JPH07128335A - 免疫測定用担体を製造する方法 - Google Patents
免疫測定用担体を製造する方法Info
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- JPH07128335A JPH07128335A JP27184193A JP27184193A JPH07128335A JP H07128335 A JPH07128335 A JP H07128335A JP 27184193 A JP27184193 A JP 27184193A JP 27184193 A JP27184193 A JP 27184193A JP H07128335 A JPH07128335 A JP H07128335A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 短時間で実施でき、かつ十分なブロッキング
効果を有する免疫測定用担体を製造する方法を提供す
る。 【構成】 抗体又は抗原を担持した担体を、免疫反応に
は実質的に関与しない蛋白質等を含むフタル酸及び／又
はクエン酸の溶液中で１〜３０分間処理することを特徴
とする免疫測定用担体の製造方法により、前記目的を達
成する。
効果を有する免疫測定用担体を製造する方法を提供す
る。 【構成】 抗体又は抗原を担持した担体を、免疫反応に
は実質的に関与しない蛋白質等を含むフタル酸及び／又
はクエン酸の溶液中で１〜３０分間処理することを特徴
とする免疫測定用担体の製造方法により、前記目的を達
成する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は改良された免疫測定用担
体を製造する方法に関するものである。
体を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】血清、尿等の生体試料中の微量物質の検
出に、免疫測定を実施することがあるが、そのために抗
原や抗体を固定化する不溶性の担体を用いることがあ
る。担体として、従来、プラスチックなどの高分子担体
が多用されているが、これらの高分子担体では、物理的
吸着法又は共有結合法等により抗体又は抗原を結合させ
た後、免疫反応には実質的に関与しない蛋白質等を含む
溶液中で、室温下、2 〜16時間程度、時にはより長時間
のブロッキング処理を行い、免疫測定で使用する検出可
能な標識物質と抗原や抗体等の結合物（コンジュゲ−
ト、以下単に標識物質という）の担体への非特異的吸着
を低減させている。
出に、免疫測定を実施することがあるが、そのために抗
原や抗体を固定化する不溶性の担体を用いることがあ
る。担体として、従来、プラスチックなどの高分子担体
が多用されているが、これらの高分子担体では、物理的
吸着法又は共有結合法等により抗体又は抗原を結合させ
た後、免疫反応には実質的に関与しない蛋白質等を含む
溶液中で、室温下、2 〜16時間程度、時にはより長時間
のブロッキング処理を行い、免疫測定で使用する検出可
能な標識物質と抗原や抗体等の結合物（コンジュゲ−
ト、以下単に標識物質という）の担体への非特異的吸着
を低減させている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】前述のブロッキング処
理は、担体を用いる免疫学的測定法では必須であり、こ
の善し悪しが感度や再現性等に重大な影響を与える。し
かしながら、前述の如くブロッキング処理には、2 〜16
時間が必要であり、それに先立ち抗体等を担体に担持さ
せるための固定化反応に要する時間も含めると、すべて
の処理を完了させるために多大な時間と労力を必要とし
ていた。
理は、担体を用いる免疫学的測定法では必須であり、こ
の善し悪しが感度や再現性等に重大な影響を与える。し
かしながら、前述の如くブロッキング処理には、2 〜16
時間が必要であり、それに先立ち抗体等を担体に担持さ
せるための固定化反応に要する時間も含めると、すべて
の処理を完了させるために多大な時間と労力を必要とし
ていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、より短時
間で実施でき、かつ十分なブロッキング効果を有する免
疫測定用担体を製造する方法について鋭意検討した結
果、本発明を完成するに至った。
間で実施でき、かつ十分なブロッキング効果を有する免
