WO1997001761A1 - Methode et necessaire de dosage - Google Patents

Description

明 TO 検 査 方 法 及 び 検 査 用 キ ッ ト 技 術 分 野

こ の発明 は、 検査方法及び検査用 キ ッ 卜 に関 し 、 詳 し く は ク ロ マ ト グ ィ ス ト リ ッ プを用 い る 検査方法及びそ の検査方 法に使用す る 検査用 キ ッ 卜 に関す る

背 景 技 術

迅速かつ簡便な検査方法 と し て、 ク ロ マ ト グ ラ フ イ ス ト リ ッ プを用 い る 方法が知 ら れて い る 。 ク ロ マ ト グラ フ ィ ス ト リ ッ ブ は、 特開昭 6 0 — 1 9 2 2 6 、 特開平 6 3 8 6 5 及び特開 平 3 — 1 7 6 6 5 9 等に記載 さ れて い る よ う に、 例え ば被検出 物 と 特異的 に結合す る 本発明で い う 捕捉物質 マ — カ ー か ら な る ト レ ー サ ー が ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 展開で き る よ う に配置 さ れ、 あ る い はサ ン プル添加時に添加 さ れ、 そ の下流に被検出物 と 特異的 に結合す る 本発明でい う 捕捉物質 2 が固定 さ れて い る ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体を有す る も の で あ る 。 こ の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体の ト レ ー サ ー が配置 さ れた領域 に サ ン プル液が添加 さ れ ま た は ト レ ー サ ー と サ ン プル液が一緒に添加 さ れ る と 、 被検 出物は ト レ ー サ ー と 結合 し 、 被検出物が結合 し た ト レ ー サ ー及 び被検出物が結合 し て い な い ト レ ー サ ー の両方が ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プの長辺方向即 ち 下流方向 に展開 さ れ る 。 ト レ ー サ 一 が捕捉物質 2 が固定化さ れて い る 領域に達す る と 、 被検出 物 （ ト レ ーサ ー が結合 し て い る ） の みが捕捉物質 2 と 結合 し て ト レ ーサ ー がそ こ に集積 さ れ、 被検出物が結合 し て い な い ト レ ー サ 一 は下流に流出す る 。 か く し て、 サ ン プル水溶液中の被検 出物の有無及びそ の量を、 捕捉物質 2 が固定 さ れた部位での発 色等に よ り 知 る こ と がで き る 。

ま た、 本発明 と 関連 し て、 特開平 3 — 1 7 6 6 5 9 に は、 本 発明でい う 標識領域の全部 ま た は一部を ゼラ チ ン で包む こ と が 記載 さ れて い る 。

こ の よ う な ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プを用 い る 検査方法は 短時間に検査がで き 、 ま た そ の操作 も 簡易であ る が、 被検出物 の検出感度を更に高め る 等の改善の必要があ っ た。 即 ち 、 こ の 発明が解決 し ょ う と す る 課題 は、 検出感度等が改善 さ れた ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プを用 い る 検査方法を提供す る こ と に あ り 、 ま た、 検出感度等が改善 さ れた検査方法に使用 す る 検査用 キ ッ ト を提供す る こ と に あ る 発明の開示

本発明者 ら は、 ゼ ラ チ ン を ク ロ マ ト グ ィ 担体の特定位置 に サ ン プル添加時に添加す る か、 又 は ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体の 特定位置 に予め配置 し て お く こ と に よ り 、 検出感度が著 し く 高 ま る こ と 、 検出時間を短縮で き る こ と 及びサ ン ド ウ イ ツ チ法に お け る プ ロ ゾー ン現象が低下す る こ と 等、 従来の検査方法及び 検査用 キ ッ 卜 の種々 の点が改善 さ れ る こ と を見い だ し た。

即 ち こ の発明の一つ は、 被検出物に 直接に若 し く は被検出物 と 捕捉物質 2 の両方 に結合す る 捕捉物質 3 を介 し て間接的に結 合す る 捕捉物質 2 が固定 さ れて い る か又 は被検出物に特異的に 又は捕捉物質 2 に被検出物 と 競合 し て特異的に結合す る 捕捉物 質 1 と 特異的 に結合す る 捕捉物質 4 が捕捉物質 2 が固定 さ れて い る 領域の下流に お い て固定さ れて い る 結合領域を少な く と も 有す る ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体に、 更 に捕捉物質 マ ー カ ー か ら な る ト レ ーサ ー が ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 展開で き る よ う に該結 合領域の上流に予め配置す る か又は サ ン プル添加時に添加す る ク ロ マ ト グ ラ フ イ ス ト リ ッ プを用 い る 検査方法に お い て ； ゼラ チ ン を該結合領域の上流に サ ン プル添加時に添加す る か、 又は ゼラ チ ン を該結合領域の上流で あ っ て ト レ ー サ ー が予め配置 さ れて い る 領域 （以下標識領域 と い う ） を除 く 領域 に予め配置す る こ と を特徴 と す る 検査方法で あ る

