JPWO2010021372A1 - 対照表示部を備えたメンブレンアッセイによる試験装置 - Google Patents

Abstract

素早く明確に表示し、より正確且つ安定した、試験が正確に実施されたことを示す対照表示部を備えた試験装置の提供。膜担体上に固定した捕捉試薬と被検出物質と標識物質で標識した標識試薬の特異的結合反応を利用したメンブレンアッセイによる試験装置であって、標識試薬を捕捉するための陽イオン性ポリマーが固定された、試験が正確に実施されたことを示す対照表示部を有することを特徴とする試験装置。

Description

本発明は、特異的結合反応を利用したメンブレンアッセイによる試験装置に関する。

近年、臨床診断や、環境分析、食品衛生管理等を中心とした様々な分野の試験において、使用者の熟練や手間をほとんど必要としない特異的結合反応を測定原理として利用した試験装置が普及してきている。特異的結合反応を測定原理として利用した試験装置は様々なタイプがあるが、その中でもメンブレンアッセイによる試験装置としてラテラルフロータイプとフロースルータイプが普及している。

一般的なラテラルフロータイプの試験装置は、液体が毛管現象で移動することができる多孔性膜担体を含むストリップ様の形態である。膜担体の一部分には被検出物質に特異的に結合する物質（捕捉試薬）が固定化された検出表示部が設けてある。またストリップの膜担体より上流側にはペルオキシダーゼ等の酵素又は金コロイド等の着色粒子からなる標識体で標識された被検出物質に特異的に結合する物質（標識試薬）が毛管作用により膜担体内に移動可能な状態で配置して構成されている。例えば特異的結合反応が被検出物質を抗原とした抗原抗体反応の場合、捕捉試薬は被検出物質に特異的に結合する抗体、標識試薬は被検出物質に特異的に結合する標識抗体を用いる。ストリップの上流側にある標識試薬の配置場所に液体試料を供給すると、液体試料は標識試薬と接触し、該標識試薬は溶解又は分散される。液体試料中に被検出物質が存在する場合には、溶解又は分散した標識試薬と結合し「標識試薬−被検出物質」複合体を形成する。「標識試薬−被検出物質」複合体はさらにストリップの下流側に移動して、検出表示部に到達する。検出表示部において、「標識試薬−被検出物質」複合体は検出表示部の捕捉試薬に捕捉され、「標識試薬−被検出物質−捕捉試薬」のサンドイッチ複合体を形成する。そして、検出表示部でサンドイッチ複合体を形成している標識試薬の標識体を目視、発色等の任意の方法で検出し、被検出物質の有無を判定する（特許文献１から４を参照）。

また、一般的なフロースルータイプの試験装置の形態は、液体が通過できる多孔性膜担体の上面の一部分には被検出物質に特異的に結合する物質（捕捉試薬）が固定化された検出表示部が設けてあり、膜担体の下面には吸水手段を設置して構成される。例えば特異的結合反応が被検出物質を抗原とした抗原抗体反応の場合、膜担体の上面の一部分には捕捉試薬として被検出物質に特異的に結合する抗体が固定化されている。膜担体の上面に液体試料を供給すると、液体試料は膜担体を通過して吸水手段により吸収される。その時、試料中に被検出物質が存在する場合には、被検出物質は膜担体上面の検出表示部に固定化された捕捉試薬に捕捉され、検出表示部において「被検出物質−捕捉試薬」複合体が形成される。次に、膜担体の上面にペルオキシターゼ等の酵素又は金属コロイド等の着色粒子からなる標識体で標識した、被検出物質に特異的に結合する抗体（標識試薬）を供給し、検出表示部に捕捉された被検出物質と結合させ、検出表示部に「標識試薬−被検出物質−捕捉試薬」のサンドイッチ複合体を形成させる。そして、検出表示部でサンドイッチ複合体を形成している標識試薬の標識体を目視、発色等の任意の方法で検出し、被検出物質の有無を判定する（特許文献５から７を参照）。

これらの試験装置では、試験が正確に実施されたことを試験者に示す対照試験の結果を表示する対照表示部を設けている。この対照表示部は試料中に被検出物質が存在しない場合、検出表示部に標識体が検出されなくとも、試料及び標識試薬が膜担体を通過した事を表示するものである。例えば、検出表示部に被検出物質が検出されない場合、対照表示部において試料及び標識試薬が膜担体を通過したことの確認ができれば、試験が正確に実施された証明になる。逆に対照表示部において試料及び標識試薬が膜担体又はストリップを通過したことの確認ができなければ、試料又は標識試薬が何らかの原因で不備があったと考えられ、試験が正確に実施されなかった事を示す。従って、その試験結果は無効とし再試験する。

対照表示部の多くは標識試薬に対する抗原抗体反応を利用したものが多く用いられていた。例えば、被検出物質と同一物質、又は標識試薬への免疫学的特異反応性が被検出物質と同一な物質を膜担体上の対照表示部に固定化する（特許文献８を参照）。しかし、抗原抗体反応による対照試験は、試料中に含まれる抗原の量や、夾雑物の種類、pH、その他の要因に影響されやすい事から、対照表示部の表示が鈍く明確に表示されない場合もあった。従って、より安定した対照表示部を設けた試験装置が望まれている。