疫測定用担体を製造する方法について鋭意検討した結
果、本発明を完成するに至った。
【０００５】即ち本発明は、抗体又は抗原を担持した担
体を、免疫反応には実質的に関与しない蛋白質等を含む
酸性溶液中で 1〜30分間処理することを特徴とする免疫
測定用担体の製造方法である。以下本発明を詳細に説明
する。
体を、免疫反応には実質的に関与しない蛋白質等を含む
酸性溶液中で 1〜30分間処理することを特徴とする免疫
測定用担体の製造方法である。以下本発明を詳細に説明
する。
【０００６】本発明は、酸性溶液中で免疫反応には実質
的に関与しない蛋白質等を酸変性させ、それによって担
体への吸着速度を増加させ、効率的で有効なブロッキン
グを行い、速やかに担体の非特異的結合をおこす性質を
低減させることを特徴としている。
的に関与しない蛋白質等を酸変性させ、それによって担
体への吸着速度を増加させ、効率的で有効なブロッキン
グを行い、速やかに担体の非特異的結合をおこす性質を
低減させることを特徴としている。
【０００７】本発明の製造方法に供される、抗体又は抗
原を担持した担体は、例えばポリスチレン、塩化ビニル
樹脂、エチレン酢酸ビニル共重合体等の樹脂、磁性粒
子、アルミナ、金属、金属酸化物等の無機物に、物理的
吸着又は共有結合により抗体、抗原、ハプテン等を結合
したものであり、その大きさや形状に制限はない。表面
積の大きさや反応容器との接地面積等の観点からは、特
に球状が良い。
原を担持した担体は、例えばポリスチレン、塩化ビニル
樹脂、エチレン酢酸ビニル共重合体等の樹脂、磁性粒
子、アルミナ、金属、金属酸化物等の無機物に、物理的
吸着又は共有結合により抗体、抗原、ハプテン等を結合
したものであり、その大きさや形状に制限はない。表面
積の大きさや反応容器との接地面積等の観点からは、特
に球状が良い。
【０００８】免疫反応に関与しない蛋白質等としては、
例えばウシ血清アルブミン、ゼラチン、カゼインやそれ
らの分解物等が例示できるが、ウシ血清アルブミンは前
述の担体に物理的に吸着させることができ特に好まし
い。
例えばウシ血清アルブミン、ゼラチン、カゼインやそれ
らの分解物等が例示できるが、ウシ血清アルブミンは前
述の担体に物理的に吸着させることができ特に好まし
い。
【０００９】酸溶液としては、免疫反応に関与しない蛋
白質等に構造変化を引き起こし、担体への吸着速度を増
加させ得るものであれば制限はないが、抗体等免疫反応
に関与する抗原や抗体質等に影響を与えないように、20
mMから150 mmの濃度で、pH2.0 〜4.0 程度が好ましい。
具体的酸溶液として、例えばフタル酸、クエン酸、コハ
ク酸等の溶液が例示できる。
白質等に構造変化を引き起こし、担体への吸着速度を増
加させ得るものであれば制限はないが、抗体等免疫反応
に関与する抗原や抗体質等に影響を与えないように、20
mMから150 mmの濃度で、pH2.0 〜4.0 程度が好ましい。
具体的酸溶液として、例えばフタル酸、クエン酸、コハ
ク酸等の溶液が例示できる。
【００１０】
【発明の効果】本発明によれば、従来の製造法に比較し
て半分以下という極めて短時間で、従来法と比較して遜
色のない免疫測定用担体を製造することが可能である。
て半分以下という極めて短時間で、従来法と比較して遜
色のない免疫測定用担体を製造することが可能である。
【００１１】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１２】実施例１ ウォ−タ−ストランド法により得た平均直径1.4 mm、平
均長さ1.5 mmのエチレン−酢酸ビニル共重合体（EVA ）
ペレット（東ソ−（株）製）を特願昭６１−３８２７９
号に記載された方法に従って真球化し、フェライト（東
ソー（株）製）を熱融着させ、更にグリシジルメタクリ
レ−ト（GMA ）でコ−トし、更に苛性ソ−ダ／メタノ−
ル溶液により表面層のエポキシ基を開環させてジオ−ル
にしたものを担体として以下の操作に使用した。
均長さ1.5 mmのエチレン−酢酸ビニル共重合体（EVA ）
ペレット（東ソ−（株）製）を特願昭６１−３８２７９
号に記載された方法に従って真球化し、フェライト（東
ソー（株）製）を熱融着させ、更にグリシジルメタクリ
レ−ト（GMA ）でコ−トし、更に苛性ソ−ダ／メタノ−
ル溶液により表面層のエポキシ基を開環させてジオ−ル
にしたものを担体として以下の操作に使用した。