更に こ の発明の他の一つ は、 上記 ク ロ マ 卜 グ ラ フ イ ス ト リ ッ プ と ゼラ チ ン と を、 又 は上記 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体の結合領域 の上流であ っ て標識領域を除 く 領域に ゼラ チ ン が予め配置 さ れ て い る ゼラ チ ン配置 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プを、 少な く と も 有す る 検査用 キ ッ ト であ る

図面の簡単な説明

第 1 図は ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス 卜 リ ッ プの説明図で あ る 。

第 2 図 は 本 発 明 の 検 査 方 法 に よ る 検 査 結果 を 示 す （ 実施 例 2 )

第 3 図 は 本 発 明 の 検 査 方 法 に よ る 検 査結 果 を 示 す （ 実施 例 3 ) 。

発明を実施す る た め の最良の形態

こ の発明 に お い てサ ン プル中の有無あ る い は存在量が検出 さ れ る 被検出物は、 こ の被検出物 と 特異的 に結合す る 化合物が存 在す る も の であ れば、 何で あ っ て も よ い。 例え ば、 ピオ チ ン が 導入 さ れた化合物 （ア ビ ジ ン が特異的 に結合す る ） 、 ア ビ ジ ン を有す る 化合物、 相補的 D N A 、 抗原性を有す る 化合物あ る い はハ プテ ン 、 特定'抗原の抗体 と 特異的 に結合す る 化合物、 抗体 抗原 と 特異的 に結合す る 抗体 フ ラ グ メ ン ト 、 糖 リ ガ ン ド と 特異 的に結合す る レ ク チ ン、 レ ク チ ン と 特異的 に結合す る 糖 リ ガ ン ド、 そ の他 リ セ プ夕 一 と 特異的 に結合す る リ ガ ン ド及び リ ガ ン ド と 特異的 に結合す る リ セ プタ 一等があ げ ら れ る 。 勿論、 こ れ ら の結合反応が反応性又 は親和性の高 い も のであ る ほ ど、 検出 感度 は高 く な る 。 具体的 に は、 微生物 ； ウ ィ ル ス ； 病原性微生 物、 ウ ィ ル ス等の特異抗原、 前立腺ガ ン等の腫瘍マ ー カ 一抗原 等の抗原 ； 微生物、 ウ ィ ル ス感染等に よ り 生 じ た抗体、 自 己抗 体等の抗体、 急性期蛋白抗原等の抗体 ； 糞便中へモ グ ロ ビ ン ま た はへモ グ ロ ビ ン に特異的 な抗原 ； 特定の抗原を呈示す る 細胞 特定の糖 リ ガ ン ド を有す る 細胞、 特定の リ セ プ タ ー を有す る細 胞等の細胞 ； 甲状腺ホ ル モ ン 、 副甲状腺ホ ルモ ン、 生殖腺刺激 ホ ル モ ン 等の ホ ル モ ン 、 サ イ ト カ イ ン 、 モ ノ 力 イ ン 等 の 生理活 性蛋白質 ま た はペ プチ ド ； 酵素、 プ ロ テオ ダ リ カ ン 、 7 セ ミ ノ プ ロ テ イ ン、 ア ミ ロ イ ド ブ レ カ ー サ 一 等の蛋白質 ま た は糖蛋白 質 ； 血液中低分子化学物質 ま た は薬物 ； ァ ゴニ ス ト 、 ア ン タ ゴ ニ ス ト 等の情報伝達調節因子 ； 血栓溶解 Z血液凝固調節因子 ； 遺伝子発現調節因子 ； 細胞接着分子 ； 免疫調節 レ ク チ ン等の レ ク チ ン ； R N A、 D N A 等の核酸等が例示 と し て あ げ ら れ る 。 特に、 サ ン プ ル と し て糞便あ る い は尿等が非侵襲的検体 と し て 望 ま し い。

捕捉物質 1 は、 被検出物を特異的 に捕捉 し て結合す る か ま た は後述の捕捉物質 2 に被検出物 と 競合 し て特異的 に結合 （捕捉） す る 化合物か ら な る 。 即 ち 、 例え ば、 被検出物が抗原で あ る と き は、 抗体若 し く は抗原 と 特異的 に結合す る 抗体 フ ラ グ メ ン ト

(以下 「抗体」 は抗原 と 特異的 に結合す る 抗体 グ メ ン ト を も含む も の と す る 。 ） ま た は抗原若 し く は抗体 と 特異的に結合 す る 化合物 （以下 「抗原」 は抗体 と 特異的 に結合す る 化合物を 含む も の と す る 。 ） で あ り 、 被検出物が抗体であ る と き は、 抗 原ま た は抗体であ る 。 ま た、 被検出物が リ ガ ン ド （ ま た は リ ガ ン ドを有す る 化合物） で あ る と き は、 捕捉物質 1 は リ セ プ タ 一 (ま た は リ セ プタ ー を有す る 化合物） ま た は リ ガ ン ドであ り 、 リ セ プタ ー であ る と き は、 リ ガ ン ド ま た は リ セ プ タ ー で あ る 。 捕捉物質 1 は、 被検出物を介 し て捕捉物質 3 と 特異的 に結合 し て そ の結果、 捕捉物質 3 を介 し て捕捉物質 2 と 結合す る 場合 も あ る 。 被検出物 と 捕捉物質 1 と の結合 は、 可逆的で あ っ て も 非 可逆的であ っ て も 良いが、 結合力が弱す ぎ る と 検出感度が低下 す る 。