標識試薬に対する抗原抗体反応以外を利用した対照表示部として、発色剤又は指示薬を利用した発明がある。例えば、ラテラルフロータイプの試験装置に、ブロモクレゾールグリーン、２，５ジニトロフェノール、ブロムフェノールブルーを用いた発色剤を濾紙に吸収、乾燥させて反応終了を表示するよう構成した対照表示部を設けているものがある（特許文献９を参照）。これらの発色剤は水に濡れたときに発色するため、反応の終了を表示するものである。しかしながら、この方法は試料のpHにより発色剤が正常に発色しない場合や、また発色剤が正常に発色しても液状の試料の通過に伴って試料と共に流失する場合がある。従って、安定した対照試験を実施できない。また、ラテラルフロータイプの試験装置に、指示薬としてペンゾパープリン４Ｂ或いはコンゴーレッドを用いた直接染料を濾紙に吸収させて染色することにより反応終了を表示するよう構成した対照試験を設けているものがある（特許文献１０を参照）。しかし、この方法は指示薬を保持するために濾紙を用いているため、濾紙を試験装置に組み込む必要があり、試験装置の構成部品が多くなり、組立が面倒となっている。さらに、上記の特許文献９及び１０に記載の発明の問題点を考慮し、ラテラルフロータイプの試験装置の膜担体に、酸含有の低級アルコール溶液に溶解したエオシンＢ、エオシンＹ、フロキシンＢ、ブロムフェノールブルーのうちの少なくとも一種を用いた酸性染料からなる指示薬を吸収させて乾燥することにより反応の終了を表示するよう構成した対照試験を設けているものもある（特許文献１１を参照）。しかし、これら一連の発色剤又は指示薬を利用した対照試験は液体試料が正確に膜担体を通過し、反応が終了したことを確認できるが、標識試薬が正確に膜担体を通過したことの証明には成り得ない。
特公平７−７８５０３号公報 特公平７−３６０１７号公報 特公平６−２７７３８号公報 特開平１−２４４３７０号公報 特公平７−３４０１６号公報 特公平７−１１３６３７号公報 特開平３−１１８４７３号公報 特開２００７−３３３４２６号公報 特開平４−３５３７６４号公報 特許第２９４２０８７号公報 特許第３３８５３７７号公報

従来の特異的結合反応を利用したメンブレンアッセイによる試験装置の対照表示部の多くは標識抗体の抗原抗体反応を利用していた。抗原抗体反応は、試料中に含まれる抗原の量や夾雑物の種類、pH、その他の要因に影響を受けやすい事から、対照表示部の表示が鈍く明確に表示されない場合もあった。また、発色剤や指示薬を利用した対照表示部は標識抗体が正確に膜担体を通過したことの証明には成り得なかった。本発明は従来の問題点を考慮してなされたものであり、素早く明確に表示し、より正確且つ安定した、試験が正確に実施されたことを示す対照表示部を備えた試験装置を提供することを目的とする。

本発明者等は前記課題を克服する手段を鋭意検討した結果、特異的結合反応を利用したメンブレンアッセイにおいて、対照表示部に陽イオン性物質を用いることにより、対照試験を素早く明確に表示し、より安定した対照試験を実施する事ができることを見出し本発明に至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。

[１] 膜担体上に固定した捕捉試薬と被検出物質と標識物質で標識した標識試薬の特異的結合反応を利用したメンブレンアッセイによる試験装置であって、標識試薬を捕捉するための陽イオン性ポリマーが固定された、試験が正確に実施されたことを示す対照表示部を有することを特徴とする試験装置。

[２] 対照表示部が陽イオン性ポリマーを膜担体に吸収させて乾燥することにより構成されていることを特徴とする[１]の試験装置。

[３] 特異的結合反応が抗原抗体反応であることを特徴とする[１]又は[２]の試験装置。

[４] 陽イオン性ポリマーは、主鎖又は側鎖にアミノ基又はイミノ基を有する高分子化合物であって、0.4meq/g〜21meq/gの陽イオン電荷密度を有し、300〜5,000,000の平均分子量を有することを特徴とする[１]〜[３]のいずれかに記載の試験装置。

[５] 陽イオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン若しくはポリアリルアミン又はそれらの誘導体であることを特徴とする[１]〜[４]のいずれかの試験装置。

[６] ラテラルフロータイプであることを特徴とする[１]〜[５]のいずれかの試験装置。

[７] 試験が正確に実施されたことを示す対照表示部が、捕捉試薬が固定された検出表示部の下流に配置するように構成されていることを特徴とする[６]の試験装置。

[８] フロースルータイプであることを特徴とする[１]〜[５]のいずれかの試験装置。

[９] 試験が正確に実施されたことを示す対照表示部が捕捉試薬が固定された検出表示部と同じ平面上に配置するように構成されていることを特徴とする[８]の試験装置。

[１０] 膜担体上に固定した捕捉試薬と被検出物質と標識物質で標識した標識試薬の特異的結合反応を利用したメンブレンアッセイによる試験において、試験が正確に実施されたことを確認する方法であって、メンブレン上の対照表示部に固定化した陽イオン性ポリマーに標識試薬を結合させて対照表示部において標識試薬の標識が検出される場合に、試験が正確に実施されたと確認し得る方法。

[１１] 特異的結合反応が抗原抗体反応であることを特徴とする[１０]の方法。

[１２] 陽イオン性ポリマーは、主鎖又は側鎖にアミノ基又はイミノ基を有する高分子化合物であって、0.4meq/g〜21meq/gの陽イオン電荷密度を有し、300〜5,000,000の平均分子量を有することを特徴とする[１０]又は[１１]の方法。

[１３] 陽イオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン若しくはポリアリルアミン又はそれらの誘導体であることを特徴とする[１０]〜[１２]のいずれかの方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-214226号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

本発明により、試料中に含まれる抗原の量や、夾雑物の種類、pH、その他の要因に影響を受け難く、さらに対照試験の結果を素早く明確に表示することができる。よって従来法と比較して、より正確且つ安定した対照表示部を備えた試験装置を提供することができる。

また、陽イオン性物質に安価なポリエチレンイミン若しくはポリアリルアミンを使用することにより、従来法と比較して、より素早く明確な表示をする対照表示部を設け且つ製造しやすい試験装置を提供することができる。

本発明の一実施態様であるラテラルフロー方式検査キットの上面図及び切断断面図である。 本発明の一実施態様であるフロースルー方式検査キット（その１）の上面図及び切断断面図である。 本発明の一実施態様であるフロースルー方式検査キット（その２）の上面図及び切断断面図である。

