JPH04353764A - クロマトグラフィー用試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は診断薬の反応が終了した
ことを確認する方法に関する。更に本発明はその診断薬
の反応終了の確認方法を利用した試験具に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、各種疾病の診断等に特異的蛋白質
の検出が行われているが、特異的蛋白質の検出方法とし
ては免疫学的抗原抗体反応を応用した検出法が最も汎用
されている。これは抗体が特異的に抗原物質を認識し結
合するという性質を利用するもので、抗原となる特異的
蛋白質を認識する抗体を作成し、これを用いて被検試料
中の特異的蛋白質と抗原抗体反応させ、その結果をたと
えば凝集反応等の二次的な現象や標識を用いて検出する
ものである。この様な検出法は、更にその検出する程度
に従い、定性的検出法と定量的検出法に大別される。定
性的検出法というのはある一定量以上の蛋白質の有無を
発色等簡便な方法で検知する方法であり、一般には臨床
用の診断薬等に応用される。

【０００３】標識イムノアッセイ法というのは、抗原あ
るいは抗体を酵素や高感度の放射性同位体などで標識し
、抗原あるいは抗体を直接的に測定しようとするもので
あり、元々は標識を元に定量化する所謂定量的検出法で
あるが、非常に感度が良いことから、簡便な定性的検出
法としても応用されている。このような標識イムノアッ
セイ法を応用した定性的検出法としては、標識として酵
素を用いるエンザイムイムノアッセイ法を応用した検出
法があり、また、標識イムノアッセイ法の直接０検出法
を応用したものとして、検出物質としてコロイド状金属
粒子（金属コロイド粒子）を使用した検出法がある。

【０００４】エンザイムイムノアッセイ法には種々の測
定方法があるが、最も実用的なものとしてサンドイッチ
法がある。これは、抗原に特異的な抗体を２種類用意し
、一方を固相に結合せしめ、他方を標識となる酵素に結
合し複合体を得ておき、まず、抗体を結合せしめた固相
に被検試料液を加え、よく洗浄して未反応物質を除去し
た後、酵素−抗体複合体を反応させて、固相表面上に抗
体−抗原蛋白質複合体なるサンドイッチ状の結合物を生
成させ、次に余剰の複合体を完全に除去した後、固相表
面上に結合した複合体の酵素活性を測定するもので、こ
れを簡便な定性的検出法として応用したものとしては、
抗体を結合せしめた固相に酵素−抗体複合体を含む被検
試料液を加えて反応させ、固相表面上に抗体−抗原蛋白
質複合体を生成させるものや、抗体を結合せしめた固相
に、酵素−抗体複合体を含ませた濾過膜を介して被検試
料液（濾過膜から酵素−抗体複合体が遊離されて被検試
料液中に含まれる）を加えて反応させ、固相表面上に抗
体−抗原蛋白質複合体を生成させるものなどがあり、抗
体−抗原蛋白質複合体が生成したことを証明するために
オルトフェニレンジアミンなどの発色試薬を利用してい
る。

【０００５】検出物質として金属コロイド粒子を使用し
た検出法は、エンザイムイムノアッセイ法の酵素の代わ
りに金属コロイド粒子を使用したものである。金属コロ
イド粒子はそれぞれの物理的性質から独自の色調を帯び
ており、これにより、抗原抗体反応の結果を直接的に可
視的に表示することができる。金属コロイド粒子は金属
、金属化合物、高分子核であって金属または金属化合物
によって被覆されたもののコロイド状分散物であり、粒
子寸法は１０〜１００ｎｍである。金属コロイド粒子の
例としては、白金、金、銀、銅などの金属、ヨウ化銀、
臭化銀、銅水和酸化物、酸化鉄、鉄水酸化物または水和
酸化物、アルミニウム水酸化物または水和酸化物、クロ
ム水酸化物または水和酸化物、バナジウム酸化物、硫化
砒素、水酸化マグネシウム、硫化鉛、硫化水銀、硫酸バ
リウム、二酸化チタン等の金属化合物を挙げることがで
きる。