捕捉物質 1 に は マ ー カ ー が付加 さ れて ト レ ー サ ー が形成 さ れ る 。 捕捉物質 1 に マ ー カ ー を付加す る 方法は、 マ ー カ ー に捕捉 物質 1 を吸着 ま た は包接 さ せて も よ い し 、 水素結合 ま た は共有 結合に よ り 結合 さ せて も よ い。 要す る に、 捕捉物質 1 がマ ー カ — よ り 容易に離脱 し な い程度 に付加 さ れて い てかつ被検出物ま た は捕捉物質 2 に よ り 認識 さ れ る よ う に付加 さ れて い れば よ い マ ー カ ー は、 捕捉物質 1 が被検出物、 後述の捕捉物質 2 又は 後述の捕捉物質 4 と 結合す る こ と に よ り 、 こ れ ら の存在を示す シ グナ ル即 ち 色を発す る も のであ る 。 マ ー カ 一 と し て は、 望ま し ぐ は水不溶性で あ つ て且つ撥水性が乏 し い微粒子か ら な る 。 望ま し い マ ー カ 一 の例 と し て、 金 コ ロ イ ド等の金属 コ ロ イ ド、 セ レ ニ ウ ム コ ロ イ ド等の非金属 コ ロ イ ド ； 有機 コ ロ イ ド ； 染料 粒子 ； 着色ポ リ ス チ レ ン等の着色有機ポ リ マ ー ； 発色剤が内封 さ れた リ ボ ソ ー ム等の油性微粒子等があ る 。 コ ロ イ ド等が発色 性で な い と き は発色剤が加え ら れ る 。 発色剤 と し て は、 通常の 可視部での発色剤の ほか、 蛍光物質及び紫外部での発色物質 も 含ま れ る 。 ま た、 結合領域等に配置 さ れた酵素等 に よ り 蛍光を 含め発色す る 物質 も 、 こ の発明の発色剤 に含 ま れ る ト レ ー サ ー は、 そ れ 自 体あ る い は被検出物 と 結合 し て い る も の の何れ も 、 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プにサ ン プル液が添加 さ れた と き 、 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体中 に展開 し移動す る も ので あ る 。 ト レ ー サ ー は、 使用時 は溶液 （又 は懸濁液） と し て使用 さ れ る が、 凍結乾燥等に よ り 粉末状 に し て保存す る がで き る

水性溶媒に て ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体上を ク ロ マ ト グラ フ ィ 展 開で き る よ う に ト レ ー サ ー を配置す る に は、 二つ の方法があ る 第一は、 ト レ ー サ ー水溶液を し み こ ま せ乾燥 し た ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体切片を、 後 に述べ る 結合領域の上流であ っ て結合領域 と は適当 な 間隔を お い て基材 ま た は ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体上に 予め配置す る 方法であ る 。 こ の場合、 ト レ 一 ザが置かれた場所 を標識領域 と い う 。 第二 は、 ト レ ー サをサ ン プル添加時に ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー担体上に添加す る 方法で あ る 。 従 っ て こ の場合 に は ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 ス ト リ ッ プは標識領域を有 し な い。

捕捉物質 2 は、 被検出物を有 し て い る ト レ ー サ ー を被検出物 を介 し て結合す る か、 あ る い は、 捕捉物質 1 を有す る ト レ 一サ 一を捕捉物質 1 を介 し て結合す る も の で あ る 。 後者の捕捉物皙 を介 し て結合す る 場合 に は、 被検出物 と 競合 し て捕捉物質 2 に結合す る 。 何れの場合 も 、 捕捉物質 2 は、 被検出物 と 特異的 に結合す る も の であ る 。 更 に、 被検出物 と 特異的 に結合す る 捕 捉物質 3 と 特異的 に結合す る こ と に よ り 、 被検出物 と 間接的に 結合す る よ う に さ れて い る も の であ っ て も よ い。 捕捉物質 2 を 具体的 に示せ ば、 被検出物が抗原で あ る と き は、 抗体 （ こ こ で 「抗体」 は前に定義 し た よ う に抗原 と 特異的 に結合す る抗体 フ ラ グ メ ン ト も 含む も の と す る 。 ） で あ る 。 捕捉物質 2 が抗体で あ っ て捕捉物質 1 も 抗体で あ る と き は、 被検出物抗原の異な る ェ ピ ト 一 プを認識す る も の であ る こ と が望 ま し い。 以下同様に 被検出物が抗体であ る と き は抗原 （ 「抗原」 は前に定義 し た よ う に抗体 と 特異的 に結合す る 化合物 も 含む も の と す る ） で あ り リ セ プタ ー であ る と き は リ ガ ン ドで あ り 、 リ ガ ン ドであ る と き は リ セ プタ ー であ る 。 ま た、 捕捉物質 2 が捕捉物質 3 と 特異的 に結合す る も の であ る と き は、 ア ビ ジ ン、 抗 ビォ チ ン抗体、 レ ク チ ン等が捕捉物質 2 の例 と し て あ げ ら れ る 。