【００１３】担体2000個を、特願６１−３８２９号に記
載された方法に従って100 mgのN,N'- カルボニルジイミ
ダゾル（CDI 、東京化成工業（株）製）を含む乾燥アセ
トン5 mlと窒素雰囲気、室温下で30分攪拌した後、0.5
mgの抗インシュリン抗体を含む50 mM ホウ酸緩衝液（pH
8.5）を4 ml加えて室温下で16時間インキュベ−トし該
抗体を吸着させた。
載された方法に従って100 mgのN,N'- カルボニルジイミ
ダゾル（CDI 、東京化成工業（株）製）を含む乾燥アセ
トン5 mlと窒素雰囲気、室温下で30分攪拌した後、0.5
mgの抗インシュリン抗体を含む50 mM ホウ酸緩衝液（pH
8.5）を4 ml加えて室温下で16時間インキュベ−トし該
抗体を吸着させた。
【００１４】インキュベ−ト終了後、洗浄した抗体固定
化担体を0.5%のウシ血清アルブミンを含む50mMフタル酸
溶液（pH 3.5）に加え、3 分間ブロッキング処理した
後、リン酸緩衝液（pH 7.4）で洗浄して担体を製造した
（フタル酸/BSA）。
化担体を0.5%のウシ血清アルブミンを含む50mMフタル酸
溶液（pH 3.5）に加え、3 分間ブロッキング処理した
後、リン酸緩衝液（pH 7.4）で洗浄して担体を製造した
（フタル酸/BSA）。
【００１５】比較のため、0.5%のウシ血清アルブミンを
含む50mMトリス緩衝液（pH 8.0）で室温下2 時間ブロッ
キングした担体（Tris/BSA) 、0.5%のウシ血清アルブミ
ンを含む50mMグリシン溶液（pH 3.5）で室温下3 分間ブ
ロッキングした担体（グリシン/BSA）及びブロッキング
操作を行わなかった担体（ブロッキングなし）を準備し
た。
含む50mMトリス緩衝液（pH 8.0）で室温下2 時間ブロッ
キングした担体（Tris/BSA) 、0.5%のウシ血清アルブミ
ンを含む50mMグリシン溶液（pH 3.5）で室温下3 分間ブ
ロッキングした担体（グリシン/BSA）及びブロッキング
操作を行わなかった担体（ブロッキングなし）を準備し
た。
【００１６】以上のようにして製造した本発明の担体と
比較担体を用いて、インシュリン（IRI ）の免疫測定を
行った。まず、担体又は比較担体8 個をプラスチック製
テストカップに入れ、各々にIRI 測定用希釈液を100 μ
l 加えて、さらにアルカリ性ホスファタ−ゼ標識抗イン
シュリン抗体（約2 mA）を加えて自動免疫測定装置（AI
A-1200、東ソー（株）製）にセットした。抗原溶液とし
ては、0 又は344 μU ／mlのインシュリン溶液を使用し
た。
比較担体を用いて、インシュリン（IRI ）の免疫測定を
行った。まず、担体又は比較担体8 個をプラスチック製
テストカップに入れ、各々にIRI 測定用希釈液を100 μ
l 加えて、さらにアルカリ性ホスファタ−ゼ標識抗イン
シュリン抗体（約2 mA）を加えて自動免疫測定装置（AI
A-1200、東ソー（株）製）にセットした。抗原溶液とし
ては、0 又は344 μU ／mlのインシュリン溶液を使用し
た。
【００１７】測定装置を作動させて抗原溶液を25μl 分
注し、37℃にて攪拌しながら40分間免疫反応を行わせた
後、カップ及び担体を洗浄して遊離物を除去し、続いて
アルカリ性ホスファタ−ゼの基質として40メチルウンベ
リフェロンリン酸溶液を分注して酵素反応させ、酵素反
応により生成した4-メチルウンベリフェロン（4MU ）の
増加速度を測定した。結果を表１に示す。
注し、37℃にて攪拌しながら40分間免疫反応を行わせた
後、カップ及び担体を洗浄して遊離物を除去し、続いて
アルカリ性ホスファタ−ゼの基質として40メチルウンベ
リフェロンリン酸溶液を分注して酵素反応させ、酵素反
応により生成した4-メチルウンベリフェロン（4MU ）の
増加速度を測定した。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】表１からは、0.5%ウシ血清アルブミン／50
mMフタル酸溶液（pH 3.5）中でブロッキングした担体
は、3 分間の処理で従来のブロキング溶液（0.5%ウシ血
清アルブミン／50mMトリス緩衝液）で2 時間処理した担
体に比べ、40分の1 の処理時間にもかかわらず、Ｓ／Ｎ
比で約2 倍高いブロッキング効果が得られたことが分か
る。また抗原存在下でのシグナルも約1.2 倍高い等、従
