시약을 시험 샘플 또는 희석제와 함께 혼합하거나 취급해야 할 필요가 없다. 이는 특히 사용자가 일반적으로 정규 실험 기술자 또는 의료 전문의도 아닐 때 현장 적용시에 유용하다. 몇몇 실시태양에서, 예를 들면, 검출 프로브 및 검량 프로브는 시험 샘플이 적용되는 지점으로부터 하류에 배치된다. 이러한 방식으로, 시험 샘플은 적용시 프로브와 함께 혼합될 수 있고, 임의로는 프로브를 재현탁시킬 수 있다. 별법으로, 프로브는 시험 샘플 적용 지점으로부터 상류에 배치될 수 있다. 예를 들면, 희석제는 분석 실시용 프로브를 재현탁시키기 위하여 사용될 수 있다. 유사하게, 검량 분석물 또한 시험 샘플의 적용 이전에 분석 장치상에 배 치될 수 있다. 특정 위치는 달라질 수 있지만, 일반적으로는 검량 분석물이 검출 프로브 및 검량 프로브로부터 상류에 적용되는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 검량 분석물은 검량 프로브과 접촉하기 전에 시험 샘플과 용이하게 혼합될 수 있고, 이로써 그들 사이의 결합은 증진될 수 있다. 검량 분석물 또한 분석 장치에 적용되기 전에 시험 샘플과 혼합될 수 있다. 그 자체로서, 검량 분석물은 실질적으로 분석 실시 이전의 시험 분석물과 동일한 조건에 가해진다. 이것이 검량 정확도를 추가로 최적화시킬 수 있다.

이제, 도 1을 참조하여, 본 발명의 내부 검량 시스템과 함께 사용될 수 있는 측면 흐름 분석 장치(20)의 하나의 실시태양을 보다 상세하게 설명할 것이다. 나타낸 바와 같이, 장치(20)는 임의로 경질 물질(21)에 의해 지지되는 다공성 막(23)을 포함한다. 일반적으로, 다공성 막(23)은 이를 통해 시험 샘플이 통과할 수 있는 임의의 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 다공성 막(23)을 형성하는데 사용되는 물질은 제한하는 것은 아니지만, 천연, 합성, 또는 합성적으로 변형된 천연 발생 물질, 예로서, 다당류 (예로서, 종이와 같은 셀룰로오스 물질 및 셀룰로오스 유도체, 예로서, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스); 폴리에테르 설폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF); 폴리에스테르, 폴리프로필렌; 실리카; 불활성화 알루미나, 규조토, MgSO₄, 또는 다공성 중합체 매트릭스 내에 균일하게 분산된 다른 무기 미분된 물질, 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체, 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같 은 중합체; 천연 발생 직물 (예로서, 면) 및 합성 직물 (예로서, 나일론 또는 레이온); 다공성 겔, 예를 들면, 실리카겔, 아가로스, 덱스트란, 및 젤라틴; 중합성 필름, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 등을 포함한다. 하나의 특정 실시태양에서, 다공성 막(23)은 니트로셀룰로오스 및/또는 폴리에테르 설폰 물질로부터 형성된다. 용어 "니트로셀룰로오스"는 셀룰로오스의 질산 에스테르를 언급하고, 이것은 니트로셀룰로오스 단독이거나 질산 및 다른 산, 예를 들면, 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 지방족 카르복실산의 혼합된 에스테르를 언급하는 것으로 이해되어야 한다.

당업계의 숙련인에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 다공성 막(23)의 크기 및 형상은 일반적으로 변할 수 있다. 예를 들면, 다공성 막 스트립의 길이는 약 10 내지 약 100mm, 몇몇 실시태양에서는, 약 20 내지 약 80mm, 및 몇몇 실시태양에서는, 약 40 내지 약 60mm일 수 있다. 막 스트립의 폭은 또한 약 0.5 내지 약 20mm, 몇몇 실시태양에서는, 약 1 내지 약 15mm, 및 몇몇 실시태양에서는, 약 2 내지 약 10mm 범위일 수 있다. 유사하게, 막 스트립의 두께는 일반적으로 투과-기반 검출을 허용하는데 충분할 만큼 얇다. 예를 들면, 막 스트립의 두께는 약 500㎛ 미만, 몇몇 실시태양에서는, 약 250㎛ 미만, 및 몇몇 실시태양에서는, 약 150㎛ 미만의 범위일 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 지지체(21)가 다공성 막(23)을 수반한다. 예를 들면, 도 1에 나타낸 바와 같이 지지체(21)가 다공성 막(23)에 직접적으로 인접하게 배치될 수 있거나, 다공성 막(23)과 지지체(21) 사이에 개재층이 배치될 수 있다. 이와는 무관하게, 지지체(21)는 일반적으로 다공성 막(23)을 수반할 수 있는 임의 의 물질로부터 형성될 수 있다. 지지체(21) 는 빛이 투과할 수 있는 물질, 예로서, 투명하거나 광학적 확산(예, 반투명) 물질로부터 형성될 수 있다. 또한, 일반적으로 막(23)을 통과하여 흐르는 유체가 지지체(21)를 통해 누출되지 않도록, 지지체(21)는 액체-비투과성인 것이 바람직하다. 지지체에 적합한 물질의 일례로 제한하는 것은 아니지만, 유리; 중합성 물질, 예로서, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 (예로서, 마일라(Mylar)® 필름), 폴리부타디엔, 폴리염화비닐, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 에폭사이드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함한다. 다공성 막(23)을 위한 충분한 구조적 지지를 제공하기 위하여, 지지체(21)는 일반적으로 특정한 최소 두께를 갖도록 선택된다. 유사하게, 지지체(21)의 두께는 전형적으로 그의 광학 성질에 악영향을 미칠 정도로 크지 않다. 따라서, 예를 들면, 지지체(21)의 두께는 100 내지 약 5,000㎛, 몇몇 실시태양에서는, 약 150 내지 약 2,000㎛, 및 몇몇 실시태양에서, 약 250 내지 약 1,000㎛ 범위일 수 있다. 예를 들면, 두께가 약 125㎛인 하나의 적합한 막 스트립은 메사츄세츠주 베드포드에 소재하는 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.)으로부터 상표명 "SHF180UB25"로 입수할 수 있다.