１．バッキングシート
２．膜担体
３．含浸部材
４．試料供給用部材
５．吸水用部材
６．検出表示部
７．対照表示部
８．プラスチックシャーレ
９．吸水パッド
１０．膜担体
１１．検出表示部
１２．対照表示部
ａ．Ａ型検出表示部
ｂ．Ｂ型検出表示部
ｃ．対照表示部

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は被検出物質との特異的結合反応を測定原理として利用したメンブレンアッセイによる試験装置において、膜担体であるメンブレン上の対照表示部に陽イオン性物質を用いることを特徴とする試験装置である。試験装置には被検出物質に特異的に結合する捕捉試薬及び被検出物質に特異的に結合し且つ標識物質により標識された標識試薬を有している。被検出物質は試験装置の検出表示部に配置された捕捉試薬と標識試薬により「標識試薬−被検出物質−捕捉試薬」のサンドイッチ複合体を形成する。さらに試験装置には対照表示部が設けてあり、試験が正確に実施されて終了したことを試験者に示す。試験者は対照表示部を観察することにより、試験が正確に実施されて終了したことを確認することができる。対照表示部を反応終了表示部やバリデーション部ということもある。本発明における、「特異的結合」とは、二つの物質間に起こる選択的な反応性をいい、例としては、抗原抗体反応のような免疫学的な特異反応や受容体とそのリガンドとの反応などの特異的反応や特異的結合を意味する。前記試験装置はフロースルー方式の試験装置もラテラルフロー方式の試験装置も含む。フロースルー方式においては、検体が前記メンブレンを横切るように通過し、ラテラルフロー方式においては、検体がメンブレンに沿って展開移動する。「メンブレンアッセイ」とはメンブレン状の支持体を用いて該支持体上で反応の少なくとも一部を進行させ、支持体上で上記の特異的結合が起こるアッセイをいう。

本発明における被検出物質の例としては、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ノロウイルス、ロタウイルス、パルボウイルス、等のウイルス若しくはそれらの構成部分又はそれらに対する抗体、大腸菌、サルモネラ、ブドウ球菌、カンピロバクター、ウェルシュ菌、腸炎ビブリオ菌、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、炭疽菌、ＭＲＳＡ等の細菌若しくはそれらの構成部分又はそれらに対する抗体、マイコプラズマ脂質、ヒトトランスフェリン、ヒトアルブミン、ヒト免疫グロブリン、マイクログロブリン、ＣＲＰ、トロポニン、β−グルカン、ＲＦ若しくはそれらの構成部分又はそれらに対する抗体、あるいは、ヒト繊毛性ゴナドトロピン等のペプチドホルモン又はそれらに対する抗体、ステロイドホルモン等のステロイド又はそれらに対する抗体、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類又はそれらに対する抗体、ビタミンＢ類等のビタミン類又はそれらに対する抗体、プロスタングランジン類又はそれらに対する抗体、テトラサイクリン等の抗生物質又はそれらに対する抗体、細菌等が産生する毒素又はそれらに対する抗体、各種腫瘍マーカー又はそれらに対する抗体、農薬又はそれらに対する抗体、又は、病原微生物に由来する核酸配列に相補的なポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド等を挙げることができるが、これらに限定されない。

補足試薬とはメンブレン上に固相化され上記の被検出物質と結合し該被検出物質を捕捉する試薬をいい、被検出物質が抗原の場合はその抗原に対する抗体を用い、被検出物質が抗体の場合はその抗体が結合する抗原を用いればよい。また、リガンド-レセプターの関係を有する物質において、一方が被検出物質となり、もう一方が補足試薬となる。さらに、被検出物質が核酸の場合、その核酸の配列に相補的な配列を有しハイブリダイズし得る核酸を補足試薬として用いることができる。

本発明において標識試薬とは、被検出物質に特異的に結合する物質と、適当な標識体を結合させた結合体である。被検出物質に特異的に結合する物質としては、被検出物質が抗原の場合はその抗原に対する抗体を用い、被検出物質が抗体の場合はその抗体が結合する抗原を用いればよい。リガンド-レセプターの関係を有する物質において、一方が被検出物質となり、もう一方が被検出物質に特異的に結合する物質となる。さらに、被検出物質が核酸の場合、その核酸の配列に相補的な配列を有しハイブリダイズし得る核酸を被検出物質に特異的に結合する物質として用いることができる。標識体は、通常物質の標識に用いられる標識体はいずれも用いることができる。例えば、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子、セレニウムコロイド粒子等の非金属コロイド粒子、着色したラテックス粒子などの樹脂物質、染料コロイド粒子及び着色リポソーム等の不溶性粒子やアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の発色反応を触媒する酵素、蛍光色素、放射性同位体等が挙げられる。本発明において用いる標識体は、一般に入手可能な市販品であってよい。

