ES2625874T3 - Dispositivo de prueba para ensayo de membrana que comprende una sección de presentación visual de referencia - Google Patents

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ES2625874T3 ES09808308.2T ES09808308T ES2625874T3 ES 2625874 T3 ES2625874 T3 ES 2625874T3 ES 09808308 T ES09808308 T ES 09808308T ES 2625874 T3 ES2625874 T3 ES 2625874T3
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Abstract

Un dispositivo de prueba para ensayo de membrana que usa una reacción de unión específica de una sustancia que va a detectarse con un reactivo de captura inmovilizado sobre un portador de membrana y un reactivo marcado con una sustancia de marcaje, siendo el reactivo una sustancia aniónica o un anfolito que está cargado negativamente bajo condiciones básicas, que comprende una sección de presentación visual de referencia para indicar la finalización apropiada de la prueba sobre la que se ha inmovilizado un polímero catiónico para capturar un reactivo marcado, en el que el polímero catiónico es un compuesto de polímero que tiene una densidad de carga catiónica de 0,4 meq/g a 21 meq/g, y un peso molecular promedio de 300 a 5.000.000, en el que el polímero catiónico es polialilamina, en el que el dispositivo de prueba es un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral, y en el que la sección de presentación visual de referencia para indicar la finalización apropiada de la prueba está configurada de manera que está situada aguas abajo de una sección de presentación visual de detección sobre la que se ha inmovilizado un reactivo de captura.

Description

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DESCRIPCION
Dispositivo de prueba para ensayo de membrana que comprende una seccion de presentacion visual de referencia Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un dispositivo de prueba para ensayo de membrana usando una reaccion de union espedfica.
Antecedentes de la tecnica
En los ultimos anos, se han usado cada vez mas dispositivos de prueba basados en principios de medicion de reacciones de union espedfica, que realmente no requieren que los usuarios realicen procedimientos especializados y que requieren mucho tiempo, para pruebas en diversos campos relacionados principalmente con diagnostico clmico, analisis medioambiental y control de la higienizacion de alimentos. Hay diversos tipos de dispositivos de prueba basados en principios de medicion de reacciones de union espedfica. De estos, se han usado ampliamente dispositivos de prueba de tipo de flujo lateral y de flujo transversal para ensayo de membrana.
En una configuracion, un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral comunmente usado es en una forma a modo de tira y comprende un portador de membrana porosa dentro de la cual puede transferirse un lfquido mediante accion capilar. Se proporciona una seccion de presentacion visual de deteccion sobre la que se ha inmovilizado una sustancia capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse (reactivo de captura) a una parte de tal portador de membrana. Ademas, se proporciona una sustancia capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse que se ha marcado con una sustancia de marcaje que comprende una enzima, tal como peroxidasa o partfculas colorantes, tales como partfculas coloidales de oro (reactivo marcado) aguas arriba del portador de membrana de una tira de una manera tal que puede transferirse dentro del portador de membrana mediante accion capilar. Por ejemplo, cuando una reaccion de union espedfica es una reaccion de antigeno- anticuerpo en la que un antfgeno es la sustancia que va a detectarse, se usa un anticuerpo capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse como reactivo de captura y se usa un anticuerpo marcado que puede unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse como reactivo marcado. En tal caso, cuando se suministra una muestra lfquida a un sitio ubicado aguas arriba de una tira en donde se ha proporcionado un reactivo marcado, la muestra lfquida entra en contacto con el reactivo marcado, dando como resultado la disolucion o dispersion del reactivo marcado. Si esta presente una sustancia que va a detectarse en la muestra lfquida, el reactivo marcado disuelto o dispersado se une a la sustancia, de manera que se forma un complejo de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse”. El complejo de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse” se transfiere adicionalmente aguas abajo de la tira y llega a una seccion de presentacion visual de deteccion. En la seccion de presentacion visual de deteccion, el complejo de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse” se captura mediante un reactivo de captura en la seccion de presentacion visual de deteccion, de manera que se forma un complejo de intercalacion de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse-reactivo de captura”. Entonces, la sustancia de marcaje del reactivo marcado que constituye tal complejo de intercalacion en la seccion de presentacion visual de deteccion se observa visualmente. La deteccion se lleva a cabo de una manera arbitraria, tal como desarrollo de color para la determinacion de la presencia o ausencia de una sustancia que va a detectarse (veanse los documentos de patente 1 a 4).
En una configuracion, un dispositivo de prueba de tipo de flujo transversal comunmente usado comprende un portador de membrana porosa a traves del que puede pasar lfquido. Se proporciona una seccion de presentacion visual de deteccion sobre la que se ha inmovilizado una sustancia capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse (reactivo de captura) a una porcion de la superficie superior de tal portador de membrana y se proporciona un medio de absorcion de agua sobre la superficie inferior del portador de membrana. Por ejemplo, cuando una reaccion de union espedfica es una reaccion de antfgeno-anticuerpo en la que un antfgeno es la sustancia que va a detectarse, se ha inmovilizado un anticuerpo que sirve como reactivo de captura capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse en una parte de la superficie superior del portador de membrana. En tal caso, cuando se suministra una muestra lfquida a la superficie superior de un portador de membrana, la muestra lfquida pasa a traves del portador de membrana de modo que se absorbe mediante un medio de absorcion de agua. Si una sustancia que va a detectarse esta presente en una muestra, la sustancia que va a detectarse se captura mediante el reactivo de captura inmovilizado en la seccion de presentacion visual de deteccion proporcionado a la superficie superior del portador de membrana de manera que se forma un complejo de “sustancia que va a detectarse-reactivo de captura” en la seccion de presentacion visual de deteccion. Posteriormente, se suministra un anticuerpo capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse que se ha marcado con una sustancia de marcaje que comprende una enzima tal como peroxidasa o partfculas colorantes tales como partfculas coloidales metalicas (reactivo marcado) a la superficie superior del portador de membrana. Por tanto, se permite que el anticuerpo se una a la sustancia que va a detectarse que se ha capturado en la seccion de presentacion visual de deteccion. Por consiguiente, se forma un complejo de intercalacion de “reactivo marcado- sustancia que va a detectarse-reactivo de captura” en la seccion de presentacion visual de deteccion. Entonces, se observa visualmente la sustancia de marcaje del reactivo marcado que constituye tal complejo de intercalacion en la seccion de presentacion visual de deteccion. La deteccion se lleva a cabo de una manera arbitraria tal como
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desarrollo de color para la determinacion de la presencia o ausencia de una sustancia que va a detectarse (veanse los documentos de patente 5 a 7).
A los dispositivos de prueba anteriores se les proporciona una seccion de presentacion visual de referencia que presenta visualmente resultados de prueba de referencia que indican la finalizacion apropiada de la prueba a un operario. Cuando la sustancia que va a detectarse no esta presente en la muestra, la seccion de presentacion visual de referencia de este tipo indica el paso de la muestra y el reactivo marcado a traves del portador de membrana, incluso si no se detecta la sustancia de marcaje en la seccion de presentacion visual de deteccion. Por ejemplo, en un caso en el que la sustancia que va a detectarse no se detecta en la seccion de presentacion visual de deteccion, si puede confirmarse el paso de la muestra y el reactivo marcado a traves del portador de membrana en la seccion de presentacion visual de referencia, se verifica la finalizacion apropiada de la prueba. Por otro lado, si no puede confirmarse el paso de la muestra y el reactivo marcado a traves del portador de membrana o la tira en la seccion de presentacion visual de referencia, puede considerarse que hay un fallo relacionado con la muestra o el reactivo marcado debido al mismo motivo. Esto indica la finalizacion inapropiada de la prueba. En tal caso, los resultados de prueba obtenidos se consideran invalidos. Entonces, la muestra vuelve a someterse a prueba.
En muchos casos, se ha usado un dispositivo de prueba que comprende una seccion de presentacion visual de referencia que permite una reaccion de antigeno-anticuerpo con un reactivo marcado. Por ejemplo, se inmoviliza una sustancia identica a una sustancia que va a detectarse o una sustancia que tiene reactividad espedfica inmunologica frente a un reactivo marcado que es identica a la de una sustancia que va a detectarse en una seccion de presentacion visual de referencia de un portador de membrana (vease el documento de patente 8). Sin embargo, es probable que una prueba de referencia que usa una reaccion de antigeno-anticuerpo se vea influida por la cantidad de antigeno contenido en la muestra, los tipos de sustancias foraneas, el pH y otros factores. Esto da como resultado escasa sensibilidad de presentacion visual y presentacion visual poco mtida en una seccion de presentacion visual de referencia en algunos casos. Por tanto, se ha esperado un dispositivo de prueba provisto de una seccion de presentacion visual de referencia que muestre una estabilidad mejorada.