당업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 다공성 막(23)은 지지체(21) 상으로 주조될 수 있고, 여기에서, 생성된 적층물은 원하는 크기 및 형상으로 금형-절단될 수 있다. 별법으로, 다공성 막(23)은 예를 들면, 접착제를 사용하여 지지체(21)에 단순히 적층될 수도 있다. 몇몇 실시태양에서, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 다 공성 막이 마일라^® 필름에 부착된다. 다공성 막을 마일라^® 필름에 결합시키기 위해 접착제, 예로서, 감압성 접착제를 사용한다. 이러한 유형의 적층 구조물은 미국 메사츄세츠주 베드포드에 소재하는 밀리포어 코포레이션으로부터 상업적으로 구입가능한 것으로 여겨진다. 적합한 적층물 분석 장치의 구조에 대한 추가의 다른 일례는 미국 특허번호 제5,075,077호 (덜리(Durley), III 등) (모든 목적을 위해 전체적으로 본 원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다.

장치(20)은 또한 흡수성 패드(28)를 포함할 수 있다. 흡수성 패드(28)는 일반적으로 전체 다공성 막(23)를 통해 이동하는 유체를 수용한다. 당업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 흡수성 패드(28)는 다공성 막(23)를 통한 유체 유동과 모세관 작용을 촉진시키는데 도움이 될 수 있다.

샘플 중에 있는 분석물의 검출을 시작하기 위하여, 사용자는 시험 샘플을 다공성 막(23)의 일부에 직접 적용시킬 수 있고, 이것을 통해 도 1에서 화살표 "L"로 나타낸 방향으로 이동할 수 있다. 별법으로, 시험 샘플을 먼저, 다공성 막(23)과 유체 소통하는 샘플 패드(24)에 적용시킬 수 있다. 샘플 패드(24)를 형성하기 위하여 사용될 수 있는 일부 적합한 물질은, 제한하는 것은 아니지만, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 다공성 폴리에틸렌 패드 및 유리 섬유 여과지를 포함한다. 원하는 경우, 샘플 패드(24)는 또한 확산적으로 또는 비-확산적으로 그것에 부착되는 하나 이상의 분석 전처리 시약을 함유할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 검량 분석물은 그에 적용시 시험 샘플과 접촉할 수 있도록 샘플 패드(24)상에 배치될 수 있다.

예시된 실시태양에서, 시험 샘플은 샘플 패드(24)로부터, 샘플 패드의 한쪽 말단과 소통되도록 놓여진 접합 패드(22)로 이동한다. 접합 패드(22)는 시험 샘플이 통과할 수 있는 물질로부터 형성된다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 접합 패드(22)는 유리 섬유로부터 형성된다. 단지 하나의 접합 패드(22)가 도시되어 있긴 하지만, 다수의 접합 패드들도 본 발명에서 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 하나의 특정 실시태양에서, 검출 프로브 및 검량 프로브 (나타내지 않음)를 접합 패드(22)에 적용시킨다. 적용시킨 후, 이어서, 프로브를 건조시켜 그로부터 이동하지 못하도록 한다. 접합 패드(22)는 재수화시 자유롭게 이동할 수 있도록 하는 프로브 증착을 위한 매트릭스를 제공한다. 더욱 특히, 액체 시험 샘플이 프로브와 접촉하였을 때, 이들은 재수화되고, 재현탁되고/거나 재용해된다. 물론, 프로브가 시험 샘플과 접촉하였을 때, 시험 샘플에 의해 재수화될 수 있는 한, 프로브는 분석 장치(20)의 다양한 다른 위치에도 적용될 수 있다는 것, 예로서, 막(23)에 직접 적용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

도 1을 다시 참조하면, 다공성 막(23)은 또한 분석을 실시하기 위해 구성된 다양한 대역을 규정한다. 예를 들면, 다공성 막(23)은, 막(23)의 길이 방향으로 통과하는 접합된 검출 프로브 (또는 그의 복합체)에 결합할 수 있는 제1 수용 물질을 함유하는 검출 대역(31)을 규정한다. 제1 수용 물질은 다공성 막(23)상에 고정되고, 예를 들면, 항원; 합텐; 항체-결합 단백질, 예로서, 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A/G; 뉴트라비딘 (탈글리코실화 아비딘 유도체), 아비딘 (고도로 양이온 성인 66,000-달톤의 당단백질), 스트렙타비딘 (비당화된 52,800-달톤의 단백질), 또는 캡타비딘 (질산화된 아비딘 유도체); 1차 또는 2차 항체, 및 그의 유도체 또는 단편을 비롯한, 상기 기술된 특이 결합 구성원과 동일한 물질로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 제1 수용 물질은 시험 샘플 중에 있는 항원에 특이적인 항체이다. 샌드위치 분석 포맷에서, 예를 들면, 제1 수용 물질은 분석물과 접합된 검출 프로브간에 형성된 복합체에 대한 고정 결합 부위로서의 역할을 할 수 있다. 특히, 분석물, 예로서, 항체, 항원 등은 전형적으로 2개 이상의 결합 부위 (예로서, 에피토프)를 갖는다. 검출 대역(31)에 도달하였을 때, 이들 결합 부위중 하나는 접합된 프로브의 특이 결합 구성원에 의해 점유된다. 그러나, 분석물의 유리 결합 부위는 고정화된 제1 수용 물질에 결합할 수 있다. 고정화된 제1 수용 물질에 결합하였을 때, 복합 프로브는 새로운 3원 샌드위치 복합체를 형성하게 된다.