本発明の検出装置の重要な特徴は、対照表示部に陽イオン性物質を用いることである。対照表示部は、膜担体上に陽イオン性物質を固相化することにより設けることができる。この際、陽イオン性物質の膜担体への固相化は、陽イオン性物質を膜担体に吸収させて乾燥することにより行うことができる。陽イオン性物質は強い陽電荷を維持しているため、近くに来たタンパク質等の両性電解質をマイナスに荷電させ、陽イオン性物質自身の陽電荷との相互作用でそれらタンパク等を電気的な相互作用により捕捉すると考えられる。これは強陽イオン性物質の近傍のpHは常に塩基性であるため、近くに来たタンパク等の両性電解質は結果的に負に帯電すると考えられるからである。本発明の陽イオン性物質は、このように近くに来た両性電解質を負に帯電させる程度の強い陽イオン性物質である。陽イオン性物質は従来の抗原抗体反応による標識試薬の結合と比較して結合対象の選択性すなわち特異性はなく、陰イオン性物質、又は塩基性下で負に帯電する両性電解質であれば吸着する。すなわち、陽イオン性物質を対照表示部に用いる本発明の装置において、被検出物質と特異的に結合する物質であって標識体と結合させる物質は、陰イオン性物質または塩基性下で負に帯電する両性電解質である。例えば、抗体を含むタンパク質等が挙げられる。しかし、試料中の夾雑物が結合することにより標識試薬の結合が阻害される等の懸念は、十分量の陽イオン性物質を塗布することで容易に解決できる。この性質は本発明の極めて重要な特徴の一つである。一般的に、抗原や抗体等を大過量に膜担体に塗布した場合、結合容量や結合速度といった特性はむしろ悪化してしまうため、抗体塗布量をあまり増やすことができない。これは、抗原や抗体分子中のエピトープやエピトープ認識部位が、他の抗原や抗体分子によりマスクされてしまうためと考えられる。本発明は電気的な相互作用を利用しているため、単に陽イオン性物質の固定量を増減するだけで結合容量を調節することができる。対照表示部に塗布される陽イオン性物質としては、陽イオン性ポリマー（カチオニックポリマー）、陽イオン性界面活性剤を用いることができる。陽イオン性ポリマーとしては、例えば、主鎖又は側鎖にアミノ基又はイミノ基を有する高分子化合物であって、0.4meq/g〜21meq/g、好ましくは1.0meq/g〜21meq/g、さらに好ましくは4.0meq/g〜21meq/gの陽イオン電荷密度を有し、300〜5,000,000の平均分子量を有する陽イオン性ポリマーが挙げられる。このような陽イオン性ポリマーとしてポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミンが挙げられる。ポリエチレンイミンには、直鎖PEIと1級、2級、3級アミンを含む分岐したポリエチレンイミンとが存在するがいずれも用いることができる。また、ポリエチレンイミンの分子量も限定されない。さらに脱アシル化等の化学修飾されたものも含まれる。また、ポリアリルアミンとしてポリ（アリルビグアニド-co-アリルアミン）やポリ（アリル-N-カルバモイルグアニジノ-co-アリルアミン）等の誘導体も含まれる。陽イオン性界面活性剤としては、塩化ベンザルコニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。これらの物質は混合物として用いてもよい。これらの中でも、コスト、製造しやすさ及び素早い明確な反応性からポリエチレンイミン又はポリアリルアミンが望ましい。上記の陽イオン性物質の固定量は限定されないが、0.1〜10％（w/v）の濃度で調製し、0.1μl〜10μlをラテラルフロータイプ又はフロースルータイプの試験装置のメンブレンに添加して固定化すればよい。またさらに別の方法として、化学修飾によりポジティブチャージしたナイロン膜を、試験装置のメンブレン上の一部に重ねて配置することにより、対照表示機能を持たせることも可能である。

本発明の試験装置の具体的な態様について以下に説明する。

本発明における試験装置としてラテラルフロータイプとフロースルータイプがある。

ラテラルフロータイプの試験装置の具体例としては、例えば、図１に示される形態が挙げられる。図１に示す試験装置は、一例であり、本発明の試験装置の構造、サイズ等は図１に示される形態に限定されない。図１において、符号１はバッキングシート、２は膜担体、３は含浸部材、４は試料供給用部材、５は吸水用部材、６は検出表示部、７は対照表示部を示している。バッキングシートはプラスティック等でできたシートであり、試験装置の構造を維持する。膜担体２は、幅５mm、長さ30mmの帯状のニトロセルロース製の膜で構成されている。膜担体２には、そのクロマト展開始点側の末端（図1中膜担体2の左端）から7.5mmの位置に、捕捉試薬が固定され、検体の検出表示部６が形成される。捕捉試薬を膜担体２に固定する方法としては、物理的吸着又は化学的な結合等の公知の方法が挙げられる。捕捉試薬は膜担体２にライン状に固定して検出表示部６を形成しているが、円状でも四角状でもいずれの形態でも良い。膜担体２には、検出表示部６から4.0mmの位置に、陽イオン性物質が固定され、検体の対照表示部７が形成される。対照表示部７も検出表示部６同様に膜担体２に固定する方法としては、物理的吸着又は化学的な結合等の公知の方法が挙げられる。陽イオン性物質は膜担体２にライン状に固定化して対照表示部７を形成しているが、円状でも四角状でもいずれの形態でも良い。図１の例のように、対照表示部は捕捉試薬を固定した検出表示部の下流に設けるのが望ましい。本発明のラテラルフロータイプの試験装置においては、試料供給用部材から吸水用部材に向かって溶液の流れが生じるが、その流れを基準に上流、下流という。膜担体２は、ニトロセルロース製の膜を例示しているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉試薬及び陽イオン性物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。含浸部材３は、標識試薬を含浸せしめた部材からなる。含浸部材３として、5mm×8mmの帯状の合成繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ガラス繊維、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。標識試薬は被検出物質に特異的に結合し且つ標識物質により標識されている。標識物質は限定されないが、呈色標識物質、酵素標識物質、蛍光標識物質などが挙げられる。このうち、検出表示部６での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色又は青色などの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、ポリスチレンラテックスが特に好ましい。含浸部材３は、標識試薬の懸濁液を前記合成繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。図１に示されるように、膜担体２をバッキングシート１の中程に貼着し、該膜担体２のクロマト展開の開始点側（すなわち図１の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図１の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上又は下に、含浸部材３の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材３の上流側部分をバッキングシート１に貼着して本発明のラテラルフロータイプの試験装置を作成できる。図１に示すストリップ状の装置をクロマトストリップということがあり、抗原抗体反応を利用して被検出物質を捕捉する場合、装置をイムノクロマト装置又はイムノクロマトストリップという場合がある。