捕捉物質 2 を ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体 に固定す る に は、 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体の適当 な 官能基 と 捕捉物質 2 の官能基 と の 間で 共有結合に て結合 さ せて も 良 い し 、 捕捉物質 2 を ク ロ マ ト ダ ラ フ ィ 担体 に 強固 に吸着 さ せ て も よ い。 更 に、 捕捉物質 2 を微細 粒子に結合ま た は吸着さ せ、 こ の微細粒子を ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体中 に分散 さ せ固定 し て も よ い。 こ こ で固定 と は、 水性溶媒 に よ り 実質的 に拡散、 展開 さ れな い よ う に配置 さ れて い る こ と を い う 。 捕捉物質 2 が固定 さ れて い る 領域を結合領域 と い う 。

捕捉物質 1 、 捕捉物質 2 、 捕捉物質 3 ま た は捕捉物質 4 が抗 体であ る と き は、 多 く の場合モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体が使用 さ れ る が、 血清抗体であ っ て も 、 必要があ れば、 吸収操作、 抗原 あ る い は動物種の選択等、 適当 な手段を施 し て、 使用す る こ と がで き る

捕捉物質 3 は、 被検出物 に特異的 に結合す る 部分 と 捕捉物質 2 に特異的に結合す る 部分 と か ら な る 複合体で あ る 。 被検出物 に特異的 に結合す る 部分 は捕捉物質 1 に お い て詳述 し た よ う に 被検出物が抗体であ る と き は抗原、 抗原であ る と き は抗体、 以 下同様、 リ ガ ン ドで あ る と き は リ セ プ タ ー、 リ セ プ タ 一 で あ る と き は リ ガ ン ドで あ る 。 捕捉物質 2 に特異的 に結合す る 部分は 例え ば、 捕捉物質 2 がア ビ ジ ン であ る と き は ビォ チ ン 、 ビォ チ ン で あ る と き は、 抗 ビォ チ ン抗体又 は ア ビ ジ ン 、 レ ク チ ン であ る と き は糖 リ ガ ン ド で あ る 。

捕捉物質 3 は、 結合領域の上流の適宜選択 さ れ る 何れかの領 域 に、 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プに サ ン プル水溶液が添加 さ れた と き ク ロ マ ト グ ィ 担体中 に展開 し移動す る よ う に ク ロ マ ト グラ フ ィ 担体上に予め配置 さ れ る か ま た は サ ン プル添加時 に ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体に添加 さ れ る 。 配置の方法は ト レ ー ザ 一の配置の項に て詳 し く 述べた

捕捉物質 4 は捕捉物質 1 と 特異的 に結合す る

ク ロ マ ト グ ィ 担体は、 水性溶媒で溶質を展開で き る も の であ れば、 どの よ う な も の であ っ て も 良い。 例え ば、 セ ル ロ ー ス 、 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 、 セ ル ロ ー ス ア セ テ ー ト 、 ポ リ ア ク リ レ ー ト 、 ガ ラ ス、 ァ ガ ロ ー ス、 ポ リ ウ レ タ ン等及び こ れ ら と 無機 粉末 と を組み合わせ た も の を材料 と し た不織布か ら な る 。

ク ロ マ ト グ ィ 担体 に必要に よ り 適当な基材を張 り 合わせ る 等 し て ク ロ マ ト グ イ ス ト リ ッ プが得 ら れ る

ゼ ン は、 周知の よ う に、 魚類あ る い は ほ乳類等の脊椎動 物よ り 得 ら れ る 。 ゼ ラ チ ン の ゲルの溶融温度は 1 5 °C以上が好 ま し く 、 よ り 好ま し く 【ま 2 5 °C以上で あ る 。

ゼ ラ チ ン の ゲルの溶融温度 は、 本発明で は次の方法で測定す る も の と す る 。

ゼラ チ ン を 濃度が 1 0 g Z d 1 と な る よ う に、 0 . 9 %塩化 ナ ト リ ウ ム を含む l O m M リ ン 酸緩衝液 （ p H 7 . 4 ) に溶解 す る 。 こ の ゼ ラ チ ン 溶液を 、 長 さ 1 0 0 m m、 口 径 1 2 . 5 m mの試験管中 に l m l 入れ、 試験管に栓をす る 。 試験管を 0 での水浴中 に十分浸 し 、 ゼ ラ チ ン を ゲル化 さ せ る 。 水浴の温度 を 1 で にっ き 2 分程度の速度でゆ つ く り 上昇 さ せ、 試験管を逆 さ ま に し た と き 、 ゼ ラ チ ン ゲルが落下す る 最初の温度を測定す る

ゼ ラ チ ン は、 サ ン プル液添加時に使用 さ れ る か、 あ る い は予 め ク ロ マ ト グラ フ ィ 担体上に配置 し て使用 さ れ る 。 サ ン プル液 添加時に使用す る に は、 サ ン プル溶液中 に溶か し 込んで も よ い が、 サ ン プル液 と は別に ゼ ラ チ ン水溶液 と し て添加 し て も よ い ゼ ラ チ ン水溶液を作成す る と き の水性溶媒 は、 通常、 サ ン プ ル 液を作成す る と き の水性溶媒 と 同 じ も の を使用す る の が望 ま し い。 ゼラ チ ン をサ ン プル添加時 に使用す る 場合に は、 ゼ ラ チ ン 溶液の ゼ ラ チ ン濃度は、 好ま し く は、 0 な い し 5 重量