분석 장치(20)은 또한 검량 대역(32)를 포함한다. 본 실시태양에서, 검량 대역(32)은 다공성 막(23)상에 형성되고, 검출 대역(31)으로부터 하류에 위치한다. 그러나, 별법으로, 검량 대역(32)은 또한 검출 대역(31)으로부터 상류에 위치할 수 있다. 검량 대역(32)은, 막(23)의 길이 방향으로 통과하는 접합된 검량 프로브 (또는 그의 복합체)에 결합할 수 있는 제2 수용 물질과 함께 제공된다. 제2 수용 물질은 검량 프로브를 접합시키기 위해 사용되는 특이 결합쌍의 구성원일 수 있다. 이러한 방식으로, 제2 수용 물질은 우선적으로 검량 프로브 (또는 그의 복합체)에 결합한다. 예를 들면, 검량 분석물이 항원일 때, 제2 수용 물질은 항체 (예로서, 샌드위치 또는 경쟁 분석 포맷) 또는 항원 (예로서, 간접 분석 포맷)일 수 있다. 또한, 상기 논의된 바와 같이, 보통 제1 수용 물질 및 제2 수용 물질은 pH, 온도, 염 농도, 저장 시간 조건과 관련하여 유사한 분해 프로파일을 나타내는 것이 바람직하다.

사용자가 샘플 중에 있는 분석물의 농도를 잘 측정할 수 있도록 검출 대역(31) 및 검량 대역(32)은 각각 임의 갯수의 별개의 검출 영역을 제공할 수 있다. 각 영역은 동일한 수용 물질을 함유할 수 있거나, 상이한 수용 물질을 함유할 수 있다. 예를 들면, 상기 대역은 2개 이상의 별개의 영역 (예로서, 선, 점 등)을 포함할 수 있다. 상기 영역은 분석 장치(20)를 통한 시험 샘플의 흐름에 실질적으로 수직인 방향으로 선 형태로 배치될 수 있다. 유사하게, 몇몇 실시태양에서, 상기 영역은 분석 장치(20)를 통한 시험 샘플의 흐름에 실질적으로 평행한 방향으로 선 형태로 배치될 수 있다.

샘플 중에 있는 분석물의 농도를 정량적으로 또는 반-정량적으로 검출하는 것이 바람직한 경우, 검출 대역(31)에서 생성된 검출 신호 "I_s"의 강도를 검량 대역(32)에서 생성된 검량 신호 "I_c"의 강도와 비교할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시태양 (예로서, 샌드위치 분석 포맷)에서, 분석물의 양은 I_s 대 I_c의 비에 직접적으로 비례한다. 다른 실시태양 (예로서, 경쟁 및 간접 분석 포맷)에서, 미리 규정된 기본량을 초과하는 분석물의 양은 I_s 대 I_c의 비에 반비례한다. 비율이 속하는 범위를 기준으로 하여, 분석물에 대한 일반 농도 범위를 결정할 수 있다. 원하는 경우, I_s 대 I_c의 비를 일정 범위의 공지된 분석물 농도에 대한 분석물 농도에 대하여 플롯팅하여 검량 곡선을 제작할 수 있다. 미리 규정된 기본량을 초과하여 존재하는 미지의 시험 샘플 중의 분석물의 양을 결정하기 위하여, 이어서, 신호비를 검량 곡선에 따른 분석물 농도로 전환시킬 수 있다. I_s와 I_c 사이의 다른 수학적 관계를 분석물 농도에 대하여 플롯팅하여 검량 곡선을 제작할 수 있다는 것에 주의하여야 한다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서는, I_s/(I_s+I_c)의 값을 분석물 농도에 대하여 플롯팅하여 검량 곡선을 제작할 수 있다. 상기와는 무관하게, 검량 및 샘플 시험은 대략 동일한 조건하에서 동시에 수행할 수 있고, 이로써 신뢰할 수 있고, 감도는 증가된 정량적 또는 반-정량적 결과를 제공할 수 있다.

원하는 경우, 몇몇 실시태양에서는 검출 대역(31) 및/또는 검량 대역(32)의 프로브 강도를 측정하기 위하여 광학식 판독기를 사용할 수 있다. 당업계의 숙련인에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 광학식 판독기의 실제 구성 및 구조는 다양하다. 예를 들면, 사용될 수 있는 광학 검출 기술은 제한하는 것은 아니지만, 발광 (예로서, 형광, 인광 등), 흡광도 (예로서, 형광 또는 비형광), 회절 등을 포함할 수 있다. 하나의 적합한 반사 분광광도계가 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 제2003/0119202호 (케일러 ( Kaylor ) 등) (모든 목적을 위해 전체적으로 본 원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다. 또다른 실시태양에서는 형광을 나타내는 프로브의 존재를 검출하기 위하여 반사-모드 분광광도계가 사용될 수 있다. 적합한 분광광도계 및 관련된 검출 기술은 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 제2004/0043502 호 (송( Song ) 등) (모든 목적을 위해 전체적으로 본 원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다. 유사하게, 투과-모드 검출 시스템 또한 검출 프로브의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있다.