Existe una invencion de un dispositivo de prueba en el que se usa un indicador o formador de color en una seccion de presentacion visual de referencia que usa una reaccion distinta de una reaccion de antigeno-anticuerpo frente a un reactivo marcado. Por ejemplo, existe un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral provisto de una seccion de presentacion visual de referencia, en el que la seccion de presentacion visual de referencia esta configurada de manera que indica la finalizacion de la reaccion permitiendo que el papel de filtro absorba un formador de color que comprende verde de bromocresol, 2,5-dinitrofenol o azul de bromofenol y secando el papel de filtro (vease el documento de patente 9). En este caso, el desarrollo de color tiene lugar cuando el formador de color se humedece con agua, indicando la finalizacion de la reaccion. Sin embargo, en un caso de este metodo, el desarrollo de color normal de un formador de color no tiene lugar dependiendo del pH de la muestra. En otro caso, incluso si tiene lugar el desarrollo de color normal, el formador de color fluye hacia fuera con la muestra lfquida cuando la muestra pasa a traves de la seccion de presentacion visual de referencia. Por tanto, no puede llevarse a cabo de manera estable una prueba de referencia. Ademas, existe un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral en el que la prueba de referencia se lleva a cabo de manera que la finalizacion de la reaccion se indica permitiendo que el papel de filtro absorba directamente un colorante usado como indicador que contiene benzopurpurina 4B o rojo Congo para tenir (vease el documento de patente 10). Sin embargo, en este metodo, se usa papel de filtro para retener el indicador y por tanto es necesario incorporar papel de filtro en el dispositivo de prueba. Por tanto, el numero de partes componentes del dispositivo de prueba aumenta, dando como resultado un montaje complicado. Ademas, existe una invencion que se ha realizado en vista de los puntos problematicos de las invenciones divulgadas en los documentos de patente 9 y 10. La invencion se refiere a un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral en el que la prueba de referencia se lleva a cabo de manera que la finalizacion de la reaccion se indica permitiendo que el portador de membrana absorba un indicador que comprende un colorante acido (que contiene al menos un elemento seleccionado de entre eosina B, eosina Y, floxina B y azul de bromofenol) disuelto en una disolucion de alcohol inferior que contiene acido y secando el portador de membrana (vease el documento de patente 11). Sin embargo, en caso de que las pruebas de referencia anteriores usen un indicador o formador de color, la finalizacion de la reaccion puede confirmarse cuando una muestra lfquida ha pasado a traves de un portador de membrana de una manera apropiada. Sin embargo, el paso de un reactivo marcado a traves de un portador de membrana de una manera apropiada no puede verificarse.
El documento de patente 12 describe un dispositivo de flujo lateral que incluye una zona de control que comprende polietilenimina para inmovilizar conjugados de sondas o sondas que migran a las lmeas de control sin analito, situandolos de ese modo para generar una senal de control que indica la finalizacion apropiada de la prueba.
Documento de patente 1: Publicacion de patente japonesa (Kokoku) n.° 7-78503 B (1995)
Documento de patente 2: Publicacion de patente japonesa (Kokoku) n.° 7-36017 B (1995)
Documento de patente 3: Publicacion de patente japonesa (Kokoku) n.° 6-27738 B (1994)
Documento de patente 4: Publicacion de patente japonesa (Kokai) n.° 1-244370 A (1989)
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Documento de patente 5: Publicacion de patente japonesa (Kokoku) n.° 7-34016 B (1995)
Documento de patente 6: Publicacion de patente japonesa (Kokoku) n.° 7-113637 B (1995)
Documento de patente 7: Publicacion de patente japonesa (Kokai) n.° 3-118473 A (1991)
Documento de patente 8: Publicacion de patente japonesa (Kokai) n.° 2007-333426 A
Documento de patente 9: Publicacion de patente japonesa (Kokai) n. 4-353764 A (1992)
Documento de patente 10: Patente japonesa n.° 2942087 Documento de patente 11: Patente japonesa n.° 3385377 Documento de patente 12: US 2003/0119203 Divulgacion de la invencion Problema a solucionar mediante la invencion
Se usa una reaccion de antigeno-anticuerpo provocada por un anticuerpo marcado en secciones de presentacion visual de referencia en muchos dispositivos de prueba convencionales para ensayo de membrana que implica una reaccion de union espedfica. Es probable que una reaccion de antigeno-anticuerpo se vea influida por la cantidad de antigeno contenido en la muestra, los tipos de sustancias foraneas, el pH y otros factores. Esto da como resultado escasa sensibilidad de presentacion visual y presentacion visual poco mtida en secciones de presentacion visual de referencia en algunos casos. Ademas, una seccion de presentacion visual de referencia sobre la que se usa un indicador o formador de color no puede demostrar el paso de un anticuerpo marcado a traves de un portador de membrana de una manera apropiada. La presente invencion se ha realizado en vista de los problemas convencionales. Un objeto de la presente invencion es proporcionar un dispositivo de prueba provisto de una seccion de presentacion visual de referencia que indica rapida y claramente la finalizacion apropiada de la prueba con precision y estabilidad mejoradas.
Medios para solucionar el problema
Como resultado de estudios intensivos de un medio para lograr el objetivo anterior, los presentes inventores encontraron que el uso de una sustancia cationica en una seccion de presentacion visual de referencia para ensayo de membrana que implica una reaccion de union espedfica permite una presentacion visual rapida y nftida de resultados de prueba de referencia, logrando de ese modo la implementacion de una prueba de referencia con estabilidad mejorada. Esto ha conducido a la finalizacion de la presente invencion.
Espedficamente, la presente invencion se define en su sentido mas amplio mediante las reivindicaciones adjuntas.
[1] Un dispositivo de prueba para ensayo de membrana que usa una reaccion de union espedfica de una sustancia que va a detectarse con un reactivo de captura inmovilizado sobre un portador de membrana y un reactivo marcado con una sustancia de marcaje, siendo el reactivo una sustancia anionica o un anfolito que esta cargado negativamente en condiciones basicas, que comprende una seccion de presentacion visual de referencia para indicar la finalizacion apropiada de la prueba sobre la que se ha inmovilizado un polfmero cationico para capturar un reactivo marcado, en el que el polfmero cationico es un compuesto de polfmero que tiene una densidad de carga cationica de 0,4 meq/g a 21 meq/g, y un peso molecular promedio de 300 a 5.000.000, en el que el polfmero cationico es polialilamina, en el que el dispositivo de prueba es un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral, y en el que la seccion de presentacion visual de referencia para indicar la finalizacion apropiada de la prueba esta configurada de manera que esta situada aguas abajo de una seccion de presentacion visual de deteccion sobre la que se ha inmovilizado un reactivo de captura. [2] El dispositivo de prueba segun [1], en el que la seccion de presentacion visual de referencia esta configurada para permitir que el portador de membrana absorba el polfmero cationico y seque la membrana. [3] El dispositivo de prueba segun [1] o [2], en el que la reaccion de union espedfica es una reaccion de antfgeno-anticuerpo. [4] Un metodo para confirmar la finalizacion apropiada de una prueba para ensayo de membrana que usa el dispositivo de prueba segun uno cualquiera de [1] a [3], usando el metodo una reaccion de union espedfica de una sustancia que va a detectarse con el reactivo de captura inmovilizado sobre el portador de membrana y el reactivo marcado con la sustancia de marcaje, mediante lo cual puede confirmarse la finalizacion apropiada de la prueba cuando se detecta el marcaje del reactivo marcado en la seccion de presentacion visual de referencia sobre la membrana permitiendo que el reactivo marcado se una al polfmero cationico inmovilizado en la seccion de presentacion visual de referencia.
Esta descripcion incluye parte o todo el contenido divulgado en la descripcion y/o dibujos de la solicitud de patente japonesa n.° 2008-214226, que es un documento de prioridad de la presente solicitud.
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Efectos de la invencion
Segun la presente invencion, los resultados de prueba de referencia pueden presentarse visualmente de manera rapida y mtida sin sustancialmente influencia debida a la cantidad de antigeno contenido en la muestra, los tipos de sustancias foraneas, el pH y otros factores. Por tanto, puede proporcionarse un dispositivo de prueba que comprende una seccion de presentacion visual de referencia con precision y estabilidad mejoradas en comparacion con casos que implican metodos convencionales.
Ademas, puede proporcionarse un dispositivo de prueba facil de producir que comprende una seccion de presentacion visual de referencia para presentar visualmente resultados mas rapida y claramente que en casos que implican metodos convencionales con el uso de polialilamina economica como sustancia cationica.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra una vista desde arriba y una vista en seccion transversal de un equipo de prueba de tipo de flujo lateral en una realizacion de la presente invencion.
La figura 2 muestra una vista desde arriba y una vista en seccion transversal de un dispositivo de prueba de tipo de flujo transversal (modelo 1).
La figura 3 muestra una vista desde arriba y una vista en seccion transversal de un dispositivo de prueba de tipo de flujo transversal (modelo 2).