%の範囲であ る 。 ゼ ラ チ ン を予め配置す る 場合 に も ゼ ラ チ ン量 は上記サ ン プ ル溶液に対す る 重量％ に て予め配置す る の が良い ゼ ラ チ ン を サ ン プ ル液添加時に 添加す る 場合 は、 結合領域上 流の何れかの領域に添加 さ れ る 。 ゼ ラ チ ン を予め配置す る き は、 結合領域の上流であ っ てかつ標識領域を除 く 領域 に配置 さ れ る 。 具体的な添加 ま た は配置部位 は、 最適な部位が適宜予め 選択 さ れ る が、 領域 7 に配置すれば、 最良の結果が得 ら れ る こ と があ る 。 ゼ ラ チ ン を ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体上に予め配置 し て あ る ゼラ チ ン配置 ク ロ マ 卜 グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プを得 る 場合 は、 結合領域の上流で あ っ て標識領域を除 く 領域の予め選択 し た領 域 に、 水性溶媒に て展開 さ れ る よ う に配置すれば よ い。 即 ち 、 ゼラ チ ン水溶液を し み こ ま せ乾燥 し た ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体切 片を基材ま た は ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体上に 置 けばよ い。

ま た、 捕捉物質 特異的 に結合す る 捕捉物質 4 を ク ロ マ ト グ ィ 担体の捕捉物質 2 が結合 さ れて い る 領域の下流に固定 し て結合領域 と す る 場合は、 ゼ ラ チ ン は捕捉物質 2 が固定 さ れ てい る 領域 と 捕捉物質 4 が固定 さ れて い る 領域の 間 に添加す る か予め配置す る のが好ま し い。

ゼラ チ ン を本発明以外の方法に よ り 使用 し た と き は、 例えば ゼ ラ チ ン を予め標識領域 に配置 し た と き は、 多 く の場合、 検出 時間の延長、 検出感度の低下等の 問題が生 じ る 。 一方、 例え ば ゼラ チ ン をサ ン プル添加時に使用す る と き は、 標識領域 に添加 し て も こ の よ う な 問題が生 じ る こ と は な い。 こ れは、 ゼ ラ チ ン を予め標識領域に配置す る と ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プを保 存 し て い る 間 に標識物質に ゼ ラ チ ンが何 ら かの影響を与え て い る こ と に よ る と 考え ら れ る 。

サ ン プ ル液の水性溶媒は、 水であ っ て も よ いが、 通常 は p H 緩衝液が用 い ら れ る 。 水性溶媒の P H は、 5 な い し 9 の範囲が 好ま し い。

サ ン プ ル液は、 標識領域があ る と き は標識領域ま た は そ の領 域よ り 上流域に、 標識領域がな い と き は結合領域の上流に添加 さ れ る 。 こ こ でい う 添加 と は、 サ ン プル水溶液を ク ロ マ ト ダラ フ ィ ス 卜 リ ッ プ上に 置 く 場合 と 、 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プ の最上流端を サ ン プ ル溶液中 に浸 け る 場合 と があ る 。

ト レ ー サ ー及び 又 は捕捉物質 3 を予め ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担 体上に配置 し な い場合 は、 こ れ ら は サ ン プル添加時に添加 さ れ る 。 添加方法 は 、 通常サ ン プル と 共に添加す る 。

こ の発明の検査用 キ ッ 卜 につ い て、 2 つ の ケ ー ス があ る 。 第 1 は、 ゼラ チ ン が予め配置 さ れて い な い ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プ と ゼ ラ チ ン と が少な く と も 組み合わ さ れて い る 場合 であ る 。 こ の場合、 更 に 水性溶媒等が組み合わ さ れて い て も よ い。 ま た、 ゼ ラ チ ン は、 水性溶媒 に溶解 さ れて い て も 溶解 さ れ て い な く と も よ い。

第 2 は、 ゼ ラ チ ン配置 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プか ら 構成 さ れて い る 場合で あ る 。 こ の場合に お い て も 、 水性溶媒等の他 の構成成分が更に組み合わ さ れて い て も よ い。 上記何れの場合 も 、 ト レ ー ザ 一及び 又 は捕捉物質 3 が予め ク ロ マ ト グ ラ フ ィ —担体上に配置 さ れて い な い場合 は、 凍結乾燥等の粉末状又 は 水溶液 （又 は懸濁液） と し て組み合せ ら れ る 。

更 に図面を用 い て説明す る 。

図 1 は、 標識領域が配置 さ れて い る 場合の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プを表す。 ク ロ マ ト グ ラ フ イ ス ト リ ッ プ 1 は、 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体 2 と 必要に よ り 基材か ら 構成 さ れて い る 。

ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体 2 に は、 ト レ ー サ ーが水性溶媒に て展開 可能な よ う に配置 さ れて い る 標識領域 3 があ る 。