전형적으로, 광학식 판독기는 전자기 방사선을 방사할 수 있는 광원, 및 신호 (예로서, 투과되거나 반사된 광, 방사된 형광 또는 인광 등)을 기록할 수 있는 검출기를 포함한다. 광원은 전자기 방사선, 예로서, 가시광선 또는 근-가시광선 영역 (예로서, 적외선 또는 자외선)의 광을 제공할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 장치일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 광원은 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 발광 다이오드 (LED), 섬광등, 냉음극 형광 램프, 전기발광 램프 등을 포함한다. 조명은 다중 방사되고/되거나 시준될 수 있다. 몇몇 경우에는, 조명을 펄스화하여 임의의 배경 간섭을 감소시킬 수 있다. 추가로, 조명은 연속적일 수 있거나, 지속파 (CW)와 펄스화 조명을 조합할 수 있으며, 여기에서, 다수의 조명 빔이 다중 방사되어 (예로서, 펄스화 빔은 CW 빔과 다중 방사됨) CW 기원에 의해 유도된 신호와, 펄스화된 기원에 의해 유도된 신호 사이에 신호 구별을 가능하게 한다. 예를 들면, 몇몇 실시태양에서는, LED (예로서, 알루미늄 갈륨 아르세나이드 적색 다이오드, 갈륨 포스파이드 녹색 다이오드, 갈륨 아르세나이드 포스파이드 녹색 다이오드, 또는 인듐 갈륨 니트라이드 보라색/청색/자외선(UV) 다이오드)가 펄스화 광원으로서 사용된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 UV LED 들뜸 다이오드중 상업적으로 구입가능한 일례는 반치전폭이 10도이고, 최고 파장이 370 내지 375nm이며, 스펙트럼 반높이 너비가 12nm인 빔으로 10 밀리암페어 (3.5 내지 3.9 볼트)의 순방향 전류에서 750 내지 1000㎼의 광출력을 내보내는 모델 NSHU550E (니키아 코포레이션(Nichia Corporation))이다.

몇몇 경우에, 광원은 분석 장치에 확산 조명을 제공할 수 있다. 예를 들면, 다수의 점광원의 어레이 (예로서, LED)는 상대적으로 확산 조명을 제공하는데 간단하게 사용될 수 있다. 상대적으로 저렴한 방식으로 확산 조명을 제공할 수 있는 또다른 특히 바람직한 광원은 전기발광 (EL) 장치이다. EL 장치는 일반적으로, 그 중 적어도 하나가 투명하여 빛이 빠져나가는 전극들 사이에 개재된 발광 물질 (예로서, 인광체 미립자)을 이용하는 콘덴서 구조이다. 전극에 전압을 가하면 발광 물질내에서 변화하는 전기장이 발생하여, 빛을 방사하도록 한다.

검출기는 일반적으로 신호을 감지할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 장치일 수 있다. 예를 들면, 검출기는 공간의 식별을 위해 구성된 전자식 이미지화 검출기일 수 있다. 이러한 전자식 이미지화 센서의 몇몇 일례로 고속 선형 전하-결합 소자 (CCD), 전하-주입 소자 (CID), 상보적-금속-산화막-반도체 (CMOS) 소자 등을 포함한다. 이러한 이미지 검출기는 예를 들면, 일반적으로 전자식 광 센서의 2차원 어레이이지만, 단일 라인의 검출기 픽셀 또는 광 센서, 예를 들면, 이미지를 스캐닝하기 위한 것들을 포함하는 선형 이미지화 검출기 (예로서, 선형 CCD 검출기) 또한 사용될 수 있다. 어레이는 각각 "어드레스"라고 하는 이미 공지된 특정한 위치의 세트를 포함한다. 이미지 검출기에서 각각의 어드레스는 영역 (예로서, 전형적으로 박스형 또는 직사각형 모양의 영역)을 덮는 센서에 의해 점유된다. 상기 영역을 일반적으로 "픽셀" 또는 픽셀 영역이라고 한다. 검출기 픽셀은, 예를 들 면, CCD, CID 또는 CMOS 센서, 또는 빛을 검출하거나 측정하는 임의의 다른 소자 또는 센서일 수 있다. 검출기 픽셀의 크기는 매우 다양할 수 있고, 몇몇 경우에는 직경 또는 길이가 0.2㎛ 정도로 작을 수 있다.

다른 실시태양에서, 검출기는 공간 식별 능력이 결여된 광 센서일 수 있다. 그러한 광 센서의 일례로 광전자증배관 장치, 포토다이오드, 예로서, 애벌랜치(avalanche) 포토다이오드 또는 실리콘 포토다이오드 등을 포함할 수 있다. 실리콘 포토다이오드는 이들이 저렴하며, 고감도이며, 고속으로 작업할 수 있으며 (짧은 라이즈타임/넓은 대역폭), 대부분의 다른 반도체 기술 및 모노리식 회로에 용이하게 통합된다는 점에서 종종 유리하다. 게다가, 실리콘 포토다이오드는 물리적으로 작아서, 이들을 막-기반 장치와 함께 사용하기 위한 시스템에 용이하게 도입할 수 있다. 실리콘 포토다이오드가 사용될 경우, 방출된 신호의 파장 범위는 400 내지 1100nm의 감도 범위 내에 있을 수 있다.

