JPH07128336A - 免疫測定用担体を製造する方法及び免疫測定用担体 - Google Patents
免疫測定用担体を製造する方法及び免疫測定用担体Info
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- JPH07128336A JPH07128336A JP27184293A JP27184293A JPH07128336A JP H07128336 A JPH07128336 A JP H07128336A JP 27184293 A JP27184293 A JP 27184293A JP 27184293 A JP27184293 A JP 27184293A JP H07128336 A JPH07128336 A JP H07128336A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 非特異的吸着が低減された免疫測定用担体、
該担体の製造方法を提供する。 【構成】 任意の大きさ、形状の不溶性物質の表面にポ
リリジンを非共有結合させて該表面を覆うことを特徴と
する免疫測定用担体を製造する方法又は表面に非共有結
合により結合したポリリジンの被覆層を有する免疫測定
用担体等により、前記目的を達成する。
該担体の製造方法を提供する。 【構成】 任意の大きさ、形状の不溶性物質の表面にポ
リリジンを非共有結合させて該表面を覆うことを特徴と
する免疫測定用担体を製造する方法又は表面に非共有結
合により結合したポリリジンの被覆層を有する免疫測定
用担体等により、前記目的を達成する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定用担体の改良
された製造方法及び免疫測定用担体に関するものであ
る。
された製造方法及び免疫測定用担体に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】血清、尿等の生体試料中の微量物質の検
出には、例えば抗体を固定化した担体と、標識物質を結
合した抗体を用いたサンドイッチエンザイムノアッセイ
等の免疫測定を行うことが多い。これらの免疫測定を実
施するために、抗原や抗体を固定化するための不溶性の
担体を用いることがあり、従来、プラスチック等の高分
子担体が安価で簡便なことから多用されている。
出には、例えば抗体を固定化した担体と、標識物質を結
合した抗体を用いたサンドイッチエンザイムノアッセイ
等の免疫測定を行うことが多い。これらの免疫測定を実
施するために、抗原や抗体を固定化するための不溶性の
担体を用いることがあり、従来、プラスチック等の高分
子担体が安価で簡便なことから多用されている。
【０００３】これら高分子担体では、抗体又は抗原を直
接又は間接に結合させた後、更にブロッキング操作を行
うことにより、測定する目的物質非存在下での検出可能
な標識物質と結合した免疫学的に活性な物質（コンジュ
ゲ−ト、以下単に標識物質という）の担体への非特異的
吸着を再現性良く低減し得ることが知られており、高感
度な免疫測定が実施できる。
接又は間接に結合させた後、更にブロッキング操作を行
うことにより、測定する目的物質非存在下での検出可能
な標識物質と結合した免疫学的に活性な物質（コンジュ
ゲ−ト、以下単に標識物質という）の担体への非特異的
吸着を再現性良く低減し得ることが知られており、高感
度な免疫測定が実施できる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来の免疫測定用担体
では、高分子等の担体に直接抗原又は抗体を結合させた
後、更に免疫反応に実質的に関与しない蛋白質等を用い
たブロッキング処理を行うことにより、免疫反応の際に
生じる標識物質の担体への非特異的結合を低減させてい
た。しかし、特に担体それ自体が非特異的吸着をおこす
性質を有している場合等は、従来のブロッキング処理の
みでは、免疫測定中にブロキング剤が剥離する等した場
合、標識物質の非特異的結合を十分に抑えきれない。
では、高分子等の担体に直接抗原又は抗体を結合させた
後、更に免疫反応に実質的に関与しない蛋白質等を用い
たブロッキング処理を行うことにより、免疫反応の際に
生じる標識物質の担体への非特異的結合を低減させてい
た。しかし、特に担体それ自体が非特異的吸着をおこす
性質を有している場合等は、従来のブロッキング処理の
みでは、免疫測定中にブロキング剤が剥離する等した場
合、標識物質の非特異的結合を十分に抑えきれない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】免疫測定の感度を向上さ
せるためには、標識物質の担体への非特異的吸着を抑制
することが必要であるが、本発明者らは、担体表面をポ
リリジンで被覆することにより標識物質の非特異的吸着
を抑制し得ることを見出だし本発明を完成させた。
せるためには、標識物質の担体への非特異的吸着を抑制
することが必要であるが、本発明者らは、担体表面をポ