さらに、必要に応じて、含浸部材３の上面に試料供給用部材４の下流側部分を重なるように載置するとともに、該試料供給用部材４の上流側部分をバッキングシート１に貼着してもよい。また、膜担体２の下流側部分の上面に吸水用部材５の上流側部分を重なるように載置するとともに、該吸水用部材５の下流側部分をバッキングシート１に貼着せしめることもできる。試料供給用部材４としては、例えば、多孔質ポリエチレン及び多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成繊維の不織布、並びに濾紙及び綿布などのようなセルロース製の紙又は織布若しくは不織布を用いることができる。

吸水用部材５は、試料供給用部材４に供給された液体試料が流れ到達する部材であり、試料供給用部材が流れてきた試料を吸収し保持するため、検体試料は上流から下流に向かって速やかに流れる。従って、吸水用部材５は、液体を速やかに吸収、保持できる材質のものであればよく、セルロース、ガラス繊維、及びポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特にセルロースが最適である。さらに、図１のラテラルフロー型イムノクロマトグラフィーは、膜担体２の表面を保護するラミネートシートによる包装、又は試料供給用部材４と検出表示部６及び対照表示部７の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製のハウジングに組み込んだ形態で提供することができる。

試料供給用部材４に液体試料を供給すると、液体試料は試料供給用部材４に浸透して、毛管作用により含浸部材３へ移動し、液体試料は含浸部材３の標識試薬を溶解させる。液体試料中に被検出物質が存在する場合には、標識試薬と結合し、「標識試薬−被検出物質」複合体を形成する。「標識試薬−被検出物質」複合体はさらに毛管作用により浸透して膜担体２に移動して、検出表示部６を通過する。その時、検出表示部６の捕捉試薬は「標識試薬−被検出物質」複合体を捕捉し、「標識試薬−被検出物質−捕捉試薬」のサンドイッチ複合体を形成する。また、被検出物質と反応しない一部の標識試薬は検出表示部６に捕捉されずにさらに膜担体２の下流側の対照表示部７へ移動する。対照表示部７に移動した標識試薬は対照表示部７に固定された陽イオン性物質に捕捉される。この時に予め液体試料中の一部の陰イオン性物質が、対照表示部７の陽イオン性物質と結合している場合があるが、標識試薬の捕捉にはほとんど影響することはない。そして、検出表示部６と対照表示部７に捕捉された標識試薬を検出する。標識試薬の検出方法は標識方法によって最適な方法を選択できる。例えば、酵素で標識した場合は基質を供給して発色させたり、蛍光、ラジオアイソトープで標識した場合は専用の機器で測定したり、金コロイド、ラテックス等の着色粒子で標識した場合は凝集像を目視で確認する。対照表示部７に標識試薬の標識が検出される場合、試料供給用部材４に供給した液体試料は検出表示部６を通過し対照表示部７に到達したことを示し、アッセイが正常に行われたと判断することができる。液体試料に被検出物質が存在する場合には検出表示部６及び対照表示部７には標識試薬の標識が検出される。液体試料に被検出物質が存在しない場合には対照表示部７のみに標識試薬の標識が検出される。

また、ラテラルフロータイプの別の形態として、含浸部材３を設けず試料供給用部材４を直接膜担体に重ね合わせて構成し、液体試料と標識試薬を予め混合してから試料供給用部材４に供給する方法がある。液体試料と標識試薬を予め混合すると液体試料中の被検出物質が「標識試薬−被検出物質」複合体を形成する。次に液体試料と標識試薬の混合物を試料供給用部材４に供給すると、液体試料と標識試薬の混合物は試料供給用部材４に浸透して、毛管作用により膜担体へ移動する。膜担体へ移動した液体試料と標識試薬の混合物は検出表示部６を通過する。その時、液体試料と標識試薬の混合物中の「標識試薬−被検出物質」は検出表示部６の捕捉試薬に捕捉され、「標識試薬−被検出物質−捕捉試薬」のサンドイッチ複合体が形成される。また、捕捉試薬に捕捉されなかった一部の「標識試薬−被検出物質」及び未反応の標識試薬はさらに下流の対照表示部７に移動し、捕捉される。

フロースルータイプの具体例としては、例えば、図２に示される形態が挙げられる。図２に示す試験装置は、一例であり、本発明の試験装置の構造、サイズ等は図２に示される形態に限定されない。図２において、符号８は３５ｍｍ径のプラスチックシャーレ、９は吸水パッド、１０は膜担体、１１は検出表示部、１２は対照表示部を示している。液体通過性の膜担体１０は20mm×20mmの大きさに裁断したニトロセルロース膜（孔径３μｍ、東洋濾紙製）を用いている。膜担体１０上には捕捉試薬が固定された検体の検出表示部１１が設けられている。捕捉試薬を膜担体１０に固定する方法としては、物理的吸着又は化学的な結合等の公知の方法が挙げられる。捕捉試薬は膜担体１０に円状に固定して検出表示部１１を形成しているが、線状でも四角状でもいずれの形態でも良い。膜担体１０には、検出表示部１１と同じ平面上で検出表示部１１から離れた位置に、陽イオン性物質を固定した対照表示部１２を設けている。対照表示部１２も検出表示部１１同様に膜担体１０に固定する方法としては、物理的吸着又は化学的な結合等の公知の方法が挙げられる。陽イオン性物質は膜担体１０に円状に固定化して対照表示部１２を形成しているが、線状でも四角状でもいずれの形態でも良い。膜担体１０は、ニトロセルロース製の膜を用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉試薬及び陽イオン性物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、不織布、棉系繊維、ナイロン、ウレタン等のプラスチック系繊維或いはこれらの混合繊維も使用できる。プラスチックシャーレ８の中に、適当な大きさ（20mm×20mmのニトロセルロース膜より大きいサイズ）の吸水パッド９を入れる。さらに前記吸水パッド９の上に上記膜担体１０を、試薬を滴下固定した面（上面）が表に見えるようして置く。膜担体１０の上面に液体試料を添加する。膜担体１０の上面を試料滴下面という。吸水パッド９は、供給された液体試料が流れ到達する部材であり、流れてきた試料を吸収し保持するための吸水手段として用いられる。膜担体下面に接する吸水手段は、図２に示す例のように、脱脂綿や濾紙等の繊維を吸水パッドとして用いてもよいが、吸水ポリマー等の薬剤、減圧による吸引装置等、膜担体を通過する液体を吸収又は吸引する物であればいずれの手段でも構わない。また、図２に示す例ではプラスチックシャーレを用いているが、試験装置の形態はプラスチックシャーレに限られるものではなく、プラスチック製のデバイスに組み込む等、膜担体と吸水手段を保持できるものであれば、いかなる形態でも良い。