검출 및 검량은 본 발명에 따라 자동으로 및/또는 수동으로 실시될 수 있다. 예를 들면, 마이크로프로세서를 임의로 사용하여 검출기로부터의 신호 강도를, 정량적으로 또는 반-정량적으로 분석물의 농도를 지시하는 결과로 전환시킬 수 있다. 마이크로프로세서는 사용자가 최후 수개의 결과를 상기할 수 있도록 기억 능력을 포함할 수 있다. 당업계의 숙련인은 임의의 적합한 컴퓨터-판독형 기억 소자, 예로서, RAM, ROM, EPROM, EEPROM, 플래쉬 메모리 카드, 디지털 비디오 디스크, 베르누이(Bernoulli) 카트리지 등을 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 원하는 경우, 결과는 액정 (LCD) 또는 LED 디스플레이를 사용하여 사용자에게 전달될 수 있 다.

이제, 도 2를 참조하여, 샌드위치 분석 포맷을 사용하여 시험 항원 A (예로서, CRP)의 존재를 검출하는 방법에 대한 하나의 실시태양을 보다 상세하게 설명할 것이다. 먼저, 검량 항원 A* (예로서, PTX3)를 샘플 패드(24)에 미리 적용시키고, 접합된 검출 프로브(41) 및 접합된 검량 프로브(43)를 접합 패드(22)에 미리 적용시킨다. 하나의 실시태양에서, 예를 들면, 검출 프로브(41)는 CRP에 대한 항체와 접합된, 염색된 미립자 (예로서, CRP IgG₁)이고, 검량 프로브(43)는 다른 펜트락신 계열의 구성원과는 교차 반응하지 않는 PTX3에 대한 항체와 접합된, 염색된 미립자 (예로서, 래트 항체 PTX3 (클론 MNB4))이다. 분석을 시작하기 위하여, 시험 항원 A를 함유하는 시험 샘플을 샘플 패드(22)에 적용시키고, 여기에서, 검량 항원 A*는 혼합된다. 시험 항원 A 및 검량 항원 A*는 "L" 방향으로 접합 패드(22)로 이동하고, 여기에서, 그들은 검출 프로브(41) 및 검량 프로브(43)와 혼합된다. 시험 항원 A는 검출 프로브(41)와 결합하여 분석물/프로브 복합체(49)를 형성하고, 검량 항원 A*는 검량 프로브(43)와 결합하여 분석물/프로브 복합체(50)을 형성한다. 이어서, 복합체(49) 및 복합체(50)는 그 안에 제1 수용 물질(51)이 고정화되어 있는 검출 대역(31)으로 이동한다. 예를 들면, 제1 수용 물질은 접합된 검출 프로브의 항체와는 상이한 CRP에 대한 항체 (예로서, 항-CRP IgG₂) 또는 검출 프로브에 접합된 항체와 일치하는 CPR에 대한 항체일 수 있다. 복합체(49)는 고정화된 수용 물질(51)상의 이용가능한 결합 부위에 결합한다. 이어서, 남은 복합체(50)는 그 안 에 제2 수용 물질(53)이 고정화되어 있는 검량 대역(32)로 이동한다. 예를 들면, 제2 수용 물질은 접합된 검량 프로브의 항체와 동일하거나 상이한 PTX3에 대한 항체 (예로서, 상이한 래트 항체 PTX3 클론)일 수 있다. 복합체(50)은 고정화된 수용 물질(53)상의 이용가능한 결합 부위에 결합한다. 이어서, 검출 대역(31)에서 포획된 검출 프로브(41) 및 검량 대역(32)에서의 검량 프로브(43)에 의해 생성된 신호 강도를 측정할 수 있다. 이제, 도 3을 참조하여, 간접 분석 포맷을 사용하여 시험 항원 A의 존재를 검출하는 방법에 대한 또다른 실시태양을 보다 상세하게 설명할 것이다. 본 실시태양에서, 검출 프로브(41)은 시험 항원 A에 대한 항체와 접합하고, 검량 프로브(43)는 검량 항원 A*에 대한 항체와 접합한다. 게다가, 제1 수용 물질(51)은 사실상 시험 항원 A와 유사하고, 제2 수용 물질(53)은 사실상 검량 항원 A*와 유사하다. 이러한 방식으로, 시험 항원 A와 제1 수용 물질(51)은 접합된 검출 프로브(41)상의 이용가능한 결합 부위에 대하여 경쟁하고, 검량 항원 A*와 제2 수용 물질(53)은 접합된 검량 프로브(43)상의 이용가능한 결합 부위에 대하여 경쟁한다.

또한, 이제, 도 4를 참조하여, 경쟁 분석 포맷을 사용하여 시험 항원 A의 존재를 검출하는 방법에 대한 추가의 또다른 실시태양을 보다 상세하게 설명할 것이다. 본 실시태양에서, 검출 프로브(41)은 사실상 시험 항원 A와 유사한 항원과 접합하고, 검량 프로브(43)은 사실상 검량 항원 A*와 유사한 항원과 접합한다. 게다가, 제1 수용 물질(51)은 시험 항원 A에 대한 항체이고, 제2 수용 물질(53)은 검량 항원 A*에 대한 항체이다. 이러한 방식으로, 시험 항원 A와 접합된 검출 프로 브(41)은 제1 수용 물질(51)상의 이용가능한 결합 부위에 대하여 경쟁하고, 검량 항원 A*와 접합된 검량 프로브(43)은 제2 수용 물질(53)상의 이용가능한 결합 부위에 대하여 경쟁한다.