リリジンで被覆することにより標識物質の非特異的吸着
を抑制し得ることを見出だし本発明を完成させた。
【０００６】即ち本発明は、任意の大きさ、形状の不溶
性物質の表面にポリリジンを共有又は非共有結合させて
該表面を覆うことを特徴とする免疫測定用担体を製造す
る方法又は任意の大きさ、形状の不溶性物質の表面にポ
リリジンを共有又は非共有結合させて該表面を覆い、更
に免疫反応には実質的に関与しない蛋白質を結合させる
ブロッキング処理を施すことを特徴とする免疫測定用担
体を製造する方法である。
性物質の表面にポリリジンを共有又は非共有結合させて
該表面を覆うことを特徴とする免疫測定用担体を製造す
る方法又は任意の大きさ、形状の不溶性物質の表面にポ
リリジンを共有又は非共有結合させて該表面を覆い、更
に免疫反応には実質的に関与しない蛋白質を結合させる
ブロッキング処理を施すことを特徴とする免疫測定用担
体を製造する方法である。
【０００７】更に本発明は、表面に非共有結合により結
合したポリリジンの被覆層を有する免疫測定用担体であ
る。以下本発明を詳細に説明する。
合したポリリジンの被覆層を有する免疫測定用担体であ
る。以下本発明を詳細に説明する。
【０００８】本発明は、免疫測定で用いられる検出可能
な標識物質、即ち標識物質と抗体や抗原等の結合体の担
体への非特異的吸着を抑制するためになされたものであ
る。ここで標識物質とは、 131Ｉ、 125Ｉ、57Ｃｏ、32
Ｐ、14Ｃ、 3Ｈ等の放射性同位元素、アルカリ性フォス
ファタ−ゼ、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ等の酵素、Ｆ
ＩＴＣ等の蛍光物質の他、発光物質、吸光物質等の一般
に免疫測定に使用される標識物質を意味する。
な標識物質、即ち標識物質と抗体や抗原等の結合体の担
体への非特異的吸着を抑制するためになされたものであ
る。ここで標識物質とは、 131Ｉ、 125Ｉ、57Ｃｏ、32
Ｐ、14Ｃ、 3Ｈ等の放射性同位元素、アルカリ性フォス
ファタ−ゼ、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ等の酵素、Ｆ
ＩＴＣ等の蛍光物質の他、発光物質、吸光物質等の一般
に免疫測定に使用される標識物質を意味する。
【０００９】本発明の免疫測定用担体を製造する方法
は、担体に直接又は間接に抗原や抗体を結合させるので
はなく、まず、ポリリジンを共有又は非共有結合させて
担体表面を被覆することで、担体自体がもつ非特異的結
合をおこす担体表面の性質を改善させることを特徴とす
る。
は、担体に直接又は間接に抗原や抗体を結合させるので
はなく、まず、ポリリジンを共有又は非共有結合させて
担体表面を被覆することで、担体自体がもつ非特異的結
合をおこす担体表面の性質を改善させることを特徴とす
る。
【００１０】本発明で用いられる担体は、ポリリジンを
結合できれば特に制限はなく、例えばポリスチレン、塩
化ビニル樹脂、エチレン酢酸ビニル共重合体等の樹脂、
アルミナ、金属、金属酸化物等の無機物を例示できる。
担体の大きさや形状にも制限はなく、任意の大きさや形
状を選択できるが、表面積が大きく、かつ反応容器との
接地面積が均一で最小である等の理由から、特に球状が
好ましい。
結合できれば特に制限はなく、例えばポリスチレン、塩
化ビニル樹脂、エチレン酢酸ビニル共重合体等の樹脂、
アルミナ、金属、金属酸化物等の無機物を例示できる。
担体の大きさや形状にも制限はなく、任意の大きさや形
状を選択できるが、表面積が大きく、かつ反応容器との
接地面積が均一で最小である等の理由から、特に球状が
好ましい。
【００１１】ポリリジンを結合させることで、担体の表
面は標識物質が吸着し難いように変化するが、担体の化
学的性質自体は変化しない点が本発明の利点である。
面は標識物質が吸着し難いように変化するが、担体の化
学的性質自体は変化しない点が本発明の利点である。
【００１２】ポリリジンを担体に結合させた後、免疫反
応には実質的に関与しない蛋白質を用いてブロッキング
処理を行うと、更に非特異的吸着の低い担体を得ること
ができる。ここで用いる、免疫反応には実質的に関与し
ない蛋白質等としては、例えばウシ血清アルブミン、ゼ
ラチン、カゼイン又はそれらの分解物等を例示すること
ができるが、これら蛋白に限定されない。
応には実質的に関与しない蛋白質を用いてブロッキング
処理を行うと、更に非特異的吸着の低い担体を得ること
ができる。ここで用いる、免疫反応には実質的に関与し
ない蛋白質等としては、例えばウシ血清アルブミン、ゼ
ラチン、カゼイン又はそれらの分解物等を例示すること
ができるが、これら蛋白に限定されない。
【００１３】本発明はまた、任意の大きさ、形状の不溶
性担体の表面に共有又は非共有結合により結合したポリ
リジンを介して免疫学的に活性な物質が結合されている
免疫測定用担体をも提供する。担体に結合される免疫学
的に活性な物質は、例えば抗体や抗原等である。これら
免疫学的に活性な物質と本発明の担体の結合は、例えば
共通結合による場合はポリリジンのアミノ基と、Fab'化