Descripcion de numeros de referencia
1: Lamina de soporte
2: Portador de membrana
3: Elemento impregnado
4: Elemento de suministro de muestra
5: Elemento de absorcion de agua
6: Seccion de presentacion visual de deteccion
7: Seccion de presentacion visual de referencia
8: Placa Petri de plastico
9: Lecho absorbente de agua
10: Portador de membrana
11: Seccion de presentacion visual de deteccion
12: Seccion de presentacion visual de referencia
a: Seccion de presentacion visual de deteccion de tipo A
b: Seccion de presentacion visual de deteccion de tipo B
c: Seccion de presentacion visual de referencia
Mejor modo de llevar a cabo la invencion
La presente invencion se describe en detalle a continuacion.
La presente invencion se refiere a un dispositivo de prueba para ensayo de membrana basado en principios de medicion de una reaccion de union espedfica con una sustancia que va a detectarse, en el que se usa una sustancia cationica para una seccion de presentacion visual de referencia situada sobre una membrana que sirve como portador de membrana. Un dispositivo de prueba contiene un reactivo de captura capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse y un reactivo marcado capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse que esta marcada con una sustancia de marcaje. La sustancia que va a detectarse
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forma un complejo de intercalacion de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse-reactivo de captura” con un reactivo de captura y un reactivo marcado proporcionados en una seccion de presentacion visual de deteccion de un dispositivo de prueba. Ademas, el dispositivo de prueba esta provisto de una seccion de presentacion visual de referencia para presentar visualmente la finalizacion apropiada de la prueba a un operario. El operario puede confirmar la implementacion y finalizacion apropiadas de la prueba observando la seccion de presentacion visual de referencia. La seccion de presentacion visual de referencia puede denominarse “seccion de presentacion visual de la finalizacion de la reaccion” o “seccion de validacion”. El termino “union espedfica” usado en la presente invencion indica una reactividad selectiva entre dos sustancias. Por ejemplo, el termino indica una reaccion inmunologica espedfica tal como una reaccion de antigeno-anticuerpo, una reaccion espedfica tal como una reaccion entre un receptor y su ligando, o union espedfica. Ejemplos detal dispositivo de prueba descrito son un dispositivo de prueba de tipo de flujo transversal y un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral. En un dispositivo de prueba de tipo de flujo transversal, un analito pasa a traves de la membrana descrita anteriormente. En un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral, se revela un analito y se transfiere a lo largo de una membrana. El termino “ensayo de membrana” se refiere a un ensayo en el que al menos una etapa de una reaccion se realiza sobre un soporte de tipo membrana de manera que la union espedfica anterior tiene lugar sobre el soporte.
Los ejemplos de una sustancia que va a detectarse en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a: virus tales como virus influenza, adenovirus, virus RS, VHA, VHB, VHC, VIH, VEB, norovirus, rotavirus y parvovirus, o sus componentes o anticuerpos; bacterias tales como Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Campilobacter, Clostridium perfringens, Vibrio parahaemolyticus, Chlamydia trachomatis, Hemolytic streptococcus, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, Leptospira, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, Borrelia, antrax y MRSA, o sus componentes o anticuerpos; sustancias tales como lfpido de micoplasmas, transferrina humana, albumina humana, inmunogloblina humana, microglobulina, CRP, troponina, p-glucano y RF, o sus componentes o anticuerpos; hormonas peptfdicas tales como gonadotropina corionica humana o sus anticuerpos; esteroides tales como hormonas esteroides o sus anticuerpos; aminas fisiologicamente activas tales como epinefrina y morfina o sus anticuerpos; vitaminas tales como vitamina B o sus anticuerpos; prostaglandinas o sus anticuerpos; antibioticos tales como tetraciclina o sus anticuerpos; toxinas producidas por bacterias y similares o sus anticuerpos; una variedad de marcadores tumorales o sus anticuerpos; agroqmmicos o sus anticuerpos; y secuencias de polinucleotido u oligonucleotido complementarias a secuencias de acido nucleico derivadas de microorganismos patogenos.
El termino “reactivo de captura” se refiere a un reactivo que se ha inmovilizado sobre una membrana para que se una a cualquiera de las sustancias anteriores que van a detectarse. Tal reactivo se usa para capturar la sustancia que va a detectarse. Si la sustancia que va a detectarse es un antfgeno, puede usarse un anticuerpo contra el antfgeno como reactivo de captura. Si la sustancia que va a detectarse es un anticuerpo, puede usarse un antfgeno al que se une el anticuerpo como reactivo de captura. Ademas, cuando se usan sustancias entre las que existe una relacion de ligando-receptor, cualquiera de los mismos puede ser la sustancia que va a detectarse mientras que la otra puede ser el reactivo de captura. Ademas, si la sustancia que va a detectarse es un acido nucleico, puede usarse un acido nucleico, que tiene una secuencia complementaria a la secuencia del acido nucleico y por tanto puede hibridarse con el acido nucleico, como reactivo de captura.
Segun la presente invencion, el termino “reactivo marcado” se refiere a un conjugado obtenido permitiendo que una sustancia de marcaje adecuada se una a una sustancia capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse. Si la sustancia que va a detectarse es un antfgeno, puede usarse un anticuerpo contra el antfgeno como sustancia capaz de unirse espedficamente a la sustancia que va a detectarse. Si la sustancia que va a detectarse es un anticuerpo, puede usarse un antfgeno al que se une el anticuerpo como sustancia capaz de unirse espedficamente a la sustancia que va a detectarse. Cuando se usan sustancias entre las que existe una relacion de ligando-receptor, cualquiera de los mismos puede ser la sustancia que va a detectarse mientras que la otra puede ser la sustancia capaz de unirse espedficamente a la sustancia que va a detectarse. Ademas, si la sustancia que va a detectarse es un acido nucleico, puede usarse un acido nucleico, que tiene una secuencia complementaria a la secuencia del acido nucleico y por tanto puede hibridarse con el acido nucleico, como sustancia capaz de unirse espedficamente a la sustancia que va a detectarse. Puede usarse cualquier sustancia de marcaje generalmente usada para el marcaje de una sustancia. Los ejemplos de las mismas incluyen: partmulas coloidales metalicas tales como partmulas coloidales de oro; partmulas coloidales no metalicas tales como partmulas coloidales de selenio; partmulas de una sustancia de resina tales como partmulas de latex coloreadas; partmulas insolubles tales como partmulas coloidales de colorante y liposomas coloreados; enzimas que catalizan reacciones cromogenicas tales como fosfatasa alcalina y peroxidasa; fluorocromos; y radioisotopos. La sustancia de marcaje usada en la presente invencion puede ser un producto comercial generalmente disponible.