장치 구성의 다양한 실시태양이 상기에 기술되어 있지만, 본 발명의 장치는 일반적으로 원하는 임의 구성을 가질 수 있고, 상기 기술된 모든 성분들을 가질 필요는 없음을 이해하여야 한다. 다양한 다른 장치 구성은 예를 들면 미국 특허번호 제5,395,754호 (람보테 ( Lambotte ) 등); 제5,670,381호 (조우 등); 및 제6,194,220호 (말리크 ( Malick ) 등) (모든 목적을 위해 전체적으로 본 원에 참조로서 인용된다)에 기재되어 있다.

이하 실시예를 참조하면 본 발명을 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다.

실시예 1

본 발명에 따른 측면 흐름 분석 장치를 형성할 수 있는 능력을 입증하였다. 길이가 대략 30cm인 니트로셀룰로오스 다공성 막 (밀리포어 코포레이션으로부터 입수한 HF 120)을 지지 카드상에 적층시켰다. C-반응성 단백질에 대한 단일클론을 다공성 막상에 고정화시켜 검출 대역을 형성시켰다. 항체는 바이오스퍼시힉 인코포레이티드(BiosPacific, Inc.)로부터 입수하였고 (카탈로그 번호 A58040136P), 그의 농도는 1mg/ml였다. β-HCG (1mg/ml)에 대한 단일클론 항체 또한 다공성 막에 고정화시켜 검량 대역을 형성시켰다. 셀룰로오스 흡상 패드 (밀리포어 코포레이 션)를 막의 한쪽 말단 (검량 대역에 보다 근접한 위치)에 적층시켰다. 이어서, 막 샘플을 1시간동안 37℃의 온도에서 건조시켰다.

항-CRP 단일클론 항체 (바이오스퍼시힉 인코포레이티드, 카탈로그 번호 A58110228P)에 접합된 36㎕의 금 미립자, 항 α-hCG 단일클론 항체에 접합된 100㎕의 금 미립자, 물중 500ml의 수크로오스 (20％) 및 1200㎕의 물을 혼합하여 미립자 현탁액을 제조하였다. 항 CRP 단일클론 항체와 접합된 금 미립자의 미립자 크기는 40nm이고, 광학 밀도는 50.2였고, 브리티쉬 바이오셀 인터내셔널(British Biocell International)로부터 입수하였다. 항 α-hCG 단일클론 항체와 접합된 금 미립자의 미립자 크기는 40nm이고, 광학 밀도는 10.1이였고, 브리티쉬 바이오셀 인터내셔널로부터 입수하였다. 이어서, 상기 현탁액을 길이가 30cm인 유리 섬유 접합 패드 (밀리포어 코포레이션)상에 로딩하였다. 이어서, 유리 섬유 패드를 2시간동안 37℃에서 건조시켜 접합 패드를 형성시켰다. 이어서, 접합 패드를 다공성 막의 다른 한쪽 말단 (검출 대역에 보다 근접한 위치)에 적층시켰다. 셀룰로오스 흡상 패드 (밀리포어 코포레이션) 샘플 패드를 추가로 접합 패드상에 적층시켰다. 적층된 전체 카드를 폭이 4mm인 측면 흐름 분석 장치로 절단하였다.

실시예 2

본 발명에 따라 CRP를 검출하는 능력을 입증하였다. 실시예 1에 기술한 바와 같이 5개의 측면 흐름 장치 (샘플 1-5)를 제작하였다. 60㎕의 CRP (90ng/ml) 및 60㎕의 β-hCG (50ng/ml)를 함유하는 혼합 용액을 5개의 측면 흐름 장치 각각의 샘플 패드에 적용시켰다. 실온에서 30분동안 전개시킨 후, 반사율 판독기를 사용 하여 검출 대역 및 검량 대역의 색 농도를 측정하였다. 각 대역의 색상 강도를 하기 표 1에 나열한다.

I_d에 대한 평균, 표준 편차, 및 ％CV (변이계수, 또는 평균에 대한 표준 편차의 비)는 각각 92.111 , 2.33127, 및 2.531이었다. 한편, I_d/I_c에 대한 평균, 표준 편차, 및 ％CV는 각각 0.9323, 0.01081, 및 1.1159였다. 따라서, 나타낸 바와 같이, 검량된 신호 강도에 대한 표준 편차 및 ％CV는 비검량된 신호 강도에 대한 것보다 더욱 낮았다.

실시예 3

본 발명에 따라 CRP를 검출하는 능력을 입증하였다. 실시예 1에 기술한 바와 같이 15개의 측면 흐름 장치 (샘플 1-5)를 제작하고, 3개의 군으로 분할하였다. 제1 군은 실온에서 저장하고, 제2 군은 40분동안 65℃에서 가열하고, 제3 군은 210분동안 65℃에서 가열하였다. 1％ 트윈® 20 (ICI 아메리카스(ICI Americas))을 포함하는 트리스 완충액중 60㎕의 CRP (100ng/ml) 및 60㎕의 β-hCG (50ng/ml)를 함유하는 혼합 용액을 15개의 측면 흐름 장치 각각의 샘플 패드에 적용시켰다. 실온에서 30분동안 전개시킨 후, 반사율 판독기를 사용하여 검출 대역 및 검량 대역의 색 농도를 측정하였다. 각 군의 색상 강도를 하기 표 2-4에 나열한다.

I_d에 대한 평균, 표준 편차, 및 ％CV는 93.3354, 1.75261, 및 1.878이었다. 한편, I_d/I_c에 대한 평균, 표준 편차, 및 ％CV는 각각 0.96069, 0.01024, 및 1.066이었다.