標識領域 3 の上流域 5 は必要に よ り 配置 さ れ る も のであ り 、 配置 さ れた と き は サ ン プル液の添加部位 と な る こ と が多 い。 こ こ で は、 サ ン プル液中の懸濁物の濾過を行 う こ と がで き る 他、 検査を 円滑 に行 う た めの補助的物質を含 ま せ る こ と がで き る 。 補助的物質 と し て は、 被検出物 と 捕捉物質 1 と の結合反応を よ り 特異的又は よ り 定量的 にす る も の、 不溶性マ 一 力 — の発色試 薬等があ る 。

標識領域 3 の上流域 5 ま た は標識領域 3 に サ ン プ ル液を添加 すれば、 サ ン プ ル中の被検出物 は捕捉物質 1 と 結合す る も の で あ れば、 ト レ ー サ ー に よ り 標識 さ れ る 。 次いで、 被検出物 と 結 合 し た ト レ ー サ ー及び被検出物 と 結合 し て い な い ト レ ー サ ー及 び被検出物は、 図 1 の右方向即 ち下流方向 に ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 展開 し移動 し て、 標識領域 3 の下流 に 置かれた結合領域 4 に達 す る

標識領域 3 と 結合領域 4 と は、 直接接続 し て配置 さ れ る こ と は な く 、 適宜選択さ れ る と こ ろ の一定の 間隔がおかれ る の 間隔を お く た めの領域 7 で は、 ゼラ チ ン がおかれ る 場合が あ る か、 標識物質 3 が ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 展開で き る よ う 〖こ配置 さ れ る 場合があ る 。 更に マ ー カ ー の発色剤が配置 さ れ る 場合があ る

結合領域 4 は、 次の二つ の場合があ る 。 即 ち 、 第一 は、 被検 出物を捕捉 し た ト レ ー サ ー が こ こ で捕捉 さ れて呈色す る か、 被 検出物 と 競合 し て ト レ ー サ ー が こ こ で捕捉 さ れて呈色す る 場合 であ る 。 第二 は、 捕捉物質 2 が固定 さ れて い る 領域 （上記第一 の場合で は、 こ の領域を結合領域 と し た） の下流に捕捉物質 4 が固定 さ れて い る 場合で あ る 。 こ の場合に は、 必要に よ り 適宜 配置 さ れ る も の で あ る が、 配置 さ れかつ呈色の検出の た め に用 い ら れ る と き は、 結合領域 4 と す る 。 第二の場合、 被検出物質 と 競合 し て捕捉物質 2 に結合で き ず捕捉 さ れな か っ た ト レ ーザ 一 が、 こ の結合領域 に て捕捉物質 4 に捕捉 さ れて呈色す る 。

捕捉物質 3 が配置 さ れて い る と き は、 ト レ ー サ ー に捕捉 さ れ て い る 被検出物に捕捉物質 3 が結合 し 、 ト レ ー サ ー /被検出物 捕捉物質 3 の複合体が捕捉物質 3 を介 し て、 捕捉物質 2 と 結 合 し 、 結合領域 4 に止 ま る 。 或い は、 捕捉物質 3 が捕捉物質 2 に結合 し て結合領域 4 に お い て被検出物 と 特異的 に結合す る よ う に な る 。

結合領域 4 の下流域 6 は、 捕捉物質 1 が被検出物 と 結合す る も の で あ る と き は、 被検出物が捕捉物質 1 を介 し て結合 し て い な い ト レ ーザ 一 を流出 さ せ る た め に、 あ る い はサ ン プル液中の 被検出物以外の可溶性物質が流出す る よ う に、 必要に よ り 設 け ら れ る 。 更 に、 下流域 6 に は、 ま た、 サ ン プ ル水溶液の水性溶 媒が流れて き た と き に発色す る 例え ば p H 指示薬等が配置 さ れ こ れに よ り 、 検出 の信頼性を判断で き る よ う に さ れ る 場合があ る 標識領域 3 を ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プが有 し な い場合に は、 ト レ ー サ ー がサ ン プル添加時に添加 さ れ る 以外 は、 上記 と 同様に検査が行な わ れ る 。 実施例 1

セ レ ニ ウ ム コ ロ イ ドで標識 し た抗 ヒ ト ヘモ グ ロ ビ ン抗体か ら な る ト レ ー サ ーの調製 ：

9 I m Mの L ー ァ ス コ ル ビ ン酸ナ ト リ ゥ ム と 3 2 m M酸化セ レ ニ ウ ム と を、 約 4 °Cで 1 5 分つ い で約 4 2 °Cで約 7 0 時間撹 拌 し て、 セ レ ニ ウ ム コ ロ イ ドを調製 し た。

得 ら れた セ レ ニ ウ ム コ ロ イ ドを 5 5 O n mの吸光度が 1 5 に な る よ う に 1 0 m M ピス ト リ ス緩衝液 （ p H 7 . 0 ) で希釈 し た。 こ の希釈液に マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 ヒ ト へモ グ ロ ビ ン抗 体 （ 0 . 0 2 % ) を添加 し 、 こ れを室温で 1 時間撹拌 し た。 次 いで、 得 ら れたセ レ ニ ウ ム コ ロ イ ドで標識 し た抗 ヒ ト へモ グ ロ ビ ン抗体を 1 0 m M ト リ ス 塩酸緩衝液 （ p H 7 . 2 ) で洗浄 し て ト レ ー サ ー と し た。 標識領域の調製 ：