Una caractenstica importante del dispositivo de deteccion de la presente invencion es el uso de una sustancia cationica en una seccion de presentacion visual de referencia. La seccion de presentacion visual de referencia puede proporcionarse inmovilizando una sustancia cationica sobre un portador de membrana. En este caso, la inmovilizacion de una sustancia cationica sobre un portador de membrana puede llevarse a cabo permitiendo que el portador de membrana absorba una sustancia cationica y luego se seque. Se supone que la sustancia cationica retiene una carga positiva fuerte de modo que provoca que un anfolito tal como una protema que se introduce en las cercamas de la misma este cargada negativamente, tras lo cual captura la protema por medio de una interaccion electrica entre la carga negativa y la carga positiva de la propia sustancia cationica. Esto es probablemente porque
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el pH en las proximidades de una sustancia cationica fuerte es siempre basico, lo que finalmente provoca que un anfolito tal como una protema que se introduce en las cercamas de una sustancia cationica este cargada negativamente. La sustancia cationica usada en la presente invencion es fuertemente cationica hasta un grado tal que puede provocar que un anfolito que se introduce en las cercamas de la misma este cargado negativamente. A diferencia de la union de un reactivo marcado provocada por una reaccion de anffgeno-anticuerpo convencional, una sustancia cationica no tiene selectividad (es decir, especificidad) en cuanto al sujeto de union. Una sustancia cationica puede adsorberse a cualquier sustancia anionica o cualquier anfolito que este cargado negativamente en condiciones basicas. Es decir, para el dispositivo de la presente invencion en el que se usa una sustancia cationica para una seccion de presentacion visual de referencia, una sustancia capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse, que se permite que se una a una sustancia de marcaje, es una sustancia anionica o un anfolito que esta cargado negativamente en condiciones basicas. Un ejemplo de la misma es una protema tal como un anticuerpo. Sin embargo, existe el problema de que la union de un reactivo marcado podna inhibirse por la union de una sustancia foranea en una muestra. Tal problema puede resolverse facilmente aplicando una cantidad suficiente de una sustancia cationica. Esta es una caractenstica muy importante de la presente invencion. En general, la aplicacion de una cantidad excesiva de un anffgeno, un anticuerpo, o similar a un portador de membrana tiende a afectar al rendimiento en cuanto al volumen de union o la tasa de union. Por tanto, la cantidad de anticuerpo que va a aplicarse no puede aumentarse significativamente. Esto es probablemente porque el epftopo o sitio de reconocimiento de epftopos de una molecula de anffgeno o anticuerpo esta enmascarado por una molecula de anffgeno o anticuerpo diferente. La presente invencion usa interaccion electrica y por tanto el volumen de union puede controlarse simplemente aumentando o disminuyendo la cantidad de la sustancia cationica que va a inmovilizarse. En la presente invencion se usa polialilamina como sustancia cationica que va a aplicarse a una seccion de presentacion visual de referencia. Por ejemplo, el poffmero cationico que va a usarse es un compuesto de poffmero que tiene grupos amino o grupos en la cadena principal o cadena lateral, una densidad de carga cationica de 0,4 meq/g a 21 meq/g (preferiblemente de 1,0 meq/g a 21 meq/g y mas preferiblemente de 4,0 meq/g a 21 meq/g), y un peso molecular promedio de 300 a 5.000.000. Los ejemplos de tal poffmero cationico descrito en el presente documento incluyen polietilenimina y polivinilamina. La polietilenimina incluye PEI lineal y polietilenimina ramificada que comprende amina primaria, secundaria o terciaria, y puede usarse cualquiera de ellas. Ademas, el peso molecular de la polietilenimina no esta limitado. Ademas, puede incluirse polietilenimina sometida a modificacion qmmica tal como desacilacion. Ademas, los ejemplos de polialilamina incluyen derivados de polialilamina tales como poli(alil-N-carbamoilguanidino-co-alilamina). Los ejemplos de tensioactivo cationico descritos en el presente documento incluyen cloruro de benzalconio y bromuro de tetradeciltrimetilamonio. Puede usarse una mezcla de las sustancias anteriores. La polialilamina es deseable en cuanto a coste, facilidad de produccion y reactividad rapida y mtida. La cantidad de la sustancia cationica anterior que va a inmovilizarse no esta limitada. Sin embargo, la sustancia se prepara a una concentracion del 0,1% al 10% (p/v). Luego, se anaden de 0,1 |il a 10 |il de la sustancia a una membrana de un dispositivo de prueba de tipo de flujo transversal o de tipo de flujo lateral, seguido por fijacion. En un metodo alternativo, puede conferirse una funcion de presentacion visual de referencia a tal dispositivo de prueba situando una membrana de nailon cargada positivamente por medio de modificacion qmmica sobre una parte de una membrana de un dispositivo de prueba de manera que se solapen entre sff
A continuacion, se describen realizaciones espedficas del dispositivo de prueba de la presente invencion.
El dispositivo de prueba de la presente invencion es un dispositivo de tipo de flujo lateral.
En la figura 1 se muestra un ejemplo espedfico de la configuracion de un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral. El dispositivo de prueba mostrado en la figura 1 es meramente un ejemplo y por tanto el dispositivo de prueba de la presente invencion no esta limitado a la configuracion mostrada en la figura 1 en cuanto a estructura o tamano. En la figura 1, las referencias numericas 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 indican una lamina de soporte, un portador de membrana, un elemento impregnado, un elemento de suministro de muestra, un elemento de absorcion de agua, una seccion de presentacion visual de deteccion y una seccion de presentacion visual de referencia, respectivamente. La lamina de soporte es una lamina hecha de plastico o similar y se usa para mantener la estructura del dispositivo de prueba. El portador 2 de membrana esta compuesto por una membrana de nitrocelulosa con una anchura de 5 mm y una longitud de 30 mm en forma de banda. El reactivo de captura se inmoviliza en un sitio 7,5 mm alejado del extremo del portador 2 de membrana en el lado en el que comienza el desarrollo cromatografico (el extremo izquierdo del portador 2 de membrana en la figura 1) de manera que se forma una seccion 6 de presentacion visual de deteccion. Puede usarse un metodo conocido que implica adsorcion ffsica, union qmmica, o similar como metodo para fijar un reactivo de captura sobre un portador 2 de membrana. El reactivo de captura se inmoviliza en una forma lineal sobre el portador 2 de membrana de manera que se forma la seccion 6 de presentacion visual de deteccion. Sin embargo, puede inmovilizarse de cualquier forma, tal como una forma circular o cuadrada. Se inmoviliza una sustancia cationica en un sitio 4,0 mm alejado de la seccion 6 de presentacion visual de deteccion sobre el portador 2 de membrana de manera que se forma una seccion 7 de presentacion visual de referencia. Como en el caso de la seccion 6 de presentacion visual de deteccion, puede usarse un metodo conocido que implica adsorcion ffsica, union qmmica, o similar como metodo para fijar una sustancia cationica sobre el portador 2 de membrana para la seccion 7 de presentacion visual de referencia. La sustancia cationica se inmoviliza en una forma lineal sobre el portador 2 de membrana de manera que se forma la seccion 7 de presentacion visual de referencia. Sin embargo, puede inmovilizarse de cualquier forma, tal como una forma circular
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o cuadrada. Tal como se muestra en el ejemplo de la figura 1, se forma deseablemente una seccion de presentacion visual de referencia aguas abajo de una seccion de presentacion visual de deteccion sobre la que se ha inmovilizado un reactivo de captura. En el dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral de la presente invencion, el flujo de una disolucion comienza desde el elemento de suministro de muestra y se desplaza hacia el elemento de absorcion de agua. En este caso, los terminos “aguas arriba” y “aguas abajo” se definen basandose en la direccion de tal flujo. Se describe una membrana de nitrocelulosa como ejemplo del portador 2 de membrana. Sin embargo, puede usarse cualquier membrana siempre que permita el desarrollo cromatografico de un analito contenido en una muestra de prueba, y el reactivo de captura y la sustancia cationica descritos anteriormente puedan inmovilizarse sobre la misma. Los ejemplos de una membrana que pueden usarse incluyen otras membranas de celulosa, membranas de nailon y membranas de fibra de vidrio. El elemento 3 impregnado consiste en un elemento impregnado con un reactivo marcado. Se usa material textil no tejido que comprende fibras sinteticas en forma de banda con un tamano de 5 mm x 8 mm para el elemento 3 impregnado. Sin embargo, la presente invencion no esta limitada a lo mismo. Por ejemplo, tambien puede usarse material textil de celulosa (papel de filtro, membrana de nitrocelulosa, o similar) y material textil de plastico poroso que comprende fibras de vidrio, polietileno, polipropileno, o similar. El reactivo marcado se marca con una sustancia de marcaje y se une espedficamente a la sustancia que va a detectarse. Los ejemplos de la sustancia de marcaje incluyen, pero no se limitan a, una sustancia de marcaje de color, una sustancia de marcaje de enzima y una sustancia de marcaje fluorescente. De estas, se usa preferiblemente una sustancia de marcaje de color en cuanto a determinacion rapida y conveniente por medio de observacion visual de cambios de color en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion. Los ejemplos de una sustancia de marcaje de color incluyen latex tal como latex sintetico (por ejemplo, latex de poliestireno) o latex de caucho natural tenido con un colorante tal como un colorante rojo o azul, ademas de un coloide metalico tal como coloide de oro o coloide de platino. De estos, el latex de poliestireno es particularmente preferible. El elemento 3 impregnado puede producirse impregnando un elemento que consiste en el material textil no tejido anterior que comprende fibras sinteticas o similares con una suspension de un reactivo marcado y secando el elemento impregnado. Tal como se muestra en la figura 1, el portador 2 de membrana se une en el medio de la lamina 1 de soporte. La parte de extremo aguas abajo del elemento 3 impregnado esta situada sobre o bajo la parte de extremo del portador 2 de membrana en el lado sobre el que comienza el desarrollo cromatografico (a continuacion en el presente documento denominado “lado aguas arriba” (es decir, el lado izquierdo en la figura 1), mientras que el lado opuesto del mismo se denomina “lado aguas abajo” (es decir, el lado derecho en la figura 1)) de manera que el elemento 3 impregnado se conecta secuencialmente al portador 2 de membrana. Entonces, la parte aguas arriba del elemento 3 impregnado se une a la lamina 1 de soporte. Por tanto, puede producirse el dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral de la presente invencion. El dispositivo en forma de tira mostrado en la figura 1 puede denominarse “tira cromatografica”. Cuando la sustancia que va a detectarse se captura usando una reaccion de antfgeno-anticuerpo, el dispositivo se denomina algunas veces “dispositivo inmunocromatografico” o “tira inmunocromatografica”.