I_d에 대한 평균, 표준 편차, 및 ％CV는 90.2974, 3.25741, 및 3.607이었다. 한편, I_d/I_c에 대한 평균, 표준 편차, 및 ％CV는 각각 0.96517, 0.00732, 및 0.758이었다.

I_d에 대한 평균, 표준 편차, 및 ％CV는 87.842, 2.204, 및 2.509였다. 한편, I_d/I_c에 대한 평균, 표준 편차, 및 ％CV는 각각 0.95935, 0.01074, 및 1.12였다.

실시예 4

본 발명에 따른 측면 흐름 분석 장치를 형성할 수 있는 능력을 입증하였다. 대략 길이가 30cm인 니트로셀룰로오스 다공성 막 (밀리포어 코포레이션으로부터 입수한 HF 120)을 지지 카드상에 적층시켰다. C-반응성 단백질에 대한 단일클론을 다공성 막상에 고정화시켜 검출 대역을 형성시켰다. 항체는 바이오스퍼시힉 인코포레이티드로부터 입수하였고 (카탈로그 번호 A58040136P), 그의 농도는 1mg/ml였다. β-HCG (1mg/ml)에 대한 단일클론 항체 또한 다공성 막에 고정화시켜 검량 대역을 형성시켰다. 셀룰로오스 흡상 패드 (밀리포어 코포레이션)를 막의 한쪽 말단 (검량 대역에 보다 근접한 위치)에 적층시켰다. 이어서, 막 샘플을 1시간동안 37℃의 온도에서 건조시켰다.

항-CRP 단일클론 항체 (바이오스퍼시힉 인코포레이티드, 카탈로그 번호 A58110228P)에 접합된 36㎕의 금 미립자, 항 α-hCG 단일클론 항체에 접합된 100㎕의 금 미립자, 물중 500ml의 수크로오스 (20％) 및 1400㎕의 물을 혼합하여 미립자 현탁액을 제조하였다. 항 CRP 단일클론 항체와 접합된 금 미립자의 미립자 크기는 40nm이고, 광학 밀도는 50.2였고, 브리티쉬 바이오셀 인터내셔널로부터 입수하였다. 항 α-hCG 단일클론 항체와 접합된 금 미립자의 미립자 크기는 40nm이고, 광학 밀도는 10.1이였고, 브리티쉬 바이오셀 인터내셔널로부터 입수하였다. 이어서, 상기 현탁액을 길이가 30cm인 유리 섬유 접합 패드 (밀리포어 코포레이션)상에 로딩하였다. 이어서, 유리 섬유 패드를 2시간동안 37℃에서 건조시켜 접합 패드를 형성시켰다. 이어서, 접합 패드를 다공성 막의 다른 한쪽 말단 (검출 대역에 보다 근접한 위치)에 적층시켰다. 셀룰로오스 흡상 패드 (밀리포어 코포레이션) 샘플 패드를 추가로 접합 패드상에 적층시켰다. 적층된 전체 카드를 폭이 4mm인 측면 흐름 분석 장치로 절단하였다.

실시예 5

본 발명에 따라 CRP를 검출하는 능력을 입증하였다. 실시예 4에 기술한 바와 같이 15개의 측면 흐름 장치 (샘플 1-5)를 제작하고, 3개의 군으로 분할하였다. 제1 군은 실온에서 저장하고, 제2 군은 40분동안 65℃에서 가열하고, 제3 군은 210분동안 65℃에서 가열하였다. 1％ 트윈® 20 (ICI 아메리카스)을 포함하는 20mM Hepes 완충액 (pH 7.51)중 60㎕의 CRP (100ng/ml) 및 60㎕의 β-hCG (50ng/ml)를 함유하는 혼합 용액을 제1 군의 샘플 패드에 적용시켰다. 1％ 트윈® 20 (ICI 아메리카스)을 포함하는 20mM Hepes 완충액 (pH 8.0)중 60㎕의 CRP (100ng/ml) 및 60㎕의 β-hCG (50ng/ml)를 함유하는 혼합 용액을 제2 군의 샘플 패드에 적용시켰다. 1％ 트윈® 20 (ICI 아메리카스)을 포함하는 20mM Hepes 완충액 (pH 8.5)중 60㎕의 CRP (100ng/ml) 및 60㎕의 β-hCG (50ng/ml)를 함유하는 혼합 용액을 제3 군의 샘플 패드에 적용시켰다.

실온에서 30분동안 전개시킨 후, 반사율 판독기를 사용하여 검출 대역 및 검량 대역의 색 농도를 측정하였다. 각 군의 통계학적 데이타를 하기 표 5에 나열한다.

나타낸 바와 같이, 검출 대역에 대한 검량 데이타는 전 범위의 pH 값에 걸쳐 비검량된 데이타보다 더욱 낮은 표준 편차 및 ％CV를 가졌다.

본 발명을 그의 특정 실시태양에 관하여 상세하게 설명하였지만, 당업계의 숙련인은 상기한 내용을 이해할 때 이들 실시태양들에 대한 변경, 변화 및 등가물을 쉽게 이해할 수 있을 것이라고 인지된다. 따라서, 본 발명의 범주는 첨부되는 청구범위 및 그의 임의의 등가물의 것으로서 평가되어야 한다.