【０００６】金属コロイド粒子の代表例として、コロイ
ド状金粒子（以下金コロイドという）がある。これは四
塩化金酸をある特定の条件下でコロイド状にしたもので
、金コロイドの粒子径に従いピンク色から赤紫色に着色
する。この金コロイドと蛋白質をある条件下におくと非
共有的、静電的的吸着によって結合し、安定したコンジ
ュゲートを形成する。そして金属コロイド粒子は化学修
飾を要しない結合であるため、蛋白質の変性は起こらず
、また生理活性の低下も見られないという特徴を有する
。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、金属コ
ロイド粒子や酵素を利用した試験具は簡便であるが、陰
性の場合フィルム上の変化が起こらないため、反応が終
了したことの確認が難しく、また、一般的な方法として
判定面と別な位置に予め抗原を付着させておく方法があ
るが、この方法では抗原によっては劣化により反応が起
こらなくなることがあり問題であった。また金属コロイ
ド粒子を利用したクロマトグラフィー用試験具の場合は
、反応の終了（展開の終了）が判定しにくいため、この
ことを確認するために例えば判定面より上部すなわち展
開溶液が上昇してゆく上端部分に抗原を付着させている
が、抗原によっては劣化により反応しなくなっているも
のもあり、従って展開の終了が確認できないことがあり
問題であった。本発明は如上の事情に鑑みて成されたも
ので、診断薬の反応が終了したことを容易かつ確実に確
認する方法を提供することを目的とする。また、本発明
は診断薬の反応終了を容易かつ確実に確認できる試験具
を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は上記の課題を解
決するために、金属コロイドや酵素を利用した抗原の検
出法において、水に濡れたときに発色する発色剤を反応
層上で濡らして発色させることを特徴とする診断薬の反
応終了の確認方法を採用している（第１の発明）。また
前記方法の具体的例として、反応層に水に濡れて発色す
る発色剤を塗布してなる金属コロイドまたは酵素を利用
した試験具（第２の発明）、および、展開層の判定面の
上部に水に濡れて発色する発色剤を塗布してなる金属コ
ロイドを利用したクロマトグラフィー用試験具（第３の
発明）を採用している。尚、本発明において「発色剤を
塗布する」とは、発色剤を含浸させることを含む。また
「発色」とは変色を含む。

【０００９】

【作用】上記の構成によれば、第２の発明の場合には（
図　　）、被検試料液を反応層に滴下したとき、被検試
料液中に抗原がある場合には、抗原は例えば金属コロイ
ド粒子付着抗体および反応層上の抗体と反応して、金属
コロイド粒子付着抗体−抗原−抗体複合体が生成され発
色するのに対して、被検試料液中に抗原がない場合には
、前記の複合体は生成されないので発色しない。一方同
時に、被検試料液中の水が発色剤を発色させるので、陰
性・陽性にかかわらず確実にしかも容易に反応の終了が
確認できる。また、第３の発明の場合には（図）、被検
試料液を展開層の原点にスポットすると、被検試料液中
に抗原がある場合には、被検試料液中の抗原と展開層上
の金属コロイド粒子が展開層上の抗体の方向に移動し、
これらが反応して金属コロイド粒子付着抗体−抗原−抗
体複合体が生成され発色するのに対して、被検試料液中
に抗原がない場合には、前記の複合体は生成されないの
で発色しない。一方被検試料液中の水は展開層の上部ま
で移動し塗布されている発色剤を濡らしてこれを発色さ
せるので、陰性・陽性にかかわらず確実にしかも容易に
反応の終了が確認できる。

【００１０】

【実施例】次に本発明の実施例に付いて説明する。図１
〜３は本発明の金属コロイド粒子を利用した試験具を用
いた場合の反応機序を示す説明図であり、図１は被検試
料液に金属コロイド粒子を含む場合、図２は膜濾過法を
利用する場合、図３はクロマトグラフィー用試験具の場
合を示す。また、図４〜６はそれぞれ図１〜３に対応す
る従来の試験具を用いた場合の反応機序を示す説明図で
ある。図４〜６の反応機序から分かるように、従来の試
験具では陰性の場合に反応の終了が確認できないのに対
して、本発明の試験具では、陰性の場合にも発色剤の発
色により反応層あるいは展開層に被検試料液が達したこ
と即ち反応が終了したことが確認できる。