ト レ ー サ ー を 1 %カ ゼィ ン を含有 し た 1 O m M ト リ ス緩衝液

( P H 7 . 2 ) に入れ、 波長 5 5 0 n mの吸光度が 1 . 0 に な る よ う に し て ト レ ー サ ー 懸濁液を得た。 こ の懸濁液中 に ガ ラ ス 繊維膜 （米国 LYDALL社製、 Lypore9524) を浸 し 懸濁液を充分 し み こ ま せ た後、 ガ ラ ス繊維膜を乾燥 し 、 標識領域 と し た。

結合領域の調製 ：

上記抗 ヒ ト へ モ グ ロ モ ビ ン抗体 と は、 ヒ ト ヘモ グ ロ ビ ンへの 結合部位が異な る マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 ヒ ト へ モ グ ロ ビ ン抗 体を、 2 m g Z m l に な る よ う に、 1 5 0 m M塩化ナ ト リ ウ ム を含有 し た 3 O m M ト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 7 . 4 ) 中 に混合 し た。 一方、 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体 と し て 0 . 4 x 4 . 5 c m の長方形の細孔 5 ju mの 二 ト ロ セ ル ロ ー ス膜 （米国 S c h 1 e i c h e r & S c h u e l l 社製） に 、 厚 さ 1 0 0 ;« mの 0 . 4 x 6 . O c mの長方形の ラ ミ ネ ー ト （ リ ン テ ッ ク 社製、 P E T 1 0 0 P E L R 0 0 7 A ) を、 長 い辺を縦 と し た と き に上端が揃 う よ う に貼付 し た。 ラ ミ ネ ー ト を貼付 し たニ ト ロ セ ル ロ ー ス膜の下端か ら 約 1 c mの と こ ろ に線状に抗体を混合 し た溶液を滴下 し た後、 十分乾燥 さ せ、 抗 ヒ ト ヘモ グ ロ ビ ン抗 体を固定 し た。

ク ロ マ ト グ ラ フ イ ス ト リ ッ プの調製 ：

抗 ヒ ト ヘモ グ ロ ビ ン抗体を固定 し た 二 ト ロ セ ル ロ ー ス の下側 の ラ ミ ネ ー ト 上に、 0 . 4 x 0 . 4 c mの正方形に切断 し たセ レ ニ ウ ム コ ロ イ ド標識抗 ヒ ト ヘ モ グ ロ ビ ン抗体を含有す る パ ッ ド （標識領域） を、 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス と わずかに接す る よ う に 貼付 し た。 パ ッ ドの下側の ラ ミ ネ ー ト 上に、 プ レ フ ィ ル タ ー と し て、 0 . 4 X 1 . 3 c mの疎水性不織布 （米国デ ュ ポ ン社製 ソ ン タ ラ 8 8 0 1 ) を、 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス と わずか に接す る よ う に貼付 し 、 こ れを、 ク ロ マ ト グ ラ フ イ ス ト リ ッ プ と し た。 ア ツ セ ィ ：

ヒ ト ヘモ グ ロ ビ ン （米国 シ グマ社製） を含み、 0 . 1 %牛血 清ア ル ブ ミ ン （生化学工業、 東京都） 、 0 . 9 %塩化ナ ト リ ウ ム 、 0 . 1 % ア ジ化ナ ト リ ウ ム を含有す る 0 . 1 M ト リ ス塩酸 緩衝液 （ p H 7 . 6 ) をサ ン プル と し た。 こ れに、 豚の皮虜由 来の ゼ ラ チ ン （米国 シ グマ社製） を 0 . 7 % に な る よ う に添加 し た。 こ のサ ン プル液 2 5 〃 1 を ク ロ マ ト グラ フ イ ス ト リ ッ プ のプ レ フ ィ ル タ ー上 に添加 し た。 サ ン プル液添加後 7 分後 に セ レ ニ ウ ム コ ロ イ ド 由来の "赤 さ " を 肉眼で読み と る こ と に よ り 判定を行 っ た。 "赤 さ " が肉眼で観察で き る 最低ヘモ グ ロ ビ ン 濃度を以て感度 と し た。

判定結果を表 1 に示す。 表 1 よ り 明 ら かな よ う に ゼ ラ チ ン * 2

使用 し た と き （ a ) は使用 し な か っ た と き （ b ) に比べ約 8 0 倍感度が上昇 し た

実施例 2

実施例 1 に お いて、 判定をサ ン プ ル液添加後 1 分か ら 1 2 分 迄の 1 分間隔 と し た。

結果を図 2 に示す。 図 2 よ り ゼラ チ ン を使用 し た と き （線 a ) は使用 し な か っ た と き （線 b ) に比べ検査時間が約 3 分の 1 に 短縮 さ れた。