来の方法に比較してより優れた担体を製造できることが
分かる。
mMフタル酸溶液（pH 3.5）中でブロッキングした担体
は、3 分間の処理で従来のブロキング溶液（0.5%ウシ血
清アルブミン／50mMトリス緩衝液）で2 時間処理した担
体に比べ、40分の1 の処理時間にもかかわらず、Ｓ／Ｎ
比で約2 倍高いブロッキング効果が得られたことが分か
る。また抗原存在下でのシグナルも約1.2 倍高い等、従
来の方法に比較してより優れた担体を製造できることが
分かる。
【００２０】なお表１中、POSIの欄は344 μU/mlのイン
シュリン溶液についての、ZEROの欄は0 μU/mlのインシ
ュリン溶液について結果であり、POSI/ZERO の欄は、PO
SIの値／ZEROの値、即ちＳ／Ｎ比を示している。
シュリン溶液についての、ZEROの欄は0 μU/mlのインシ
ュリン溶液について結果であり、POSI/ZERO の欄は、PO
SIの値／ZEROの値、即ちＳ／Ｎ比を示している。
【００２１】実施例２ ブロッキング処理を、0.5%のウシ血清アルブミンを含む
50mMクエン酸溶液（pH3.5）を用いて行った以外は実施
例１と同様の操作を行って担体を製造し、実施例１と同
様の測定に供した。
50mMクエン酸溶液（pH3.5）を用いて行った以外は実施
例１と同様の操作を行って担体を製造し、実施例１と同
様の測定に供した。
【００２２】その結果、POSIの値は114.30であり、ZERO
の値は5.37であった。このように、POSIの値はグリシン
溶液を用いた場合と同等であったが、ZEROの値は１／２
以下であり、Ｓ／Ｎ比は大幅に向上していた。
の値は5.37であった。このように、POSIの値はグリシン
溶液を用いた場合と同等であったが、ZEROの値は１／２
以下であり、Ｓ／Ｎ比は大幅に向上していた。
Claims (2)
- 【請求項１】 抗体又は抗原を担持した担体を、免疫反
応には実質的に関与しない蛋白質等を含むフタル酸及び
／又はクエン酸の溶液中で１〜３０分間処理することを
特徴とする免疫測定用担体の製造方法。 - 【請求項２】 免疫反応には実質的に関与しない蛋白質
等としてウシ血清アルブミンを使用する請求項１又は２
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27184193A JPH07128335A (ja) | 1993-10-29 | 1993-10-29 | 免疫測定用担体を製造する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27184193A JPH07128335A (ja) | 1993-10-29 | 1993-10-29 | 免疫測定用担体を製造する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07128335A true JPH07128335A (ja) | 1995-05-19 |
Family
ID=17505621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27184193A Pending JPH07128335A (ja) | 1993-10-29 | 1993-10-29 | 免疫測定用担体を製造する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07128335A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997001761A1 (fr) * | 1995-06-27 | 1997-01-16 | Dainabot Co., Ltd. | Methode et necessaire de dosage |
-
1993
- 1993-10-29 JP JP27184193A patent/JPH07128335A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997001761A1 (fr) * | 1995-06-27 | 1997-01-16 | Dainabot Co., Ltd. | Methode et necessaire de dosage |
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