【００１１】本発明において使用される発色剤としては
、水に濡れた時に発色するもののうち、試験具の抗体と
反応しないものが選択されるが（クロマトグラフィー用
試験具の場合、発色剤を塗布する位置が抗体の塗布位置
より上部なので、抗体と反応するものでも構わない）、
一般に、診断で用いられる被検試料液が血液や尿などで
あり、これら試料のｐＨが性別や年令、健康状態によっ
て多少異なるものの、通常、血液のｐＨが７．２　〜７
．４　、尿のｐＨが４．６　〜８．０　であることから
、ｐＨ４．６　〜８．０　で必ず発色または変色する発
色剤が好適に使用される。この様な発色剤としては、た
とえばブロモクレゾールグリーン（ｐＨ３．８　以下の
酸性では黄色、ｐＨが５．４　を越えると鮮やかな青色
になる）や　２．５ジニトロフェノール（ｐＨ５．８　
を越えると黄色になる）、ブロモフェノールブルー（ｐ
Ｈ３．０　以下で淡黄色、ｐＨ４．６　を越えると赤紫
色〜青色になる。ｐＨが大きいほど変色が速い）などが
使用される。

【００１２】〔実施例１〕金属コロイド粒子を利用した
試験具の例 ブロモクレゾールグリーンをエタノール（９５％）で溶
解し、ついで水で３〜４倍に稀釈して発色剤溶液を調製
し、これを試験紙（濾紙に抗原を塗布したもの）の上に
塗布して乾燥し、試験具を作成した。この試験具の上に
金コロイド付着抗体を含む被検試料液（尿成分を含む）
を滴下したところ、鮮やかな青色に発色し、やがて試験
紙の中央付近に紫色のスポットが認められた。青色によ
り被検試料液が反応層に達したことを、紫色のスポット
により陽性が確認される。

【００１３】〔実施例２〕金属コロイド粒子を利用した
クロマトグラフィー用試験具の例 ブロモクレゾールグリーンをエタノール（９５％）で溶
解し、ついで水で３〜４倍に稀釈して発色剤溶液を調製
し、これを試験紙（図３に示すように濾紙の下部と中央
部に金コロイド付着抗体と抗体を塗布したもの）の上部
に塗布して乾燥し、試験具を作成した。この試験具の下
端部を被検試料液（尿成分を含む）に浸したところ、試
験紙の中央部には発色が見られなかったが、試験紙の上
部が鮮やかな青色に発色した。無発色により陰性が、青
色により被検試料液が展開層に達したことが確認される
。

【００１４】

【発明の効果】以上説明してきたことから明らかなよう
に、本発明の方法を採用することにより、短時間でかつ
容易に反応の終了を確認することができるので、時間の
節約になる。また被検試料液の反応層への到着、不到着
を発色の有無で確認できるので、陽性を陰性と診断する
ような判定ミスが少なくなる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の金属コロイド粒子を利用した試験具を
用いた場合の反応機序を示す説明図であり、被検試料液
に金属コロイド粒子を含む場合を示す。

【図２】本発明の金属コロイド粒子を利用した試験具を
用いた場合の反応機序を示す説明図であり、膜濾過法を
利用する場合を示す。

【図３】本発明の金属コロイド粒子を利用した試験具を
用いた場合の反応機序を示す説明図であり、クロマトグ
ラフィー用試験具の場合を示す。

【図４】図１に対応する従来の試験具を用いた場合の反
応機序を示す説明図である。

【図５】図２に対応する従来の試験具を用いた場合の反
応機序を示す説明図である。

【図６】図３に対応する従来の試験具を用いた場合の反
応機序を示す説明図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　金属コロイドや酵素を利用した抗原の
   検出法において、水に濡れたときに発色する発色剤を反
   応層上で濡らして発色させることを特徴とする診断薬の
   反応終了の確認方法。
2. 【請求項２】　　反応層に水に濡れて発色する発色剤を
   塗布してなる金属コロイドまたは酵素を利用した試験具
   。
3. 【請求項３】　　展開層の判定面の上部に水に濡れて発
   色する発色剤を塗布してなる金属コロイドを利用したク
   ロマトグラフィー用試験具
4. 【請求項４】　　発色剤がブロモクレゾールグリーン、
   ２．５　ジニトロフェノール、ブロモフェノールブルー
   の群から選ばれる少なくとも１つである請求項２または
   ３に記載の試験具。