Ademas, si es necesario, tambien es posible situar la parte aguas abajo de un elemento 4 de suministro de muestra sobre la superficie superior del elemento 3 impregnado de manera que se solapen entre sf y unan la parte aguas arriba del elemento 4 de suministro de muestra a la lamina 1 de soporte. Tambien es posible situar la parte aguas arriba de un elemento 5 de absorcion de agua sobre la superficie superior de la parte aguas abajo del portador 2 de membrana de manera que se solapen entre sf y unan la parte aguas abajo del elemento 5 de absorcion de agua a la lamina 1 de soporte. Los ejemplos de un elemento 4 de suministro de muestra que pueden usarse incluyen: material textil no tejido que consiste en fibras sinteticas porosas de polietileno poroso, polipropileno poroso, o similar; papel de celulosa tal como papel de filtro y material textil de algodon; material textil tejido; y material textil no tejido.
El elemento 5 de absorcion de agua es el elemento al que llega el flujo de la muestra lfquida suministrada al elemento 4 de suministro de muestra. El elemento de suministro de muestra absorbe y retiene una muestra fluida de manera que la muestra de analito fluye rapidamente de aguas arriba a aguas abajo. Por tanto, el elemento 5 de absorcion de agua puede consistir en un material que absorbe rapidamente y retiene lfquido. Los ejemplos de tal material incluyen celulosa, fibras de vidrio y material textil no tejido que consiste en plastico poroso tal como polietileno o polipropileno. En particular, la celulosa es el material mas adecuado. Ademas, puede proporcionarse un dispositivo inmunocromatografico de tipo de flujo lateral mostrado en la figura 1 con una configuracion en la que se une una lamina laminada a la superficie del portador 2 de membrana para su proteccion o en el que se hacen una abertura de una entrada de muestra de prueba y una abertura de una ventana de determinacion sobre una carcasa de plastico adecuada para un elemento 4 de suministro de muestra, una seccion 6 de presentacion visual de deteccion y una seccion 7 de presentacion visual de referencia incorporados dentro de la carcasa.
Cuando se suministra una muestra lfquida a un elemento 4 de suministro de muestra, la muestra lfquida permea el elemento 4 de suministro de muestra y se transfiere a un elemento 3 impregnado mediante accion capilar, y entonces la muestra lfquida disuelve un reactivo marcado contenido en el elemento 3 impregnado. Si la sustancia que va a detectarse esta presente en la muestra lfquida, la sustancia se une al reactivo marcado de manera que se forma un complejo de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse”. Tal complejo de “reactivo marcado- sustancia que va a detectarse” permea adicionalmente mediante accion capilar y se transfiere al portador 2 de membrana de modo que pasa a traves de la seccion 6 de presentacion visual de deteccion. En tal momento, el reactivo de captura en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion captura el complejo de “reactivo marcado- sustancia que va a detectarse” de manera que se forma un complejo de intercalacion de “reactivo marcado- sustancia que va a detectarse-reactivo de captura”. Ademas, una parte del reactivo marcado que no reacciona con la
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sustancia que va a detectarse no se captura en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion y se transfiere adicionalmente a la seccion 7 de presentacion visual de referencia ubicada aguas abajo del portador 2 de membrana. La parte del reactivo marcado transferida a la seccion 7 de presentacion visual de referencia se captura por la sustancia cationica inmovilizada sobre la seccion 7 de presentacion visual de referencia. En tal caso, una parte de una sustancia anionica una muestra lfquida podna haberse unido a la sustancia cationica sobre la seccion 7 de presentacion visual de referencia. Sin embargo, es improbable que esto influya en la captura del reactivo marcado. Entonces, se detectan una parte del reactivo marcado capturado por la seccion 6 de presentacion visual de deteccion y la capturada por la seccion 7 de presentacion visual de referencia. Puede seleccionarse el metodo mas apropiado para detectar un reactivo marcado dependiendo del metodo de marcaje relevante. Por ejemplo, en el caso de marcaje con una enzima, se suministra un sustrato para el desarrollo de color. En el caso de marcaje con una sustancia fluorescente o radioisotopo, se usa un dispositivo especializado para la determinacion. En el caso de marcaje con partfculas coloreadas tales como partfculas coloidales de oro o partfculas de latex, se confirma una imagen de agregacion mediante observacion visual. Cuando el marcador del reactivo marcado se detecta en la seccion 7 de presentacion visual de referencia, esto indica que la muestra lfquida suministrada al elemento 4 de suministro de muestra ha pasado a traves de la seccion 6 de presentacion visual de deteccion y ha llegado a la seccion 7 de presentacion visual de referencia. Por consiguiente, puede determinarse que el ensayo se ha llevado a cabo de manera normal. Si la sustancia que va a detectarse esta presente en la muestra lfquida, se detecta el marcaje del reactivo marcado en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion y en la seccion 7 de presentacion visual de referencia. Si la sustancia que va a detectarse no esta presente en la muestra lfquida, se detecta el marcador del reactivo marcado solo en la seccion 7 de presentacion visual de referencia.
Ademas, en otra realizacion de un dispositivo de tipo de flujo lateral, existe un metodo en el que el elemento 4 de suministro de muestra esta situado directamente sobre el portador de membrana de manera que se solapan entre sf sin el elemento 3 impregnado entre medias, se mezclan de antemano la muestra lfquida y el reactivo marcado, y se suministra la mezcla al elemento 4 de suministro de muestra. Cuando la muestra lfquida y el reactivo marcado se mezclan de antemano, la sustancia que va a detectarse en la muestra lfquida forma un complejo de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse”. A continuacion, la mezcla de una muestra lfquida y un reactivo marcado se suministra al elemento 4 de suministro de muestra. Por consiguiente, la mezcla de la muestra lfquida y el reactivo marcado permea el elemento 4 de suministro de muestra y se transfiere al portador de membrana mediante accion capilar. La mezcla de la muestra lfquida y el reactivo marcado transferida al portador de membrana pasa a traves de la seccion 6 de presentacion visual de deteccion. En tal momento, se captura un “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse” en la mezcla de la muestra lfquida y el reactivo marcado mediante un reactivo de captura en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion de manera que se forma un complejo de intercalacion de “reactivo marcado- sustancia que va a detectarse-reactivo de captura”. Ademas, una parte del complejo de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse” que no se ha capturado mediante el reactivo de captura y una parte sin reaccionar del reactivo marcado se transfieren adicionalmente a la seccion 7 de presentacion visual de referencia ubicada aguas abajo de la seccion 6 de presentacion visual de deteccion y se capturan en la seccion 7 de presentacion visual de referencia.
Para un dispositivo de tipo de flujo transversal, se describe la configuracion mostrada en la figura 2 como ejemplo. En la figura 2, las referencias numericas 8, 9, 10, 11 y 12 indican una placa Petri de plastico de 35 mm, un lecho absorbente de agua, un portador de membrana, una seccion de presentacion visual de deteccion y una seccion de presentacion visual de referencia, respectivamente. Se usa una membrana de nitrocelulosa (diametro de poro: 3 |im, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) cortada en un trozo con un tamano de 20 mm x 20 mm para el portador 10 de membrana permeable a los lfquidos. Se proporciona una seccion 11 de presentacion visual de deteccion de analito sobre la que se ha inmovilizado un reactivo de captura sobre el portador 10 de membrana. Puede usarse un metodo conocido que implica adsorcion ffsica, union qrnmica, o similar como metodo para fijar un reactivo de captura sobre el portador 10 de membrana. Se inmoviliza un reactivo de captura sobre el portador 10 de membrana en una forma circular de manera que se forma la seccion 11 de presentacion visual de deteccion. Sin embargo, puede inmovilizarse de cualquier forma, tal como una forma lineal o cuadrada. Se proporciona una seccion 12 de presentacion visual de referencia sobre la que se ha inmovilizado una sustancia cationica al portador 10 de membrana de una manera tal que la seccion 12 de presentacion visual de referencia y la seccion 11 de presentacion visual de deteccion existen en el mismo plano con una determinada distancia entre medias. Como en el caso de la seccion 11 de presentacion visual de deteccion, puede usarse un metodo conocido que implica adsorcion ffsica, union qrnmica, o similar como metodo para fijar la seccion 12 de presentacion visual de referencia sobre el portador 10 de membrana. Se inmoviliza una sustancia cationica sobre el portador 10 de membrana en una forma circular de manera que se forma la seccion 12 de presentacion visual de referencia. Sin embargo, puede inmovilizarse de cualquier forma, tal como una forma lineal o cuadrada. Se usa una membrana de nitrocelulosa para el portador 10 de membrana. Sin embargo, puede usarse cualquier membrana siempre que permita el desarrollo cromatografico de un analito contenido en una muestra de prueba, y el reactivo de captura y la sustancia cationica descritos anteriormente puedan inmovilizarse sobre la misma. Los ejemplos de una membrana que pueden usarse incluyen otras membranas de celulosa y membranas que comprende material textil no tejido, fibras de algodon, fibras de plastico tales como fibras de nailon o uretano, o fibras mixtas de las mismas. Se coloca el lecho 9 absorbente de agua con un tamano adecuado (mayor que la membrana de nitrocelulosa con un tamano de 20 mm x 20 mm) en la placa 8 Petri de plastico. Ademas, se coloca el portador 10 de membrana sobre el lecho 9 absorbente de agua de manera que puede observarse la cara sobre la que se ha anadido el reactivo gota a gota y se ha inmovilizado (superficie superior). Se anade una muestra lfquida a la superficie superior del portador 10 de membrana. La superficie superior
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del portador 10 de membrana de denomina cara de instilacion de la muestra. El lecho 9 absorbente de agua es el elemento al que llega la muestra lfquida fluida suministrada. Se usa como medio de absorcion de agua para absorber y retener una muestra fluida. Para un medio de absorcion de agua en contacto con la superficie inferior del portador de membrana, pueden formarse fibras obtenidas a partir de papel de filtro o algodon absorbente para dar un lecho absorbente de agua y usarse tal como se muestra en el ejemplo de la figura 2. Sin embargo, puede usarse cualquier medio, tal como un farmaco que comprende un polfmero de absorcion de agua o un aspirador de vado, siempre que absorba o aspire el lfquido que pasa a traves del portador de membrana. Ademas, en el ejemplo mostrado en la figura 2, se usa una placa Petri de plastico. Sin embargo, la configuracion del dispositivo de prueba no esta limitada a una placa Petri de plastico. Puede emplearse cualquier configuracion siempre que pueda retener un portador de membrana y un medio de absorcion de agua, por ejemplo, incorporandolos dentro de un dispositivo de plastico.