抗体の−SH基やS-アセチル無水コハク酸等を用いて抗体
に導入された−SH基を、公知の二価反応性試薬等を用い
て結合させれば良い。二価反応性試薬としては、例え
ば、Succinimidyl4-(N-Maleimidomethyl) cyclohexane-
1-carboxylate 、Sulfosuccinimidyl4-(N-Maleimidomet
hyl) cyclohexane-1-carboxylate、m-Maleimidobenzoyl
-N-hydroxysuccinimide Ester 、m-Maleimidobenzoyl-N
-hydroxysulfosuccinimide Ester等を例示できるが、特
にこれらに限定されるものではない。また結合方法自体
は、例えば酵素免疫測定法（石川栄治、河合忠、宮井潔
ら編集、医学書院第３版）に記載された方法に従うこと
ができる。
性担体の表面に共有又は非共有結合により結合したポリ
リジンを介して免疫学的に活性な物質が結合されている
免疫測定用担体をも提供する。担体に結合される免疫学
的に活性な物質は、例えば抗体や抗原等である。これら
免疫学的に活性な物質と本発明の担体の結合は、例えば
共通結合による場合はポリリジンのアミノ基と、Fab'化
抗体の−SH基やS-アセチル無水コハク酸等を用いて抗体
に導入された−SH基を、公知の二価反応性試薬等を用い
て結合させれば良い。二価反応性試薬としては、例え
ば、Succinimidyl4-(N-Maleimidomethyl) cyclohexane-
1-carboxylate 、Sulfosuccinimidyl4-(N-Maleimidomet
hyl) cyclohexane-1-carboxylate、m-Maleimidobenzoyl
-N-hydroxysuccinimide Ester 、m-Maleimidobenzoyl-N
-hydroxysulfosuccinimide Ester等を例示できるが、特
にこれらに限定されるものではない。また結合方法自体
は、例えば酵素免疫測定法（石川栄治、河合忠、宮井潔
ら編集、医学書院第３版）に記載された方法に従うこと
ができる。
【００１４】以上のように調製した、免疫学的に活性な
物質を結合した担体を、例えば標識物質等に代表される
免疫測定に必要な他の成分と共に適当な容量の容器に凍
結乾燥状態に封入すること等で本発明の免疫測定用の試
薬キットを得ることができ、任意の大きさ、形状の不溶
性担体の表面に共有又は非共有結合により結合したポリ
リジンを介して免疫学的に活性な物質が結合されている
免疫測定用担体を使用する本発明の免疫測定法を迅速、
簡便に実施することができる。
物質を結合した担体を、例えば標識物質等に代表される
免疫測定に必要な他の成分と共に適当な容量の容器に凍
結乾燥状態に封入すること等で本発明の免疫測定用の試
薬キットを得ることができ、任意の大きさ、形状の不溶
性担体の表面に共有又は非共有結合により結合したポリ
リジンを介して免疫学的に活性な物質が結合されている
免疫測定用担体を使用する本発明の免疫測定法を迅速、
簡便に実施することができる。
【００１５】
【発明の効果】本発明では、免疫反応における目的生成
物である免疫複合体に関係なく標識物質が直接担体に結
合するいわゆる非特異的結合に対し、担体にまず、ポリ
リジンを結合させて担体表面を覆うことによりその表面
の性質を容易にかつ簡便に改良し、非特異的吸着を起こ
す性質を減少できる。よって、本発明は高い感度を必要
とし、より高い再現性を求められる免疫測定において有
効である。
物である免疫複合体に関係なく標識物質が直接担体に結
合するいわゆる非特異的結合に対し、担体にまず、ポリ
リジンを結合させて担体表面を覆うことによりその表面
の性質を容易にかつ簡便に改良し、非特異的吸着を起こ
す性質を減少できる。よって、本発明は高い感度を必要
とし、より高い再現性を求められる免疫測定において有
効である。
【００１６】本発明は、任意の大きさ、形状の担体を提
供するものである。本発明の免疫測定用担体は、例えば
抗体を担体に固定化して抗原を測定する競合法やサンド
イッチ法等の免疫測定に使用でき、臨床的に現在用いら
れている生体試料の微量測定法に広く応用することが可
能である。また担体の化学的性質を変化させることなく
表面処理することによってのみその表面を改善できるの
で、安価、簡便で、かつ効率的である。
供するものである。本発明の免疫測定用担体は、例えば
抗体を担体に固定化して抗原を測定する競合法やサンド
イッチ法等の免疫測定に使用でき、臨床的に現在用いら
れている生体試料の微量測定法に広く応用することが可
能である。また担体の化学的性質を変化させることなく
表面処理することによってのみその表面を改善できるの
で、安価、簡便で、かつ効率的である。
【００１７】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】実施例１ ウォ−タ−ストランド法により得た平均直径1.4mm 、平