膜担体１０の上面（試料滴下面）に液体試料を供給すると、液体試料はメンブレンを通過して吸水パッド９により吸収される。その時、液体試料中に被検出物質が存在する場合には、被検出物質は検出表示部１１の捕捉試薬に捕捉され、「被検出物質−捕捉試薬」複合体が形成される。次に、膜担体１０の試薬滴下面にペルオキシターゼ等の酵素、蛍光、ラジオアイソトープ、金コロイド、ラテックス等の着色粒子で標識した、被検出物質に特異的に結合する物質（標識試薬）を供給し、検出表示部１１に捕捉された被検出物質と結合させ「標識試薬−被検出物質−捕捉試薬」のサンドイッチ複合体を形成させる。また、標識試薬の一部は対照表示部１２に固定化された陽イオン性物質に捕捉される。この時に予め液体試料中の一部の陰イオン性物質が、対照表示部１２の陽イオン性物質と結合している場合があるが、標識試薬の捕捉にはほとんど影響することはない。そして、検出表示部１１と対照表示部１２に捕捉された標識試薬を検出する。標識試薬の検出方法は標識方法によって最適な方法を選択できる。例えば、酵素で標識した場合は基質を供給して発色させたり、蛍光、ラジオアイソトープで標識した場合は専用の機器で測定したり、金コロイド、ラテックス等の着色粒子で標識した場合は凝集像を目視で確認する。液体試料に被検出物質が存在する場合には検出表示部１１及び対照表示部１２の両方に標識試薬の標識が検出される。液体試料に被検出物質が存在しない場合には対照表示部１２のみに標識試薬の標識が検出される。

また、フロースルータイプの別の形態として、液体試料と標識試薬を予め混合してから膜担体の試料滴下面に供給する方法がある。液体試料と標識試薬を予め混合すると液体試料中の被検出物質が「標識試薬−被検出物質」複合体を形成する。次に液体試料と標識試薬の混合物を膜担体の試料滴下面に供給する。液体試料と標識試薬の混合物は膜担体を通過して吸水手段により吸収される。その時、液体試料中の「標識試薬−被検出物質」は検出表示部の捕捉試薬に捕捉され、「標識試薬−被検出物質−捕捉試薬」のサンドイッチ複合体が形成される。また、一部の「標識試薬−被検出物質」及び未反応の標識試薬は対照表示部に捕捉される。対照表示部に標識試薬の標識が検出される場合、試料滴下面に供給した液体試料は検出表示部１１と対照表示部１２を通過したことを示し、アッセイが正常に行われたと判断することができる。

本発明の試験装置を用いた検査に供される液状の試料としては、尿、液状便、血液、血清、上気道拭い液、吸引液等の液状臨床検体や、環境由来の水検体、飲料水を始めとする液状食品、あるいは微生物、固形便、土壌、汚泥、固形食品、大気中の成分等を液体に溶解、懸濁して得た溶液、乳剤やその上清等を選択することができる。

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

実施例１ ラテラルフロータイプの試験装置の作製
１．ラテックス標識試薬の作製
予め50mM MES緩衝液（pH6.0）で透析しておいた、抗アデノウイルスモノクローナル抗体溶液（0.5mg/mL）に、平均粒子径0.2μmの青色ポリスチレンラテックス粒子（セラダイン社製）を終濃度が0.25％（w/v）になるように添加し、時々撹拌しながら37℃で２時間放置した。次に、5,000×ｇ、４℃、15分間の遠心分離を行い上清を除いた。沈殿したラテックス粒子に0.5％（w/v） ＢＳＡ加Ｔｒｉｓ緩衝液（pH7.5）を加えて元の体積に戻し、ラテックス粒子を再分散させ、４℃で16時間静置した。再度、5,000×ｇ、４℃、15分間の遠心分離を行い、上清を除き、沈殿したラテックス粒子をTris緩衝液（pH7.5）に終濃度が0.1％（w/v）になるように分散し、ラテックス標識試薬とした。

２．ラテックス標識試薬含浸部材の作製
ガラス繊維ろ紙（ワットマン社製）を５mm×10mmの大きさに裁断し、上記１で作製したラテックス標識試薬を５μＬ滴下後、37℃で３時間乾燥させて含浸部材３とした。

３．ラテラルフロータイプ試験装置の組立
ラテラルフロータイプの試験装置は、図１に示すものと同様の構成のものを用いた。

膜担体２は、幅５mm×長さ30mmのニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製）シートを用いた。その長軸側の一端（この端を上流端、反対側を下流端とする）から６mm離れた位置に捕捉試薬として上記１の記載とは異なるハイブリドーマ株由来の抗アデノウイルスモノクローナル抗体溶液（5.0mg/mL）、さらに４mm下流側に対照試薬として１％（w/v）ポリエチレンイミンＰ−７０（和光純薬製）を陽圧噴霧装置（BioJet;BioDot社）を用いて線状に塗布した。塗布後、37℃の条件下で３時間乾燥し、検出表示部６と対照表示部７を形成した。