Cuando se suministra una muestra lfquida a la superficie superior (cara de instilacion de la muestra) de un portador 10 de membrana, la muestra lfquida pasa a traves de la membrana y se absorbe mediante el lecho 9 absorbente de agua. En tal momento, si la sustancia que va a detectarse esta presente en la muestra lfquida, la sustancia que va a detectarse se captura mediante el reactivo de captura en la seccion 11 de presentacion visual de deteccion de manera que se forma un complejo de “sustancia que va a detectarse-reactivo de captura”. A continuacion, se suministra una sustancia capaz de unirse espedficamente a una sustancia que va a detectarse que esta marcada con una enzima tal como peroxidasa, una sustancia fluorescente, un radioisotopo, partfculas colorantes tales como partfculas coloidales de oro o partfculas de latex, o similares (reactivo marcado) a la cara de instilacion de reactivo del portador 10 de membrana de manera que se permite que se una a la sustancia que va a detectarse que se ha capturado mediante la seccion 11 de presentacion visual de deteccion. Por tanto, se forma un complejo de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse-reactivo de captura”. Ademas, se captura una parte del reactivo marcado mediante una sustancia cationica inmovilizada en la seccion 12 de presentacion visual de referencia. En tal caso, una parte de una sustancia anionica en una muestra lfquida podna haberse unido a la sustancia cationica en la seccion 12 de presentacion visual de referencia. Sin embargo, es improbable que esto influya en la captura del reactivo marcado. Entonces, se detectan la parte del reactivo marcado capturado por la seccion 11 de presentacion visual de deteccion y la capturada por la seccion 12 de presentacion visual de referencia. Puede seleccionarse el metodo mas apropiado para detectar un reactivo marcado dependiendo del metodo de marcaje relevante. Por ejemplo, en el caso de marcaje con una enzima, se suministra un sustrato para el desarrollo de color. En el caso de marcaje con una sustancia fluorescente o radioisotopo, se usa un dispositivo especializado para la determinacion. En el caso de marcaje con partfculas coloreadas tales como partfculas coloidales de oro o partfculas de latex, se confirma una imagen de agregacion mediante observacion visual. Si la sustancia que va a detectarse esta presente en la muestra lfquida, se detecta el marcador del reactivo marcado en tanto la seccion 11 de presentacion visual de deteccion como la seccion 12 de presentacion visual de referencia. Si la sustancia que va a detectarse no esta presente en la muestra lfquida, se detecta el marcador del reactivo marcado solo en la seccion 12 de presentacion visual de referencia.
Ademas, se usa otra configuracion de un dispositivo de tipo de flujo transversal para un metodo en el que se mezclan de antemano una muestra lfquida y un reactivo marcado y luego se suministra la mezcla a la cara de instilacion de la muestra de un portador de membrana. Cuando la muestra lfquida y el reactivo marcado se mezclan de antemano, la sustancia que va a detectarse en la muestra lfquida forma un complejo de “reactivo marcado- sustancia que va a detectarse”. A continuacion, se suministra la mezcla de una muestra lfquida y un reactivo marcado a la cara de instilacion de la muestra de un portador de membrana. La mezcla de la muestra lfquida y el reactivo marcado pasa a traves de un portador de membrana y se absorbe mediante un medio de absorcion de agua. En tal momento, se captura el complejo de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse” en la muestra lfquida mediante un reactivo de captura en una seccion de presentacion visual de deteccion. Por tanto, se forma un complejo de intercalacion de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse-reactivo de captura”. Ademas, se capturan una parte del complejo de “reactivo marcado-sustancia que va a detectarse” y una parte sin reaccionar del reactivo marcado en la seccion de presentacion visual de referencia. Si se detecta el marcador del reactivo marcado en la seccion de presentacion visual de referencia, esto indica que la muestra lfquida suministrada a la cara de instilacion de la muestra ha pasado a traves de la seccion 11 de presentacion visual de deteccion y la seccion 12 de presentacion visual de referencia. Por consiguiente, puede determinarse que el ensayo se ha llevado a cabo de manera normal.
La muestra lfquida que va a someterse a prueba mediante el dispositivo de prueba de la presente invencion puede seleccionarse de los siguientes ejemplos: espedmenes de lfquidos clmicos tales como orina, heces lfquidas, sangre, suero, frotis del tracto respiratorio superior y fluido de aspirado; espedmenes acuosos derivados del medio ambiente; alimentos lfquidos tales como agua potable; y disoluciones y emulsiones obtenidas disolviendo o suspendiendo microorganismos, heces lfquidas, suelo, lodo, alimentos solidos, componentes atmosfericos, y similares en liquido, y sobrenadantes de los mismos.
Ejemplos
La presente invencion se describe a continuacion en el presente documento en mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos, aunque la presente invencion no se limita a los mismos.
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Ejemplo comparativo 1: Produccion de un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral
1. Produccion de un reactivo marcado con latex
Se anadieron partmulas de latex de poliestireno azul con un diametro de partmula promedio de 0,2 |im (Ceradyne, Inc.) a una disolucion de anticuerpo monoclonal anti-adenovirus (0,5 mg/ml) previamente dializada con un tampon MES 50 mM (pH 6,0) hasta una concentracion final del 0,25% (p/v). Se dejo que el resultante reposara a 37°C durante 2 horas y se sometio algunas veces a agitacion. A continuacion, se realizo centrifugacion a 5.000 x g a 4°C durante 15 minutos para eliminar el sobrenadante. Se anadio un tampon Tris (pH 7,5) complementado con BSA al 0,5% (p/v) a partmulas de latex precipitadas de manera que se ajusto el volumen de partmulas de latex al volumen inicial. Se dispersaron las partmulas de latex de nuevo y se dejaron reposar a 4°C durante 16 horas. Se realizo centrifugacion de nuevo a 5.000 x g a 4°C durante 15 minutos para eliminar el sobrenadante. Se dispersaron partmulas de latex precipitadas en un tampon Tris (pH 7,5) hasta una concentracion final del 0,1% (p/v). Por tanto, se obtuvo un reactivo marcado con latex.
2. Produccion de un elemento impregnado con reactivo marcado con latex
Se corto papel de filtro de fibra de vidrio (Whatman) en un trozo con un tamano de 5 mm x 10 mm. Se anadio gota a gota al mismo el reactivo marcado con latex (5 |il) producido en 1 anteriormente, seguido por secado a 37°C durante 3 horas. Por tanto, se obtuvo un elemento 3 impregnado.
3. Montaje de un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral
Se uso un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral que tema una configuracion similar a la configuracion mostrada en la figura 1.
Como portador 2 de membrana, se uso una lamina de membrana de nitrocelulosa (Millipore) con un tamano de 5 mm (anchura) x 30 mm (longitud). Se uso un dispositivo de pulverizacion de presion positiva (BioJet; BioDot) para aplicar una disolucion de anticuerpo monoclonal anti-adenovirus derivado de lmea celular de hibridoma (5,0 mg/ml) (que difiere de la disolucion descrita en 1 anteriormente) que sirve como reactivo de captura al portador de manera que se formo una lmea 6 mm alejada del extremo del eje largo del portador (designado extremo aguas arriba, mientras que el extremo opuesto del mismo se designo extremo aguas abajo). Ademas, se aplico polietilenimina P70 al 1% (p/v) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) que sirve como reactivo de referencia al portador de manera que se formo una lmea 4 mm alejada de la lmea formada anteriormente en el lado aguas abajo. Despues de eso, se seco el portador en condiciones de 37°C durante 3 horas. Por tanto, se formaron una seccion 6 de presentacion visual de deteccion y una seccion 7 de presentacion visual de referencia.