均長さ1.5mm のエチレン−酢酸ビニル共重合体（EVA ）
ペレット（東ソ−（株）製）を特願昭６１−３８２７９
号に記載された方法に従って真球化し、フェライト（東
ソー（株）製）を熱融着させ、更にグリシジルメタクリ
レ−ト（GMA ）でコ−トし、更に苛性ソ−ダ／メタノ−
ル溶液により表面層のエポキシ基を開環させてジオ−ル
にしたものを担体として以下の操作に使用した。
均長さ1.5mm のエチレン−酢酸ビニル共重合体（EVA ）
ペレット（東ソ−（株）製）を特願昭６１−３８２７９
号に記載された方法に従って真球化し、フェライト（東
ソー（株）製）を熱融着させ、更にグリシジルメタクリ
レ−ト（GMA ）でコ−トし、更に苛性ソ−ダ／メタノ−
ル溶液により表面層のエポキシ基を開環させてジオ−ル
にしたものを担体として以下の操作に使用した。
【００１９】担体2000個に0.5mg ／mlのポリリジン（シ
グマ P-1274 ）の水溶液を5 ml加えて37℃のインキュベ
−タで3 時間インキュベ−トした。さらに、これらの担
体のうち約1000個は、別途0.5 ％ BSAを含むトリス緩衝
液（pH 8.0）を加えて室温下で16時間インキュベ−トす
るブロッキング操作を行った。
グマ P-1274 ）の水溶液を5 ml加えて37℃のインキュベ
−タで3 時間インキュベ−トした。さらに、これらの担
体のうち約1000個は、別途0.5 ％ BSAを含むトリス緩衝
液（pH 8.0）を加えて室温下で16時間インキュベ−トす
るブロッキング操作を行った。
【００２０】比較のため、ポリリジンを結合させる操作
を行わず、BSA ブロッキングのみを行った担体及び何の
処理も行っていない担体を準備した。
を行わず、BSA ブロッキングのみを行った担体及び何の
処理も行っていない担体を準備した。
【００２１】以上のようにして製造した本発明の担体と
比較担体を用いて、標識物質の担体への非特異的吸着を
測定した。まず、担体又は比較担体12個を容器に入れ、
各々に標識物質であるアルカリ性フォスファタ−ゼで標
識したマウス抗インシュリン抗体（標識抗体）を100 μ
l 加えて、37℃で40分間免疫反応を行わせた後、リン酸
緩衝液（pH 7.4）で容器及び担体を洗浄して遊離物を除
去し、抗原非存在下での標識抗体の担体への非特異的吸
着を以下の基質で測定した。
比較担体を用いて、標識物質の担体への非特異的吸着を
測定した。まず、担体又は比較担体12個を容器に入れ、
各々に標識物質であるアルカリ性フォスファタ−ゼで標
識したマウス抗インシュリン抗体（標識抗体）を100 μ
l 加えて、37℃で40分間免疫反応を行わせた後、リン酸
緩衝液（pH 7.4）で容器及び担体を洗浄して遊離物を除
去し、抗原非存在下での標識抗体の担体への非特異的吸
着を以下の基質で測定した。
【００２２】アルカリ性ホスファタ−ゼの基質として1
mMの4-メチルウンベリフェロン溶液（pH 10 ）を、37℃
条件下で100 μl 加え、10分間反応させた後、2.9 mlの
酵素反応停止液を加えて酵素反応を停止させ、励起波長
360 nm、蛍光波長450 nmで蛍光測定を行った。
mMの4-メチルウンベリフェロン溶液（pH 10 ）を、37℃
条件下で100 μl 加え、10分間反応させた後、2.9 mlの
酵素反応停止液を加えて酵素反応を停止させ、励起波長
360 nm、蛍光波長450 nmで蛍光測定を行った。
【００２３】その結果、担体に吸着した標識物質中の酵
素（アルカリ性フォスファタ−ゼ）により生成した4-メ
チルウンベリフェロン（４ＭＵ）の濃度は、未処理担体
では19.4 nM であったのに対し、ポリリジン被覆担体で
は12.4 nM に減少した。またBSA ブロッキングのみを行
った担体では0.7 nMであったのに対し、BSA ブロッキン
グをも行ったポリリジン被覆担体では0.4 nMであった。
素（アルカリ性フォスファタ−ゼ）により生成した4-メ
チルウンベリフェロン（４ＭＵ）の濃度は、未処理担体
では19.4 nM であったのに対し、ポリリジン被覆担体で
は12.4 nM に減少した。またBSA ブロッキングのみを行
った担体では0.7 nMであったのに対し、BSA ブロッキン
グをも行ったポリリジン被覆担体では0.4 nMであった。
【００２４】この結果から、担体にポリリジンを結合さ
せることにより、非特異的吸着の低い担体が得られるこ
とが分かる。未処理に比べポリリジン被覆とBsa ブロッ
キング処理を行ったものは約49倍、BSA ブロッキング処
理のみを行った場合に比べポリリジン被覆とBSA ブロッ
キング処理を行ったものは約 2倍も非特異的吸着は低
い。また、ポリリジン被覆だけでも未処理に比べ約 1.6
倍非特異的吸着は低い。
せることにより、非特異的吸着の低い担体が得られるこ
とが分かる。未処理に比べポリリジン被覆とBsa ブロッ
キング処理を行ったものは約49倍、BSA ブロッキング処
理のみを行った場合に比べポリリジン被覆とBSA ブロッ
キング処理を行ったものは約 2倍も非特異的吸着は低