次に膜担体２を、試薬塗布面の反対側面が接着するように、５mm幅に切断したプラスチック製バッキングシート１（バイオドット社製）に貼り付けた（なお、膜担体２の両端には、上記含浸部材３及び後述の吸水用部材５を固定する必要があるため、上記バッキングシート１には適当な長さの余裕が必要である）。次に、膜担体２の上流側に、上記含浸部材３を、膜担体２と１mmの重なりを持つように上記バッキングシート１に貼り付け、次いで試料供給用部材４として、５mm×10mmの大きさのろ紙小片（アドバンテック東洋社製）を、含浸部材３と９mmの重なりを持つように上記バッキングシートに貼り付けた。さらに、膜担体２の下流側には、吸水用部材５として、５mm×30mmの大きさの厚手ろ紙（ワットマン社製）を、膜担体と10mmの重なりを持つように上記バッキングシート１に貼り付けた。最後に、両端にはみ出した余分なバッキングシートを切り取り、図１に示すラテラルフロータイプの試験装置とした。

４．抗原の検出
１％（w/v）トリトンX-100、２％（w/v）塩酸アルギニンを含む50mM Tris緩衝液（pH8.0）を展開液として用い、及び、アデノウイルスＣＦ抗原（デンカ生研製）を検体として用いてモデル実験を行った。展開液を希釈溶媒として用いてアデノウイルスＣＦ抗原を適宜希釈して液体試料を調整した。液体試料100μLを小試験管に加え、上記３で作製したラテラルフロータイプの試験装置を、試料供給用部材４（上流側）を下にして試験管に挿入し、試験管をラックに立てて室温で静置した。また、陰性コントロールとして上記展開液のみ100μＬで同様に試験を実施した。液体試料は、まず試料供給用部材４に滲み込み、次いで含浸部材３中のラテックス標識抗体と混合された後に、毛管現象によって膜担体２内に展開した。展開する液体試料とラテックス標識抗体の混合物は、検出表示部６、対照表示部７を順に通過した後、最終的には最下流側に配した吸水用部材５に吸収されて反応過程は終了した。ライン状のシグナルを形成するのに十分な時間（本実施例では20分）経過後、ニトロセルロースメンブレン上の検出表示部６と対照表示部７に現れる青色ラインの有無と、その太さや色調等の性状を観察した。

その結果、液体試料を展開した試験装置は検出表示部６及び対照表示部７に明確な青色のラインがみられた。検出表示部６の陽性シグナルは、前記アデノウイルスＣＦ抗原の1,000倍希釈液まで確認することができた。一方、陰性コントロールの展開液のみを展開した試験装置は対照表示部７には明確な青色のラインが見られたが、検出表示部６には全く何も表示されなかった。従って、対照表示部が陽イオン性物質を膜担体に吸収させて乾燥することにより構成しても、強い色調のラインを表示し、対照表示部として十分に機能することが確認された。

なお、実施例１で用いた試験装置は抗原抗体反応を利用したイムノクロマトストリップであり、このイムノクロマトストリップは、プラスチック製のハウジングに組み込んで、イムノクロマトデバイスとして用いることもできる。

実施例２ フロースルータイプの試験装置の作製
１．金コロイド標識抗体の作製
炭酸カリウム水溶液を用いてpH5.5に調整した金コロイド溶液（ＢＢＩ社製、粒径40nm、塩化金酸濃度として0.01％（w/v））の９容量に対して、予め2mM ホウ酸ナトリウム水溶液で透析した、抗A型又は抗B型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（100μｇ/mL）を１容量加え（終濃度10μｇ/mL）、５分間ゆっくりと撹拌した後、10％（w/v） ＢＳＡ溶液を１容量加え、さらに10分間ゆっくりと撹拌した。次いで、全量を14,000rpm、４℃、30分間遠心分離して上清を除いた。沈殿した金コロイド粒子に、１％（w/v） ＢＳＡ、150mM塩化ナトリウム加10mM Tris緩衝液（pH8.5）を加えて再分散し、530nmでの吸光度が2.0となるように希釈した。最後に、上記に準じて作製した金コロイド標識抗Ａ型抗体と、金コロイド標識抗Ｂ型抗体を等量ずつ混合し、金コロイド標識抗インフルエンザ抗体とした。

２．ニトロセルロース膜への試薬塗布
フロースルータイプの試験装置は、図３に示すものと同様の構成のものを用いた。

液体通過性の膜担体１０として、20mm×20mmの大きさに裁断したニトロセルロース膜（孔径３μm、東洋濾紙製）を用いた。このニトロセルロース膜の中央部に10mm×10mmの正方形を想定し、その四隅に相当する位置を、任意の一角から始めて時計回りに、ａ、ｂ、ｃ、ｄとした。

上記１に記載されたものとは、それぞれ異なるハイブリドーマ株由来の、抗Ａ型及び抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を、それぞれ予め10mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し、3mg/mLに濃度を調整した。

上記ニトロセルロース膜上の、ａ位置には抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を、ｂ位置には抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を、それぞれ１μＬずつ滴下し、Ａ型検出表示部ａ、Ｂ型検出表示部ｂとした。次いで、ｃ位置に１％ポリエチレンイミンＰ−７０（和光純薬製）を１μL滴下し、対照表示部ｃとした。残るｄ位置はブランクとして何も滴下せず、試験終了後にａ、ｂ、ｃの各位置を推定するための目印として利用した（ｄ位置には鉛筆等で小さく印を付けておいてもよい）。

試薬を滴下したニトロセルロース膜は、37℃で3時間乾燥させた。

３．フロースルータイプ試験装置の組立
35mm径のプラスチックシャーレ８の中に、20mm×20mmの上記膜担体１０より広いサイズのセルロース製吸水パッド９（ベセル社製）を入れた。さらに前記吸水パッド９の上に上記膜担体１０を、試薬を滴下固定した面（上面）が表に見えるようして置き、フロースルー型のイムノクロマト装置とした。