A continuacion, se unio el portador 2 de membrana a la lamina 1 de soporte de plastico (BioDot) cortada para que tuviese una anchura de 5 mm de una manera tal que se unio a la misma la cara opuesta a la cara a la que se habfan aplicado los reactivos. (En tal caso, es necesario que la lamina 1 de soporte tenga una longitud excedente adecuada porque es necesario fijar por separado el elemento 3 impregnado anterior y el elemento 5 de absorcion de agua mencionado a continuacion en ambos extremos del portador 2 de membrana). Posteriormente, se unio el elemento 3 impregnado a la lamina 1 de soporte en el lado aguas arriba del portador 2 de membrana de una manera tal que el elemento 3 impregnado y el portador 2 de membrana se solapaban entre sf 1 mm. Entonces, se unio un trozo de papel de filtro (Advantec Toyo Kaisha Ltd.) con un tamano de 5 mm x 10 mm que sirve como elemento 4 de suministro de muestra a la lamina de soporte de una manera tal que el elemento 4 de suministro de muestra y el elemento 3 impregnado se solapaban entre sf 9 mm. Ademas, se unio papel de filtro grueso (Whatman) con un tamano de 5 mm x 30 mm que sirve como elemento 5 de absorcion de agua a la lamina 1 de soporte en el lado aguas abajo del portador 2 de membrana de una manera tal que el elemento 5 de absorcion de agua y el portador de membrana se solapaban entre sf 10 mm. Al final, se cortaron las partes innecesarias de la lamina de soporte que sobresalfan hacia fuera desde ambos extremos. Por tanto, se obtuvo el dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral mostrado en la figura 1.
4. Deteccion de antfgenos
Se uso un tampon Tris 50 mM (pH 8,0) que contema Triton X-100 al 1% (p/v) y clorhidrato de arginina al 2% (p/v) como revelador, y se realizo un experimento modelo usando un antfgeno CF de adenovirus (Denka Seiken Co., Ltd.) como analito. Se diluyo adecuadamente el antfgeno CF de adenovirus con un revelador usado como disolvente de dilucion. Por tanto, se preparo una muestra lfquida. Se anadio la muestra lfquida (100 |il) a un tubo de ensayo pequeno. Se inserto el dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral producido en 3 anteriormente en el tubo de ensayo de manera que se situo el elemento 4 de suministro de muestra (en el lado aguas arriba) hacia abajo. Se coloco el tubo de ensayo verticalmente en una rejilla y se permitio que reposara a temperatura ambiente. Ademas, para el control negativo, se realizo un experimento similar con el revelador solo (100 |il). En primer lugar, se permitio que la muestra lfquida penetrara en el elemento 4 de suministro de muestra. Entonces, se mezclo con un anticuerpo marcado con latex contenido en el elemento 3 impregnado y la mezcla permeo el portador 2 de membrana mediante
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accion capilar. Se permitio que la mezcla de la muestra Kquida y el anticuerpo marcado con latex que habfa permeado pasara a traves de la seccion 6 de presentacion visual de deteccion y la seccion 7 de presentacion visual de referencia en tal orden y finalmente se absorbio mediante el elemento 5 de absorcion de agua situado el mas proximo al extremo aguas abajo. Por tanto, se completo el procedimiento de reaccion. Tras un transcurso de tiempo suficiente para la formacion de la senal de lmea (20 minutos en este ejemplo), se observaron la presencia o ausencia de una lmea azul que aparece en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion y en la seccion 7 de presentacion visual de referencia sobre la membrana de nitrocelulosa y caractensticas de la lmea tales como anchura ytono de color.
Como resultado, se observaron lmeas azules claras en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion y en la seccion 7 de presentacion visual de referencia del dispositivo de prueba en el que habfa permeado la muestra lfquida, respectivamente. Fue posible confirmar senales positivas en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion con el uso de una disolucion que contema el antigeno CF de adenovirus anterior diluido hasta 1.000 veces. Mientras tanto, en el caso del dispositivo de prueba en el que habfa permeado el revelador solo (usado como control negativo), se observo una lmea azul mtida en la seccion 7 de presentacion visual de referencia, mientras que, por otro lado, no se presento visualmente ninguna lmea en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion. Por consiguiente, se confirmo que una seccion de presentacion visual de referencia formada permitiendo que un portador de membrana absorba una sustancia cationica y secando el portador tambien puede presentar visualmente una lmea intensamente coloreada y por tanto funcion suficiente como seccion de presentacion visual de referencia.
En este caso, el dispositivo de prueba usado en el ejemplo 1 es una tira inmunocromatografica que usa una reaccion de antigeno-anticuerpo. Tal tira inmunocromatografica puede incorporarse dentro de una carcasa de plastico y el producto resultante puede usarse como dispositivo inmunocromatografico.
Ejemplo comparativo 2: Produccion de un dispositivo de prueba de tipo de flujo transversal
1. Produccion de un anticuerpo marcado con coloide de oro
Se anadio gota a gota un anticuerpo monoclonal frente a virus influenza NP anti-tipo A o anti-tipo B (100 |ig/ml) (1 volumen) previamente dializado con una disolucion acuosa de borato de sodio 2 mM a una disolucion de coloide de oro (BBI; tamano de partmula: 40 nm; concentracion de acido cloroaurico: 0,01% (p/v)) (9 volumenes) ajustada a pH 5,5 con una disolucion acuosa de carbonato de potasio (concentracion final: 10 |ig/ml), seguido por agitacion lenta durante 5 minutos. Despues de eso, se anadio a lo mismo disolucion de BSA al 10% (p/v) (1 volumen), seguido por agitacion adicional durante 10 minutos. Posteriormente, se centrifugo el volumen total del resultante a 14.000 rpm a 4°C durante 30 minutos para eliminar el sobrenadante. Se anadieron BSA al 1% (p/v) y un tampon Tris 10 mM (pH 8,5) complementado con cloruro de sodio 150 mM a partmulas coloidales de oro precipitadas para su redispersion. Se diluyo la dispersion de manera que la absorbancia a 530 nm se hizo de 2,0. Al final, se mezclaron entre sf cantidades iguales de un anticuerpo anti-tipo A marcado con coloide de oro y un anticuerpo anti-tipo B marcado con coloide de oro producidos de la manera descrita anteriormente de manera que se obtuvo un anticuerpo anti-influenza.
2. Aplicacion de un reactivo a una membrana de nitrocelulosa
Se uso un dispositivo de prueba de tipo de flujo transversal que tema una configuracion similar a la configuracion mostrada en la figura 3.
Se corto una membrana de nitrocelulosa (diametro de poro: 3 |im; Toyo Roshi Kaisha, Ltd.) en un trozo con un tamano de 20 mm x 20 mm. Se uso el trozo como portador 10 de membrana permeable a los lfquidos. Suponiendo que se dibujo un cuadrado con un tamano de 10 mm x 10 mm en el centro de una membrana de nitrocelulosa de este tipo, se indicaron los puntos que correspondenan a las cuatro esquinas de un cuadrado de este tipo mediante “a”, “b”, “c” y “d” en el sentido de las agujas del reloj partiendo de una esquina arbitraria.
Los anticuerpos monoclonales frente a virus influenza NP anti-tipo A y anti-tipo B, cada uno de los cuales se habfa obtenido de una lmea celular de hibridoma distinta de la del anticuerpo descrito en 1 anteriormente, se dializaron por separado de antemano con un tampon fosfato 10 mM (pH 7,0) para ajustar la concentracion a 3 mg/ml.
Se anadieron gota a gota un anticuerpo monoclonal frente a virus influenza NP anti-tipo A y un anticuerpo monoclonal frente a virus influenza NP anti-tipo B en una cantidad de 1 |il a los puntos “a” y “b” sobre la membrana de nitrocelulosa, respectivamente. Por tanto, se formaron una seccion de presentacion visual de deteccion de tipo A “a” y una seccion de presentacion visual de deteccion de tipo B “b”. Posteriormente, se anadio gota a gota polietilenimina P-70 al 1% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (1 |il) al punto “c” de manera que se formo una seccion de presentacion visual de referencia “c”. No se anadio anticuerpo al punto “d” restante, y el punto “d” se designo como blanco y se uso como marca para distinguir las ubicaciones de los puntos “a”, “b” y “c” tras la finalizacion de la prueba. (Alternativamente, es posible realizar una marca pequena en el punto “d” con un lapiz o similar).
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Se seco la membrana de nitrocelulosa sobre la que se habfan anadido los reactivos gota a gota a 37°C durante 3 horas.