Claims

검출 대역 및 검량(calibration) 대역을 규정하며, 제1 수용 물질이 검출 대역 내에 고정되어 있고, 제2 수용 물질이 검량 대역 내에 고정되어 있는 다공성 막을 포함하는 측면 흐름 분석 장치, 및

측면 흐름 분석 장치상에 하나 이상 배치되어 있고, 검량 분석물, 검출 프로브 및 검량 프로브를 포함하며, 검출 프로브는 시험 분석물, 제1 수용 물질, 또는 그의 조합물에 우선적으로 결합하도록 구성된 제1 특이 결합 구성원과 접합되어 있고, 검량 프로브는 검량 분석물, 제2 수용 물질, 또는 그의 조합물에 우선적으로 결합하도록 구성된 제2 특이 결합 구성원과 접합되어 있는, 다수의 분석 시약

을 포함하는, 시험 샘플 중에 있는 시험 분석물의 존재 또는 양을 검출하기 위한 진단 시험용 키트.
제1항에 있어서, 제1 특이 결합 구성원, 제2 특이 결합 구성원, 제1 수용 물질, 및 제2 수용 물질이 면역반응성 결합 구성원인 진단 시험용 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서, 검량 분석물 및 시험 분석물이 동일한 단백질 계열의 구성원인 진단 시험용 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서, 검량 분석물 및 시험 분석물이 상이한 단백질 계열의 구성원인 진단 시험용 키트.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 분석물, 검량 분석물, 또는 양자 모두가 펜트락신 단백질인 진단 시험용 키트.
제5항에 있어서, 시험 분석물이 C-반응성 단백질인 진단 시험용 키트.
제5항에 있어서, 검량 분석물이 포스포콜린-결합 펜트락신 단백질인 진단 시험용 키트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 특이 결합 구성원은 시험 분석물에 결합하도록 구성되어 있고, 제2 결합 구성원은 검량 분석물에 결합하도록 구성되어 있는 진단 시험용 키트.
제8항에 있어서, 제1 수용 물질은 시험 분석물에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하도록 구성되어 있고, 제2 수용 물질은 검량 분석물에 결합하여 샌드위치 복합체를 형성하도록 구성되어 있는 진단 시험용 키트.
제8항에 있어서, 제1 수용 물질 및 시험 분석물은 제1 특이 결합 구성원과의 결합에 대하여 경쟁하도록 구성되어 있고, 제2 수용 물질 및 검량 분석물은 제2 특 이 결합 구성원과의 결합에 대하여 경쟁하도록 구성되어 있는 진단 시험용 키트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 특이 결합 구성원 및 시험 분석물은 제1 수용 물질과의 결합에 대하여 경쟁하도록 구성되어 있고, 제2 특이 결합 구성원 및 검량 분석물은 제2 수용 물질과의 결합에 대하여 경쟁하도록 구성되어 있는 진단 시험용 키트.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 검량 대역이 검출 대역으로부터 하류에 위치하는 진단 시험용 키트.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 측면 흐름 분석 장치가 다공성 막과 유체 소통하는 접합 패드를 추가로 포함하고, 하나 이상의 분석 시약이 상기 접합 패드상에 배치되어 있는 진단 시험용 키트.
제13항에 있어서, 검출 프로브 및 검량 프로브가 접합 패드상에 배치되어 있는 진단 시험용 키트.
제13항 또는 제14항에 있어서, 접합 패드로부터 상류에 위치하고 시험 샘플에 대한 적용 지점을 규정하는 샘플 패드를 추가로 포함하고, 검량 분석물이 상기 샘플 패드상에 배치되어 있는 진단 시험용 키트.
i) 측면 흐름 장치를 검량 분석물과 접촉시키고;

ii) 측면 흐름 장치를 시험 샘플과 접촉시키고;

iii) 검출 대역에서 생성된 검출 신호 강도를 측정하고;

iv) 검량 대역에서 생성된 검량 신호 강도를 측정하는 것을 포함하고, 이 때 시험 분석물의 양은 검량 신호 강도에 의해 검량되는 검출 신호 강도에 비례하며,

제1 특이 결합 구성원과 접합된 검출 프로브, 및 제2 특이 결합 구성원과 접합된 검량 프로브와 소통하고, 검출 대역 및 검량 대역을 규정하는 다공성 막을 포함하는 측면 흐름 장치를 사용하여 시험 샘플 중에 있는 시험 분석물을 정량적으로 또는 반-정량적으로 검출하는 방법.
제16항에 있어서, 측면 흐름 장치와 접촉시키기 전에 검량 분석물과 시험 샘플을 혼합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
i) 측면 흐름 장치를 시험 샘플과 접촉시키고;

ii) 검출 대역에서 생성된 검출 신호 강도를 측정하고;

iii) 검량 대역에서 생성된 검량 신호 강도를 측정하는 것을 포함하고, 이 때 시험 분석물의 양은 검량 신호 강도에 의해 검량되는 검출 신호 강도에 비례하며,

검량 분석물, 제1 특이 결합 구성원과 접합된 검출 프로브, 및 제2 특이 결 합 구성원과 접합된 검량 프로브와 소통하고, 검출 대역 및 검량 대역을 규정하는 다공성 막을 포함하는 측면 흐름 장치를 사용하여 시험 샘플 중에 있는 시험 분석물을 정량적으로 또는 반-정량적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 분석물의 양은 검량 신호 강도에 의해 검량되는 검출 신호 강도에 정비례하는 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 분석물의 양은 검량 신호 강도에 의해 검량되는 검출 신호 강도에 반비례하는 방법.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 소정의 분석물 농도에 대하여 검출 신호 강도 대 검량 신호 강도의 비를 플롯팅하여 검량 곡선을 제작하는 것을 추가로 포함하는 방법.