４．抗原の検出
検体希釈液として、５％（w/v）ＢＳＡ、５％（w/v）トリトンX-100、２％（w/v）ゼラチンを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.4）を用いた。陽性検体として、適宜希釈したＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスを、陰性検体として上記検体希釈液をそれぞれ用いた。

上記１の金コロイド標識抗インフルエンザ抗体と、上記検体希釈液で希釈した検体を１：４の割合に混合し、上記３．の測定装置のニトロセルロース膜上に１mL滴下した。少しずつゆっくり滴下し、膜担体１０上に液がなくなるまで室温で静置後、金コロイドの赤色スポットの有無を目視で判定した。

その結果、Ａ型検出表示部ａには、Ａ型インフルエンザウイルスが１０の５乗pfu/mLまで検出され、Ｂ型インフルエンザウイルスに対しては陰性を示した。Ｂ型検出表示部ｂには、Ｂ型インフルエンザウイルスが10の５乗pfu/mLまで検出され、Ａ型インフルエンザウイルスに対しては陰性を示した。一方、対照表示部ｃに関しては、検体の種類、濃度にかかわらず、常に強い色調のスポットを形成し、対照表示部として十分に機能することが確認された。

実施例３ 対照表示試薬の比較検討
１．ラテラルフロータイプの試験装置の作製
対照表示部に用いる試薬の候補として以下の７種の試薬を用いて、実施例１と同様にラテラルフロータイプの試験装置を作製した。

（１）3.0mg/mL ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）・・従来法
（２）１％（w/v） ポリエチレンイミン Ｐ−７０（和光純薬製）・・・陽イオン性物質
（３）１％（w/v） ポリアリルアミン ＨＣｌ−１０Ｓ（日東紡績製）・・・陽イオン性物質
（４）１％（w/v） カルボキシメチルセルロース（和光純薬製）・・・陰イオン性物質
（５）１％（w/v） セリシン（東洋紡績製）・・・陰イオン性物質
（６）１％（w/v） ポリエチレングリコール（ナカライテスク社製）・・・非イオン性物質
（７）１％（w/v） ポリビニルアルコール（ナカライテスク社製）・・・非イオン性物質
２．試験方法
実施例１と同様に、１％（w/v）トリトンX-100、２％（w/v）塩酸アルギニンを含む50mM Tris緩衝液（pH8.0）を展開液として用い、及び、アデノウイルスＣＦ抗原（デンカ生研製）を検体として用いた。展開液を希釈溶媒として用いてアデノウイルスＣＦ抗原を適宜希釈して、100倍希釈した検体を強陽性検体、500倍希釈した検体を弱陽性検体として液体試料を調整した。実施例１と同様に試験し、各試験装置の対照表示部７に現れる青色ラインの有無と、その太さや色調等の性状を観察した。

３．結果と考察
対照表示部７に用いる試薬が異なる各試験装置の対照表示部７に形成されるラインと、そのラインが現れるまでの時間、及び、検出表示部６に出現する検出ラインへの影響を比較検討した（表１）。従来法である（１）との比較の結果、特に（２）と、（３）の陽イオン性物質が、ラインが従来法である（１）よりも色調が強く明確であり、かつラインが出現するまでの時間も（１）より速かった。他の陰イオン性物質及び非イオン性物質の対照試薬については、ラインが形成されず、対照表示部７として機能しなかった。（５）のセリシンは陽イオン性のアミノ酸残基も含むタンパクであるが、全体として陰電荷にチャージしていることから対照表示試薬として機能しなかったと考えられる。また、いずれの対照表示試薬を用いた場合も、サンプル中の抗原濃度にかかわり無く、検出ラインに対しては何らの影響も認められなかったが、これは対照表示部７が検出表示部６よりも下流側に位置するためと考えられる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (13)

1. 膜担体上に固定した捕捉試薬と被検出物質と標識物質で標識した標識試薬の特異的結合反応を利用したメンブレンアッセイによる試験装置であって、標識試薬を捕捉するための陽イオン性ポリマーが固定された、試験が正確に実施されたことを示す対照表示部を有することを特徴とする試験装置。
2. 対照表示部が陽イオン性ポリマーを膜担体に吸収させて乾燥することにより構成されていることを特徴とする請求項１記載の試験装置。
3. 特異的結合反応が抗原抗体反応であることを特徴とする請求項１又は２に記載の試験装置。
4. 陽イオン性ポリマーは、主鎖又は側鎖にアミノ基又はイミノ基を有する高分子化合物であって、0.4meq/g〜21meq/gの陽イオン電荷密度を有し、300〜5,000,000の平均分子量を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の試験装置。
5. 陽イオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン若しくはポリアリルアミン又はそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の試験装置。
6. ラテラルフロータイプであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の試験装置。
7. 試験が正確に実施されたことを示す対照表示部が、捕捉試薬が固定された検出表示部の下流に配置するように構成されていることを特徴とする請求項６記載の試験装置。
8. フロースルータイプであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の試験装置。
9. 試験が正確に実施されたことを示す対照表示部が捕捉試薬が固定された検出表示部と同じ平面上に配置するように構成されていることを特徴とする請求項８記載の試験装置。
10. 膜担体上に固定した捕捉試薬と被検出物質と標識物質で標識した標識試薬の特異的結合反応を利用したメンブレンアッセイによる試験において、試験が正確に実施されたことを確認する方法であって、メンブレン上の対照表示部に固定化した陽イオン性ポリマーに標識試薬を結合させて対照表示部において標識試薬の標識が検出される場合に、試験が正確に実施されたと確認し得る方法。
11. 特異的結合反応が抗原抗体反応であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. 陽イオン性ポリマーは、主鎖又は側鎖にアミノ基又はイミノ基を有する高分子化合物であって、0.4meq/g〜21meq/gの陽イオン電荷密度を有し、300〜5,000,000の平均分子量を有することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 陽イオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン若しくはポリアリルアミン又はそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。

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