実施例 3

実施例 1 に お い て、 サ ン プ ル液中 ヒ ト ヘ モ グ ロ ビ ン濃度を図 3 に示す値 と し た。 結果を図 3 に し めす。 図 3 か ら わか る よ う に、 ゼラ チ ン を使用 し た と き （線 a ) の測定可能な ヒ ト へモ グ ロ ビ ン濃度上限がゼ ラ チ ン を使用 し な か っ た と き （線 b ) の測 定可能上限 よ り 約 1 0 倍高 い。 即 ち ゼ ラ チ ン を使用す る と プ ロ ゾー ン現象が低下す る こ と がわか る

実施例 4

実施例 1 に お い て、 ゼラ チ ン を表 2 に示す も の を用 い、 ヒ ト ヘモ グ ロ ビ ン を検出 し た。 但 し 、 ヒ ト ヘモ グ ロ ビ ン は 1 0 n g

/ m 1 と し 、 ゼ ラ チ ン の サ ン プ ル液へ の 添加量 は 0 % と し た。 結果を表 2 に示す。 ゼ ラ チ ン の溶融温度 は、 本文中 に示 し た方法に よ り 測定 し た

表 2

ゼ ラ チ ン ゲル tトへモク * Dt* ン ゼ ラ チ ン

溶融温度 （ ） 検 出 結 果 豚皮セ ' ラチン （S ma) 3 1 . 4 + + + 牛皮セ ' ラチン（S i gma) 2 4 . 9 +

豚骨セ ' ラチン （D i ί c 0) 2 7 . 5 +

Co l d F i s h セ ' ラチ ン （S i gma) 0 . 0 土

無 添 加 産業上の利用可能性

こ の発明の検査方法又 は検査用 キ ッ ト を用 い る こ と に よ り 、 被検 出物の検出感度を高め る こ と がで き る 。 更に、 検出 に要す る 時間を短縮す る こ と がで き る 。 加え て、 サ ン ド ウ イ ツ チ法に お け る い わ ゆ る プ ロ ゾー ン現象が低下す る

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 被検出物に直接に若 し く は被検出物 と 捕捉物質 2 の両方 に結合す る 捕捉物質 3 を介 し て間接的 に結合す る 捕捉物質 2 が 固定 さ れて い る か又 は被検出物に特異的 に若 し く は捕捉物質 2 に被検出物 と 競合 し て特異的 に結合す る 捕捉物質 特異的に 結合す る 捕捉物質 4 が捕捉物質 2 が固定 さ れて い る 領域の下流 に お い て固定 さ れて い る 結合領域を少な く と も 有す る ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 担体に、 更 に捕捉物質 1 と マ 一 カ ー と か ら な る ト レ 一 サ ー を該結合領域の上流に ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 展開で き る よ う に 予め配置す る か又 は サ ン プル添加時に添加す る ク ロ マ ト グ ラ フ イ ス ト リ ッ プを用 い る 検査方法に お い て ； ゼ ラ チ ン を該結合領 域の上流に サ ン プル添加時に添加す る か又 は該結合領域の上流 であ っ て ト レ ー サ ー が予 め配置 さ れて い る 領域を除 く 領域に予 め配置す る こ と を特徴 と す る 検査方法。

2 ゼ ラ チ ン の ゲルが、 1 5 °C以上で溶融す る も の であ る 請 求項 1 に記載の検査方法。

3 . ゼ ラ チ ン の ゲルが、 2 5 °C以上で溶融す る も の であ る 請 求項 1 に記載の検査方法

4 . サ ン プルが、 糞便 ま た は尿で あ る 請求項 1 、 2 又 は 3 に 記載の検査方法。

5 . 捕捉物質 1 に特異的 に結合す る 捕捉物質 4 が捕捉物質 2 が固定 さ れて い る 領域の下流に お い て固定 さ れて い る 領域を結 合領域 と す る 場合に お い て、 ゼ ラ チ ン を捕捉物質 2 が固定 さ れ て い る 領域 と 捕捉物質 4 が固定 さ れて い る 領域の 間 に添加 ま た は予 め配置す る こ と か ら な る 請求項 1 記載の検査方法。

6 請求項 1 に記載の ク ロ マ ト グ ラ フ イ ス ト リ ッ プ と ゼ ラ チ ン と を、 又 は請求項 1 に記載の結合領域の上流で あ っ て 卜 レ ー サ 一 が予め配置 さ れて い る 領域を除 く 領域に ゼ ラ チ ン が予 め配 置 さ れて い る ゼラ チ ン配置 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ス ト リ ッ プを、 少 な く と も 有す る 検査用 キ ッ ト 。

7 ゼ ラ チ ン の ゲルが、 2 5 °C以上で溶融す る も の であ る 請 求項 7 に記載の検査用 キ ッ ト

8 . ゼ ラ チ ン の ゲルが、 1 5 °C以上で溶融す る も の で あ る 請 求項 7 に記載の検査用 キ ッ ト 。

9 サ ン プルが、 糞便 ま た は尿で あ る 請求項 6、 7 又 は 8 に 記載の検査用 キ ッ ト

0 捕捉物質 1 に特異的 に結合す る 捕捉物質 4 が捕捉物質

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