3. Montaje de un dispositivo de prueba de tipo de flujo transversal
Se coloco un lecho 9 absorbente de agua de celulosa (Vessel Inc.) con un tamano mayor que el tamano del portador 10 de membrana anterior (20 mm x 20 mm) en una placa 8 Petri de plastico con un diametro de 35 mm. Ademas, se situo el portador 10 de membrana sobre el lecho 9 absorbente de agua de manera que pudiera observarse la cara sobre la que se habfa anadido el reactivo gota a gota (superficie superior). Por tanto, se obtuvo un dispositivo inmunocromatografico de tipo de flujo transversal.
4. Deteccion de antfgenos
Se uso como diluyente de analito tampon fosfato 10 mM (pH 7,4) que contema BSA al 5% (p/v), Triton X-100 al 5% (p/v) y gelatina al 2% (p/v). Se uso como analito positivo un virus influenza de tipo A o un virus influenza de tipo B, que se habfa diluido adecuadamente. Se uso el diluyente de analito anterior como analito negativo.
Se mezclo el anticuerpo anti-influenza marcado con coloide de oro obtenido en 1 anteriormente con cada analito diluido con el diluyente de analito anterior a una razon de 1:4. Se anadio cada resultante (1 ml) gota a gota sobre una membrana de nitrocelulosa del dispositivo de prueba obtenido en 3 anteriormente. Se realizo la adicion gota a gota lenta y gradualmente y se dejo que el portador 10 de membrana reposara a temperatura ambiente hasta que no se observo lfquido sobre el mismo. Entonces, se determino la presencia o ausencia de manchas rojas derivadas de coloide de oro.
Como resultado, se detecto el virus influenza de tipo A hasta 105 ufp/ml en la seccion de presentacion visual de deteccion de tipo A “a”, y esta seccion dio resultados negativos para el virus influenza de tipo B. El virus influenza de tipo B se detecto hasta 105 ufp/ml en la seccion de presentacion visual de deteccion de tipo B “b”, y esta seccion dio resultados negativos para el virus influenza de tipo A. Mientras tanto, en el caso de la seccion de presentacion visual de referencia “c”, se formo una mancha intensamente coloreada en cualquier caso independientemente de la concentracion o el tipo de analito, y por tanto se confirmo una funcion suficiente de la seccion como seccion de presentacion visual de referencia.
Ejemplo 3: Comparacion y examen de reactivos de presentacion visual de referencia
1. Produccion de dispositivos de prueba de tipo de flujo lateral
Se produjeron dispositivos de prueba de tipo de flujo lateral usando los siguientes 7 tipos de reactivos como reactivos candidatos usados para secciones de presentacion visual de referencia de la manera descrita en el ejemplo 1.
(1) anticuerpo de conejo anti-inmunoglobulina de raton 3,0 mg/ml (Dako): Un metodo convencional
(2) polietilenimina P-70 al 1% (p/v) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): Una sustancia cationica
(3) polialilamina HCl-10S al 1% (p/v) (Nitto Boseki Co., Ltd.): Una sustancia cationica
(4) carboximetilcelulosa al 1% (p/v) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): Una sustancia anionica
(5) sericina al 1% (p/v) (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha): Una sustancia anionica
(6) polietilenglicol al 1% (p/v) (Nacalai Tesque, Inc.): Una sustancia no ionica
(7) poli(alcohol vimlico) al 1% (p/v) (Nacalai Tesque, Inc.): Una sustancia no ionica
2. Metodo de prueba
Como en el ejemplo 1, se uso como revelador un tampon Tris 50 mM (pH 8,0) que contema Triton X-100 al 1% (p/v) y clorhidrato de arginina al 2% (p/v) y se uso como analito un antfgeno CF de adenovirus (Denka Seiken Co., Ltd.). Se uso un revelador como un disolvente de dilucion para la dilucion adecuada del antfgeno CF de adenovirus. Se designo el analito diluido 100 veces como analito fuertemente positivo. Se designo el analito diluido 500 veces como analito debilmente positivo. Por tanto, se prepararon muestras lfquidas. Se realizo una prueba de la manera descrita en el ejemplo 1. Se observaron la presencia o ausencia de una lmea azul que apareda en la seccion 7 de presentacion visual de referencia de cada dispositivo de prueba y caractensticas de la lmea tales como anchura y color.
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3. Resultados y discusion
Se examinaron los dispositivos de prueba para los que se habfan usado diferentes reactivos en las respectivas secciones 7 de presentacion visual de referencia basandose en comparaciones relacionadas con la formacion de una lmea en la seccion 7 de presentacion visual de referencia, la duracion de la aparicion de una lmea de este tipo y la influencia de una lmea de este tipo tras aparecer una lmea en la seccion 6 de presentacion visual de deteccion (tabla 1). Como resultado de la comparacion de la lmea observada en el caso de un metodo convencional de (1) con otras lmeas, particularmente en los casos de (2) y (3), la lmea derivada de sustancia cationica presentaba un tono de color mas oscuro y mas mtido que el observado en el caso de un metodo convencional de (l). Ademas, la duracion de la aparicion de la lmea fue mas corta que en el caso de (1). En los otros casos que implican el uso de reactivos de referencia que comprenden cada uno una sustancia anionica o una sustancia no ionica, no se formo ninguna lmea, y las secciones 7 de presentacion visual de referencia relevantes no funcionaron apropiadamente. La sericina usada en (5) es una protema que comprende residuos de aminoacido cationicos. Sin embargo, la molecula de protema en su totalidad esta cargada negativamente. Por tanto, se cree que la sericina no funciono como reactivo de presentacion visual de referencia en el caso anterior. Ademas, cuando se uso cualquiera de los reactivos de presentacion visual de referencia anteriores, no se confirmo la influencia sobre la lmea de deteccion correspondiente, independientemente de la concentracion de antfgeno en la muestra relevante. Probablemente, esto es porque la seccion 7 de presentacion visual de referencia estaba ubicada aguas abajo de la seccion 6 de presentacion visual de deteccion.
[Tabla 1]
Reactivo de presentacion visual de referencia
Intensidad de lmea de deteccion (analito fuertemente positivo) Intensidad de lmea de deteccion (analito debilmente positivo) Intensidad de lmea de referencia Tiempo de aparicion de la lmea de referencia (valor medio de 3 resultados de medicion) Caractensticas de la lmea de referencia
(1)
+ + + + + + 25 (s)
(2)
+ + + + + + + 20 Lmea fina con tono de color oscuro
(3)
+ + + + + + + 15 Lmea gruesa con tono de color oscuro
(4)
+ + + + - -
(5)
+ + + + - -
(6)
+ + + + - -
J7__________
+ + + + - -
-: Negativo
+: Debilmente positivo (detectable como positivo incluso con tono de color claro y falta de nitidez de la lmea) ++: Positivo (claramente positivo)
+++: Fuertemente positivo (claramente positivo con tono de color particularmente oscuro)

Claims (1)

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    30
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    REIVINDICACIONES
    Un dispositivo de prueba para ensayo de membrana que usa una reaccion de union espedfica de una sustancia que va a detectarse con un reactivo de captura inmovilizado sobre un portador de membrana y un reactivo marcado con una sustancia de marcaje, siendo el reactivo una sustancia anionica o un anfolito que esta cargado negativamente bajo condiciones basicas, que comprende una seccion de presentacion visual de referencia para indicar la finalizacion apropiada de la prueba sobre la que se ha inmovilizado un polfmero cationico para capturar un reactivo marcado,
    en el que el polfmero cationico es un compuesto de pohmero que tiene una densidad de carga cationica de 0,4 meq/g a 21 meq/g, y un peso molecular promedio de 300 a 5.000.000,
    en el que el pohmero cationico es polialilamina,
    en el que el dispositivo de prueba es un dispositivo de prueba de tipo de flujo lateral,
    y en el que la seccion de presentacion visual de referencia para indicar la finalizacion apropiada de la prueba esta configurada de manera que esta situada aguas abajo de una seccion de presentacion visual de deteccion sobre la que se ha inmovilizado un reactivo de captura.
    El dispositivo de prueba segun la reivindicacion 1, en el que la seccion de presentacion visual de referencia esta configurada para permitir que el portador de membrana absorba el polfmero cationico y seque la membrana.
    El dispositivo de prueba segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la reaccion de union espedfica es una reaccion de antfgeno-anticuerpo.
    Un metodo para confirmar la finalizacion apropiada de una prueba para ensayo de membrana que usa el dispositivo de prueba segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, usando el metodo una reaccion de union espedfica de una sustancia que va a detectarse con el reactivo de captura inmovilizado sobre el portador de membrana y el reactivo marcado con la sustancia de marcaje, mediante lo cual puede confirmarse la finalizacion apropiada de la prueba cuando se detecta el marcaje del reactivo marcado en la seccion de presentacion visual de referencia sobre la membrana, permitiendo que el reactivo marcado se una al polfmero cationico inmovilizado en la seccion de presentacion visual de referencia.
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