い。また、ポリリジン被覆だけでも未処理に比べ約 1.6
倍非特異的吸着は低い。
Claims (4)
- 【請求項１】 任意の大きさ、形状の不溶性物質の表面
にポリリジンを非共有結合させて該表面を覆うことを特
徴とする免疫測定用担体を製造する方法。 - 【請求項２】 任意の大きさ、形状の不溶性物質の表面
にポリリジンを非共有結合させて該表面を覆い、更に免
疫反応には実質的に関与しない蛋白質を結合させるブロ
ッキング処理を施すことを特徴とする免疫測定用担体を
製造する方法。 - 【請求項３】 免疫反応には実質的に関与しない蛋白質
としてウシ血清アルブミンを使用する請求項２の免疫測
定用担体を製造する方法。 - 【請求項４】 表面に非共有結合により結合したポリリ
ジンの被覆層を有する免疫測定用担体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27184293A JPH07128336A (ja) | 1993-10-29 | 1993-10-29 | 免疫測定用担体を製造する方法及び免疫測定用担体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27184293A JPH07128336A (ja) | 1993-10-29 | 1993-10-29 | 免疫測定用担体を製造する方法及び免疫測定用担体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07128336A true JPH07128336A (ja) | 1995-05-19 |
Family
ID=17505637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27184293A Pending JPH07128336A (ja) | 1993-10-29 | 1993-10-29 | 免疫測定用担体を製造する方法及び免疫測定用担体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07128336A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2436003A (en) * | 2005-12-06 | 2007-09-12 | Trinity Res Ltd | A method for preparing a microbead suspension for use in an assay for determining the presence of antibodies to human immunodeficiency virus |
| WO2010123448A1 (en) * | 2009-04-21 | 2010-10-28 | Gyros Patent Ab | Method for reducing adsorption losses on metal oxide surfaces |
| JP2015184125A (ja) * | 2014-03-24 | 2015-10-22 | 東ソー株式会社 | 非特異的反応を抑制した免疫学的測定方法 |
-
1993
- 1993-10-29 JP JP27184293A patent/JPH07128336A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2436003A (en) * | 2005-12-06 | 2007-09-12 | Trinity Res Ltd | A method for preparing a microbead suspension for use in an assay for determining the presence of antibodies to human immunodeficiency virus |
| GB2436003B (en) * | 2005-12-06 | 2011-01-05 | Trinity Res Ltd | A method for preparing a microbead suspension for use in an assay for determining the presence of antibodies to HIV in a sample and an assay |
| WO2010123448A1 (en) * | 2009-04-21 | 2010-10-28 | Gyros Patent Ab | Method for reducing adsorption losses on metal oxide surfaces |
| JP2015184125A (ja) * | 2014-03-24 | 2015-10-22 | 東ソー株式会社 | 非特異的反応を抑制した免疫学的測定方法 |
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